基于艾日布林的抗体-药物偶联物和使用方法与流程

基于艾日布林的抗体-药物偶联物和使用方法
1.本技术是申请号为201780022381.5，申请日为2017年3月2日， 发明名称为“基于艾日布林的抗体-药物偶联物和使用方法”的专利 申请的分案申请。
2.本技术主张2016年3月2日提交的美国临时专利申请no. 62/302,562的优先权益，所述临时专利申请的全部内容以引用的方式 并入本文中。
3.本公开涉及结合例如叶酸受体α的人类肿瘤学抗原标靶和/或提 供抗微管蛋白药物活性的抗体药物偶联物(adc)。本公开进一步涉及 可用于治疗和诊断表达叶酸受体α和/或通过破坏微管蛋白可治疗的 癌症的方法和组合物。
4.癌症为全世界致病率和死亡率的主要原因之一，其中2012年大 约有1400万例新病例和820万例癌症相关的死亡。癌症死亡的最常 见原因为以下癌症：肺癌(159万例死亡)；肝癌(745,000例死亡)；胃 癌(723,000例死亡)；结肠直肠癌(694,000例死亡)；乳腺癌(521,000 例死亡)；和食道癌(400,000例死亡)。预计新癌症病例的数目在未来 二十年间上升约70％，每年达大约2200万例新癌症病例(world cancerreport 2014)。
5.微管为与包括细胞内迁移和转运、细胞信号传导和维持细胞形状 的多种细胞功能相关的有力的细丝状细胞骨架蛋白。微管也在有丝分 裂细胞分裂中通过形成染色体分成两个子细胞所需的有丝分裂纺锤 体而起到关键作用。所有细胞中微管的生物功能大部分由其聚合动力 学调节，这通过α和β微管蛋白二聚物可逆、非共价地加在微管两端 进行。这种动力学行为和所产生的对微管长度的控制为有丝分裂纺锤 体的适当功能所不可缺少的。甚至微管动力学的微小改变也会牵涉轴 检查点，抑制有丝分裂时细胞周期进展，且随后引起细胞死亡 (mukhtar等人(2014)mol.cancer ther.13:275-84)。由于癌细胞的细胞 分裂快速，所以与正常细胞相比，其一般对结合于微管蛋白且破坏其 正常功能的化合物更加敏感。因此，微管蛋白抑制剂和其它靶向微管 剂有望成为一类治疗癌症的药物(dumontet和jordan(2010)nat.rev. drug discov.9:790-803)。
6.叶酸受体α(fra)为一种结合叶酸盐的经甘油磷脂酰肌醇(gpi) 连接的膜蛋白。虽然未充分了解fra在正常和癌组织的生物学中的 作用，但其在高百分比的上皮细胞来源的卵巢癌上(o'shannessy等人 (2013)int.j.gynecol.pathol.32(3):258-68)，以及在一定百分比的非小 细胞肺癌中(christoph等人(2014)clin.lung cancer 15(5):320-30)过度 表达。fra在正常组织中也具有有限表达。这些特性使得fra成为 癌症免疫疗法的吸引人的标靶。
7.原致癌基因人类表皮生长因子受体2(her2)编码属于人类表皮 生长因子受体(egfr)家族的跨膜酪氨酸激酶受体(king等人(1985) science 229:974-6)。her2的过度表达能够组成性活化生长因子信号 传导路径，例如pi3k-akt-mtor路径，因此用作若干类癌症，包括 接近20％侵袭性乳腺癌的致瘤驱动因子(slamon等人(1989)science244:707-12；gajria和chandarlapaty(2011)expert rev.anticancer ther. 11:263-75)。鉴于her2扩增介导转化的表型，her2为癌症治疗的 另一有希望的标靶。
发明概要
8.本公开部分提供具有针对肿瘤细胞的生物活性的新颖化合物。所 述化合物可以抑制哺乳动物中的肿瘤生长，且可用于治疗人类癌症患 者。
9.更特定地说，本公开涉及能够结合、内化和杀死肿瘤细胞(例如 表达fra的肿瘤细胞)的抗体-药物偶联物化合物。公开了包含将药物 部分附接于抗体部分的连接子的抗体-药物偶联物化合物。抗体-药物 偶联物(adc)化合物可以由式i表示：
10.ab-(l-d)
p
ꢀꢀꢀ(i)11.其中ab为靶向肿瘤细胞的内化抗体或其内化抗原结合片段；
12.d为艾日布林；
13.l为将ab共价附接于d的可裂解连接子；且
14.p为整数1至20。
15.在一些实施方案中，连接子在细胞外是稳定的，使得adc在存 在于细胞外环境中时保持完整，但在例如癌细胞的细胞中内化时能够 裂解。在一些实施方案中，当adc进入表达对adc的抗体部分具 有特异性的抗原的细胞时，艾日布林药物部分从抗体部分裂解，且裂 解释放艾日布林的未修饰形式。在一些实施方案中，连接子包含被定 位成使得所述连接子或所述抗体部分中没有部分在裂解后保持结合 于艾日布林的可裂解部分。
16.在一些实施方案中，连接子中的可裂解部分为可裂解肽部分。在 一些实施方案中，相对于包含替代可裂解部分的adc，包含可裂解 肽部分的adc显示较低的聚集水平，改善的抗体:药物比率，增加的 癌细胞的靶向杀死，减少的非癌细胞的脱靶杀死，和/或较高的药物 负载(p)。在一些实施方案中，相对于不可裂解的连接子，添加可裂解 部分增加细胞毒性和/或效力。在一些实施方案中，增加的效力和/或 细胞毒性是在表达中等水平的由adc的抗体部分所靶向的抗原(例 如中等fra表达)的癌症中。在一些实施方案中，可裂解肽部分能够 由酶裂解，且连接子为酶能够裂解的连接子。在一些实施方案中，酶 为组织蛋白酶，且连接子为组织蛋白酶能够裂解的连接子。在某些实 施方案中，与替代分裂机制相比，酶能够裂解的连接子(例如组织蛋 白酶能够裂解的连接子)显示上述改善特性中的一种或多种。
17.在一些实施方案中，连接子中的可裂解肽部分包含氨基酸单元。 在一些实施方案中，氨基酸单元包含缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)。在一些 实施方案中，相对于包含替代氨基酸单元或替代可裂解部分的adc， 包含val-cit的adc显示增加的稳定性，减少的脱靶细胞杀死，增加 的靶向细胞杀死，较低的聚集水平，和/或较高的药物负载。
18.在一些实施方案中，连接子包含至少一种将抗体部分接合于可裂 解部分的间隔子单元。在一些实施方案中，连接子中的间隔子单元可 以包含至少一种聚乙二醇(peg)部分。peg部分可以例如包含
ꢀ‑
(peg)
m-，其中m为整数1至10。在一些实施方案中，连接子中的间 隔子单元包含(peg)2。在一些实施方案中，尽管连接子长度较短，但 相对于包含较长间隔子单元(例如(peg)8)的adc，包含较短间隔子单 元(例如(peg)2)的adc显示较低的聚集水平和/或较高的药物负载。
19.在一些实施方案中，连接子中的间隔子单元经由顺丁烯二酰亚胺 部分(mal)附接于adc的抗体部分。在一些实施方案中，相对于包含 经由替代部分附接于抗体部分的连接子的adc，包含经由mal附接 于抗体部分的连接子的adc显示较高的药物负载。在一些实施
方案 中，连接子中的mal与抗体部分上的半胱氨酸残基反应。在一些实施 方案中，连接子中的mal经由半胱氨酸残基接合于抗体部分。在一些 实施方案中，mal-间隔子单元包含peg部分。在一些实施方案中， 连接子包含mal-(peg)m，例如mal-(peg)2。在一些实施方案中，连 接子包含mal-(peg)2。在一些实施方案中，mal-间隔子单元将抗体部 分附接于连接子中的可裂解部分。在一些实施方案中，连接子中的可 裂解部分为可裂解肽部分，例如氨基酸单元。在一些实施方案中，连 接子包含mal-(peg)
2-val-cit。
20.在一些实施方案中，连接子中的可裂解部分直接接合于adc的 艾日布林药物部分，且可裂解部分直接连接于抗体部分或经由间隔子 单元连接。在一些实施方案中，间隔子单元还将连接子中的可裂解部 分附接于艾日布林药物部分。在一些实施方案中，将连接子中的可裂 解部分附接于艾日布林药物部分的间隔子单元为自消耗的。在一些实 施方案中，自消耗间隔子能够释放标靶细胞中的未改性的艾日布林。 在一些实施方案中，自消耗间隔子单元包含对氨基苯甲醇。在一些实 施方案中，自消耗间隔子单元包含对氨基苯甲氧基羰基(pab)。在一 些实施方案中，连接子中的pab将可裂解部分附接于艾日布林药物 部分。在一些实施方案中，可裂解部分为可裂解肽部分，例如氨基酸 单元。在一些实施方案中，连接子包含val-cit-pab。在一些实施方 案中，连接子包含val-cit-pab和经由mal将连接子接合于抗体部分 的peg间隔子单元。
21.在一些实施方案中，p为整数1至6、2至5或优选3至4。在一 些实施方案中，p为4。在一些实施方案中，提供一组adc，且所述 组中的平均p为约4(例如3.5-4.5，例如约3.8)。在一些实施方案中， 连接子包含mal-(peg)
2-val-cit-pab。在一些实施方案中，连接子包 含mal-(peg)
2-val-cit-pab且p为4。在一些实施方案中，提供一组 adc，其中各adc包含mal-(peg)
2-val-cit-pab连接子，且所述组 中平均p为约4(例如3.5-4.5，例如约3.8)。
22.在一些实施方案中，adc的内化抗体或内化抗原结合片段(ab 或ab部分)为抗叶酸受体α(fra)抗体或内化抗体片段，且可以结合 表达fra的肿瘤细胞(即adc靶向表达fra的细胞)。在一些实施方 案中，相对于不可裂解连接子或替代裂解机制，包含抗fra ab部分 和可裂解肽部分的adc显示较低的聚集水平，改善的抗体:药物比率， 增加的癌细胞的靶向杀死，减少的非癌细胞的脱靶杀死，较高的药物 负载(p)，增加的细胞毒性和/或效力。在一些实施方案中，增加的效 力和/或细胞毒性是在表达中等水平的由adc的抗体部分靶向的抗原 (例如中等fra表达)的癌症中。在一些实施方案中，可裂解的肽部分 能够由酶裂解，且连接子为酶能够裂解的连接子。在一些实施方案中， 酶为组织蛋白酶，且连接子为组织蛋白酶能够裂解的连接子。在某些 实施方案中，与替代分裂机制相比，酶能够裂解的连接子(例如组织 蛋白酶能够裂解的连接子)显示上述改善特性中的一种或多种。在一 些实施方案中，连接子为mal-(peg)
m-val-cit-pab。
23.在一些实施方案中，内化抗体或内化抗原结合片段结合于叶酸受 体α(fra)且靶向表达fra的肿瘤细胞。在一些实施方案中，内化抗 体或内化抗原结合片段包含三个重链互补决定区(cdr)和三个轻链 cdr，其中重链cdr包含由seq id no:2组成的重链cdr1、由seqid no:3组成的重链cdr2和由seq id no:4组成的重链cdr3；且 三个轻链cdr包含由seq id no:7组成的轻链cdr1、由seq idno:8组成的轻链cdr2和由seq id no:9组成的轻链cdr3(如 kabat编号系统所定义)；或其中重链cdr包含由seq id no:13组 成的重链cdr1、由seq id no:14组成的重链cdr2和由seq idno:15组成的重链cdr3；且轻链cdr包含
no:28的轻链可变域的抗 体竞争结合表位和/或结合相同的表位。
26.在一些实施方案中，内化抗体或内化抗原结合片段为内化抗her 2 抗体或内化抗原结合片段。在一些实施方案中，内化抗体或内化抗原 结合片段包含三个重链cdr和三个轻链cdr，其中重链cdr包含 由seq id no:71组成的重链cdr1、由seq id no:72组成的重链 cdr2和由seq id no:73组成的重链cdr3；且三个轻链cdr包含 由seq id no:74组成的轻链cdr1、由seq id no:75组成的轻链 cdr2和由seq id no:76组成的轻链cdr3(如kabat编号系统所定 义)；或其中重链cdr包含由seq id no:191组成的重链cdr1、由 seq id no:192组成的重链cdr2和由seq id no:193组成的重链 cdr3；且轻链cdr包含由seq id no:194组成的轻链cdr1、由 seq id no:195组成的轻链cdr2和由seq id no:196组成的轻链 cdr3(如imgt编号系统所定义)；连接子包含 mal-(peg)
2-val-cit-pab；且p为4。在一些实施方案中，提供一组这 类adc，且p为约4(例如约3.8)。在一些实施方案中，内化抗体或 内化抗原结合片段包含seq id no:27的重链可变域和seq idno:28的轻链可变域。在一些实施方案中，内化抗体或内化抗原结合 片段包含人类igg1重链恒定域和igκ轻链恒定域。在一些实施方案 中，内化抗体或内化抗原结合片段与包含seq id no:27的重链可变 域和seq id no:28的轻链可变域的抗体竞争结合表位和/或结合相 同的表位。
27.在一些实施方案中，内化抗体或内化抗原结合片段结合于间皮素 (msln)且靶向表达msln的肿瘤细胞。在一些实施方案中，内化抗 体或内化抗原结合片段包含三个重链互补决定区(cdr)和三个轻链 cdr，其中重链cdr包含由seq id no:65组成的重链cdr1、由 seq id no:66组成的重链cdr2和由seq id no:67组成的重链 cdr3；且三个轻链cdr包含由seq id no:68组成的轻链cdr1、 由seq id no:69组成的轻链cdr2和由seq id no:70组成的轻链 cdr3(如kabat编号系统所定义)；或其中重链cdr包含由seq idno:185组成的重链cdr1、由seq id no:186组成的重链cdr2和 由seq id no:187组成的重链cdr3；且轻链cdr包含由seq idno:188组成的轻链cdr1、由seq id no:189组成的轻链cdr2和 由seq id no:190组成的轻链cdr3(如imgt编号系统所定义)。在 一些实施方案中，内化抗体或内化抗原结合片段包含seq id no:25 的重链可变域和seq id no:26的轻链可变域。在一些实施方案中， 内化抗体或内化抗原结合片段包含人类igg1重链恒定域和igκ轻链 恒定域。在一些实施方案中，内化抗体或内化抗原结合片段与包含 seq id no:25的重链可变域和seq id no:26的轻链可变域的抗体 竞争结合表位和/或结合相同的表位。
28.在一些实施方案中，内化抗体或内化抗原结合片段为内化抗 msln抗体或内化抗原结合片段。在一些实施方案中，内化抗体或内 化抗原结合片段包含三个重链cdr和三个轻链cdr，其中重链cdr 包含由seq id no:65组成的重链cdr1、由seq id no:66组成的重 链cdr2和由seq id no:67组成的重链cdr3；且三个轻链cdr包 含由seq id no:68组成的轻链cdr1、由seq id no:69组成的轻链 cdr2和由seq id no:70组成的轻链cdr3(如kabat编号系统所定 义)；或其中重链cdr包含由seq id no:185组成的重链cdr1、由 seq id no:186组成的重链cdr2和由seq id no:187组成的重链 cdr3；且轻链cdr包含由seq id no:188组成的轻链cdr1、由seq id no:189组成的轻链cdr2和由seq id no:190组成的轻链 cdr3(如imgt编号系统所定义)；连接子包含 mal-(peg)
2-val-cit-pab；且p为4。在一些实施方案中，提供一组这 类adc，且p为约4(例如约3.8)。在一些实施方案中，内化抗体或 内化抗原结合片段包含seq id no:25的重链可变域和seq idno:26的轻链可变域。在一些实
施方案中，内化抗体或内化抗原结合 片段包含人类igg1重链恒定域和igκ轻链恒定域。在一些实施方案 中，内化抗体或内化抗原结合片段与包含seq id no:25的重链可变 域和seq id no:26的轻链可变域的抗体竞争结合表位和/或结合相 同的表位。
29.本文中还提供包含多个拷贝的任何所述adc的组合物，其中组 合物中adc的平均药物负载(平均p)在约3与4之间，或约3.5至约 4.5，或约4。在一些实施方案中，平均p在约3.2与3.8之间。在一 些实施方案中，平均p在约3.6与4.4之间。
30.本文还提供包含-l-d的组合物，其中d为艾日布林；且l为共 价附接于d的可裂解连接子。在一些实施方案中，可裂解连接子共 价附接于艾日布林上的c-35胺。在一些实施方案中，可裂解连接子 包含val-cit。在一些实施方案中，可裂解连接子包含peg间隔子单 元。在一些实施方案中，可裂解连接子包含mal-(peg)
2-val-cit-pab。
31.本文进一步提供包含adc和药学上可接受的稀释剂、载体和/ 或赋形剂的药物组合物。
32.本公开的另一方面包括所述adc化合物和组合物例如在治疗癌 症中的治疗和诊断用途。另一方面包括治疗表达由adc的抗体部分 靶向的抗原(例如fra)的癌症的方法。在各种实施方案中，提供杀死 肿瘤细胞或癌细胞或抑制其增殖的方法，其是通过施用治疗有效量和 /或方案的任一所述adc。另一方面包括使用所公开的adc检测表 达fra的肿瘤细胞或癌细胞的方法，和筛选对用所述adc治疗起反 应的癌症患者的方法。在一些实施方案中，癌症为胃癌、浆液性卵巢 癌、透明细胞卵巢癌、非小细胞肺癌、结肠直肠癌、三阴性乳腺癌、 子宫内膜癌、浆液性子宫内膜癌、肺类癌或骨肉瘤。还公开了产生所 述adc的方法。
33.图示简单说明
34.图1展示如某些实施方案中所公开，用于制备morab-003 adc 的一种方法。在此方法中，通过用有限摩尔当量的非硫醇还原剂tcep 部分还原，产生未配对的半胱氨酸。此方法优先还原连接轻链与重链 (每一h-l配对的一对)和铰链区中的两个重链(在人类igg1情况下每 一h-h配对的两对)的链间二硫键，而使链内二硫键完整。
35.图2展示如某些实施方案中所公开，合成顺丁烯二酰亚胺
ꢀ‑
(peg)
2-val-cit-pab-艾日布林(mal-(peg)
2-vcp-艾日布林)的方法。
36.图3展示morab-003的还原条件的sds-page分析。泳道指示 在图右侧。泳道m对应于标准蛋白质；泳道1对应于未经处理的 morab-003；泳道2对应于5.3mg/ml，70.6μm tcep中还原；泳 道3对应于morab-003 5.3mg/ml，141.2μm tcep中还原；泳道4 对应于morab-003 1.5mg/ml，20μm tcep中还原；且泳道5对应 于morab-003 1.5mg/ml，40μm tcep中还原。各亮带的身分指示 在右下凝胶上。“h”指示重链。“l”指示轻链。
37.图4展示morab-003的还原条件的sds-page分析。泳道1对 应于蛋白质标准；泳道2对应于未经处理的morab-003；泳道3对 应于以1:1的morab-003:tcep比率处理的morab-003；泳道4对 应于以1:2的morab-003:tcep比率处理的morab-003；泳道5对 应于以1:3的morab-003:tcep比率处理的morab-003；且泳道6 对应于以1:4的morab-003:tcep比率处理的morab-003。
38.图5展示所选morab-003 adc的非还原sds-page分析，包 括m-mmae(泳道2)、m-dm1(泳道3)、m-0026(泳道4)、m-0260(泳 道5)、m-0267(泳道6)、m-0272(泳道7)、m-0285(泳道8)、m-0292 (泳道9)、m-027-0381(泳道10)和m-0284(泳道11)。
morab-003-vcp-艾日布林(morab-202)处 理的负载nsclc pdx(lxfa-737)肿瘤的每组小鼠(组平均数和sem) 的肿瘤生长动力学(图19a)和体重改变动力学(图19b)。
53.图20a和20b展示用单静脉内剂量的pbs、0.1或3.2mg/kg艾 日布林或5mg/kg morab-003-vcp-艾日布林(morab-202)处理的负 载子宫内膜癌pdx(endo-12961)肿瘤的每组小鼠(组平均数和sem) 的个别肿瘤体积比(图20a)和体重改变动力学(图20b)。图20c和20d 展示用单静脉内剂量的pbs、0.1或3.2mg/kg艾日布林或5mg/kgmorab-003-vcp-艾日布林(morab-202)处理的负载子宫内膜癌 pdx(endo-10590)肿瘤的每组小鼠(组平均数和sem)的肿瘤生长动力 学(图20c)和体重改变动力学(图20d)。
54.图21a展示具有抗人类igg抗体的负载tnbcpdx(od-bre-0631)肿瘤的小鼠中肿瘤组织的免疫组织化学(ihc)染 色。收集来自用单静脉内剂量的媒介物(右)或5mg/kgmorab-003-vcp-艾日布林(morab-202)(左)处理的小鼠的肿瘤组织 并在处理后5天染色。图21b展示具有α-平滑肌肌动蛋白(sma)-fitc 抗体的负载tnbc pdx(od-bre-0631)肿瘤的小鼠中肿瘤组织的ihc 染色。在处理前2天，收集来自未经处理的小鼠的肿瘤组织(左)，而 处理后5天，收集来自用单静脉内剂量的5mg/kg morab-003-vcp
‑ꢀ
艾日布林(morab-202)处理的小鼠的肿瘤组织(右)。图21c展示用单 静脉内剂量的媒介物(pbs)或5mg/kg morab-003-vcp-艾日布林 (morab-202)处理的负载tnbc pdx(od-bre-0631)肿瘤的每组小 鼠(组平均数和sem)的肿瘤生长动力学。
55.图22展示如通过流动式细胞测量分析所测量，在用媒介物(pbs 或乙醇)、艾日布林、morab-003或morab-003-vcp-艾日布林 (morab-202)处理后，与mkn-74细胞一起培养的人类骨髓-间质干 细胞(bm-msc)的分化。stro-1

/cd105

、cd34

/cd31-和ng2

分别 为msc、脂肪细胞和周细胞的标记物。
56.图23展示来自用单静脉内剂量的媒介物(pbs)或5mg/kg morab-003-vcp-艾日布林(morab-202)处理的植入nci-h2110的 cb17-scid小鼠的肿瘤组织的时程分析，用α-平滑肌肌动蛋白 (sma)-fitc抗体染色。收集肿瘤组织且在第0天和处理后第3天、 第5天、第7天和第9天染色。y轴：％＝[计数的染色细胞/计数的 总细胞]
×
100。x轴：天数(计数的总细胞)。
[0057]
发明详述
[0058]
通过参考以下详细描述，以及形成本公开的一部分的附图，可以 更容易地理解所公开的组合物和方法。应了解所公开的组合物和方法 不局限于本文所述和/或所示的特定组合物和方法，且本文所用的术 语仅仅出于借助于实例描述特定实施方案的目的，且不意图限制所要 求的组合物和方法。
[0059]
本文通篇，描述提及组合物和使用所述组合物的方法。在本公开 描述或要求与组合物有关的特征或实施方案的情况下，这类特征或实 施方案同等适用于使用所述组合物的方法。同样，在本公开描述或要 求与使用组合物的方法有关的特征或实施方案的情况下，这类特征或 实施方案同等适用于所述组合物。
[0060]
当表述值的范围时，其包括使用所述范围内的任何特定值的实施 方案。此外，提及范围内所述的值包括所述范围内的每个值。所有范 围都包括其终点且可以组合。当通过利用前面的“约”，将值表述为近 似值时，应了解特定值形成另一实施方案。除非上下文另外清楚规定， 否则提及特定数值至少包括所述特定值。除非所使用的特定上下文另 外规
定，否则使用“或”将意指“和/或”。本文中引用的所有参考文献都 以引用的方式并入以达成任何目的。在参考文献与本说明书冲突的情 况下，将以本说明书为主。
[0061]
应了解，为清楚起见，在本文中单独实施方案的上下文中描述的 所公开组合物和方法的某些特征也可以组合提供于单个实施方案。相 反，为简便起见，在单个实施方案的上下文中描述的所公开的组合物 和方法的各种特征也可以分开或呈任何子组合提供。
[0062]
定义
[0063]
本说明书和权利要求书通篇使用与本描述的方面有关的各种术 语。除非另有指示，否则这类术语将给出其通常含义。其它特别定义 的术语将以符合本文中提供的定义的方式解释。
[0064]
如本文所用，除非上下文另外清楚规定，单数形式“一种(a/an)
”ꢀ
和“所述”包括复数形式。
[0065]
在数值和范围的上下文中术语“约”或“大约”是指约等于或接近 所述值或范围，使得实施方案可以如所欲执行，例如反应混合物中具 有所需量的核酸或多肽的值或范围，如技术人员从本文中所含的教示 内容显而易见。这至少部分归因于核酸组合物的改变特性、年龄、种 族、性别、解剖和生理变异和生物系统的不精密。因此，这些术语涵 盖除由系统误差产生的值以外的值。
[0066]
术语“抗体-药物偶联物”、“抗体偶联物”、“偶联物”、“免疫偶联 物”和“adc”可以互换使用，且是指连接于抗体(例如抗fra抗体)的 化合物或其衍生物，且定义为以下通式：ab-(l-d)
p
(式i)，其中ab＝ 抗体部分(即抗体或抗原结合片段)，l＝连接子部分，d＝药物部分， 且p＝每一抗体部分的药物部分数目。
[0067]
术语“抗体”以最广泛的意义使用，是指一种免疫球蛋白分子，其 通过免疫球蛋白分子的可变区内的抗原识别位点，识别和特异性结合 于标靶，例如蛋白质、多肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或上述组 合。抗体重链由重链可变域(vh)和重链恒定区(ch)组成。轻链由轻链 可变域(v
l
)和轻链恒定域(c
l
)组成。出于本应用的目的，成熟重链和 轻链可变域各包含在n端至c端排列的四个构架区(fr1、fr2、fr3 和fr4)内的三个互补决定区(cdr1、cdr2和cdr3)：fr1、cdr1、 fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4。“抗体”可以天然存在或是人造的， 例如通过常规杂交瘤技术产生的单克隆抗体。术语“抗体”包括全长单 克隆抗体和全长多克隆抗体，以及抗体片段，例如fab、fab'、f(ab')2、 fv和单链抗体。抗体可以为免疫球蛋白五种主要类别中的任一者： iga、igd、ige、igg和igm或其子类(例如同型igg1、igg2、igg3、 igg4)。所述术语进一步涵盖人类抗体、嵌合抗体、人源化抗体和含 有抗原识别位点的任何经修饰的免疫球蛋白分子，只要其显示所需生 物活性即可。
[0068]
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体获 得的抗体，即除了可能少量存在的可能天然存在的突变外，构成所述 群体的个别抗体都一致。单克隆抗体为高度特异性的，针对单个表位。 相反，常规(多克隆)抗体制剂通常包括针对不同表位(或对其具有特异 性)的众多抗体。修饰语“单克隆”指示抗体的特征为从基本上均质的 抗体群体获得，且不应解释为需要通过任何特定的方法产生所述抗 体。举例来说，根据本公开使用的单克隆抗体可以通过kohler等人 (1975)nature 256:495最先描述的杂交瘤方法制备，或可以通过重组 dna方法制备(参见例如美国专利no.4,816,567)。单克隆抗体也可以 从噬菌体抗体库使用例如clackson等人(1991)nature 352:624-8和 marks等人(1991)
3)。 使用本领域技术人员已知的常规技术获得抗原结合片段，且以与完整 抗体相同的方式，针对效用(例如结合亲和力、内在化)来筛选结合片 段。抗原结合片段可以通过例如用蛋白酶或化学裂解使完整蛋白质裂 解来制备。
[0074]
如本文关于抗体或抗原结合片段所用，“内化”是指在结合于细胞 时，能够通过细胞脂质双层膜至内部隔室(即“内化”)，优选至细胞中 的降解隔室中的抗体或抗原结合片段。举例来说，内化抗fra抗体 为在结合于细胞膜上的fra后能够进入细胞的抗体。
[0075]
如本文所用，术语“叶酸受体α”或“fra”是指人类fra的任何天 然形式。所述术语涵盖全长fra(例如ncbi参考序列：np_000793； seq id no:19)，以及由细胞加工产生的人类fra的任何形式。所述 术语还涵盖天然存在的fra变异体，包括(但不限于)剪接变异体、等 位基因变异体和同工型。fra可以从人类分离，或可以重组或通过 合成方法产生。
[0076]
术语“抗fra抗体”或“特异性结合fra的抗体”是指特异性结合 fra的任何形式的抗体或其片段，且涵盖单克隆抗体(包括全长单克 隆抗体)、多克隆抗体和生物功能抗体片段，只要所述片段特异性结 合fra即可。用于本文中公开的adc中的抗fra抗体优选为内化 抗体或内化抗体片段。morab-003为一种示例性内化抗人类fra抗 体。如本文所用，术语“特异性”、“特异性结合”和“特异性地结合”是 指抗体选择性结合于标靶表位。可以通过在给定的一组条件下，比较 结合于适当抗原与结合于不相关抗原或抗原混合物，来测试抗体的结 合特异性。如果抗体结合于适当抗原的亲和力比结合于不相关抗原或 抗原混合物的亲和力大至少2、5、7和优选10倍，那么其被视为特 异性。在一个实施方案中特异性抗体为仅结合fra抗原，而不结合(或 显示最低程度的结合)其它抗原的抗体。
[0077]
术语“人类表皮生长因子受体2”、“her2”或“her2/neu”是指人类 her2的任何天然形式。所述术语涵盖全长her2(例如ncbi参考序列： np_004439.2；seq id no:21)，以及由细胞加工产生的人类her2的 任何形式。所述术语还涵盖天然存在的her2变异体，包括(但不限于) 剪接变异体、等位基因变异体和同工型。her2可以从人类分离，或 可以重组或通过合成方法产生。
[0078]
术语“抗her2抗体”或“特异性结合her2的抗体”是指特异性结合 her2的任何形式的抗体或其片段，且涵盖单克隆抗体(包括全长单克 隆抗体)、多克隆抗体和生物功能抗体片段，只要所述片段特异性结 合her2即可。美国专利no.5,821,337(以引用的方式并入本文中)提供 示例性her2结合序列，包括示例性抗her2抗体序列。用于本文中公 开的adc中的抗her2抗体优选为内化抗体或内化抗体片段。曲妥珠 单抗(trastuzumab)为一种示例性内化抗人类her2抗体。
[0079]
术语“表位”是指能够被抗体识别且特异性结合的抗原部分。当抗 原为多肽时，表位可以由通过多肽三级折叠而并置的邻接氨基酸或非 邻接氨基酸形成。抗体所结合的表位可以使用本领域中已知的任何表 位定位技术鉴别，包括x射线晶体分析法，其通过将抗原-抗体复合 物直接可视化，以及监测抗体与抗原的片段或突变变体的结合，或监 测抗体和抗原的不同部分的溶剂可及性来鉴别表位。用于定位抗体表 位的示例性策略包括(但不限于)基于阵列的寡肽扫描、限制性蛋白酶 解、定点诱变、高通量诱变定位、氢-氘交换和质谱分析(参见例如 gershoni等人(2007)21:145-56；以及hager-braun和tomer(2005) expert rev.proteomics 2:745-56)。
[0080]
竞争性结合和表位分组也可以用于测定共享一致或重叠表位的 抗体。竞争性结
合可以使用交叉阻断测定，例如“antibodies,alaboratory manual，”cold spring harbor laboratory，harlow和lane(第 一版1988，第二版2014)中描述的测定来评估。在一些实施方案中， 当在交叉阻断测定中测试抗体或结合蛋白(例如包含选自表2、4和6 中鉴别的cdr和/或可变域的cdr和/或可变域的结合蛋白)使参考抗 体或结合蛋白与标靶抗原(例如fra或her2)的结合减少至少约50％ (例如50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.5％或更多，或 之间的任何百分比)时，和/或相反情况，确定竞争性结合。在一些实 施方案中，竞争性结合可以归因于共享或类似(例如部分重叠)的表位， 或归因于抗体或结合蛋白结合在附近表位的位阻。参见例如tzartos, methods in molecular biology(morris编辑(1998)第66卷,第55-66 页)。在一些实施方案中，竞争性结合可以用于将共享类似表位的结 合蛋白组分类，例如竞争结合的结合蛋白可以“分组”为具有重叠或接 近表位的一组结合蛋白，而不竞争的结合蛋白处于不具有重叠或接近 表位的另一组结合蛋白中。
[0081]
术语“k
on”或“k
a”是指抗体与抗原缔合形成抗体/抗原复合物的缔 合速率常数。可以使用标准测定，例如biacore或elisa测定来测定 此速率。
[0082]
术语“k
off”或“k
d”是指抗体从抗体/抗原复合物解离的解离速率常 数。可以使用标准测定，例如biacore或elisa测定来测定此速率。
[0083]
术语“k
d”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。kd由 ka/kd算得。可以使用标准测定，例如biacore或elisa测定来测定速 率。
[0084]
术语“p”或“抗体:药物比率”或“药物抗体比率”或“dar”是指每一 抗体部分的药物部分数目，即药物负载，或式i的adc中每一抗体 或抗原结合片段(ab)的-l-d部分数目。在包含多个拷贝的式i的adc 的组合物中，“p”是指每一抗体或抗原结合片段的-l-d部分的平均数 目，又称为平均药物负载。
[0085]“连接子”或“连接子部分”为能够将化合物，通常药物部分(例如化 学治疗剂)共价接合于另一部分(例如抗体部分)的任何化学部分。在化 合物或抗体保持活性的条件下连接子容易或基本上抵抗酸诱发性裂 解、肽酶诱发性裂解、基于光的裂解、酯酶诱发性裂解和/或二硫键 裂解。
[0086]
术语“剂”在本文中用以指化合物、化合物的混合物、生物大分子 或从生物物质工艺制得的提取物。术语“治疗剂”、“药物”或“药物部 分”是指能够调节生物过程和/或具有生物活性的药剂。
[0087]
术语“化学治疗剂”或“抗癌剂”在本文中用以指不管作用机制如 何，都有效治疗癌症的所有化合物。转移或血管生成的抑制时常为化 学治疗剂的特性。化学治疗剂的非限制性实例包括烷基化剂，例如氮 芥、伸乙基亚胺化合物和烷基磺酸酯；抗代谢物，例如叶酸、嘌呤或 嘧啶拮抗剂；抗有丝分裂剂，例如抗微管蛋白剂，例如艾日布林或艾 日布林甲磺酸盐(halaven
tm
)或其衍生物、长春花生物碱和奥瑞他汀 (auristatin)；细胞毒性抗生素；破坏或干扰dna表达或复制的化合物， 例如dna小沟结合剂；和生长因子受体拮抗剂。另外，化学治疗剂 包括抗体、生物分子和小分子。化学治疗剂可以为细胞毒性或细胞生 长抑制剂。术语“细胞生长抑制剂”是指抑制或遏制细胞生长和/或细胞 繁殖的剂。
[0088]
术语“细胞毒性剂”是指主要通过干扰细胞的表达活性和/或功能 而引起细胞死亡的物质。细胞毒性剂的实例包括(但不限于)抗有丝分 裂剂，例如艾日布林、奥瑞他汀(例如单甲基奥瑞他汀e(mmae)、 单甲基奥瑞他汀f(mmaf))、类美登素(maytansinoid)(例如美
登素 (maytansine))、海兔毒素(dolastatin)、多司他汀(duostatin)、念珠藻环 肽(cryptophycin)、长春花生物碱(例如长春新碱(vincristine)、长春花碱 (vinblastine))、紫杉烷(taxane)、紫杉醇(taxol)和秋水仙碱；蒽环类药 物(例如道诺霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、二羟基蒽二 酮(dihydroxyanthracindione))；细胞毒性抗生素(例如丝裂霉素 (mitomycin)、放线菌素(actinomycin)、倍癌霉素(duocarmycin)(例如 cc-1065)、金霉素(auromycin)、多霉素(duomycin)、卡奇霉素 (calicheamicin)、内孢霉素(endomycin)、酚霉素(phenomycin))；烷基 化剂(例如顺铂(cisplatin))；插入剂(例如溴化乙锭(ethidium bromide))； 拓扑异构酶抑制剂(例如依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide))； 放射性同位素，例如at
211
、i
131
、i
125
、y
90
、re
186
、re
188
、sm
153
、bi
212
或bi
213
、p
32
和镥的放射性同位素(例如lu
177
)；以及细菌、真菌、植 物或动物来源的毒素(例如蓖麻毒素(例如蓖麻毒素a链)、白喉毒素、 假单胞细菌外毒素a(例如pe40)、内毒素、米托菌素(mitogellin)、考 布他汀(combrestatin)、局限曲菌素(restrictocin)、白树毒素(gelonin)、α
‑ꢀ
八迭球菌、相思子毒素(例如相思子毒素a链)、蒴莲根毒素 (modeccin)(例如蒴莲根毒素a链)、达托霉素(curicin)、巴豆毒素、肥 皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、糖皮质激素)。
[0089]
如本文所用，术语“艾日布林”是指软海绵素b(最初从海绵冈田 软海绵(halichondria okadais)分离的大环化合物)的合成类似物。术语
ꢀ“
艾日布林药物部分”是指具有艾日布林结构并经由其c-35胺附接于 adc的连接子的adc的组分。艾日布林为微管动力学抑制剂，认为 其结合微管蛋白并通过抑制有丝分裂纺锤体组件，在g2/m期引起细 胞周期停滞。术语“艾日布林甲磺酸盐”是指艾日布林的甲磺酸盐，其 以商品名halaven
tm
出售。
[0090]
术语“同源性”是指通过例如具有在对应位置相同或类似的化学 残基的序列，显示与另一分子的同源性的分子。
[0091]
如本文所用，术语“抑制(inhibit或inhibition)”意指减少可测量的 量，且可以包括但不需要完全预防或抑制。
[0092]
术语“标靶阴性”或“标靶抗原阴性”是指细胞或组织缺乏标靶抗 原表达。术语“标靶阳性”或“标靶抗原阳性”是指存在标靶抗原表达。 举例来说，不表达标靶抗原的细胞或细胞系可以被描述为标靶阴性， 而表达标靶抗原的细胞或细胞系可以被描述为标靶阳性。
[0093]
术语“旁观杀死”或“旁观者效应”是指在标靶阳性细胞存在下杀 死标靶阴性细胞，其中在标靶阳性细胞缺乏下未观察到标靶阴性细胞 的杀死。细胞-细胞接触或标靶阳性与标靶阴性细胞之间至少邻近能 够进行旁观杀死。这类杀死可同“脱靶杀死”区分，脱靶杀死是指标靶 阴性细胞的无差别杀死。可以在标靶阳性细胞缺乏下观察到“脱靶杀 死”。
[0094]
术语“癌症”是指哺乳动物中细胞群体的特征为不受调控的细胞 生长的生理病状。癌症的实例包括(但不限于)癌瘤、淋巴瘤、胚细胞 瘤、肉瘤和白血病。这类癌症的更特定实例包括鳞状上皮细胞癌、小 细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞 癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀 胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、骨肉瘤、黑素瘤、结 肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜(例如浆液小)或子宫癌、唾液腺癌、肾 癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各类头颈癌。三阴 性乳腺癌是指对于雌激素受体(er)、孕酮受体(pr)或her2/neu的基因 的表达呈阴性的乳
腺癌。
[0095]
术语“肿瘤”和“赘生物”是指由良性或恶性的过度细胞生长或增 殖产生的任何组织块，包括癌前病变。
[0096]
术语“癌细胞”和“肿瘤细胞”是指来源于肿瘤的个别细胞或细胞 总群体，包括非致癌细胞与癌症干细胞。如本文所用，当仅仅提及无 法更新和分化的那些肿瘤细胞时术语“肿瘤细胞”将由术语“非致瘤 性”修饰，以区分那些肿瘤细胞与癌症干细胞。
[0097]
术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，是指任何动物，例 如任何哺乳动物，包括(但不限于)人类、非人类灵长类动物、啮齿类 动物等等。在一些实施方案中，哺乳动物为小鼠。在一些实施方案中， 哺乳动物为人类。
[0098]
术语“共同施用”或“组合”一种或多种治疗剂施用包括以任何次 序同时和连续施用。
[0099]“药物组合物”是指呈允许施用并随后提供活性成分的所欲生物 活性和/或实现治疗作用的形式且不含毒性为制剂所投受试者无法接 受的其它组分的制剂。药物组合物可以为无菌的。
[0100]“药物赋形剂”包含例如佐剂、载体、ph调整和缓冲剂、张力调 整剂、润湿剂、防腐剂等物质。
[0101]“药学上可接受”意指经或能够经联邦政府或州政府的管理机构 批准，或美国药典或其它公认药典中所列，用于动物中且更尤其用于 人类中。
[0102]
如本文中公开的adc的“有效量”为足够执行特别说明的目的， 例如在施用后产生治疗作用，例如降低肿瘤生长速率或肿瘤体积、减 少癌症症状或治疗功效的一些其它征候的量。有效量可以用关于所述 目的的常规方式测定。术语“治疗有效量”是指有效治疗受试者的疾病 或病症的adc的量。在癌症情况下，治疗有效量的adc可以减少 癌细胞数目，减小肿瘤尺寸，抑制(例如减慢或终止)肿瘤转移，抑制(例 如减慢或终止)肿瘤生长，和/或减轻一种或多种症状。“预防有效量
”ꢀ
是指在必需的剂量下和时间段内有效实现预防结果所需的量。通常， 因为在患病前或在疾病早期，预防剂量用于受试者中，所以预防有效 量将小于治疗有效量。
[0103]
如本文所用，“治疗(treat)”或“治疗(therapeutic)”和语法上相关的 术语是指任何疾病后果的任何改善，例如存活期延长、发病率较小和 /或作为替代治疗方式的副产物的副作用减轻。如本领域中容易了解， 疾病完全根除为优选的，但并不是治疗行为的必要条件。如本文所用，
ꢀ“
治疗(treatment或treat)”是指向受试者(例如患者)施用所述adc。治 疗可以为治愈、医治、缓和、减轻、改变、医治、改善、减弱、好转 或影响病症、病症的症状或例如癌症的患病倾向性。
[0104]
在一些实施方案中，使用标记的adc。合适“标记”包括放射性 核素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光部分、化学发光部分、磁性 颗粒等。
[0105]
如本文所用，“蛋白质”意指至少两个共价附接的氨基酸。所述术 语涵盖多肽、寡肽和肽。在一些实施方案中，两个或更多个共价附接 的氨基酸通过肽键附接。例如当蛋白质使用表达系统和宿主细胞重组 制造时，蛋白质可以由天然存在的氨基酸和肽键组成。或者，蛋白质 可以包括合成氨基酸(例如高苯丙氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸和正亮氨酸) 或肽模拟结构，即“肽或蛋白质类似物”，例如类肽。类肽为肽模拟物 的一种示例性类别，其侧链侧接
val-cit连接子)的adc构筑体展现意外有利的药物负载、聚集和/或 稳定性型态，和/或保留抗体结合功能、药物活性和/或改善的旁观杀 死，同时减少脱靶杀死。
[0119]
在一些实施方案中，与将艾日布林接合于抗体部分的其它可裂解 或不可裂解连接子相比，包含将艾日布林接合于抗体(例如抗fra抗 体，例如morab-003)的mal-(peg)
2-val-cit-pab连接子的adc显 示所列种类中的尤其有利的特性。在一些实施方案中，与不可裂解 adc相比，包含将艾日布林接合于抗体(例如抗fra抗体，例如 morab-003)的mal-(peg)
2-val-cit-pab连接子的adc显示尤其有利 的旁观杀死特性。在一些实施方案中，与使用替代的可裂解连接子结 构的adc相比，包含将艾日布林接合于抗体(例如抗fra抗体，例 如morab-003)的mal-(peg)
2-val-cit-pab连接子的adc显示尤其 有利的旁观杀死特性。
[0120]
在一些实施方案中，相对于例如包含经由替代部分(例如丁二酰 亚胺部分)附接于抗体的连接子的adc，包含将艾日布林接合于 morab-003的mal-(peg)
2-val-cit-pab连接子的adc显示更高且更 合乎需要的药物:抗体比率(即约3-4的比率)。在一些实施方案中，相 对于例如包含更长间隔子单元(例如(peg)8)的adc，包含将艾日布林 接合于morab-003的mal-(peg)
2-val-cit-pab连接子的adc显示 更高且更合乎需要的药物:抗体比率和/或更低的聚集水平。在一些实 施方案中，相对于例如包含替代的可裂解部分(即非肽可裂解部分， 例如可裂解二硫化物或磺酰胺)的adc，包含将艾日布林接合于morab-003的mal-(peg)
2-val-cit-pab的adc显示更高且更合乎需 要的药物:抗体比率、更低的聚集水平、增加的靶向杀死和/或减少的 脱靶杀死。在一些实施方案中，相对于例如包含替代的氨基酸单元(例 如ala-ala-asn)或替代的可裂解部分(例如可裂解二硫化物或磺酰胺) 的adc，包含将艾日布林接合于morab-003的 mal-(peg)
2-val-cit-pab连接子的adc显示增加的稳定性、增加的 靶向杀死、减少的脱靶杀死、更低的聚集水平和/或更高且更合乎需 要的药物:抗体比率。
[0121]
在一些实施方案中，以上针对包含将艾日布林接合于 morab-003的mal-(peg)
2-val-cit-pab连接子的adc所述的一些或 所有合乎需要的特征可以在包含结合于her2抗体(例如曲妥珠单抗) 或抗间皮素抗体的mal-(peg)
2-val-cit-pab-艾日布林连接子-毒素的 adc下观察到。
[0122]
本公开的adc化合物可以选择性地递送有效剂量的细胞毒性或 细胞生长抑制剂至癌细胞或肿瘤组织。已经发现所公开的adc针对 表达各自的标靶抗原(例如fra或her2)的细胞具有有效的细胞毒性 和/或细胞抑制活性。在一些实施方案中，adc的细胞毒性和/或细胞 抑制活性取决于细胞中标靶抗原的表达水平。在一些实施方案中，与 以低水平表达相同抗原的癌细胞比，所公开的adc尤其有效地杀死 以高水平表达标靶抗原的癌细胞。在一些实施方案中，与以低水平表 达相同抗原的癌细胞比，所公开的adc尤其有效地杀死以中等水平 表达标靶抗原的癌细胞。示例性高fra表达癌症包括(但不限于)卵巢 癌(例如浆液性卵巢癌、透明细胞卵巢癌)、肺类癌瘤、三阴性乳腺癌、 子宫内膜癌和非小细胞肺癌(例如腺癌)。示例性中等fra表达癌症包 括(但不限于)胃癌和结肠直肠癌。示例性低fra表达癌症包括(但不 限于)黑素瘤和淋巴瘤。示例性高her2表达癌症包括(但不限于)乳腺 癌、胃癌、食道癌、卵巢癌和子宫内膜癌。示例性中等her2表达癌 症包括(但不限于)肺癌和膀胱癌。
[0123]
在一些实施方案中，adc的裂解从抗体部分和连接子释放艾日 布林。在一些实施方案中，艾日布林的裂解和释放提高adc的细胞 毒性。在一些实施方案中，与用包含不可裂解连接子的adc的可比 较治疗相比，包含可裂解连接子的adc尤其有效地杀死癌细胞，包 括旁观杀死。在一些实施方案中，相对于包含不可裂解连接子(例如 不可裂解(peg)2或(peg)4连接子)的adc，尤其在用adc治疗的细 胞和/或癌症未表达高水平标靶抗原下，包含可裂解连接子(例如 val-cit连接子)的adc显示增加的靶向杀死和/或减少的脱靶杀死。
[0124]
在一些实施方案中，所公开的adc还显示旁观杀死活性，但脱 靶细胞毒性低。不受理论束缚，adc的旁观杀死活性在其渗透至实 体肿瘤有限和/或肿瘤细胞中标靶抗原表达不均匀的情况下可能尤其 有益。在一些实施方案中，与用包含不可裂解连接子的adc的可比 较治疗相比，包含可裂解连接子的adc尤其有效地进行旁观杀死和/ 或显示改善的旁观杀死活性。
[0125]
本文中提供adc化合物，其包含靶向肿瘤细胞的抗体或其抗原 结合片段(ab)、药物部分(d)和将ab共价附接于d的连接子部分(l)。 在某些方面中，抗体或抗原结合片段能够以高特异性和高亲和力结合 于肿瘤相关抗原(例如fra或her2)。在某些实施方案中，抗体或抗原 结合片段在结合时内化至标靶细胞，例如内化至细胞中的降解隔室 中。因此，优选adc为在结合时内化至标靶细胞，经历降解，且释 放药物部分以杀死癌细胞的adc。药物部分可以通过酶促作用、水 解、氧化或任何其它机制，从adc的抗体和/或连接子部分释放。
[0126]
一种示例性adc具有式i
[0127]
ab-(l-d)
p
ꢀꢀꢀ(i)[0128]
其中ab＝抗体部分(即抗体或抗原结合片段)，l＝连接子部分， d＝药物部分，且p＝每一抗体部分的药物部分数目。
[0129]
抗体
[0130]
式i的抗体部分(ab)在其范围内包括特异性结合于癌细胞上标靶 抗原的任何抗体或抗原结合片段。如例如分析所测量，抗 体或抗原结合片段可以在离解常数(kd)≤1mm、≤100nm或≤10nm或 其间的任何量结合于标靶抗原。在某些实施方案中，kd为1pm至 500pm。在一些实施方案中，kd在500pm至1μm、1μm至100nm 或100mm至10nm之间。
[0131]
在一些实施方案中，抗体部分为包含两个重链和两个轻链的四链 抗体(又称为免疫球蛋白)。在一些实施方案中，抗体部分为两链半体 (一个轻链和一个重链)或免疫球蛋白的抗原结合片段。
[0132]
在一些实施方案中，抗体部分为内化抗体或其内化抗原结合片 段。在一些实施方案中，内化抗体结合于在细胞表面上表达的标靶癌 症抗原且在结合时进入细胞。在一些实施方案中，在adc进入且存 在于表达标靶癌症抗原的细胞后(即在adc已内化后)，adc的药物 部分从adc的抗体部分释放。
[0133]
本公开的示例性抗体的氨基酸和核酸序列阐述于表1-9中。
[0134]
表1.抗体
[0135][0136][0137]
缩写：xi-嵌合；zu-人源化。
[0138]
表2.mab可变区的氨基酸序列
[0139]
[0140]
[0141]
[0142][0143]
表3.编码mab可变区的核酸序列
[0144]
[0145]
[0146]
[0147]
[0148]
[0149]
[0150]
[0151][0152]
表4.mab kabat cdr的氨基酸序列
[0153]
[0154]
[0155][0156]
表5.编码mab kabat cdr的核酸序列
[0157]
[0158]
[0159]
[0160]
[0161][0162]
表6.mab imgt cdr的氨基酸序列
[0163]
[0164]
[0165][0166]
表7.编码mab imgt cdr的核酸序列
[0167]
[0168]
[0169]
[0170][0171]
表8.全长mab ig链的氨基酸序列
[0172]
[0173]
[0174]
[0175]
[0176]
[0177]
[0178][0179]
表9.编码全长mab ig链的核酸序列

[0180]
[0181]
[0182]
[0183]
[0184]
[0185]
[0186]
[0187]
[0188]
[0189]
[0190]
[0191]
[0192]
[0193]
[0194]
[0195]
[0196]
的轻链氨基酸序列，或与以上所提及的序列至少95％同一的序列。在 一些实施方案中，抗fra抗体具有与seq id no：1至少96％、至少 97％、至少98％或至少99％同一的重链氨基酸序列，和/或与seq idno：6至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的轻链氨基酸 序列。在一些实施方案中，抗fra抗体包含由seq id no：11(具有 编码前导序列的核苷酸)或seq id no：345(不具有编码前导序列的 核苷酸)的核苷酸序列编码的重链；和由seq id no：12(具有编码前 导序列的核苷酸)或seq id no：346(不具有编码前导序列的核苷酸) 的核苷酸序列编码的轻链。在一些实施方案中，重链氨基酸序列缺乏 c端赖氨酸。在各种实施方案中，抗fra抗体具有由根据布达佩斯 条约(the budapest treaty)的条款于2006年4月24日以登记号 pta-7552保藏在美国典型培养物保藏中心(atcc，保藏单位地址为 美国弗吉尼亚州20110-2209，马纳萨斯10801 university blvd.， manassas，va.20110-2209)的细胞系(生物材料分类命名为中国仓鼠 卵巢细胞系：mor-cho-morab-003-rcb)产生的抗体的氨基酸 序列，或缺乏重链c端赖氨酸的这类序列。在各种实施方案中，抗 fra抗体为morab-003(usan名称：法乐单抗(farletuzumab))(ebel 等人(2007)cancer immunity 7：6)或其抗原结合片段。
[0206]
在各种其它实施方案中，adc的标靶癌症抗原为人类表皮生长 因子受体2(“her2”)。
[0207]
在各种实施方案中，抗her2抗体或其抗原结合片段包含如下三 个重链cdr和三个轻链cdr：由seq id no:71组成的重链cdr1 (hcdr1)、由seq id no:72组成的重链cdr2(hcdr2)、由seq idno:73组成的重链cdr3(hcdr3)；由seq id no:74组成的轻链 cdr1(lcdr1)、由seq id no:75组成的轻链cdr2(lcdr2)和由 seq id no:76组成的轻链cdr3(lcdr3)，如kabat编号系统所定 义。
[0208]
在一些实施方案中，抗her2抗体或其抗原结合片段包含如下三 个重链cdr和三个轻链cdr：由seq id no:191组成的重链cdr1、 由seq id no:192组成的重链cdr2、由seq id no:193组成的重链 cdr3；由seq id no:194组成的轻链cdr1、由seq id no:195组 成的轻链cdr2和由seq id no:196组成的轻链cdr3，如imgt编 号系统所定义。
[0209]
在各种实施方案中，抗her2抗体或其抗原结合片段包含有包含 seq id no:27的氨基酸序列的重链可变区和包含seq id no:28的 氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗her2抗体或其抗 原结合片段包含seq id no:27的重链可变区氨基酸序列和seq id no:28的轻链可变区氨基酸序列，或与以上所提及的序列至少95％同 一的序列。在一些实施方案中，抗her2抗体或其抗原结合片段具有 与seq id no:27至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的 重链可变区氨基酸序列和/或与seq id no:28至少96％、至少97％、 至少98％或至少99％同一的轻链可变区氨基酸序列。
[0210]
在各种实施方案中，抗her2抗体包含人类igg1重链恒定域和人 类igκ轻链恒定域。
[0211]
在各种实施方案中，抗her2抗体包含seq id no:327的重链氨 基酸序列或与seq id no:327至少95％同一的序列，和seq idno:328的轻链氨基酸序列或与seq id no:328至少95％同一的序 列。在特定实施方案中，抗体包含seq id no:327的重链氨基酸序列 和seq id no:328的轻链氨基酸序列，或与以上所提及的序列至少 95％同一的序列。在一些实施方案中，抗her2抗体具有与seq idno:327至少96％、至少97％、至少98％或至少99％
同一的重链氨基 酸序列，和与seq id no:328至少96％、至少97％、至少98％或至 少99％同一的轻链氨基酸序列。在各种实施方案中，抗her2抗体为 曲妥珠单抗或其抗原结合片段。
[0212]
在各种实施方案中，抗fra抗体或其抗原结合片段包含 morab-003的三个重链cdr和三个轻链cdr，或其中cdr包括以 下各cdr的至多一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸添加、 缺失或取代：hcdr1(根据kabat的seq id no:2，或根据imgt的 seq id no:13)、hcdr2(根据kabat的seq id no:3，或根据imgt 的seq id no:14)、hcdr3(根据kabat的seq id no:4，或根据imgt 的seq id no:15)；lcdr1(根据kabat的seq id no:7，或根据imgt 的seq id no:16)、lcdr2(根据kabat的seq id no:8，或根据imgt 的seq id no:17)和lcdr3(根据kabat的seq id no:9，或根据 imgt的seq id no:18)。
[0213]
在各种其它实施方案中，抗her2抗体或其抗原结合片段包含曲 妥珠单抗的三个重链cdr和三个轻链cdr，或其中cdr包括以下 各cdr的至多一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸添加、 缺失或取代：hcdr1(根据kabat的seq id no:71，或根据imgt 的seq id no:191)、hcdr2(根据kabat的seq id no:72，或根据 imgt的seq id no:192)、hcdr3(根据kabat的seq id no:73， 或根据imgt的seq id no:193)；lcdr1(根据kabat的seq idno:74，或根据imgt的seq id no:194)、lcdr2(根据kabat的seqid no:75，或根据imgt的seq id no:195)和lcdr3(根据kabat 的seq id no:76，或根据imgt的seq id no:196)。
[0214]
在各种实施方案中，氨基酸取代为单个残基。插入通常将为约1 个至约20个氨基酸残基，不过只要保留生物功能(例如结合于fra 或her2)，可以允许更大插入。缺失通常在约1个至约20个氨基酸残 基范围内，不过在一些情况下缺失可以大得多。取代、缺失、插入或 其任何组合可以用于得到最终衍生物或变异体。一般来说，对一些氨 基酸进行这些改变，以使分子的改变最少，尤其抗原结合蛋白的免疫 原性和特异性。然而，在某些情形下，可以允许较大的改变。根据以 下描述为表10的图表，进行保守性取代。
[0215]
表10
[0216]
[0217][0218]
通过选择不如表10中所示的取代保守的取代，使得功能或免疫 同一性发生实质改变。举例来说，可以制造更显著地影响以下的取代： 在改变区域内的多肽主链的结构，例如α-螺旋或β-片状结构；分子 在标靶位点的电荷或疏水性；或侧链的体积。一般预期使多肽特性产 生最大改变的取代为如下取代：(a)例如丝氨酰基或苏氨酰基的亲水性 残基取代例如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨 酰基的疏水性残基(或经其取代)；(b)半胱氨酸或脯氨酸取代任何其它 残基(或经其取代)；(c)具有正电性侧链的残基(例如赖氨酰基、精氨酰 基或组氨酰基)取代负电性残基(例如谷氨酰基或天冬氨酰基)(或经其 取代)；或(d)具有大体积侧链的残基(例如苯丙氨酸)取代不具有侧链的 残基(例如甘氨酸)(或经其取代)。
[0219]
在变异抗体序列用于adc的各种实施方案中，变异体通常展现 相同的定性生物活性并引起相同的免疫反应，不过需要时也可以选择 改变抗原结合蛋白的特征的变异体。可替代地，变异体可以设计成改 变抗原结合蛋白的生物活性。举例来说，如本文中论述，可以改变或 去除糖基化位点。
[0220]
各种抗体可以用于本文中使用的adc来靶向癌细胞。如下所示， 本文中公开的adc中的连接子-毒素在不同肿瘤抗原靶向抗体下惊 人地有效。本领域中已知在肿瘤细胞上而非健康细胞上表达或在肿瘤 细胞上的表达水平高于健康细胞上的合适抗原，还已知针对其的抗 体。这些抗体可以用于本文中公开的连接子和毒素(例如艾日布林)。 在一些实施方案中，抗体部分靶向fra。在一些实施方案中，靶向fra的抗体部分为morab-003。在一些实施方案中，虽然所公开的 连接子和毒素(艾日布林)在若干不同肿瘤靶向抗体下惊人地有效，但 例如morab-003的靶向fra的抗体部分尤其改善药物:抗体比率、 肿瘤靶向、旁观杀死、治疗功效且减少脱靶杀死。改善的治疗功效可 以在体外或体内测量，且可以包括肿瘤生长速率降低和/或肿瘤体积 减小。
[0221]
在某些实施方案中，使用针对其它抗原标靶的抗体且提供包含靶 向fra的抗体部分(例如morab-003)的adc的至少一些有利的功 能特性(例如改善的药物:抗体比率、改善的治疗功效、减少的脱靶杀 死等等)。在一些实施方案中，当所公开的连接子和毒素(艾日布林) 结合于靶向her2的抗体部分(例如曲妥珠单抗)时，观察到一些或所有 这些有利的功能特性。在一些实施方案中，抗体部分靶向her2。在一 些实施方案中，靶向her2的抗体部分为曲妥珠单抗。在一些实施方 案中，当所公开的连接子和毒素(艾日布林)结合于靶向msln的抗体 部分(例如morab-009)时，观察到一些或所有这些有利的功能特性。 在一些实施方案中，抗体部分靶向msln。在一些实施方案中，靶向 msln的抗体部分为morab-009。
[0222]
连接子
[0223]
在各种实施方案中，adc中的连接子在细胞外足够稳定，从而 治疗有效。在一些实施方案中，连接子在细胞外稳定，使得adc在 存在于细胞外条件下时保持完整(例如在输送或递送至细胞前)。在 adc的背景下使用的术语“完整”意指抗体部分保持附接于药物部分。 如本文所用，当adc存在于细胞外条件下时，在连接子或包含连接 子的adc的背景下“稳定”意指adc样品中至多20％、至多15％、 至多10％、至多5％、至多3％或至多约1％连接子(或其间的任何百分 比)裂解(或在整个adc的情况下，以其它方式不完整)。
[0224]
可以例如通过在血浆中包括adc达预定时间段(例如2、4、6、8、16或24小时)，然后对血浆中存在的游离药物部分的量进行定量， 来确定连接子在细胞外是否稳定。稳定性可以允许adc按时定位至 靶向肿瘤细胞且防止药物提前释放，药物提前释放可以通过无差别地 破坏正常组织与肿瘤组织而降低adc的治疗指数。在一些实施方案 中，连接子在标靶细胞外稳定且一旦在细胞内，那么从adc释放药 物部分，使得药物部分可以结合于其标靶(例如微管)。因此，有效连 接子将：(i)维持抗体部分的特异性结合特性；(ii)允许药物部分经由稳 定附接于抗体部分而递送、例如细胞内递送；(iii)保持稳定和完整， 直至adc已输送或递送至其标靶位点；和(iv)允许药物部分在裂解后 具有治疗作用，例如细胞毒性作用。
[0225]
连接子可以影响adc的物理化学特性。因为许多细胞毒性剂在 本质上为疏水性的，所以用另一疏水性部分将其连接于抗体可能引起 聚集。adc聚集体不能溶解并经常限制抗体上能够实现的药物负载， 这可能负面影响adc的效力。一般来说，还连接生物制品的蛋白质 聚集体以增加免疫原性。如下所示，本文中公开的连接子产生具有低 聚集水平和合乎需要的药物负载水平的adc。
[0226]
连接子可以为“可裂解”或“不可裂解”(ducry和stump, bioconjugate chem.(2010)21:5-13)。可裂解连接子被设计成在经受某 些环境因子时，例如在内化至标靶细胞时，释放药物，而不可裂解连 接子一般依赖于抗体部分本身的降解。
[0227]
在一些实施方案中，连接子为不可裂解连接子。在一些实施方案 中，adc的药物部分通过抗体部分的降解而释放。不可裂解连接子 趋向于在标靶细胞内化和在标靶细胞内降解时保持与抗体和药物的 至少一个氨基酸共价缔合。不可裂解连接子通常包括硫醚键，硫醚键 通过药物或抗体上的硫醇基分别与抗体或药物上的顺丁烯二酰亚胺 基或卤乙酰胺基结合来制备(goldmacher等人,cancer drug discoveryand development:antibody-drug conjugates and immunotoxins(g.l. phillips编,springer,2013))。一种示例性不可裂解连接子包含硫醚、 环己基、4-(n-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1甲酸n-丁二酰亚胺基 酯(smcc)、n-羟基丁二酰亚胺(nhs)或一个或多个聚乙二醇(peg)部 分，例如1、2、3、4、5或6个peg部分。在一些实施方案中，不 可裂解连接子包含(peg)2。在其它实施方案中，不可裂解连接子包含 (peg)4。
[0228]
在一些实施方案中，连接子为可裂解连接子。可裂解连接子是指 包含可裂解部分的任何连接子。如本文所用，术语“可裂解部分”是指 可裂解的任何化学键。合适可裂解化学键为本领域中众所周知，且包 括(但不限于)对酸不稳的键、对蛋白酶/肽酶不稳的键、对光不稳的键、 二硫键和对酯酶不稳的键。包含可裂解部分的连接子可以允许药物部 分经由连接子中的特定位点裂解从adc释放。在各种实施方案中， 抗体从连接的毒素裂解活化或增加毒素的活性。在一些实施方案中， 与包含不可裂解连接子(例如不可裂解(peg)2或(peg)4连接子)的 adc相比，包含可裂解连接子(例如val-cit连接子)的adc显示增加 的靶
向细胞杀死和/或减少的脱靶细胞杀死。在一些实施方案中，当 用adc治疗的细胞和/或癌症未表达高水平标靶抗原(例如fra或 her2)时，相对于包含不可裂解连接子的adc，包含可裂解连接子的 adc显示改善的治疗功效。在一些实施方案中，需要抗体从连接的 毒素裂解以实现如体外和/或体内所测量，adc改善的治疗功效。
[0229]
在一些实施方案中，连接子在细胞内条件下能够裂解，使得连接 子的裂解足够在细胞内环境中从抗体部分释放药物部分，以活化药物 和/或使药物治疗有效。在一些实施方案中，直至adc进入表达对 adc的抗体部分具有特异性的抗原的细胞时，药物部分才从抗体部 分裂解，并在进入细胞时药物部分从抗体部分裂解。在一些实施方案 中，连接子包含被定位成使得所述连接子或所述抗体部分中没有部分 在裂解后保持结合于药物部分的可裂解部分。示例性可裂解连接子包 括对酸不稳的连接子、对蛋白酶/肽酶敏感的连接子、对光不稳的连 接子、含有二甲基、二硫化物或磺酰胺的连接子。
[0230]
在一些实施方案中，连接子为ph值敏感性连接子，且容易在某 些ph值下水解。通常，ph值敏感性连接子在酸性条件下能够裂解。 此裂解策略一般利用与细胞溶质(约ph 7.4)相比，内体(约ph 5-6)和 溶酶体(约ph 4.8)细胞内隔室中较低的ph值，以引发连接子中对酸 不稳的基团(例如腙)水解(jain等人(2015)pharm res 32:3526-40)。在 一些实施方案中，连接子为对酸不稳和/或可水解的连接子。举例来 说，可以使用在溶酶体中可水解且含有对酸不稳的基团(例如腙、缩 氨基脲、缩氨硫脲、顺式-乌头酰胺、原酸酯、缩醛、缩酮等等)的对 酸不稳的连接子。参见例如美国专利no.5,122,368；5,824,805； 5,622,929；dubowchik和walker(1999)pharm.therapeutics 83:67-123； neville等人(1989)biol.chem.264:14653-61。这类连接子在中性ph 值条件，例如血液中的ph值条件下相对稳定，但在低于ph 5.5或 5.0(接近溶酶体的ph值)下不稳定。在某些实施方案中，可水解连接 子为硫醚连接子(例如经由酰腙键附接于治疗剂的硫醚)。参见例如美 国专利no.5,622,929。
[0231]
在一些实施方案中，连接子在还原条件下可裂解。在一些实施方 案中，连接子在例如谷胱甘肽或二硫苏糖醇的还原剂存在下能够裂 解。在一些实施方案中，连接子为可裂解二硫化物连接子或可裂解磺 酰胺连接子。
[0232]
在一些实施方案中，连接子为可裂解二硫化物连接子。本领域中 已知多种二硫化物连接子，包括例如可以使用sata(n-丁二酰亚胺 基-5-乙酰基硫代乙酸酯)、spdp(n-丁二酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基) 丙酸酯)、spdb(n-丁二酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯)和 smpt(n-丁二酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫基)甲苯)、 spdb和smpt形成的二硫化物连接子。参见例如thorpe等人(1987) cancer res.47:5924-31；wawrzynczak等人,immunoconjugates: antibody conjugates in radioimagery and therapy of cancer(c.w. vogel编,oxford u.press，1987)。又参见美国专利no.4,880,935。二 硫化物连接子通常用于利用大量细胞内硫醇，硫醇可以促进其二硫键 的裂解。最丰富的细胞内硫醇还原谷胱甘肽的细胞内浓度一般在1-10 nm范围内，约为血液中最丰富的低分子量硫醇(即半胱氨酸)的浓度 (约5μm)的1,000倍(goldmacher等人，cancer drug discovery anddevelopment:antibody-drug conjugates and immunotoxins(g.l. phillips编,springer,2013))。蛋白质二硫化物异构酶家族的胞内酶也 可以促进二硫化物连接子的细胞内裂解。如本文所用，可裂解二硫化 物连接子是指包含可裂解二硫化物部
分的任何连接子。术语“可裂解 二硫化物部分”是指可以例如通过硫醇或酶裂解和/或还原的二硫键。 在一些实施方案中，可裂解二硫化物部分为二硫基-二甲基。
[0233]
在一些实施方案中，连接子为可裂解磺酰胺连接子。如本文所用， 可裂解磺酰胺连接子是指包含可裂解磺酰胺部分的任何连接子。术语
ꢀ“
可裂解磺酰胺部分”是指磺酰胺基，即连接于胺基的磺酰基，其中硫
ꢀ‑
氮键可以裂解。
[0234]
在一些实施方案中，连接子可以为树枝状类型连接子，其通过分 支的多官能连接子部分将超过一个药物部分共价附接于抗体部分。参 见例如sun等人(2002)bioorg.med.chem.lett.12:2213-5；sun等人 (2003)bioorg.med.chem.11:1761-8。树枝状连接子可以增加药物比 抗体的摩尔比，即药物负载，其与adc的效力有关。因此，在抗体 部分仅载有一个例如反应性半胱氨酸硫醇基的情况下，众多药物部分 可以通过树枝状连接子附接。在一些实施方案中，连接子部分或连接 子-药物部分可以经由还原二硫桥化学或限制性赖氨酸利用技术附接 于抗体。参见例如intl.publ.no.wo2013173391和wo2013173393。
[0235]
在一些实施方案中，连接子可以通过例如酶的存在于细胞内环境 中(例如溶酶体或内体或质膜微囊)的裂解剂裂解。连接子可以为例如 通过细胞内肽酶或蛋白酶(包括(但不限于)溶酶体或内体蛋白酶)裂解 的肽连接子。在一些实施方案中，连接子为可裂解肽连接子。如本文 所用，可裂解肽连接子是指包含可裂解肽部分的任何连接子。术语“可 裂解肽部分”是指可以通过存在于细胞内环境中的试剂裂解的任何化 学键连接的氨基酸(天然或合成氨基酸衍生物)。举例来说，连接子可 以包含能够通过肽酶(例如组织蛋白酶，例如组织蛋白酶b)裂解的丙 氨酸-丙氨酸-天冬酰胺(ala-ala-asn)序列或缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)序 列。
[0236]
在一些实施方案中，连接子为酶能够裂解的连接子且连接子中的 可裂解肽部分能够由酶裂解。在一些实施方案中，可裂解肽部分能够 由溶酶体酶(例如组织蛋白酶)裂解。在一些实施方案中，连接子为组 织蛋白酶能够裂解的连接子。在一些实施方案中，连接子中的可裂解 肽部分可以由溶酶体半胱氨酸组织蛋白酶(例如组织蛋白酶b、c、f、 h、k、l、o、s、v、x或w)裂解。在一些实施方案中，可裂解肽 部分能够由组织蛋白酶b裂解。能够由组织蛋白酶b裂解的一种示 例性二肽为缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)(dubowchik等人(2002) bioconjugate chem.13:855-69)。在一些实施方案中，相对于包含替代 可裂解部分(例如可裂解二硫化物部分或可裂解磺酰胺部分)的adc， 包含可裂解肽部分的adc显示较低的聚集水平，和/或较高的药物负 载(p)。
[0237]
在一些实施方案中，连接子或连接子中的可裂解肽部分包含氨基 酸单元。在一些实施方案中，所述氨基酸单元允许连接子由蛋白酶裂 解，因此在暴露于一种或多种细胞内蛋白酶(例如一种或多种溶酶体 酶)时促进药物部分从adc释放(doronina等人(2003)nat.biotechnol. 21:778-84；dubowchik和walker(1999)pharm.therapeutics83:67-123)。示例性氨基酸单元包括(但不限于)二肽、三肽、四肽和五 肽。示例性二肽包括(但不限于)缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)、丙氨酸-天冬 酰胺(ala-asn)、丙氨酸-苯丙氨酸(ala-phe)、苯丙氨酸-赖氨酸 (phe-lys)、丙氨酸-赖氨酸(ala-lys)、丙氨酸-缬氨酸(ala-val)、缬氨 酸-丙氨酸(val-ala)、缬氨酸-赖氨酸(val-lys)、赖氨酸-赖氨酸 (lys-lys)、苯丙氨酸-瓜氨酸(phe-cit)、亮氨酸-瓜氨酸(leu-cit)、异亮 氨酸-瓜氨酸(ile-cit)、色氨酸-瓜
氨酸(trp-cit)和苯丙氨酸-丙氨酸 (phe-ala)。示例性三肽包括(但不限于)丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺(ala-ala-asn)、甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)、甘氨酸-甘氨酸
‑ꢀ
甘氨酸(gly-gly-gly)、苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸(phe-phe-lys)和甘 氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸(gly-phe-lys)。其它示例性氨基酸单元包括(但 不限于)gly-phe-leu-gly、ala-leu-ala-leu、phe-n
9-甲苯磺酰基-arg 和phe-n
9-硝基-arg，如例如美国专利no.6,214,345中所述。在一些 实施方案中，连接子中的氨基酸单元包含val-cit。在一些实施方案 中，连接子中的氨基酸单元包含ala-ala-asn。在一些实施方案中， 相对于包含替代氨基酸单元或替代可裂解部分的adc，包含val-cit 的adc显示减少的脱靶细胞杀死，增加的靶向细胞杀死，较低的聚 集水平，和/或较高的药物负载(p)。氨基酸单元可以包含天然存在的 氨基酸残基和/或次要氨基酸和/或非天然存在的氨基酸类似物，例如 瓜氨酸。氨基酸单元可以被设计和优化成由特定酶，例如肿瘤相关蛋 白酶、溶酶体蛋白酶(例如组织蛋白酶b、c、d或s)或血纤蛋白溶酶 蛋白酶进行酶裂解。
[0238]
在一些实施方案中，本文中公开的任何adc中的连接子可以包 含至少一种将抗体部分接合于药物部分的间隔子单元。在一些实施方 案中，间隔子单元将连接子中的裂解位点(例如可裂解肽部分)接合于 抗体部分。在一些实施方案中，连接子和/或连接子中的间隔子单元 基本上为亲水性的。亲水性连接子可以用于降低药物通过多药耐药性 (mdr)或功能类似的转运体可能从抗性癌细胞泵出的程度。在一些方 面中，连接子包括一个或多个聚乙二醇(peg)部分，例如1个、2个、 3个、4个、5个或6个peg部分。在一些实施方案中，连接子为较 短peg连接子，且相比于较长peg连接子，提供改善的稳定性和减 少的聚集。
[0239]
在一些实施方案中，连接子中的间隔子单元包含一个或多个peg 部分。在一些实施方案中，间隔子单元包含-(peg)
m-，且m为1至10 的整数。在一些实施方案中，m在1至10、2至8、2至6、2至5、 2至4或2至3的范围内。在一些实施方案中，m为8。在一些实施 方案中，m为4。在一些实施方案中，m为3。在一些实施方案中，m 为2。在一些实施方案中，间隔子单元包含(peg)2、(peg)4、(peg)8、 (peg)9、(peg)
3-三唑-(peg)3、(peg)
4-三唑-(peg)3或二苯甲基环辛烯
ꢀ‑
三唑-(peg)3。在一些优选实施方案中，间隔子单元包含(peg)2。在 一些实施方案中，相对于包含较长间隔子单元(例如(peg)8)的adc， 包含较短间隔子单元(例如(peg)2)的adc显示较低的聚集水平和/或 较高的药物负载(p)。
[0240]
在一些实施方案中，连接子中的间隔子单元包含烷基部分。在一 些实施方案中，间隔子单元包含-(ch2)
n-，且n为整数1至10(即，n 可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在一些实施方案中，n 为5。在一些实施方案中，相对于包含较长间隔子单元(例如(peg)8) 的adc，包含较短间隔子单元(例如(ch2)5)的adc显示较低的聚集 水平和/或较高的药物负载(p)。
[0241]
间隔子单元可以用于例如直接或间接将抗体部分连接于药物部 分。在一些实施方案中，间隔子单元直接将抗体部分连接于药物部分。 在一些实施方案中，抗体部分和药物部分经由包含一个或多个peg 部分(例如(peg)2或(peg)4)的间隔子单元附接。在一些实施方案中， 间隔子单元间接将抗体部分连接于药物部分。在一些实施方案中，间 隔子单元经由可裂解部分(例如可裂解肽、可裂解二硫化物或可裂解 磺酰胺)和/或将间隔子单元接合于抗体部分的附接部分(例如顺丁烯 二酰亚胺部分)间接将抗体部分连接于药物部分。
[0242]
在各种实施方案中，间隔子单元经由顺丁烯二酰亚胺部分(mal) 附接于抗体部分(即抗体或抗原结合片段)。在一些实施方案中，相对 于包含经由替代附接部分(例如丁二
(peg)2和ala-ala-asn。
[0249]
在一些实施方案中，连接子包含osu-间隔子单元和可裂解二硫 化物部分。在一些实施方案中，可裂解二硫化物部分为二硫基-二甲 基。在一些实施方案中，连接子包含osu-间隔子单元和二硫基-二甲 基。在一些实施方案中，连接子包含osu-(peg)
3-三唑-(peg)3和二硫 基-二甲基。在其它实施方案中，连接子包含osu-二苯甲基环辛烯
‑ꢀ
三唑-(peg)3和二硫基-二甲基。
[0250]
在一些实施方案中，连接子包含osu-间隔子单元和可裂解磺酰 胺部分。在一些实施方案中，连接子包含osu-(peg)
3-三唑-(peg)3和磺酰胺。在其它实施方案中，连接子包含osu-二苯甲基环辛烯-三 唑-(peg)3和磺酰胺。
[0251]
在一些实施方案中，mal-间隔子单元或osu-间隔子单元将抗体 部分(即抗体或抗原结合片段)附接于连接子中的可裂解部分。在一些 实施方案中，mal-间隔子单元或osu-间隔子单元将抗体或抗原结合 片段附接于可裂解肽部分。在一些实施方案中，可裂解肽部分包含氨 基酸单元。在一些实施方案中，连接子包含mal-间隔子单元-氨基酸 单元或osu-间隔子单元-氨基酸单元。在一些实施方案中，mal-间隔 子单元或osu-间隔子单元包含peg部分。在一些实施方案中，mal
‑ꢀ
间隔子单元或osu-间隔子单元包含烷基部分。在一些实施方案中， 氨基酸单元包含val-cit。在其它实施方案中，氨基酸单元包含 ala-ala-asn。
[0252]
在一些实施方案中，连接子包含结构：mal-间隔子单元-val-cit。 在一些实施方案中，连接子包含结构：mal-(peg)
2-val-cit。在一些实 施方案中，连接子包含结构：mal-(peg)
2-val-cit-pab。在一些实施 方案中，连接子包含mal-(peg)
8-val-cit。在某些实施方案中，连接 子包含mal-(ch2)
5-val-cit。在一些实施方案中，连接子包含mal-间 隔子单元-ala-ala-asn。在一些实施方案中，连接子包含 mal-(peg)
2-ala-ala-asn。
[0253]
在一些实施方案中，连接子包含osu-间隔子单元-val-cit。在一 些实施方案中，连接子包含osu-(peg)
2-val-cit。在其它实施方案中， 连接子包含osu-(peg)
9-val-cit。在其它实施方案中，连接子包含 osu-(ch2)
5-val-cit。在其它实施方案中，连接子包含osu-(peg)
3-三 唑-(peg)
3-val-cit。在一些实施方案中，连接子包含osu-间隔子单元
ꢀ‑
ala-ala-asn。在一些实施方案中，连接子包含 osu-(peg)
2-ala-ala-asn。
[0254]
在各种实施方案中，mal-间隔子单元或osu-间隔子单元将抗体 或抗原结合片段附接于可裂解二硫化物部分。在一些实施方案中，连 接子包含mal-间隔子单元-二硫化物或osu-间隔子单元-二硫化物。 在一些实施方案中，二硫化物为二硫基-二甲基。在一些实施方案中， 连接子包含mal-间隔子单元-二硫基-二甲基。在一些实施方案中，连 接子包含mal-(peg)
4-三唑-(peg)
3-二硫基-二甲基。在其它实施方案 中，连接子包含osu-间隔子单元-二硫基-二甲基。在一些实施方案中， 连接子包含osu-(peg)
3-三唑-(peg)
3-二硫基-二甲基。在其它实施方 案中，连接子包含osu-二苯甲基环辛烯-三唑-(peg)
3-二硫基-二甲基。
[0255]
在某些实施方案中，mal-间隔子单元或osu-间隔子单元将抗体 或抗原结合片段附接于可裂解磺酰胺部分。在一些实施方案中，连接 子包含mal-间隔子单元-磺酰胺或osu-间隔子单元-磺酰胺。在一些 实施方案中，连接子包含mal-(peg)
4-三唑-(peg)
3-磺酰胺。在一些实 施方案中，连接子包含osu-(peg)
3-三唑-(peg)
3-磺酰胺。在其它实施 方案中，连接子包含osu-二苯甲基环辛烯-三唑-(peg)
3-磺酰胺。
35胺。在其它 实施方案中，抗her2抗体(例如曲妥珠单抗)通过包含 mal-(peg)
2-val-cit-pab的连接子接合于艾日布林的c-35胺。
[0263]
在一些实施方案中，pab在连接子中的可裂解部分裂解时进行自 消耗。在一些实施方案中，可裂解肽部分包含氨基酸单元。在一些实 施方案中，连接子包含氨基酸单元-pab。在一些实施方案中，氨基 酸单元为val-cit。在一些实施方案中，连接子包含val-cit-pab (vcp)。在某些实施方案中，氨基酸单元为ala-ala-asn。在一些实施 方案中，连接子包含ala-ala-asn-pab。
[0264]
在一些实施方案中，pab在连接子中的可裂解二硫化物部分裂解 时进行自消耗。在一些实施方案中，连接子包含二硫化物-pab。在 一些实施方案中，连接子包含二硫基-二甲基-pab。
[0265]
在一些实施方案中，pab在连接子中的可裂解磺酰胺部分裂解时 进行自消耗。在一些实施方案中，连接子包含磺酰胺-pab。
[0266]
在各种方面中，adc的抗体部分经由连接子结合于药物部分， 其中连接子包含mal-间隔子单元、可裂解氨基酸单元和pab。在一 些实施方案中，间隔子单元包含peg部分。在一些实施方案中，间 隔子单元包含烷基部分。在一些实施方案中，连接子包含mal-(peg)2‑ꢀ
氨基酸单元-pab。在一些实施方案中，连接子包含 mal-(peg)
2-val-cit-pab。在其它实施方案中，连接子包含 mal-(peg)
2-ala-ala-asn-pab。在一些实施方案中，连接子包含 mal-(peg)
8-氨基酸单元-pab。在一些实施方案中，连接子包含 mal-(peg)
8-val-cit-pab。在一些实施方案中，连接子包含mal-(ch2)5‑ꢀ
氨基酸单元-pab。在一些实施方案中，连接子包含mal-(ch2)
5-val-cit-pab。
[0267]
在各种实施方案中，adc的抗体部分经由连接子结合于药物部 分，其中连接子包含mal-间隔子单元-二硫化物-pab。在一些实施方 案中，间隔子单元包含peg部分。在一些实施方案中，连接子包含 mal-(peg)
4-三唑-(peg)
3-二硫化物-pab。在一些实施方案中，连接子 包含mal-(peg)
4-三唑-(peg)
3-二硫基-二甲基-pab。
[0268]
在一些实施方案中，adc的抗体部分经由连接子结合于药物部 分，其中连接子包含mal-间隔子单元-磺酰胺-pab。在一些实施方案 中，间隔子单元包含peg部分。在一些实施方案中，连接子包含 mal-(peg)
4-三唑-(peg)
3-磺酰胺-pab。
[0269]
在一些方面中，adc的抗体部分经由连接子结合于药物部分， 其中连接子包含osu-间隔子单元-氨基酸单元-pab。在一些实施方案 中，间隔子单元包含peg部分。在一些实施方案中，间隔子单元包 含烷基部分。在一些实施方案中，连接子包含osu-(peg)
2-氨基酸单 元-pab。在一些实施方案中，连接子包含osu-(peg)
2-val-cit-pab。 在其它实施方案中，连接子包含osu-(peg)
2-ala-ala-asn-pab。在一 些实施方案中，连接子包含osu-(peg)
9-氨基酸单元-pab。在一些实 施方案中，连接子包含osu-(peg)
9-val-cit-pab。在一些实施方案中， 连接子包含osu-(ch2)
5-氨基酸单元-pab。在一些实施方案中，连接 子包含osu-(ch2)
5-val-cit-pab。在一些实施方案中，连接子包含 osu-(peg)
3-三唑-(peg)
3-氨基酸单元-pab。在一些实施方案中，连接 子包含osu-(peg)
3-三唑-(peg)
3-val-cit-pab。
[0270]
在一些实施方案中，adc的抗体部分经由连接子结合于药物部 分，其中连接子包含osu-间隔子单元-二硫化物-pab。在一些实施方 案中，间隔子单元包含peg部分。在一些实施方案中，连接子包含 osu-(peg)
3-三唑-(peg)
3-二硫化物-pab。在一些实施方案中，连
接子 包含osu-(peg)
3-三唑-(peg)
3-二硫基-二甲基-pab。在一些实施方案 中，连接子包含osu-二苯甲基环辛烯-三唑-(peg)
3-二硫化物-pab。 在一些实施方案中，连接子包含osu-二苯甲基环辛烯-三唑-(peg)3‑ꢀ
二硫基-二甲基-pab。
[0271]
在一些实施方案中，adc的抗体部分经由连接子结合于药物部 分，其中连接子包含osu-间隔子单元-磺酰胺-pab。在一些实施方案 中，间隔子单元包含peg部分。在一些实施方案中，连接子包含 osu-(peg)
3-三唑-(peg)
3-磺酰胺-pab。在一些实施方案中，连接子包 含osu-二苯甲基环辛烯-三唑-(peg)
3-磺酰胺-pab。
[0272]
在各种实施方案中，连接子被设计成在连接子-药物部分和/或单 独药物部分进行细胞内化和扩散至相邻细胞后通过裂解促进旁观杀 死(相邻细胞的杀死)。在一些实施方案中，连接子促进细胞内化。在 一些实施方案中，连接子被设计成使细胞外环境中的裂解减至最少， 因此减少对脱靶组织(例如非癌组织)的毒性，同时保持adc结合于 标靶组织，和不表达adc的抗体部分所靶向的抗原但在表达所述抗 原的标靶癌症组织周围的癌组织的旁观杀死。在一些实施方案中，包 含顺丁烯二酰亚胺部分(mal)、聚乙二醇(peg)部分、缬氨酸-瓜氨酸 (val-cit或“vc”)和pab的连接子提供这些功能特征。在一些实施方案 中，包含mal-(peg)
2-val-cit-pab的连接子尤其有效地提供这些功能 特征，例如当例如morab-003的抗fra抗体部分与例如艾日布林 的药物部分接合时。在一些实施方案中，在无抗fra抗体部分和/或 无morab-003下也可以观察到这些功能特征中的至少一些。举例来 说，在一些实施方案中，包含mal-(peg)
2-val-cit-pab的连接子有效 地提供这些功能特征中的一些或所有，例如当例如曲妥珠单抗的抗 her2抗体部分与例如艾日布林的药物部分接合时。
[0273]
在一些实施方案中，抗体部分经由包含顺丁烯二酰亚胺部分 (mal)、聚乙二醇(peg)部分、缬氨酸瓜氨酸(val-cit或“vc”)和pab的 连接子结合于药物部分。在这些实施方案中，顺丁烯二酰亚胺部分将 连接子-药物部分共价附接于抗体部分，且pab充当自消耗间隔子单 元。这类连接子可以称为“m-vc-pab”连接子、“mal-vcp”连接子、
ꢀ“
mal-(peg)
2-vcp”连接子或“mal-(peg)
2-val-cit-pab”连接子。在一 些实施方案中，药物部分为艾日布林。mal-(peg)
2-val-cit-pab-艾日 布林的结构提供于表46中。mal-(peg)
2-val-cit-pab连接子的pab 附接于艾日布林上的c-35胺。
[0274]
已经发现包含mal-(peg)
2-val-cit-pab-艾日布林的adc显示具 有合乎需要的特性的特定组合，尤其当与例如morab-003的抗fra 抗体或其抗原结合片段配对时。这些特性包括(但不限于)有效水平的 药物负载(p～4)、低聚集水平、在存储条件下或当在身体内循环时的 稳定性(例如血清稳定性)、保留可与未偶联抗体相比较的对表达标靶 的细胞的亲和力、针对表达标靶的细胞的有效细胞毒性、低水平的脱 靶细胞杀死、高水平的旁观杀死和/或有效的体内抗癌活性，这些都 与使用其它连接子-毒素和/或抗体部分的adc进行比较。虽然许多 连接子选择和间隔子与裂解位点的组合为本领域中已知的且可以提 供这些功能类别中的一种或多种的某些益处，但将艾日布林接合于例 如抗fra抗体(例如morab-003)的抗体部分的 mal-(peg)
2-val-cit-pab的特定组合可以为治疗性adc提供在合乎 需要的功能特性范围内良好或优良的特性。在一些实施方案中，由将 艾日布林接合于抗体部分的mal-(peg)
2-val-cit-pab连接子的特定组 合所提供的良好或优良功能特性可以在此连接子-毒素结合于例如抗 her2抗体(例如曲妥珠单抗)下观察到。
[0275]
在一些实施方案中，adc包含mal-(peg)
2-val-cit-pab-艾日布 林和包含保留靶向肿瘤细胞且在肿瘤细胞中内化的能力的内化抗体 或其抗原结合片段的抗体部分。在一些实施方案中，adc包含 mal-(peg)
2-val-cit-pab-艾日布林和靶向表达fra的肿瘤细胞的内 化抗体或其内化抗原结合片段。在一些实施方案中，靶向表达fra 的肿瘤细胞的内化抗体或其内化抗原结合片段包含如kabat编号系统 所定义，三个重链互补决定区(hcdr)，其包含seq id no:2 (hcdr1)、seq id no:3(hcdr2)和seq id no:4(hcdr3)的氨基酸 序列；和三个轻链互补决定区(lcdr)，其包含seq id no:7 (lcdr1)、seq id no:8(lcdr2)和seq id no:9(lcdr3)的氨基酸 序列；或如imgt编号系统所定义，三个重链互补决定区(hcdr)， 其包含seq id no:13(hcdr1)、seq id no:14(hcdr2)和seq idno:15(hcdr3)的氨基酸序列；和三个轻链互补决定区(lcdr)，其 包含seq id no:16(lcdr1)、seq id no:17(lcdr2)和seq idno:18(lcdr3)的氨基酸序列。在一些实施方案中，靶向表达fra 的肿瘤细胞的内化抗体或其内化抗原结合片段包含有包含seq idno:23的氨基酸序列的重链可变区和包含seq id no:24的氨基酸序 列的轻链可变区。在一些实施方案中，靶向表达fra的肿瘤细胞的 内化抗体或其内化抗原结合片段包含人类igg1重链恒定域和igκ轻 链恒定域。
[0276]
在一些实施方案中，adc具有式i：
[0277]
ab-(l-d)
p
ꢀꢀꢀ(i)[0278]
其中：
[0279]
(i)ab为内化抗叶酸受体α(fra)抗体或其内化抗原结合片段， 其包含：如kabat编号系统所定义，三个重链互补决定区(hcdr)， 其包含seq id no:2(hcdr1)、seq id no:3(hcdr2)和seq id no:4(hcdr3)的氨基酸序列；和三个轻链互补决定区(lcdr)，其包 含seq id no:7(lcdr1)、seq id no:8(lcdr2)和seq id no:9 (lcdr3)的氨基酸序列；或如imgt编号系统所定义，三个重链互补 决定区(hcdr)，其包含seq id no:13(hcdr1)、seq id no:14 (hcdr2)和seq id no:15(hcdr3)的氨基酸序列；和三个轻链互补 决定区(lcdr)，其包含seq id no:16(lcdr1)、seq id no:17 (lcdr2)和seq id no:18(lcdr3)的氨基酸序列；
[0280]
(ii)d为艾日布林；
[0281]
(iii)l为包含mal-(peg)
2-val-cit-pab的可裂解连接子；且
[0282]
(iv)p为整数1至20。
[0283]
在一些实施方案中，内化抗体或其内化抗原结合片段包含有包含 seq id no:23的氨基酸序列的重链可变区和包含seq id no:24的 氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，内化抗体为 morab-003。在一些实施方案中，p为1至8或1至6。在一些实施 方案中，p为2至8或2至5。在一些实施方案中，p为3至4。在一 些实施方案中，p为4。
[0284]
在其它实施方案中，adc包含mal-(peg)
2-val-cit-pab-艾日布 林和靶向表达her2的肿瘤细胞的内化抗体或其内化抗原结合片段。 在一些实施方案中，靶向表达her2的肿瘤细胞的内化抗体或其内化 抗原结合片段包含：如kabat编号系统所定义，三个重链互补决定区 (hcdr)，其包含seq id no:71(hcdr1)、seq id no:72(hcdr2) 和seq id no:73(hcdr3)的氨基酸序列；和三个轻链互补决定区 (lcdr)，其包含seq id no:74(lcdr1)、seq id no:75(lcdr2) 和seq id no:76(lcdr3)的氨基酸序列；或如imgt编号系统所定 义，三个重链互补决定区(hcdr)，其包含seq id no:191(hcdr1)、 seq id no:192(hcdr2)和seq id no:193(hcdr3)的氨基酸序列； 和三个轻链互补决定区(lcdr)，其包含seq id no:194
(lcdr1)、 seq id no:195(lcdr2)和seq id no:196(lcdr3)的氨基酸序列。 在一些实施方案中，靶向表达her2的肿瘤细胞的内化抗体或其内化 抗原结合片段包含有包含seq id no:27的氨基酸序列的重链可变区 和包含seq id no:28的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案 中，靶向表达her2的肿瘤细胞的内化抗体或其内化抗原结合片段包 含人类igg1重链恒定域和igκ轻链恒定域。
[0285]
在一些实施方案中，adc具有式i：
[0286]
ab-(l-d)
p(i)[0287]
其中：
[0288]
(i)ab为内化抗人类表皮生长因子受体2(her2)抗体或其内化抗 原结合片段，其包含：如kabat编号系统所定义，三个重链互补决定 区(hcdr)，其包含seq id no:71(hcdr1)、seq id no:72(hcdr2) 和seq id no:73(hcdr3)的氨基酸序列；和三个轻链互补决定区 (lcdr)，其包含seq id no:74(lcdr1)、seq id no:75(lcdr2) 和seq id no:76(lcdr3)的氨基酸序列；或如imgt编号系统所定 义，三个重链互补决定区(hcdr)，其包含seq id no:191(hcdr1)、 seq id no:192(hcdr2)和seq id no:193(hcdr3)的氨基酸序列； 和三个轻链互补决定区(lcdr)，其包含seq id no:194(lcdr1)、 seq id no:195(lcdr2)和seq id no:196(lcdr3)的氨基酸序列；
[0289]
(ii)d为艾日布林；
[0290]
(iii)l为包含mal-(peg)
2-val-cit-pab的可裂解连接子；且
[0291]
(iv)p为整数1至20。
[0292]
在一些实施方案中，内化抗体或其内化抗原结合片段包含有包含 seq id no:27的氨基酸序列的重链可变区和包含seq id no:28的 氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，内化抗体为曲妥珠单 抗。在一些实施方案中，p为1至8或1至6。在一些实施方案中，p 为2至8或2至5。在一些实施方案中，p为3至4。在一些实施方 案中，p为4。
[0293]
在其它实施方案中，adc包含mal-(peg)
2-val-cit-pab-艾日布 林和靶向表达间皮素(msln)的肿瘤细胞的内化抗体或其内化抗原结 合片段。在一些实施方案中，靶向表达msln的肿瘤细胞的内化抗 体或其内化抗原结合片段包含：如kabat编号系统所定义，三个重链 互补决定区(hcdr)，其包含seq id no:65(hcdr1)、seq id no:66 (hcdr2)和seq id no:67(hcdr3)的氨基酸序列；和三个轻链互补 决定区(lcdr)，其包含seq id no:68(lcdr1)、seq id no:69 (lcdr2)和seq id no:70(lcdr3)的氨基酸序列；或如imgt编号 系统所定义，三个重链互补决定区(hcdr)，其包含seq id no:185 (hcdr1)、seq id no:186(hcdr2)和seq id no:187(hcdr3)的氨 基酸序列；和三个轻链互补决定区(lcdr)，其包含seq id no:188 (lcdr1)、seq id no:189(lcdr2)和seq id no:190(lcdr3)的氨 基酸序列。在一些实施方案中，靶向表达msln的肿瘤细胞的内化 抗体或其内化抗原结合片段包含有包含seq id no:25的氨基酸序列 的重链可变区和包含seq id no:26的氨基酸序列的轻链可变区。在 一些实施方案中，靶向表达msln的肿瘤细胞的内化抗体或其内化 抗原结合片段包含人类igg1重链恒定域和igκ轻链恒定域。
[0294]
在一些实施方案中，adc具有式i：
[0295]
ab-(l-d)
p(i)[0296]
其中：
[0297]
(i)ab为内化抗间皮素抗体或其内化抗原结合片段，其包含：如 kabat编号系统所定义，三个重链互补决定区(hcdr)，其包含seq id no:65(hcdr1)、seq id no:66(hcdr2)和seq id no:67(hcdr3) 的氨基酸序列；和三个轻链互补决定区(lcdr)，其包含seq id no:68 (lcdr1)、seq id no:69(lcdr2)和seq id no:70(lcdr3)的氨基 酸序列；或如imgt编号系统所定义，三个重链互补决定区(hcdr)， 其包含seq id no:185(hcdr1)、seq id no:186(hcdr2)和seq id no:187(hcdr3)的氨基酸序列；和三个轻链互补决定区(lcdr)，其 包含seq id no:188(lcdr1)、seq id no:189(lcdr2)和seq id no:190(lcdr3)的氨基酸序列；
[0298]
(ii)d为艾日布林；
[0299]
(iii)l为包含mal-(peg)
2-val-cit-pab的可裂解连接子；且
[0300]
(iv)p为整数1至20。
[0301]
在一些实施方案中，内化抗体或其内化抗原结合片段包含有包含 seq id no:25的氨基酸序列的重链可变区和包含seq id no:26的 氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，内化抗体为 morab-003、morab-009或曲妥珠单抗。在一些实施方案中，p为 为1至8或1至6。在一些实施方案中，p为2至8或2至5。在一 些实施方案中，p为3至4。在一些实施方案中，p为4。
[0302]
药物部分
[0303]
本文中描述adc的药物部分(d)可以为任何化学治疗剂。适用类 别的化学治疗剂包括例如抗微管蛋白剂。在某些实施方案中，药物部 分为抗微管蛋白剂。抗微管蛋白剂的实例包括念珠藻环肽和艾日布 林。用于所述adc的优选药物部分为艾日布林。
[0304]
在各种实施方案中，药物部分为艾日布林。在这些实施方案中， adc的连接子经由艾日布林上的c-35胺附接。
[0305]
在各种实施方案中，用于接合于连接子和抗体部分的艾日布林的 天然形式展示于下文中：
[0306][0307]
在某些实施方案中，作为连接子前体的中间体与药物部分在适当 条件下反应。在某些实施方案中，反应基团用于药物和/或中间体或 连接子上。药物与中间体之间的反应产物或衍生化药物随后与抗体或 抗原结合片段在适当条件下反应。或者，连接子或中间体可以首先与 抗体或衍生化抗体反应，然后与药物或衍生化药物反应。
[0308]
许多不同反应可用于将药物和/或连接子共价附接于抗体部分。 这常常通过抗体分子的一个或多个氨基酸残基(包括赖氨酸的胺基、 谷氨酸和天冬氨酸的游离羧酸基、半胱氨酸的硫氢基和芳族氨基酸的 各种部分)实现。举例来说，可以使用碳化二亚胺反应将
佳比率与抗体无关。
[0314]
在一些实施方案中，抗体部分在结合前暴露于还原条件，以产生 一个或多个游离半胱氨酸残基。在一些实施方案中，抗体可以用例如 二硫苏糖醇(dtt)或三(2-羧乙基)膦(tcep)的还原剂在部分或总还原 条件下还原，产生反应性半胱氨酸硫醇基。未配对半胱氨酸可以通过 用有限摩尔当量的tcep进行部分还原来产生，其优先还原连接轻链 与重链(每一h-l配对的一对)和铰链区中的两个重链(在人类igg1情 况下每一h-h配对的两对)的链间二硫键，而使链内二硫键完整 (stefano等人(2013)methods mol.biol.1045:145-71)。在实施方案中， 抗体内的二硫键例如通过采用应用交替还原和氧化电压的工作电极 来电化学还原。这种方法可以允许二硫键还原在线连接至分析装置 (例如电化学检测装置、nmr波谱仪或质谱仪)或化学分离装置(例如 液相色谱仪(例如hplc)或电泳装置(参见例如美国公布no. 20140069822))。在某些实施方案中，抗体经受变性条件，以露出例如 赖氨酸或半胱氨酸的氨基酸残基上的反应性亲核基团。
[0315]
adc的药物负载可以用不同方式，例如通过以下来控制：(i)限 制药物-连接子中间体或连接子试剂相对于抗体的摩尔过量；(ii)限制 结合反应时间或温度；(iii)半胱氨酸硫醇修饰的部分还原条件或限制 还原条件；和/或(iv)通过重组技术工程化抗体的氨基酸序列，以便改 变半胱氨酸残基的数目和位置，从而控制连接子-药物附接的数目和/ 或位置。
[0316]
在一些实施方案中，游离半胱氨酸残基引入抗体部分的氨基酸序 列中。举例来说，可以制备其中亲本抗体的一个或多个氨基酸经半胱 氨酸氨基酸替换的半胱氨酸工程化抗体。因此抗体的任何形式可以进 行工程化，即突变。举例来说，亲本fab抗体片段可以进行工程化以 形成称为“thiofab”的半胱氨酸工程化fab。类似地，亲本单克隆抗体 可以进行工程化，形成“thiomab”。单位点突变在thiofab中产生单 个工程化半胱氨酸残基，而由于igg抗体的二聚性，所以单位点突变 在thiomab中产生两个工程化半胱氨酸残基。可以通过本领域中已 知的多种方法(参见例如wo 2006/034488中描述的方法)制备编码亲 本多肽的氨基酸序列变异体的dna。这些方法包括(但不限于)通过定 点(或寡核苷酸介导)诱变、pcr诱变和早先制备的编码多肽的dna 的盒式诱变。重组抗体的变异体也可以通过限制性片段操纵或通过重 叠延伸pcr，利用合成寡核苷酸来构筑。式i的adc包括(但不限于) 具有1个、2个、3个或4个工程化的半胱氨酸氨基酸的抗体(lyon 等人(2012)methods enzymol.502:123-38)。在一些实施方案中，在不 使用工程化下，一个或多个游离半胱氨酸残基已存在于抗体部分中， 在此情况下存在的游离半胱氨酸残基可以用于将抗体部分结合于药 物部分。
[0317]
在一些实施方案中，较高药物负载(例如p》5)可引起某些抗体-药 物偶联物的聚集、不溶、毒性或细胞渗透性损失。较高药物负载也会 负面影响某些adc的药物代谢动力学(例如清除率)。在一些实施方 案中，较低药物负载(例如p《3)会降低某些adc针对表达标靶的细胞 和/或旁邻细胞的效力。在一些实施方案中，本公开的adc的药物负 载在1至约8、约2至约6、约2至约5、约3至约5或约3至约4 的范围内。
[0318]
在包含多个拷贝的抗体部分和连接子部分的反应混合物中超过 一个亲核基团与药物-连接子中间体或连接子部分试剂、接着药物部 分试剂反应的情况下，所得产物可以为adc化合物的混合物，其中 在混合物中分配一个或多个药物部分附接于抗体部分的每个
拷贝。在 一些实施方案中，由偶联反应产生的adc的混合物中药物负载在每 一抗体部分附接1至20个药物部分的范围内。每一抗体部分的药物 部分平均数目(即平均药物负载或平均p)可以通过本领域中已知的任 何常规方法，例如通过质谱分析(例如反相lc-ms)和/或高效液相色 谱(例如hic-hplc)计算。在一些实施方案中，每一抗体部分的药物 部分平均数目通过疏水作用色谱-高效液相色谱(hic-hplc)测定。在 一些实施方案中，每一抗体部分的药物部分平均数目通过反相液相色 谱-质谱分析(lc-ms)测定。在一些实施方案中，每一抗体部分的药物 部分平均数目为约3至约4；约3.1至约3.9；约3.2至约3.8；约3.2 至约3.7；约3.2至约3.6；约3.3至约3.8；或约3.3至约3.7。在一 些实施方案中，每一抗体部分的药物部分平均数目为约3.2至约3.8。 在一些实施方案中，每一抗体部分的药物部分平均数目为约3.8。在 一些实施方案中，每一抗体部分的药物部分平均数目为3至4；3.1 至3.9；3.2至3.8；3.2至3.7；3.2至3.6；3.3至3.8；或3.3至3.7。 在一些实施方案中，每一抗体部分的药物部分平均数目为3.2至3.8。 在一些实施方案中，每一抗体部分的药物部分平均数目为3.8。
[0319]
在一些实施方案中，每一抗体部分的药物部分平均数目为约3.5 至约4.5；约3.6至约4.4；约3.7至约4.3；约3.7至约4.2；或约3.8 至约4.2。在一些实施方案中，每一抗体部分的药物部分平均数目为 约3.6至约4.4。在一些实施方案中，每一抗体部分的药物部分平均 数目为约4.0。在一些实施方案中，每一抗体部分的药物部分平均数 目为3.5至4.5；3.6至4.4；3.7至4.3；3.7至4.2；或3.8至4.2。在 一些实施方案中，每一抗体部分的药物部分平均数目为3.6至4.4。 在一些实施方案中，每一抗体部分的药物部分平均数目为4.0。
[0320]
在各种实施方案中，如关于每一抗体部分的药物部分平均数目使 用的术语“约”意指 /-10％。
[0321]
混合物中的个别adc化合物或“物质”可以通过质谱分析鉴别并 通过uplc或hplc，例如疏水作用色谱(hic-hplc)分离。在某些实 施方案中，具有单负载值的均质或几乎均质adc可以例如通过电泳 或色谱从偶联混合物分离。
[0322]
在一些实施方案中，约4的药物负载和/或平均药物负载提供有 益的特性。在一些实施方案中，小于约4的药物负载和/或平均药物 负载会导致未偶联的抗体物质的水平高至无法接受，未偶联的抗体物 质可能与adc竞争结合于标靶抗原和/或降低治疗功效。在一些实施 方案中，超过约4的药物负载和/或平均药物负载可能导致产物非均 质性和/或adc聚集的水平高至无法接受。由于使抗体部分稳定所需 的一个或多个化学键损失，所以超过约4的药物负载和/或平均药物 负载也会影响adc的稳定性。
[0323]
在一些实施方案中，adc具有式i：
[0324]
ab-(l-d)
p
ꢀꢀꢀ(i)[0325]
其中：
[0326]
(i)ab为内化抗叶酸受体α抗体或其抗原结合片段，其包含有包 含seq id no:23的氨基酸序列的重链可变区和包含seq id no:24 的氨基酸序列的轻链可变区；
[0327]
(ii)d为艾日布林；
[0328]
(iii)l为包含mal-(peg)
2-val-cit-pab的可裂解连接子；且
[0329]
(iv)p为整数3至4。
[0330]
在其它实施方案中，adc具有式i：
[0331]
ab-(l-d)
p
ꢀꢀꢀ(i)[0332]
其中：
[0333]
(i)ab为内化抗人类表皮生长因子受体2抗体或其抗原结合片 段，其包含有包含seq id no:27的氨基酸序列的重链可变区和包含 seq id no:28的氨基酸序列的轻链可变区；
[0334]
(ii)d为艾日布林；
[0335]
(iii)l为包含mal-(peg)
2-val-cit-pab的可裂解连接子；且
[0336]
(iv)p为整数3至4。
[0337]
在一些实施方案中，p为4。
[0338]
本公开包括产生所述adc的方法。简单地说，adc包含作为抗 体部分的抗体或抗原结合片段、药物部分和将药物部分与抗体部分接 合的连接子。在一些实施方案中，adc可以使用具有共价附接于药 物部分和抗体部分的反应官能团的连接子制备。举例来说，在一些实 施方案中，抗体部分的半胱氨酸硫醇可以与连接子或药物连接子中间 体的反应性官能团(例如顺丁烯二酰亚胺部分)形成键，得到adc。 adc的产生可以通过熟练技术人员已知的任何技术实现。
[0339]
在一些实施方案中，adc通过抗体部分与连接子和药物部分以 相继方式接触而产生，使得抗体部分首先共价连接于连接子，然后预 先形成的抗体-连接子中间体与药物部分反应。在接触药物部分前， 抗体-连接子中间体可以经受或可以不经受纯化步骤。在其它实施方 案中，adc通过抗体部分与预先通过连接子与药物部分反应而形成 的连接子药物化合物接触来产生。在接触药物部分前，预先形成的连 接子-药物化合物可以经受或可以不经受纯化步骤。在其它实施方案 中，在一种反应混合物中抗体部分接触连接子和药物部分，允许抗体 部分与连接子之间和连接子与药物部分之间同时形成共价键。这种产 生adc的方法可以包括其中在添加连接子至反应混合物前抗体部分 接触抗体部分的反应，反之亦然。在某些实施方案中，adc通过使 抗体部分与接合于药物部分的连接子(例如mal-(peg)
2-val-cit-pab
‑ꢀ
艾日布林)在允许偶联的条件下反应而产生。
[0340]
根据上述方法制备的adc可以经受纯化步骤。纯化步骤可以包 括本领域中已知的用于纯化蛋白质的任何生物化学方法或其任何方 法组合。这些方法包括(但不限于)切向流过滤法(tff)、亲和色谱法、 离子交换色谱法、基于任何电荷或等电点的色谱法、混合模式色谱法(例如cht(陶瓷羟磷灰石))、疏水作用色谱法、空间排阻色谱法、渗 析法、过滤法、选择性沉淀法或其任何组合。
[0341]
治疗用途和组合物
[0342]
本文中公开使用所公开的adc治疗受试者的病症，例如肿瘤病 症的方法。adc可以单独或与第二治疗剂组合施用，且可以呈任何 药学上可接受的制剂、剂量和给药方案施用。可以针对毒性以及功效 的指标评估adc治疗功效，并相应调整。功效量度包括(但不限于) 在体外或体内观察到的细胞抑制和/或细胞毒性作用、肿瘤体积减小、 肿瘤生长抑制和/或存活延长。
[0343]
已知确定adc是否对细胞发挥细胞抑制和/或细胞毒性作用的方 法。举例来说，adc的细胞毒性或细胞抑制活性可以通过以下来测 量：将表达adc的标靶蛋白的哺乳动物细胞暴露于细胞培养基；将 细胞培养约6小时至约5天的时期；以及测量细胞活力。基于细
胞的 体外测定也可以用于测量活力(增殖)、细胞毒性和adc对细胞凋亡 的诱发(卡斯蛋白酶活化)。
[0344]
为了确定抗体-药物偶联物是否发挥细胞抑制作用，可以使用胸 苷掺入测定。举例来说，表达标靶抗原的癌细胞可以按96孔板5,000 个细胞/孔的密度培养72小时时间段，并在72小时时间段的最后8 小时期间，暴露于0.5μci 3
h-胸苷。在adc的存在和缺乏下测量3h
‑ꢀ
胸苷在培养物的细胞中的掺入。
[0345]
为了测定细胞毒性，可以测量坏死或细胞凋亡(程序化细胞死亡)。 坏死通常伴有质膜的渗透性增加；细胞膨胀，和质膜破裂。细胞凋亡 典型的特征为细胞膜起泡，细胞质凝聚，以及内源性核酸内切酶活化。 对癌细胞的任一这些作用的确定均指示adc可用于治疗癌症。
[0346]
细胞活力可以例如通过测定细胞中例如中性红、锥虫蓝、结晶紫 或alamar
tm
蓝的染料的吸收来测量(参见例如page等人(1993)intl. j.oncology 3:473-6)。在这类测定中，细胞在含有染料的培养基中孵 育，洗涤细胞，并以分光光度法测量剩余染料，此反映了细胞对染料 的吸收。在某些实施方案中，使用结晶紫测定来评定所制备的adc 的体外效力。结晶紫为一种积累在活细胞的细胞核中的三芳基甲烷染 料。在此测定中，细胞暴露于adc或对照试剂，历时一段界定时间， 接着，细胞用结晶紫染色，用水充分洗涤，接着用1％sds溶解并以 分光光度法读取。结合蛋白质的染料磺基若丹明b(srb)也可以用于 测量细胞毒性(skehan等人(1990)j.natl.cancer inst.82:1107-12)。
[0347]
细胞凋亡可以例如通过测量dna断裂来定量。可利用用于体外 定量测量定dna断裂的商业光度测量法。这类测定的实例包括 tunel(其检测片段化dna中标记核苷酸的掺入)和基于elisa的 测定，如biochemica(1999)第2期,第34-37页(roche molecularbiochemicals)中所描述。
[0348]
还可以通过测量细胞中的形态改变来测定细胞凋亡。举例来说， 与坏死情况一样，可以通过测量某些染料(例如荧光染料，例如吖啶 橙或溴化乙锭)的吸收来测定质膜完整性的丧失。用于测量细胞凋亡 细胞数目的方法已经由duke和cohen,current protocols inimmunology(coligan等人编,(1992)第3.17.1-3.17.16页)描述。细胞 还可以用dna染料(例如吖啶橙、溴化乙锭或碘化丙锭)标记并观察 细胞的染色质凝聚和沿着内核膜的边移。可以进行测量以确定细胞凋 亡的其它形态改变包括例如细胞质凝聚、细胞膜起泡增加和细胞收 缩。
[0349]
还可以评估所公开的adc的旁观杀死活性。可以例如通过采用 两种细胞系(一种对标靶抗原呈阳性，且一种对标靶抗原呈阴性)的测 定，测定旁观杀死活性。细胞系优选进行标记以对其进行区分。举例 来说，经nuclight
tm
绿(nlg)标记的igrov1细胞(fra )和经 nuclight
tm
红(nlr)标记的hl-60(fra-)可以共同培养，用抗fraadc处理，接着监测细胞毒性。当与标靶抗原阳性细胞混合时标靶 抗原阴性细胞的杀死表明旁观杀死，而在缺乏标靶抗原阳性细胞下标 靶抗原阴性细胞的杀死表明脱靶杀死。
[0350]
在一些方面中，本公开特征在于一种通过破坏微管蛋白来杀死癌 细胞或组织、抑制或调节其生长或干扰其代谢的方法。所述方法可以 用于其中破坏微管蛋白提供治疗益处的任何受试者。可以受益于破坏 微管蛋白的受试者包括(但不限于)患有以下疾病或处于患上以下疾病 的风险的受试者：胃癌、卵巢癌(例如浆液性卵巢癌)、肺癌(例如非小 细
胞肺癌)、乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、子宫内膜癌(例如浆液性子 宫内膜癌)、骨肉瘤、卡波西氏肉瘤(kaposi’s sarcoma)、睪丸生殖细胞 癌、白血病、淋巴瘤(例如霍奇金氏病(hodgkin’s disease)、非霍奇金 氏淋巴瘤)、骨髓瘤、头颈部癌、食道癌、胰腺癌、前列腺癌、脑癌(例 如胶质母细胞瘤)、甲状腺癌、结肠直肠癌和/或皮肤癌(例如黑素瘤) 或其任何转移(dumontet和jordan(2010)nat.rev.drug discov. 9:790-803)。在各种实施方案中，所公开的adc可以施用于表达fra 的任何细胞或组织，例如表达fra的癌细胞或组织。一种示例性实 施方案包括一种抑制fra介导的细胞信号传导的方法或杀死细胞的 方法。所述方法可以用于表达fra的任何细胞或组织，例如癌细胞 或转移病变。表达fra的癌症的非限制性实例包括胃癌、浆液性卵 巢癌、透明细胞卵巢癌、非小细胞肺癌、结肠直肠癌、三阴性乳腺癌、 子宫内膜癌、浆液性子宫内膜癌、肺类癌和骨肉瘤。表达fra的细 胞的非限制性实例包括igrov1和ovcar3人类卵巢癌瘤细胞、 nci-h2110人类非小细胞肺癌细胞和包含编码fra的重组核酸或其 部分的细胞。
[0351]
在各种其它实施方案中，所公开的adc可以施用于表达her2的 任何细胞或组织，例如表达her2的癌细胞或组织。一种示例性实施 方案包括一种抑制her2介导的细胞信号传导的方法或杀死细胞的方 法。所述方法可以用于表达her2的任何细胞或组织，例如癌细胞或 转移病变。表达her2的癌症的非限制性实例包括乳腺癌、胃癌、膀 胱癌、尿路上皮细胞癌、食道癌、肺癌、子宫颈癌、子宫内膜癌和卵 巢癌(english等人2013)mol.diagn.ther.17:85-99)。表达her2的细 胞的非限制性实例包括nci-n87-luc人类胃癌细胞、zr75和bt-474 人类乳房导管癌细胞和包含编码her2的重组核酸或其部分的细胞。
[0352]
在各种实施方案中，所公开的adc可以施用于表达间皮素 (msln)的任何细胞或组织，例如表达msln的癌细胞或组织。一种 示例性实施方案包括一种抑制msln介导的细胞信号传导的方法或 杀死细胞的方法。所述方法可以用于表达msln的任何细胞或组织， 例如癌细胞或转移病变。表达msln的癌症的非限制性实例包括间 皮瘤、胰腺癌(例如胰腺腺癌)、卵巢癌和肺癌(例如肺腺癌)(wang等 人(2012)plos one 7:e33214)。表达msln的细胞的非限制性实例包 括ovcar3人类卵巢癌细胞、hec-251人类子宫内膜样细胞、h226 人类肺鳞状上皮细胞间皮瘤细胞和包含编码msln的重组核酸或其 部分的细胞。
[0353]
示例性方法包括使细胞与有效量，即足够杀死细胞的量的如本文 中描述的adc接触的步骤。所述方法可以用于培养的细胞上，例如 体外、体内、离体或原位。举例来说，表达fra、her2和/或msln 的细胞(例如通过肿瘤或转移病变的活检收集的细胞；来自建立的癌 细胞系的细胞；或重组细胞)可以在体外在培养基中培养且可以通过 添加adc至培养基来实现接触步骤。所述方法将杀死表达fra、her2 和/或msln的细胞，尤其包括表达fra、her2和/或msln的肿瘤 细胞。或者，adc可以通过任何合适的施用途径(例如静脉内、皮下 或直接接触肿瘤组织)施用于受试者以在体内发挥作用。
[0354]
所公开的adc治疗组合物的体内作用可以在合适的动物模型中 进行评估。举例来说，可以使用异种癌症模型，其中癌症外植体或传 代异种移植组织引入免疫受损动物，例如裸小鼠或scid小鼠中(klein 等人(1997)nature med.3:402-8)。可以使用测量肿瘤形成的抑制、肿 瘤消退或转移等等的测定预测功效。
[0355]
还可以使用评估细胞凋亡的促进的体内测定。在一个实施方案 中，可以针对细胞凋亡病灶的存在检查来自载有经治疗组合物处理的 肿瘤的小鼠的异种移植物，且与未经
处理的载有异种移植物的对照小 鼠进行比较。在经处理小鼠的肿瘤中发现细胞凋亡病灶的程度指示组 合物的治疗效能。
[0356]
本文中进一步提供治疗癌症的方法。本文中公开的adc可以施 用于非人类哺乳动物或人类受试者以达成治疗的目的。所述治疗方法 需向具有肿瘤的哺乳动物施用生物学有效量的adc，所述adc包含 与结合于所表达的抗原(可结合或位于癌细胞表面上)的靶向抗体连接 的所选化学治疗剂(例如艾日布林)。一种示例性实施方案为一种将化 学治疗剂递送至表达fra的细胞的方法，其包括将化学治疗剂与免 疫特异性结合于fra表位的抗体偶联且将细胞暴露于adc。指示本 公开的adc所针对的表达fra的示例性肿瘤细胞包括来自胃癌、浆 液性卵巢癌、非小细胞肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌(例如三阴性乳腺 癌)、肺类癌瘤、骨肉瘤、子宫内膜癌和具有浆液状组织学的子宫内 膜癌的细胞。
[0357]
另一示例性实施方案为一种将化学治疗剂递送至表达her2的细 胞的方法，其包括将化学治疗剂与免疫特异性结合于her2表位的抗 体偶联且将细胞暴露于adc。指示本公开的adc所针对的表达her2 的示例性肿瘤细胞包括来自乳腺癌、胃癌、膀胱癌、尿路上皮细胞癌、 食道癌、肺癌、子宫颈癌、子宫内膜癌和卵巢癌的细胞。
[0358]
另一示例性实施方案为一种将化学治疗剂递送至表达msln的 细胞的方法，其包括将化学治疗剂与免疫特异性结合于msln表位 的抗体偶联且将细胞暴露于adc。指示本公开的adc所针对的表达 msln的示例性肿瘤细胞包括来自间皮瘤、胰腺癌(例如胰腺腺癌)、 卵巢癌和肺癌(例如肺腺癌)的细胞。
[0359]
另一示例性实施方案为一种治疗患有表达adc的抗体部分的标 靶抗原(例如fra、her2或msln)的癌症或处于患上所述癌症的风险 中的患者的方法，其包括向患者施用治疗有效量的本公开的adc。 在一些实施方案中，当抗fra抗体单独施用时，所述患者对用其治 疗不起反应或反应不良，和/或当药物部分(例如艾日布林)单独施用 时，所述患者对用其治疗不起反应或反应不良。在其它实施方案中， 当抗her2抗体单独施用时，所述患者对用其治疗不起反应或反应不 良，和/或当药物部分(例如艾日布林)单独施用时，所述患者对用其治 疗不起反应或反应不良。在其它实施方案中，当抗msln抗体单独 施用时，所述患者对用其治疗不起反应或反应不良，和/或当药物部 分(例如艾日布林)单独施用时，所述患者对用其治疗不起反应或反应 不良。在其它实施方案中，当药物部分(例如艾日布林)单独施用时， 所述患者对用其治疗不耐受。举例来说，患者可能需要多剂艾日布林 治疗癌症，这会引起全身性毒性，这可以通过靶向递送至表达adc 的抗体部分的标靶抗原(例如fra、her2或msln)的癌症克服，因此 减少脱靶杀死。
[0360]
另一示例性实施方案为一种减少或抑制表达标靶抗原的肿瘤(例 如表达fra的肿瘤、表达her2的肿瘤或表达msln的肿瘤)的生长 的方法，其包括施用治疗有效量的adc。在一些实施方案中，治疗 足够减少或抑制患者肿瘤的生长，减少转移病变的数目或尺寸，降低 肿瘤负载，降低原发性肿瘤负载，降低侵袭性，延长存活时间，和/ 或维持或改善生活质量。在一些实施方案中，当抗fra抗体单独施 用时，肿瘤对用其治疗具有抗性或为其难治，和/或当药物部分(例如 艾日布林)单独施用时，肿瘤对用其治疗具有抗性或为其难治。在其 它实施方案中，当抗her2抗体单独施用时，肿瘤对用其治疗具有抗 性或为其难治，和/或当药物部分(例如艾日布林)单独施用时，肿瘤对 用其治疗具有抗性或为其难治。在一些实施方案中，当抗msln抗 体单独施用时，肿瘤对用其治疗具有抗性或为其难治，和/或当药
物 部分(例如艾日布林)单独施用时，肿瘤对用其治疗具有抗性或为其难 治。
[0361]
此外，本公开的抗体可以施用于表达adc能够结合的抗原的用 于达成兽医学目的或作为人类疾病动物模型的非人类哺乳动物。关于 后者，这类动物模型可用于评估所公开的adc的治疗效能(例如测试 施用剂量和时程)。
[0362]
本文中进一步提供了所公开adc的治疗用途。一示例性实施方 案为adc的用途，其用于治疗表达标靶抗原的癌症(例如表达fra 的癌症、表达her2的癌症或表达msln的癌症)。还公开了用于治疗 表达标靶抗原的癌症(例如表达fra的癌症、表达her2的癌症或表达 msln的癌症)的adc。用于鉴别患有表达fra、her2和/或msln 的癌症的受试者的方法为本领域中已知的且可以用于鉴别适合用所 公开的adc治疗的患者。
[0363]
另一示例性实施方案为adc的用途，其用于制造供治疗表达标 靶抗原的癌症(例如表达fra的癌症、表达her2的癌症或表达msln 的癌症)的药剂的方法。
[0364]
用于实施上述方法的治疗组合物可以被配制成包含适于所需递 送方法的药学上可接受的载体的药物组合物。一示例性实施方案为一 种药物组合物，其包含本公开的adc和药学上可接受的载体。合适 载体包括在与治疗组合物组合时，保留治疗组合物的抗肿瘤功能且一 般不与患者的免疫系统发生反应的任何物质。药学上可接受的载体包 括在生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗 真菌剂、等张和吸收延迟剂等等。药学上可接受的载体的实例包括水、 盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、丙三醇、乙醇、甲磺酸盐等等中的 一种或多种，以及和其组合。在许多情况下，组合物中优选包括等张 剂，例如糖、多元醇(例如甘露糖醇、山梨糖醇或氯化钠)。药学上可 接受的载体可以进一步包含少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防 腐剂或缓冲剂，所述物质增强adc的存放期或效力。
[0365]
治疗制剂可以溶解且经由能够将治疗组合物递送至肿瘤部位的 任何途径施用。潜在有效的施用途径包括(但不限于)静脉内、不经肠、 腹膜内、肌肉内、肿瘤内、皮内、器官内、原位等等。治疗蛋白制剂 可以冻干且呈无菌粉末，优选在真空下存储，接着在注射前在抑菌水 (含有例如苯甲醇防腐剂)中或在无菌水中复原。治疗制剂可以包含 adc或其药学上可接受的盐，例如甲磺酸盐。
[0366]
本文中公开的adc可以在约0.2mg/kg至约10mg/kg范围内的 剂量下施用于有需要的患者。在一些实施方案中，adc每天、每两 月或其间的任何时间段施用于患者。使用上述方法治疗癌症的剂量和 施用方案将随方法和目标癌症而变化，且将一般视本领域中了解的许 多其它因素而定。
[0367]
已知各种递送系统且可用于施用一种或多种本公开的adc。施 用adc的方法包括(但不限于)不经肠施用(例如皮内、肌肉内、腹膜 内、静脉内和皮下)、硬膜外施用、肿瘤内施用和粘膜施用(例如鼻内 和经口途径)。另外，采用经肺施用，可以例如通过使用吸入器或喷 雾器，和用雾化剂配制。参见例如以下中所述的经肺施用的组合物和 方法：美国专利no.6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、 5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；以及pct公布no.wo92/19244、wo 97/32572、wo 97/44013、wo 98/31346和wo99/66903。adc可以通过任何适宜途径，例如通过输注或快速注射， 或通过经上皮细胞或粘膜皮肤内层(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等) 施用。施用可以为全身性或局部的。
[0368]
本文中公开的治疗组合物可以为无菌的且在制造和存储条件下 稳定。在一些实
施方案中，一种或多种adc或药物组合物呈干的杀 菌冻干粉末或无水浓缩物供应于密闭容器中，且可以复原(例如用水 或盐水)成适当浓度以施用于受试者。优选地，一种或多种预防剂或 治疗剂或药物组合物呈干的无菌冻干粉末以至少5mg、至少10mg、 至少15mg、至少25mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg、至 少75mg或至少100mg或其间任何量供应于密闭容器。在一些实施 方案中，冻干adc或药物组合物在原始容器中存储在2℃与8℃之间。 在一些实施方案中，本文中描述的一种或多种adc或药物组合物呈 液体形式供应于密闭容器中，例如指示剂的数量和浓度的容器。在一 些实施方案中，所施用组合物的液体形式以至少0.25mg/ml、至少 0.5mg/ml、至少1mg/ml、至少2.5mg/ml、至少5mg/ml、至少8 mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/ml、至少25mg/ml、至少50 mg/ml、至少75mg/ml或至少100mg/ml adc供应于密闭容器中。 液体形式可以在原始容器中存储在2℃与8℃之间。
[0369]
在一些实施方案中，所公开的adc可以掺入适于不经肠施用的 药物组合物中。可注射溶液可以由燧石或琥珀色小瓶、安瓿或预填充 注射器或其它已知的递送或存储装置中的液体或冻干剂型构成。
[0370]
本文中描述的组合物可以呈多种形式。这些包括例如液体、半固 体和固体剂型，例如液体溶液(例如可注射和可输注溶液)、分散液或 悬浮液、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。优选形式视所欲施用模 式和治疗应用而定。
[0371]
在各种实施方案中，治疗包括单次推注或经由可接受的给药途径 重复施用adc制剂。
[0372]
可以评估患者的给定样品中标靶抗原的水平(例如表达标靶抗原 的细胞的水平)以帮助确定最有效的给药方案等等。一示例性实施方 案为一种确定患者是否将对用本公开的adc治疗起反应的方法，其 包括提供来自患者的生物样品且使生物样品与adc接触。示例性生 物样品包括组织或体液，例如炎症渗出液、血液、血清、肠液、粪便 样品或肿瘤活检(例如来源于患有表达标靶抗原的癌症(例如表达 fra的癌症、表达her2的癌症或表达msln的癌症)或处于其风险中 的患者的肿瘤活检)。在一些实施方案中，样品(例如组织和/或体液) 可以从受试者获得，且合适免疫方法可以用于检测和/或测量标靶抗 原(例如fra、her2或msln)的蛋白质表达。这类评估还用于达成在 整个疗法中监测的目的，且可用于与其它参数的评估组合，估计治疗 的成功。
[0373]
在一些实施方案中，adc的功效可以通过使来自受试者的肿瘤 样品与adc接触且评估肿瘤生长速率或体积来评估。在一些实施方 案中，当已确定adc有效时，其可以施用于受试者。
[0374]
以上治疗方法可以与多种其它手术、化学治疗或放射治疗方案中 的任一种组合。
[0375]
本文中还公开了一种或多种所公开的adc的用途，其用于制造 供例如根据上述方法治疗癌症的药剂。在一些实施方案中，本文中公 开的adc用于例如根据上述方法治疗癌症。
[0376]
在各种实施方案中，用于本文中描述的实验室和治疗应用的试剂 盒在本公开的范围内。这类试剂盒可以包括被划分成容纳一个或多个 容器(例如小瓶、管等等)的载体、包装或容器，每一容器包含用于本 文中公开的方法中的单独要素之一，以及包含使用指导(例如本文中 描述的用途)的标签或插页。试剂盒可以包括包含药物部分的容器。 本公开还提供了一种或多种adc或其药物组合物，其包装在密闭容 器，例如安瓿或药囊中，指示所
述剂的量。
[0377]
试剂盒可以包括上述容器和一个或多个与其相联的其它容器，包 含从商业和使用者立场合乎需要的物质，包括缓冲剂、稀释剂、过滤 器、针、注射器；列出使用内容和/或指导的载体、包装、容器、小 瓶和/或管标签和关于使用指导的包装说明书。
[0378]
标签可以存在于容器上或与容器一起存在以指示组合物用于特 定疗法或非治疗应用，例如预测、预防、诊断或实验室应用。标签也 可以指示关于体内或体外使用，例如本文中描述的用途的指导。指导 和或其它信息也可以包括在插页或标签上，插页或标签与试剂盒一起 包括或包括在试剂盒上。标签可以在容器上或与其相联。当形成标签 的字母、数字或其它特性模制或蚀刻至容器自身时，标签可以在容器 上。标签可以与也容纳容器的贮器或载体相联，例如呈包装说明书形 式。标签可以指示组合物用于诊断或治疗病状，例如本文中描述的癌 症。
[0379]
本领域技术人员容易显而易见，本文中描述的本发明的方法的其 它合适修改和更改为明显的，且可以使用合适的同等物，在不偏离本 发明的范围或本文中公开的实施方案下进行。现详细描述本发明，通 过提及以下实施例，将更清楚地了解其，包括所述实施例仅仅是为了 达成说明的目的，且不意图进行限制。
[0380]
实施例1
[0381]
1.材料与方法
[0382]
用于制备adc的morab-003来自于货号aa 0312。
[0383]
1.1细胞毒素
[0384]
可偶联细胞毒素的结构展示于表11中。
[0385]
[0386]
[0387]
[0388]
[0389][0390]
1.2抗体-药物偶联
[0391]
1.2.1使用tcep部分还原
[0392]
morab-003的部分还原条件通过改变非硫醇还原剂三(2-羧乙基) 膦(tcep)的浓度、抗体浓度和还原时间来建立。morab-003被缓冲 液交换成含有1mm乙二胺四乙酸(edta)的杜尔贝科磷酸盐缓冲盐 水(dulbecco's phosphate-buffered saline，dpbs)，接着使用离心浓缩， 利用10kd分子量截止值(mwco)离心过滤器浓缩成10mg/ml。将 抗体稀释至适当浓度且添加所指示的最终浓度的tcep，并在室温下 轻缓混合1小时。通过根据制造商的方案，使用5或10ml zeba
tm
旋 转脱盐柱，以dpbs/1mm edta作为缓冲剂(thermo fisher，40kdmwco)进行脱盐，来去除tcep。使用硫醇荧光定量试剂盒(abcam)， 根据制造商的方案，分析样品的游离硫醇含量。如部分1.3.3中所述， 进行非还原条件下的sds-page分析，以测定二硫键破坏的程度和 位置。在一些情况下，脱盐mab通过在dpbs中稀释而达至1-2 mg/ml且经受生物素化，以测定可偶联性和药物比抗体(dar)比率。 将含10mm顺丁烯二酰亚胺基-peg2-生物素(thermo fisher)的二甲 亚砜(dmso)以10:1的摩尔比添加至抗体(mab)且在轻缓搅拌下在室 温下孵育4小时。在偶联后，通过使用zeba
tm
旋转脱盐柱(thermofisher)脱盐，来去除未反应的化合物。接着通过lc-ms分析样品以 确定dar，如部分1.3.4中所详述。
[0393]
1.2.2细胞毒素偶联
[0394]
部分还原的抗体在0.5x dpbs、0.5mm edta中达至2.5mg/ml， 并充分混合。接着添加有机共溶剂(如果使用)并充分混合。所检查的 共溶剂为丙二醇(20％和50％最终浓度)、二甲亚砜(dmso)(10％)、n,n
‑ꢀ
二甲基甲酰胺(20％)、n,n-二甲基乙酰胺(20％)和n,n-二甲基丙酰胺 (20％)。将经顺丁烯二酰亚胺基修饰的细胞毒素(dmso中6mm储备 液)以1:6(mab:化合物)的摩尔比添加至抗体并充分混合。在轻缓混合 下在室温下偶联3.5小时。选择50％下50％丙二醇作为最终有机改性 剂且用于所有随后偶联反应。
[0395]
1.2.3纯化
[0396]
使用26/10脱盐柱(ge healthcare)纯化偶联抗体，其中色 谱在快速蛋白质液相色谱(fplc)(ge healthcare)上进行，以去除未反 应的顺丁烯二酰亚胺基-细胞毒素和丙二醇。morab-003 adc，包括 morab-003-mal-vcp-艾日布林(morab-202)，在dpbs(在fplc色 谱期间配制缓冲液用作操作缓冲液)中配制。
[0397]
1.3生物物理学表征
[0398]
1.3.1 bca测定
[0399]
将所制备的二喹啉甲酸(bca)试剂(200μl)添加至25μl连续稀 释的adc或牛γ球蛋白(thermo fisher)2mg/ml标准品，并充分混 合样品。将样品在37℃下孵育20min。在m5板式读数 器(molecular devices)上在595nm下读取板。使用pro(ver 3.2)，利用4参数拟合模型分析数据。
[0400]
1.3.2 sec-hplc分析
[0401]
通过尺寸排阻高效液相色谱(sec-hplc)，使用agilent 1100分析 抗体聚集。mab在dpbs中稀释至1mg/ml。将抗体(20μl)注射至 supersw保护柱(4.6mm
×
3.5cm，4μm孔径，tosohbioscience)，接着supersw3000柱(4.6mm
×
30cm，4μm孔 径)，用含有0.15m nacl和0.05％nan3的0.1m磷酸钠(ph 7.4)，以 0.3ml/min的流速从柱洗脱20min。使用agilent chemstation软件分 析所有数据。聚集％计算为[pa
聚集
/pa
全部
]
×
100，
其中pa＝积分峰面 积。
[0402]
1.3.3sds-page分析
[0403]
用十二烷基硫酸锂(lds)样品缓冲液使蛋白质样品(0.1-10μg)达 至1x。对于未还原样品，在室温下孵育10min，接着进行电泳。对 于还原样品，添加二硫苏糖醇(dtt)达至20mm的最终浓度并将样品 加热至95℃，历时10min，且置于冰上，接着进行电泳。将样品负 载至10孔、12孔或15孔bis-tris sds-page凝胶(thermo fisher)上， 以1x mops或1x mes作为操作缓冲液。在185v(恒定电压)下电泳 1小时。凝胶用instantblue染色溶液(expedeon)染色并在水中脱色。 在ultralum凝胶成像系统上使用600nm橙色滤镜进行成像。
[0404]
1.3.4药物抗体比率(dar)的uplc/esi-ms分析
[0405]
使用pngase f(new england biolabs)将adc去糖基化。将g7 缓冲液(10μl)和pngase f(2μl)添加至mab(90μl，1mg/ml于 dpbs中)。反应在discover微波(cem)中孵育2个周期：(1)微波功 率10w，37℃，10min；接着暂停5min；(2)微波功率2w，37℃， 10min。通过添加dtt达至20mm的最终浓度，还原一部分样品， 接着在60℃下孵育3min。接着使用waters acquity超高效液相色谱 (uplc)和四极飞行时间(q-tof)premier质谱仪分析样品。在65℃下 将样品(各0.5-2μg)注射至massprep
tm
微型脱盐柱上，以0.05 ml/min，从柱洗脱，其中在95％流动相a中平衡5min，10min梯度 (5-90％b)，和在95％流动相a中再平衡10min。流动相a为含0.1％ 甲酸的水。流动相b为含0.1％甲酸的乙腈。q-tof质谱仪呈正离子 电压模式操作，检测在500-4000m/z范围内。源参数如下：毛细管电 压，2.25kv(完整抗体)-2.50kv(还原抗体)；取样锥电压，65.0v(完 整抗体)或50.0v(还原抗体)；源温，100℃；脱溶剂温度，250℃； 脱溶剂气体流速，550l/小时。使用maxent 1函数将蛋 白质峰反卷积。使用下式，将每个未偶联、单偶联和多偶联的重链和 轻链质量的相对强度组合以计算整个dar：
[0406]
2[[i
lc 1
2(i
lc 2
) 3(i
lc 3
)
…
n(i
lc n
)]/σi
lc
总] 2[[i
hc 1
2(i
hc 2
) 3(i
hc 3
)
…
n(i
hc n
)]/σi
hc
总]
[0407]
其中i
lc 1
为与一种细胞毒素偶联的轻链的质量强度，i
lc 2
为与 两种细胞毒素偶联的轻链的质量强度等等。i
hc
为来自对应偶联重链 的强度，且σi
lc
总和σi
hc
总分别为所有未偶联和偶联轻链和重链的 组合强度。
[0408]
1.3.5 hic-hplc dar分析
[0409]
除通过uplc电喷射离子化(esi)-ms分析进行dar分析外，还 使用疏水相互作用hplc(hic-hplc)分析morab-003-vcp-艾日布 林dar和morab-003-0285 dar。将样品注射至 ether-5pw(7.5mm id
×
7.5cm，10μm孔径)上，且以0.7ml/min从 柱洗脱，其中在100％流动相a中平衡3min，15min梯度(0-100％b)， 5min保持在100％b中，1min变成100％a，和在100％流动相a 中再平衡5min。流动相a为25mm磷酸钠、1.5m硫酸铵ph 7.0。 流动相b为25mm磷酸钠、25％异丙醇，ph 7.0。检测在280nm(参 考320nm)下进行。通过下式确定dar：
[0410]
[auc
1
2(auc
2
) 3(auc
3
)
…
n(auc
n
)]/σauc
总
]
[0411]
其中auc
1
为对应于与一种细胞毒素偶联的adc的mab峰的 曲线下面积，auc
2
为对应于与两种细胞毒素偶联的adc的mab 峰的曲线下面积等等。σauc
总
为所有峰值的组合曲线下面积。
[0412]
1.4细胞毒性分析
[0413]
1.4.1结晶紫测定
[0414]
将igrov1(fr
hi
)和sjsa-1(fr
neg
)细胞在96孔组织培养板中在完 全生长培养基中以10,000细胞/孔传代培养和接种，在37℃、5％co2下孵育过夜(16小时)。通常，测试试剂以1:4在2ml深孔稀释板中 连续稀释，起始于1μm(共稀释10次)。将100μl稀释样品添加至 细胞板(测试样品的起始浓度为500nm)。板在37℃、5％co2下再孵 育48小时。将培养基丢弃，用200μl dpbs洗涤板一次，在室温下 用50μl 0.2％结晶紫溶液染色15min，接着用自来水大量洗涤。将板 进行空气干燥，且用200μl 1％sds溶液溶解结晶紫。在570nm下 读取板。使用graphpad prism 6分析数据。使用每孔1,000个细胞的 接种密度进行测定且化合物共暴露5天。当需要较短时间暴露时，在 4小时后去除含有细胞毒性剂的培养基且在5天孵育前替换为新鲜生 长培养基。对于ovcar3、caov3和nci-h2110，细胞以3,000个 细胞/孔接种且与adc一起孵育5天。对于竞争实验，将滴定的adc 与2μm(最终)未偶联的morab-003一起预先孵育，接着与细胞一 起孵育。
[0415]
1.4.2旁观杀死测定
[0416]
在开始研究前一天，将nuclight
tm
绿(nlg)igrov1细胞以5,000 个细胞/孔接种至96孔圆底板中，接着在室温下在1,000rpm下离心3 min，以确保形成细胞团块。将板置于incucyte(essenbioscience)的容器中且在37℃/5％co2下孵育过夜。设定程序以每两小 时收集细胞生长的影像，且测定核染绿和核染红的细胞的总数以及细 胞的相汇合。在实验当天，morab-003 adc或游离药物在完全rpmi 培养基中稀释且连续稀释，起始于400nm。将50μl细胞毒素溶液 添加至nlg-igrov1细胞且孵育30min。在孵育期期间，将 nuclight
tm
红(nlr)hl-60(fr
neg
)细胞用新鲜培养基稀释至2
×
105、 1
×
105或5
×
104个细胞/毫升。将50μl单独nlr-hl60细胞悬浮液或 培养基添加至nlg-igrov1孔，接着在室温下在1,000rpm下离心3 min，以确保再次形成细胞团块。将板置回incucyte zoom(essenbioscience)的容器中且在37℃/5％co2下孵育多达5天。通过与未添加 adc或添加单独游离药物的样品相比，使用绿细胞计数，确定 nlg-igrov1的相对细胞生长。除确定红细胞计数外，hl 60的相对 细胞生长类似进行。使用prism(graphpad)确定nlg-igrov1与 nlr-hl-60的ic
50
值。
[0417]
1.4.3血清稳定性测定
[0418]
将20μl morab-003 adc与80μl dpbs、正常汇集人类血清 (bioreclamation，货号brh552911)或正常汇集小鼠血清 (bioreclamation，货号mse152591)充分混合，且在37℃下孵育0小 时、4小时、24小时和48小时。在孵育后，将样品冰冻并存储在-20℃ 下，直至在细胞毒性和结合测定中进行评估。对于细胞毒性分析，对 igrov1和sjsa-1细胞评估样品，如部分1.4.1中所详述。对于结合 评定，使用基于溶液的msd ecl测定来评估样品。将样品与生物素 化的叶酸受体α和磺基-标签抗morab-003一起孵育，接着在抗生 蛋白链菌素板上捕捉，且使用电化学发光，利用msd sector成像器 2400检测。
[0419]
2.结果
[0420]
2.1制备morab-003 adc
[0421]
为选择与morab-003偶联的连接子与细胞毒素的最佳组合，使 用三种方法制备adc。根据图1中展示的偶联策略，通过用有限摩 尔当量的非硫醇还原剂tcep部分还原，产
生未配对半胱氨酸。此策 略优先还原连接轻链与重链(每一h-l配对的一对)和铰链区中的两个 重链(在人类igg1情况下每一h-h配对的两对)的链间二硫键，而使 链内二硫键完整。
[0422]
用于制备morab-003 adc的第二偶联策略利用还原二硫化物 桥接化学。还原二硫化物桥接化学将在部分还原过程期间释放的半胱 氨酸残基的游离硫醇再次桥接，模拟二硫键的作用，因此维持adc 的稳定性和功能。
[0423]
用于制备morab-003 adc的第三个偶联策略采用限制性赖氨 酸利用。限制性赖氨酸利用导致非常有限数目的估计70 的暴露溶剂 的可用赖氨酸偶联在典型人类igg分子上，且可能得到相对于涉及半 胱氨酸修饰的策略，具有较低均质性的adc产物的混合物。
[0424]
2.1.1制备vcp-艾日布林用于morab-003 adc
[0425]
使艾日布林(1)(10mg，14μmol)(图2)溶解于n,n-二甲基甲酰胺 (dmf)(1ml)中，且充分混合。添加n,n-二异丙基乙胺(许尼希氏碱 (hunig's base)或ipr2net)(3.6μl，21μmol)和fmoc-val-cit-对氨基苯 甲基-对硝基苯酚(fmoc-vcp-pnp)(2)(16mg，21μmol，concortisbiosystems，目录号vc1003)。将反应混合物在室温下搅拌4-16小时， 使用茚三酮测试试剂盒(anaspec，目录号25241)监测，直至反应完成。 接着将二乙胺(et2nh)(0.014ml，0.14mmol)添加至反应混合物，在 18-25℃下搅拌2小时，以去除fmoc保护基。使用茚三酮测试试剂盒 监测反应。完成后，溶剂真空蒸发，得到粗vcp-艾日布林(3)(16mg)， 使用zobax sb-c18柱(5μm，孔径9.4
×
150mm)，在waters alliancee2695hplc系统上，在含有0.1％甲酸的h2o-ch3cn的流动相中， 通过15-70％b的梯度纯化。使vcp-艾日布林(3)(16mg)溶解于dmf (1ml)中。添加许尼希氏碱(7.2μl，41μmol)和顺丁烯二酰亚胺基
ꢀ‑
peg
2-nhs(4)(9.7mg，27μmol)。在18-25℃下搅拌反应混合物3小 时。通过hplc(h2o-ch3cn，含有0.1％甲酸)，通过15-70％b的梯 度，纯化反应混合物。通过冻干来去除溶剂，得到mal-(peg)
2-val-cit
‑ꢀ
对氨基苯甲氧基羰基(pab)-艾日布林(mal-(peg)
2-vcp-艾日布林) (5)。
[0426]
2.1.2还原条件优化
[0427]
通过用有限摩尔当量的非硫醇还原剂三(2-羧乙基)膦(tcep)部分 还原，产生未配对半胱氨酸，来制备morab-003 adc。对 morab-003进行初始研究，其中改变抗体浓度、tcep浓度和孵育 时间，目标为每一抗体分子产生平均4个可偶联位点。使用荧光测定 硫醇定量测定，测定游离硫醇位点数目。此分析的结果展示于表12 中。还通过sds-page分析在孵育10min、30min、60min或120min 后h-h和h-l键断裂的程度(图3)。对于此分析，将未还原和还原样 品负载在sds-page凝胶上，且在185v下进行电泳1小时。在图3 中，泳道m对应于蛋白质标准品。泳道1对应于未经处理的未还原 morab-003。泳道2对应于在70.6μm tcep中还原的morab-003 (5.3mg/ml)。泳道3对应于在141.2μm tcep中还原的morab-003 (5.3mg/ml)。泳道4对应于在20μm tcep中还原的morab-003(1.5 mg/ml)，泳道5对应于在40μm tcep中还原的morab-003(1.5 mg/ml)。每个亮带的身分指示在右下凝胶上。“h”指示重链，而“l
”ꢀ
指示轻链。
[0428]
表12.morab-003的还原条件的优化
[0429][0430]
sds-page和硫醇含量的分析表明，5.3mg/ml mab在tcep比 mab的4倍摩尔比率下孵育60min提供合理的起始点，因为似乎存 在分子内二硫化物的有限还原(如通过游离硫醇含量所确定)，且几乎 未剩下未还原的mab(未还原的mab充当使用制备的adc的体外和 体内研究中的竞争性抑制物)。利用morab-003，在5.0mg/ml起始 浓度下，进行进一步研究，以使用sds-page分析证实tcep比mab 的此优化摩尔比(图4)。图4中，泳道1对应于蛋白质标准品。泳道2 对应于未经处理的未还原morab-003。泳道3对应于在1:1的 morab-003:tcep比率下处理的morab-003。泳道4对应于在1:2 的morab-003:tcep比率下处理的morab-003。泳道5对应于在 1:3的morab-003:tcep比率下处理的morab-003。泳道6对应于 在1:4的morab-003:tcep比率下处理的morab-003。在还原和去 除tcep后，还使用顺丁烯二酰亚胺基-peg2-生物素进行偶联，以模 拟用于adc制备的细胞毒素的偶联。使用lc-ms进行dar分析。 这些研究的结果提供于表13中。
[0431]
表13.morab-003的还原条件的优化-利用顺丁烯二酰亚胺基
ꢀ‑
peg2-生物素的偶联水平
[0432][0433]
lc，轻链生物素水平；hc，重链生物素水平；dar，每一mab 的生物素[dar＝2(lc) 2(hc)]
[0434]
在生物素偶联后，游离硫醇分析表明无游离硫醇存在于 morab-003-生物素中。此表明在还原二硫键后，通常在所产生的两 个硫醇处发生偶联，且任何未偶联的经还原的二硫化物进行再氧化， 从而重新形成二硫键。选择用于还原以产生adc的最终条件为5.0 mg/ml的抗体浓度、110μm的tcep浓度和60min的孵育时间。在 偶联后此得到dar为4的mab。
[0435]
2.1.3 adc偶联优化
[0436]
因为用于制备adc的第一个细胞毒素为念珠藻环肽(一种疏水 性化合物)，所以用在特定位置具有两个可用于偶联的未配对半胱氨 酸(每一轻链一个)的“替代”抗人类间皮
素抗体进行初始偶联优化实 验。此大大地促进了质谱分析对偶联效率的分析，因为仅仅需要分析 轻链。在顺丁烯二酰亚胺基-ll3-念珠藻环肽偶联于替代抗体期间进 行丙二醇的滴定，接着通过lc-ms分析轻链的偶联效率(表14)。
[0437]
表14.偶联反应中丙二醇浓度的优化
[0438][0439]
50％丙二醇引起可利用位点全部被占据，且被选择用作最终浓度 进行使用。在偶联后未观察到mab偶联的损失(数据未示)，表明丙二 醇对抗体无有害作用。因此，所选的最终偶联反应条件为2.5mg/mlmab最终、0.5x dpbs(添加丙二醇后最终浓度)中顺丁烯二酰亚胺基
ꢀ‑
连接子-细胞毒素:mab的6:1摩尔比、0.5mm edta、50％丙二醇， ph 7.2，在室温下3.5-4小时。在这些反应中，在添加顺丁烯二酰亚 胺基-连接子-细胞毒素前添加丙二醇。
[0440]
2.1.4制备adc和生物物理学表征
[0441]
部分2.1.2中描述的所建立的还原和偶联条件用于制备表15中所 列的前10个morab-003 adc。除m-mmae和m-dm1外，通过还 原二硫化物桥接或限制性赖氨酸利用，制备剩余adc。通过concortisbiosystems公司制备m-mmae和m-dm1，且呈偶联形式接收。
[0442]
还原二硫化物桥接化学将在部分还原过程期间产生的游离硫醇 桥接，使每一还原二硫化物得到一种细胞毒素。理论上，dar＝4的 抗体将h-l与铰链二硫化物再桥接，提供稳定性和均质性均超过传统 偶联方法的adc。限制性赖氨酸利用导致非常有限数目的估计70 的暴露溶剂的可用赖氨酸偶联在典型人类igg分子上。使用此方法制 备的morab-003偶联物得到2.0的dar，表明每一h-l对利用单个 赖氨酸。
[0443]
通过hiprep 26/10脱盐色谱纯化所有adc并配制至dpbs中。 通过lc-ms，在所有制备的adc上进行dar分析，且通过 sec-hplc测定聚集水平。这些dar和聚集分析的结果列于表15 中，紧邻各别adc。
[0444]
表15.morab-003 adc的生物物理学分析
[0445][0446][0447]
所有adc的dar值都在预先确定的范围内(3与4之间的dar)。 基于念珠藻环肽的adc的聚集水平显著高于所需(》10％)，而基于艾 日布林(vcp艾日布林)和基于美登素的顺
丁烯二酰亚胺基-连接子-细 胞毒素(er-001161318、er-001161319和m-mmae)都证明可接受的 聚集水平。使用vcp-念珠藻环肽，对与morab-003的偶联反应， 进行其它有机共溶剂的研究。所测试的共溶剂为dmso(10％)、n,n
‑ꢀ
二甲基甲酰胺(20％)、n,n-二甲基乙酰胺(20％)和n,n-二甲基丙酰胺 (20％)。使用这些共溶剂进行偶联后的聚集水平均等于或高于50％丙 二醇。
[0448]
对adc子集进行非还原sds-page分析(图5)。因为确定所有 这些adc的dar为4，所以认为这些adc作为约160kd的完整igg 迁移，这是因为h-l与两个铰链的二硫化物都应再桥接。此adc子 集包括m-mmae(泳道2)、m-dm1(泳道3)、m-0026(泳道4)、m-0260 (泳道5)、m-0267(泳道6)、m-0272(泳道7)、m-0285(泳道8)、m-292 (泳道9)、m-027-0381(泳道10)和m-0384(泳道11)(图5)。图5中， 泳道1对应于蛋白质标准品。
[0449]
由此分析清楚，对于还原二硫化物桥接化学adc(泳道4-9、11)， 除完整adc外，存在显著h-l单价物质(80kd)。此表明除链间铰链 桥接外，还存在显著的链内铰链二硫化物桥接。sec-hplc分析指示 adc作为单一完整igg迁移，这表明对于具有链内h-h桥接的那些 adc，在最终adc中重链非共价缔合。
[0450]
2.2 morab-003 adc的体外效力分析
[0451]
2.2.1对igrov1和sjsa-1细胞的细胞毒性
[0452]
如部分1.4.1中所详述，使用结晶紫测定来评定所制备的adc的 体外效力。
[0453]
在igrov1(fr
hi( )
)和sjsa-1(fr
neg(-)
)细胞上，对所有 morab-003 adc进行初始筛选。igrov1细胞来源于人类卵巢上皮 癌，且表达高水平的叶酸受体α(fr)-morab-003的标靶抗原。sjsa-1 细胞为对叶酸受体α呈阴性的人类骨肉瘤肿瘤细胞系。还在caov3 (人类卵巢癌，fr
med( )
)、nci-h2110(人类非小细胞肺癌，fr
med( )
) 和/或ovcar3(人类卵巢癌，fr
med( )
)细胞中进行所选adc的筛选。 此筛选的结果提供于表16中。
[0454]
表16.在各种肿瘤细胞系上morab-003 adc的细胞毒性(ic
50
) 筛选
[0455][0456][0457]
所有值都为ic
50
，以nm为单位，且为进行的重复实验的平均值。
[0458]
vcp-艾日布林adc对igrov1细胞有效(54pm)且对sjsa-1细 胞很少杀死。对于这些
细胞系，相对于具有同等dar值的adc，例 如m-mmae和m-dm 1，vcp-艾日布林adc证明高效力和特异性。 vcp-艾日布林adc还证明对卵巢(caov3和ovcar3)和非小细胞肺 癌(nc-h2110)来源的其它表达fr的肿瘤细胞系具有有效细胞毒性。
[0459]
adc vcp-艾日布林、ll2-念珠藻环肽、ll3-念珠藻环肽、vcp
‑ꢀ
念珠藻环肽、er-001161318、er-001161319和er-001159200在 caov3(fr
med( )
)细胞中呈现特异性细胞毒性(》2-log特异性)。许多 这些adc呈现低于纳米摩尔的效力。念珠藻环肽偶联物还证明在 igrov1细胞中高效力水平(23pm-86pm)，但除vcp-念珠藻环肽外， 还证明对sjsa-1细胞的可测量的细胞毒性。可裂解美登素偶联物 er-001161318和er-001161319对igrov1(0.26nm和0.49nm)具有 中等效力且对sjsa-1细胞的脱靶杀死很少。
[0460]
所有限制性赖氨酸利用偶联物未证明特异性且不作进一步评估。 使用多司他汀-3(m-0285)、多司他汀-5(m-0115)和多司他汀-14 (m-292和m-0026)的还原二硫化物桥接技术的可裂解偶联物都证明 对igrov1细胞系的特异性细胞毒性，其中对sjsa-1细胞系的细胞 毒性很小。多司他汀-3和多司他汀-5偶联物(奥瑞他汀衍生物)的效力 比多司他汀-14偶联物(美登素衍生物)略高。效力和特异性与使用 val-cit-pab(vcp)连接子附接于单甲基e的m-mmae偶联物可比。 不可裂解的还原二硫化物化学偶联物都缺乏足够效力或特异性，且不 作进一步分析。
[0461]
2.2.2对表达人类叶酸受体的卵巢癌细胞系caov3的细胞毒性
[0462]
还在人类卵巢肿瘤细胞系ovcar3和caov3上，以及人类 nsclc细胞系nci-h2110上测定所选morab-003 adc的效力(表 16)。在人类卵巢细胞系caov3上，念珠藻环肽偶联物证明比vcp
‑ꢀ
艾日布林偶联物可测量得高的效力，不像在igrov1细胞中所观察 到。这可能归因于与igrov1相比较，caov3细胞上叶酸受体α的 表达水平较低，或与艾日布林相比，念珠藻环肽在这些细胞上的效力 较高。基于美登素的偶联物er-001161318、er-001161319和 er-001159200的效力都类似于或低于vcp-艾日布林。
[0463]
2.3 vcp-艾日布林、er-001161318和m-0285的旁观杀死
[0464]
为评定旁观杀死活性，使用两种标记细胞系建立测定。在此测定 中，经nuclight
tm
绿标记的igrov1细胞(fr
hi
)和经nuclight
tm
红标记 的hl-60(fr
neg
)以不同细胞数目比率共同培养，且用morab-003adc vcp-艾日布林、er-001161318或m-0285的滴定液处理。vcp
‑ꢀ
艾日布林为包含顺丁烯二酰亚胺基-peg
2-val-cit-pab可裂解连接子 的基于艾日布林的adc，而er-001161318为包含顺丁烯二酰亚胺基
ꢀ‑
(ch2)
5-val-cit-pab可裂解连接子的基于美登素的adc，且m-0285 为包含peg-pab可裂解连接子的基于多司他汀的adc。通过incucyte 细胞成像器监测细胞毒性。此旁观者细胞毒性分析的结果展示 于表17和图6a-6c中。
[0465]
表17.vcp-艾日布林对fr阳性与fr阴性细胞系的共同培养物 的旁观杀死活性
[0466][0467]
当hl-60(fr
neg
)细胞与igrov1(fr
hi
)细胞以2:1比率培养时， 用morab003-vcp-艾日布林处理引起与单独hl-60细胞相比杀死增 加2-log(表17和图6a)。这些数据表明当与
fr标靶阳性细胞共同培 养时，morab003-vcp-艾日布林更有效地杀死叶酸受体α(fr)标靶 阴性细胞，本文中称为旁观杀死。将旁观杀死与脱靶杀死相区分，脱 靶杀死的定义为在缺乏与标靶阳性细胞共同培养下且不依赖于与标 靶阳性细胞共同培养，独立杀死标靶阴性细胞。所观察到的旁观杀死 增加也与在用游离艾日布林处理hl-60细胞后观察到的增加几乎一 致，表明旁观作用的潜在机制。不希望受任何理论束缚，在fr阳性 igrov1细胞中或接近fr阳性igrov1细胞中，morab003-vcp
‑ꢀ
艾日布林可裂解，所述细胞还经历细胞凋亡且释放游离艾日布林至培 养物中。所释放的细胞毒素可以杀死fr阴性hl-60细胞。
[0468]
相比之下，对morab003-er-001161318仅观察到轻微移动(图 6b)，且对于morab003-0285未观察到移动(图6c)。相对于单独 hl-60细胞，对于morab003-er-001161318，当hl-60:igrov1比 率从2:1降至1:2时，观察到hl-60细胞的可测量杀死，而对于 morab003-0285，旁观作用虽然可检测但仍然低。这些数据表明， 就旁观杀死而言，所评估的morab-003 adc可以排列为vcp-艾日 布林》er-001161318》m-0285。
[0469]
2.4血清稳定性分析
[0470]
假定adc在体内具有长循环半衰期且在细胞毒素释放在循环中 的情况下可能具有毒性，adc应显示在血清中稳定。morab-003adc vcp-艾日布林、er-001161319和m-0285在人类或小鼠血清中 在37℃下预先孵育多达48小时，接着在细胞毒性测定中使用igrov1和sjsa-1细胞评估。er-001161319为包含与vcp-艾日布 林相同的连接子(顺丁烯二酰亚胺基-peg
2-val-cit-pab)的基于美登 素的adc。包括pbs和血清对照以校正血清对测定效能的任何作用。 此研究的结果展示于表18中。
[0471]
表18.所选morab-003 adc的血清稳定性
0285呈单峰迁 移，这表明单个dar物质(图7b)。此分配为dar 4.0。
[0478]
2.5.2通过竞争测定确定的特异性
[0479]
使用竞争测定格式，针对vcp-艾日布林偶联物，证明 morab-003-vcp-艾日布林细胞毒性的抗原特异性(图8)。在此实验 中，morab-003-vcp-艾日布林的滴定液(起始浓度100nm)与2μm 未偶联的morab-003共同孵育。未偶联的morab-003在igrov1 细胞上效力变化2-log，类似于在kb细胞上在imgn853(来自 immunogen的抗人类叶酸受体α-美坦生adc，现在处于ii期临床试 验中)下获得的结果(moore等人,2015american society of clinicaloncology(asco)annual meeting,abstract 5518)。
[0480]
2.5.3对nci-h2110 nsclc细胞的细胞毒性
[0481]
使用结晶紫测定，进行morab003-vcp-艾日布林和 morab003-0285对人类nsclc细胞系nci-h2110的细胞毒性。此 测定的结果展示于表16中。morab003-vcp-艾日布林具有0.73nm 的ic
50
，而morab003-0285具有14nm的ic
50
。
[0482]
2.6体内研究
[0483]
2.6.1 cd-1小鼠品系中morab-003-vcp-艾日布林 (morab-202)的最大耐受剂量(mtd)
[0484]
根据表19中的时程，将未处理cd-1小鼠静脉内注射200μlmorab-202。在给药当天给药前、给药后24小时和其后一周三次测 量体重。在整个研究持续时间期间观察动物的临床健康。给药两周后， 测量终点体重且记录。在研究结束时处理处死的小鼠(以及在研究期 间有任何小鼠处死或发现死亡的情况下)进行尸体解剖。检查器官的 组织损伤征象。
[0485]
表19.研究设计
[0486][0487]
与pbs处理的对照组相比，在任何处理组中都未观察到显著体 重损失，或在处理期间未观察到指示毒性的任何临床发现。个别小鼠 的体重展示于表20中，且组平均数和sem展示于表21中。每组的 体重改变动力学(组平均数和sem)展示于图9中。morab-202在多 达80mg/kg的剂量下经由快速静脉内施用未产生毒性。因此，mtd 超过80mg/kg。
[0488][0489]
2.6.2 cd-1小鼠中艾日布林的最大耐受剂量
[0490]
根据表22中的时程，将未处理cd-1小鼠静脉内注射200μl艾 日布林。包括在每次
给药当天给药前和每次给药后24小时，一周三 次测量体重。在整个研究持续时间期间观察动物的临床健康(最后一 次给药后两周)。测量终点体重且记录。在研究结束时处理处死的小 鼠(以及在研究期间有任何小鼠处死或发现死亡的情况下)进行尸体解 剖。检查器官的组织损伤征象。
[0491]
表22.研究设计
[0492][0493]
在使用q4d
×
3给药方案(每四日一次，共3剂)，施用多达1.6mg/kg 剂量的艾日布林的动物中未观察到体重显著损失或指示毒性的临床 发现。根据相同程序，施用3.2mg/kg在第二剂后诱发所有三只小鼠 中竖毛。与pbs处理的对照相比，观察到严重重量损失(第二剂后一 只小鼠中23％损失，#552；第三剂后其余中17％和8％，#551和#552)。 在尸体解剖期间未观察到小鼠器官的宏观改变。个别小鼠的体重展示 于表23中，且组平均数和sem展示于表24中。每组的体重改变动 力学(组平均数和sem)展示于图10中。
[0494]
使用q4d
×
3给药方案，多达1.6mg/kg剂量的艾日布林未产生毒 性，而3.2mg/kg诱发严重重量损失。因此，此研究中艾日布林的 mtd为1.6mg/kg，q4d
×
3。
[0495][0496]
2.6.3 cb17-scid小鼠中hnsclc nci-h2110模型中 morab003-vcp-艾日布林(morab-202)的最低有效剂量的评估
[0497]
将人类nsclc nci-h2110细胞第47继代皮下植入30只cb17scid小鼠(雌性，5至6周龄，重20克)中。移植14天后，小鼠随机 化至五个组。在处理当天(第0天)每组中的平均肿瘤体积在154-175 mm3之间的范围内(表27)。根据研究设计，招募小鼠用 morab003-vcp-艾日布林(morab-202)(货号nb2900-87e 10/07/15) 以1、2.5或5mg/kg处理，或用morab-003-0285(货号042-150-002) 作为对照以5mg/kg处理，或用pbs处理(表25)。当组中任何动物的 肿瘤体积》2000mm3时，从所述研究去除每组。最后一组在第61天 终止。
[0498]
表25.研究设计
[0499][0500]
个别小鼠中的肿瘤体积展示于表26中，且组平均数和sem展示 于表27中。每组的肿瘤生长动力学(组平均数和平均值的标准误差， sem)展示于图11中，且个别小鼠中的肿瘤体积以及组平均数和sem 展示于图12中。基于第17天肿瘤体积(当观察到第一肿瘤体积》2000 mm3时)，morab-202在1mg/kg下引起肿瘤生长抑制(tgi)47％(对 比盐水，p＝0.002)，在2.5mg/kg下tgi 96％(对比盐水，p《0.0001)。 然而，在处理结束后一至两周，消退的肿瘤重新生长。在用5mg/kgmorab-202处理的小鼠中未检测到肿瘤。在单个剂量处理后超过60 天，这些小鼠保持无肿瘤。morab-003-0285在5mg/kg下引起tgi 89.7％(对比盐水，p《0.0001)。
[0501]
个别小鼠的体重展示于表28中，且组平均数和sem展示于表 29中。每组的体重改变动力学(组平均数和sem)展示于图13中。
[0502]
与对照相比，在任一处理组中，未观察到显著体重损失。
[0503]
morab-202对nci-h2110肿瘤生长展示显著影响。通过在2.5 mg/kg下推注处理，实现肿瘤消退，tgi为94％(对比pbs)。因此， morab-202的最低有效剂量为2.5mg/kg，在此模型中测试。通过5 mg/kg的单个剂量实现肿瘤完全根除。超过60天，未观察到肿瘤生 长。
[0504]
[0505]
[0506]
[0507][0508]
2.6.4 cb17-scid小鼠中hnsclc nci-h2110模型中艾日布林 的最低有效剂量的评估
[0509]
将人类nsclc h2110细胞第46继代皮下植入30只cb17 scid 小鼠(雌性，5至6周龄，重20克)。移植11天后，小鼠随机化至五 个组。排除五只肿瘤体积最偏离平均数的动物。在处理当天(第0天) 每组中的平均肿瘤体积在87.6-89.4mm3之间的范围内(表32)。根据 研究设计，招募的小鼠用0.05、0.2、0.8或1.6mg/kg艾日布林(货号 n1201193)或pbs处理(表30)。当在组内第一次观察到肿瘤体积》2000 mm3时，分别终止每组。在第38天(最后一次给药后30天)终止研究。
[0510]
表30.研究设计
[0511][0512]
个别小鼠中的肿瘤体积展示于表31中，且组平均数和sem展示 于表32中。每组的肿瘤生长动力学(组平均数和sem)展示于图14中， 且第24天(当在pbs处理小鼠中观察到肿瘤体积》2000mm3时)个别 小鼠中的肿瘤体积以及组平均数和sem展示于图15中。0.05mg/kg 下艾日布林引起tgi 50.5％(未观察到肿瘤消退)(对比盐水，p＝ 0.0026)；0.2、0.8或1.6mg/kg下tgi约99％(当与盐水相比时。所 有三组，p值《0.0001)。诱发肿瘤消退的最低有效剂量为0.2mg/kg。 然而，这些小鼠中多数消退肿瘤(0.2mg/kg组中3/5，0.8mg/kg组中 4/5，和1.6mg/kg组中2/5)在整个研究持续时间期间(最后一次给药后 30天)重新生长或仍然可测量。
[0513]
个别小鼠的体重展示于表33中，且组平均数和sem展示于表 34中。每组的体重改变动力学(组平均数和sem)展示于图16中。
[0514]
与盐水处理的对照组相比，在任一处理组中，未观察到显著体重 损失。在处理期间未观察到指示毒性的临床发现。
[0515]
q4d
×
3 i.v.施用的0.2mg/kg和更高剂量的艾日布林展示显著影响 h2110肿瘤生长。实现肿瘤消退。当施用较低剂量(0.05mg/kg)时，未 实现肿瘤消退。因此，此研究中测试的最低有效剂量为0.2mg/kg。
[0516]
[0517]
[0518]
[0519][0520]
实施例2
[0521]
1.材料与方法
[0522]
通过将morab-003(人源化抗人类叶酸受体α)偶联于实施例3 的部分1.1中描述的mal-peg2-val-cit-pab-艾日布林 (er-001159569)化合物来合成morab003-vcp-艾日布林 (morab-202)。偶联方法描述于实施例4的部分1.4.1中。
[0523]
1.1肿瘤模型
[0524]
用于morab-202的另外体外评估的人类肿瘤细胞系包括 igrov1(人类卵巢癌，fr
hi( )
)、ovcar3(人类卵巢癌，fr
med( )
)、 nci-h2110(人类非小细胞肺癌，fr
med( )
)、a431-a3(经人类间皮素 转染的a431亲本细胞系，fr
lo( /-)
)、sjsa-1(人类骨肉瘤，fr
neg(-)
)和 hl-60(人类白血病，fr
neg(-)
)。所有这些细胞系都直接从美国典型培 养物保藏中心(american type culture collection，atcc)获得。对于 体内研究，非小细胞肺癌、三阴性乳腺癌和子宫内膜癌患者来源的异 种移植小鼠模型分别在oncotest gmbh(freiburg,germany)、 oncodesign(dijon,france)和epo berlin-buch gmbh(berlin,germany) 建立和维持。
[0525]
1.2体外细胞毒性分析
[0526]
1.2.1结晶紫测定
[0527]
将igrov1(fr
hi( )
)、a431-a3(fr
lo( /-)
)和sjsa-1(fr
neg(-)
)细胞 在96孔组织培养板中在完全生长培养基中以10,000细胞/孔传代培养 和接种，在37℃、5％co2下孵育过夜(16小时)。通常，测试试剂以 1:4在2ml深孔稀释板中连续稀释，起始于1μm(共稀释10次)。将 100μl稀释样品添加至细胞板(测试样品的起始浓度为100nm)。板 在37℃、5％co2下再孵育48小时。将培养基丢弃，用200μl dpbs 洗涤板一次，在室温下用50μl 0.2％结晶紫溶液染色15min，接着用 自来水大量洗涤。将板进行空气干燥，且用200μl 1％sds溶液溶解 结晶紫。在570nm下读取板。使用graphpad prism 6分析数据。对 于ovcar3(fr
med( )
)和nci-h2110(fr
med( )
)，细胞以3,000个细胞 /孔接种且与morab-202一起孵育5天。
[0528]
1.3体内研究
[0529]
1.3.1 nci-h2110异种移植模型
[0530]
动物准备：圈养cb17 scid小鼠(雌性，6周龄)，每一通风笼5 只小鼠。动物可随意取食灭菌食物颗粒和水瓶。在肿瘤移植前，使动 物适应新环境5-7天。
[0531]
细胞培养：将nci-h2110细胞从冰冻原料(nb2813-65)解冻且在 5％co2中在37℃下在补充有10％胎牛血清(fbs)的rpmi-1640培养 基中培养。继代两次后，在汇合大约70％后，通过使用细胞解离溶液 收获细胞，用无血清培养基洗涤两次且计数。
[0532]
肿瘤移植：将含细胞悬浮液的无血清培养基与冰冷基质胶以1:1 (v:v)混合，达至1.0
×
108个细胞/毫升的最终浓度。每只小鼠皮下注射 100μl 1.0
×
107个细胞/小鼠的混合物。27g针用于所有注射。监测小 鼠的临床健康，且通过数字卡尺每周测量肿瘤三次，在移植后第3天 开始。使用下式计算肿瘤体积(mm3)：w(mm)
×
l(mm)
×
d(mm)
×ꢀ
π/6。当肿瘤达至约100mm3(平均》70至约130mm3)时，动物随机化 至每组4-5只。排除5只肿瘤体积最偏离平均数的动物。
[0533]
研究设计：根据研究设计(表35)，在随机化当天，招募的实验小 鼠静脉内注射200μl媒介物或1.0、2.5和5mg/kg的morab-202。 在给药前测量体重，且在研究期间每周测量两次。在研究结束时，测 量终点体重且记录。当个别肿瘤体积超过2000mm3时，处死动物。 在达到最大允许肿瘤体积前的早期终止标准包括：(1)肿瘤溃烂大于肿 瘤的50％(v:v)；(2)瘫痪；(3)体重损失》20％；和(4)组内50％动物适 宜终止。在上述终止程序后，处理在研究
期间处死或发现死亡的任何 小鼠。
[0534]
表35.研究设计
[0535][0536]
1.3.2患者来源的异种移植(pdx)模型
[0537]
1.3.2.1非小细胞肺癌(nsclc)pdx模型：lxfa-737(oncotest)
[0538]
肿瘤移植：从裸小鼠中连续继代的lxfa-737肿瘤异种移植物获 得nsclc肿瘤片段。从供体小鼠去除后，将肿瘤切割成片段(边长 3-4mm)并置于含有10％青霉素/链霉素的磷酸盐缓冲盐水(pbs)。通 过吸入异氟烷，将接受动物麻醉，且在腰窝中皮下接受单侧或双侧肿 瘤植入物。以《65％的获取速率，每只小鼠，肿瘤异种移植物植入一 或两个肿瘤。在双侧获取的情况下，在随机化前移植这些肿瘤之一。 每天监测动物和肿瘤植入物，直至在足够数目的动物中可检测到实体 瘤生长。在随机化时，测定生长肿瘤的体积。满足随机化标准(即载 有50-250mm3，优选80-200mm3的肿瘤)的动物分配至由每组5-6只 动物组成的实验组中，目标为大约100-120mm3的可比中位和平均组 肿瘤体积。处死未用于实验的动物。随机化之日被指定为实验第0天。
[0539]
实验设计：根据研究设计(表36)，在随机化当天，招募的实验小 鼠静脉内注射媒介物、5mg/kg的morab-003或5mg/kg的 morab-202。在每个给药日在给药前测量体重，且在研究期间每周 测量两次。在研究结束时，测量终止体重且记录。当个别肿瘤体积超 过2000mm3时，处死动物。
[0540]
表36.研究设计
[0541][0542]
1.3.2.2三阴性乳腺癌(tnbc)pdx模型：od-bre-0631 (oncodesign)
[0543]
肿瘤植入：皮下注射患者来源的tnbc肿瘤片段至九只雌性 swiss裸小鼠的右腰窝中。当肿瘤体积达到500-1000mm3时，处死 载有肿瘤的小鼠，并通过手术切除肿瘤。在用γ源照射整个身体(2gy， 60co,biomep,france)后24至72小时，肿瘤片段(30-50mg)原位植 入34只swiss裸小鼠的乳脂垫区域。当肿瘤达到200-300mm3的平 均体积时，总共34只动物中的24只根据其个别肿瘤体积，使用vivo 软件(biosystemes,couternon,france)随机化至两组(n＝12只 动物)。进行统计检验(方差分析)以评估各组之间的均质性。随机化之 日被指定为实验第0天。
[0544]
研究设计：在第1天(随机化后的一天和处理前的两天)，来自两 个未经处理组中的每一个的3只小鼠被终止。根据研究设计(表37)， 在第3天，剩余实验小鼠静脉内注射媒介物或5mg/kg的 morab-202。在第8天(处理后的五天)，来自两个处理组中的每一个 的3只小鼠被终止。在终止后立即收集肿瘤组织并固定在4％中性缓 冲福尔马林中24至48小时，接着包埋于石蜡(，merck, darmstadt,germany)中。被石蜡包埋的样品存储在室温下供随后免疫 组织化学分析。
[0545]
表37.研究设计
[0546][0547][0548]
免疫组织化学(ihc)分析：对被福尔马林固定的石蜡包埋的肿瘤 组织进行ihc染色，以评估morab-202占据和与癌症相关的成纤维 细胞的表达。在染色前，将载玻片脱蜡且在lab vision
tm pt模块 (thermo scientific)中在预温热至85℃的柠檬酸盐缓冲液(ph 6.0)中使 用以下程序重新找回抗原：温热至97℃；在97℃下孵育30min；冷 却至60℃。接着在室温下将载玻片转移至重蒸馏水，历时5min。在 vision
tm
自动染色器360(thermo scientific)中进行染色。简单地说， 将载玻片在1x tris缓冲盐水/tween-20(tbst)中洗涤两次，每次洗 涤历时6min。接着组织切片在阻断缓冲液(300μl)(10％山羊血清 (jackson immunoresearch laboratory公司，目录号005-000-121)，在 3％牛血清白蛋白(bsa)-磷酸盐缓冲盐水(pbs)中稀释)中孵育1小时， 在偶联抗体(200μl)(表38)中孵育1小时，并在1x tbst中洗涤五 次，每次洗涤历时6min。将载玻片在安装培养基中以dapi复染， 且使盖玻片硬化30min。将载玻片在panoramic midi扫描仪 (3dhistech)上处理，并使用halo软件(indica labs)分析ihc影像。 用于此分析的抗体靶向α-平滑肌肌动蛋白(sma)(其为与癌症相关的 成纤维细胞的特定标记物)和人类igg(其可以检测morab-202的存 在)。
[0549]
表38.ihc抗体
[0550][0551]
1.3.2.3子宫内膜癌pdx模型：endo-12961和endo-10590(epo berlin)
[0552]
肿瘤植入：从连续继代的endo-12961和endo-10590肿瘤异种移 植物获得子宫内膜癌肿瘤片段，且作为原料存储于液氮中。肿瘤片段 皮下植入40只nmri nu/nu雌性小鼠的左腰窝中，且监测肿瘤体积。 肿瘤体积为100-160mm3的小鼠随机化至4组之一(组a-d，表39)。 用于随机化的卫星小鼠包括于第五组(组e，表39)中。每组由8只动 物组成。随机化之日被指定为实验第0天。
[0553]
研究设计：根据研究设计(表39)，在随机化当天，招募的实验小 鼠静脉内注射pbs、3.2mg/kg或0.1mg/kg艾日布林或5mg/kg的 morab-202。通过每周测量两个垂直直径两次来评估肿瘤生长，且 计算肿瘤体积(tv)、相对肿瘤体积(rtv)和处理/对照(t/c)值。每周还 评估体重两次，作为毒性的参数，其中计算每组的体重和相对于处理 开始的体重改变(bwc)。当个别肿瘤体积超过1cm3时，或在研究结 束时，处死动物。
[0554]
表39.研究设计
[0555][0556]
1.4作用机制
[0557]
1.4.1 zpredicta中的三维(3d)共同培养系统
[0558]
所有含间质干细胞(msc)的3d共同培养实验都在zpredicta中， 使用器官特定的3d细胞外基质系统，例如rstomach
tm
进行。 rstomach
tm
中骨髓间质干细胞(bm-msc)与nuc red light mkn-74胃 癌细胞系以48孔格式一式四份地共同培养12天。先前已经展示 mkn-74细胞表达足够叶酸受体α(fr)进行morab-202处理，引起 细胞凋亡。在培养前，通过流式细胞术，评估bm-msc的标靶抗原 表达和msc分化的标记物(表40)。
[0559]
表40.msc分化的标记物
[0560][0561]
如表41中所述，rstomach
tm
培养物用morab-202、未偶联的 morab-003抗体、艾日布林或对照处理。对照包括未经处理和媒介 物处理(pbs和dmso)的培养物。通过光学显微术监测msc分化。 一旦观察到可见的分化，则收获样品用于染色和流式细胞术分析。
[0562]
表41.共同培养处理
[0563]
试剂工作浓度morab-20210nmmorab-003(未偶联抗体)10nm艾日布林1.7nm和0.2nmpbs dmso0.1％未处理对照 [0564]
1.4.2 morab-202对与癌症相关的成纤维细胞的作用的时程分 析
[0565]
如部分1.3.1中所述，制备载有皮下h2110异种移植肿瘤的小鼠。 在施用媒介物或5mg/kg morab-202后0天、3天、5天、7天和9 天收获肿瘤样品。在载玻片上处理所收集的肿瘤样品，且如部分 1.3.2.2中所述，通过ihc，分析与癌症相关的成纤维细胞的表达。
[0566]
2.结果
[0567]
2.1.体外细胞毒性分析
[0568]
2.1.1 morab-202的细胞毒性
[0569]
如部分1.2.1中所详述，使用结晶紫测定，评估morab-202的 体外效力。在igrov1(fr
hi( )
)、ovcar3(fr
med( )
)、nci-h2110 (fr
med( )
)、a431-a3(fr
lo( /-)
)和sjsa-1(fr
neg(-)
)细胞上进行筛选。此 筛选的结果提供于图17和表42中。
[0570]
表42.在各种肿瘤细胞系上morab-202的细胞毒性(ec
50
)筛选
[0571][0572][0573]
morab-202显示针对肿瘤细胞系的细胞毒性取决于叶酸受体α 表达，和低水平的脱靶杀死。morab-202展示在igrov1细胞上效 力水平最高(0.01nm)，在叶酸受体α阴性sjsa-1细胞上细胞毒性很 小(》100nm)。在ovcar3和nci-h2110细胞中观察到中等效力
(0.16 nm和0.74nm)。
[0574]
2.2体内研究
[0575]
2.2.1 morab-202在nc1-h2110异种移植模型中的功效
[0576]
载有皮下h2110肿瘤的小鼠静脉内注射媒介物或1、2.5和5 mg/kg的morab-202。在单剂5mg/kg morab-202后观察到显著肿 瘤消退(图18和表43)。使用具有高叶酸受体α表达和施用单剂的此 异种移植模型，展示morab-202对于延迟肿瘤生长的治疗窗为1 mg/kg(疾病稳定)且对于肿瘤消退的治疗窗≥2.5mg/kg。在此研究中， 2.5mg/kg的morab-202引起部分反应，且5mg/kg的morab-202 引起完全反应。
[0577]
表43.morab-202在nc1-h2110异种移植模型中的抗肿瘤活性
[0578][0579]
2.2.2 morab-202在nsclc pdx模型lxfa-737中的功效
[0580]
载有皮下nsclc pdx肿瘤的小鼠静脉内注射媒介物、5mg/kg 的morab-003或5mg/kg的morab-202。与未显示显著抗肿瘤活 性的单剂未偶联morab-003抗体(5mg/kg)对比，单剂morab-202(5 mg/kg)在此模型中引起显著肿瘤消退(图19a)。总共六只用 morab-202处理的小鼠中的五只在研究第32天被视为无肿瘤(表 44)，且至第74天(研究终止)四只保持无肿瘤。另外，与媒介物处理 的对照组相比，处理组中未观察到显著体重损失，表明在处理期间无 毒性(图19b)。
[0581]
表44.morab-202在nsclc pdx模型中的抗肿瘤活性
[0582][0583]
2.2.3 morab-202和艾日布林在子宫内膜癌pdx模型 endo-12961和endo-10590中
的相对功效
[0584]
endo-12961和endo-10590异种移植物表达高水平的叶酸受体α。 载有皮下子宫内膜癌pdx肿瘤的小鼠静脉内注射pbs、3.2mg/kg或 0.1mg/kg艾日布林或5mg/kg morab-202。艾日布林在此模型中的 最大耐药量(mtd)为3.2mg/kg，而0.1mg/kg等同于以5mg/kg施用 的morab-202所提供的艾日布林剂量。贯穿研究开始，在两种动物 模型中，在用morab-202(5mg/kg)和mtd剂量的艾日布林(3.2 mg/kg)处理后，观察到显著抗肿瘤活性，而在用0.1mg/kg处理后未 观察到显著抗肿瘤活性(图20a和20c)。然而，用3.2mg/kg艾日布 林处理的小鼠中消退的肿瘤在研究持续时间期间开始重新生长，而在 用morab-202处理的小鼠中注意到肿瘤未显著重新生长。在此研究 中，发现morab-202比艾日布林显著更有效。艾日布林处理还在处 理后第一周暂时影响体重(图20b和20d)。相比之下，在用 morab-202处理的动物中未观察到体重损失。
[0585]
2.3 morab-202的作用机制
[0586]
2.3.1 morab-202在tnbc pdx模型：od-bre-0631中的ihc 和功效
[0587]
载有皮下tnbc pdx肿瘤的小鼠静脉内注射媒介物或5mg/kgmorab-202。在处理前(第1天)和处理后(第8天)从每组中的小鼠收 集肿瘤组织。所收集的肿瘤组织的ihc分析揭露在第3天施用单剂(5 mg/kg)后，在处理后五天(第8天)morab-202占据表达叶酸受体α 的肿瘤细胞。使用抗人类igg抗体评估细胞占据(图21a)。morab-202 处理还展示减少与癌症相关的成纤维细胞的结构，如利用抗α-平滑肌 肌动蛋白(sma)-fitc抗体的ihc染色所示(图21b)。就功效而言， morab-202处理引起处理后11天最大程度的肿瘤消退，如0.62的 相对肿瘤体积(rtv)所测量(图21c)。
[0588]
2.3.2 morab-202、morab-003和艾日布林对3d共同培养系 统的作用
[0589]
rstomach
tm
中骨髓间质干细胞(bm-msc)与mkn-74胃癌细胞系 共同培养12天。在培养前，通过流式细胞术，评估bm-msc的叶酸 受体α表达和msc分化的标记物。接着rstomach
tm
培养物用 morab-202、未偶联morab-003抗体、艾日布林或对照处理。一旦 通过光学显微术观察到可见的msc分化，则收获样品用于染色和流 式细胞术分析。这些分析的结果展示于图22中。
[0590]
7天的总处理持续时间(在此时间段期间补充处理)足够对与 mkn-74细胞一起培养的人类bm-msc的分化产生可测量的作用。 相对于媒介物对照，用morab-202(10nm)处理引起msc和脂肪细 胞群体增加，和周细胞群体减少(表45)。这些数据表明morab-202 能够对肿瘤微环境具有显著作用。
[0591]
表45.morab-202、morab-003和艾日布林对3d共同培养系 统的作用
[0592][0593]
2.3.3 morab-202对与癌症相关的成纤维细胞的作用的时程分 析
[0594]
在施用媒介物或5mg/kg morab-202后第0天、第3天、第5 天、第7天和第9天，从载有皮下h2110异种移植肿瘤的小鼠收获肿 瘤样品。在载玻片上处理所收集的肿瘤样品，且通过ihc分析与癌 症相关的成纤维细胞(caf)表达。如通过用抗α-平滑肌肌动蛋白 (sma)-fitc抗体染色所评估和定量，caf网状结构在施用单剂5 mg/kg morab-202后第3天和第5天为显著的(图23)。然而，至第7 天，大部分这种结构显著减少。
[0595]
实施例3
[0596]
1.材料与方法
[0597]
具有表46中所示结构的可偶联的艾日布林化合物根据以下程序 合成，且用于制备adc(实施例4)。
[0598]
所有用于合成反应中的溶剂都为无水级(emd millipore)。所有用 于处理或纯化的溶剂都为高效液相色谱(hplc)级(emd millipore)。除 非另外指示，否则所有化学品都可购得。使用sp4进行柱 色谱法。使用旋转蒸发器(b
ü
chi labortechik ag)或离心蒸发器 (genevac,sp scientific)去除溶剂。使用waters autopurification系统和 xterra ms c18柱(5μm，19mm
×
100mm)在酸性流动相条件下，进行 制备型液相色谱-质谱分析(lc/ms)。除非另有说明，否则使用氘化氯 仿(cdcl3)取得核磁共振(nmr)谱，且使用varian仪器(agilenttechnologies)在400mhz或500mhz下记录。使用waters acquity超 高效lc/ms取得质谱。如本文所用，术语“惰性”是指反应器(例如反 应容器、烧瓶、玻璃反应器)中空气经基本上无水分的惰性气体，例 如氮气或氩气替换。使用以下缩写指示多重峰：s＝单峰，d＝二重峰， t＝三重峰，q＝四重峰，quint＝五重峰，sxt＝六重峰，m＝多重峰，dd＝ 双二重峰，ddd＝两个双二重峰，dt＝双三重峰，br s＝宽单峰。
[0599]
表46.可偶联的艾日布林化合物
[0600]
[0601]
[0602]
[0603]
[0604]
[0605][0606]
1.1制备mal-peg2-val-cit-pab-艾日布林(er-001159569)
[0607][0608]
使艾日布林(er-000086526)(61.5mg，0.074mmol)溶解于n,n
‑ꢀ
二甲基甲酰胺(dmf)(6.0ml)且接着与许尼希氏碱(0.027ml，0.156 mmol)和fmoc-val-cit-pab-pnp(86mg，0.112mmol)混合。将反应在 室温下搅拌18小时直至完全偶合，如通过高效液相色谱(hplc)分析 所确定。将二乙胺(0.078ml，0.745mmol)添加至混合物，且将混合 物再搅拌2小时，直至反应结束。通过蒸发去除溶剂，且残余物通过 快速色谱法纯化，得到呈白色固体状的val-cit-pab-艾日布林 (er-001228950)(60mg，71％产率)。1hnmr(400mhz,cd3od)δppm7.56(d,j＝8.4hz,2h),7.32(d,j＝8.4hz,2h),5.14(s,1h),5.06(d,j ＝12.4hz,1h),5.03(s,1h),5.01(d,j＝12.4hz,1h),4.87(s,1h),4.83 (s,1h),4.71(t,j＝4.4hz,1h),4.62(t,j＝4.4hz,1h),4.57(dd,j＝4.8, 8.8hz,1h),4.47(d,j＝10.8hz,1h),4.32-4.27(m,2h),4.18(dd,j＝ 4.8,6.4hz,1h),4.13-4.07(m,2h),3.98(t,j＝10.4hz,1h),3.88-3.82 (m,3h),3.76-3.70(m,4h),3.60(d,j＝6.0hz,1h),3.38(s,3h), 3.26-3.10(m,3h),2.93(dd,j＝2.0,11.2hz,1h),2.91-2.84(m,1h), 2.75-2.64(m,2h),2.44-2.29(m,5h),2.21-1.97(m,8h),1.93-1.83(m, 3h),1.79-1.72(m,5h),1.68-1.29(m,8h),1.11(d,j＝6.8hz,3h), 1.07-1.01(m,1h),1.06(d,j＝7.2hz,3h),1.02(d,j＝7.2hz,3h)。 lcms(m h)＝1135.7。
[0609]
使val-cit-pab-艾日布林(er-001228950)(16mg，14μmol)溶解 于dmf(1ml)。接着在室温下将n,n-二异丙基乙胺(7.2μl，41μmol) 和mal-peg2-nhs(9.7mg，27μmol)添加至此溶液，且将反应混合物 在室温下搅拌1小时。反应结束后，粗混合物通过逆相hplc，使用 含有0.1％甲酸的乙腈-水流动相纯化。合并的洗脱份在未加热的水浴 中在室温下真空浓缩，得到mal-peg2-val-cit-pab-艾日布林 (er-001159569)(7.1mg，5.2μmol，38％产率)。1hnmr(400mhz, cd3od)δppm 7.59(d,j＝8.4hz,2h),7.31(d,j＝8.4hz,2h),6.81(s, 2h),
5.13(s,1h),5.06(d,j＝12.4hz,1h),5.02(s,1h),5.01(d,j＝12.4 hz,1h),4.87(s,1h),4.82(s,1h),4.71(t,j＝4.0hz,1h),4.61(t,j＝ 4.4hz,1h),4.50(dd,j＝5.2,9.2hz,1h),4.47(d,j＝10.8hz,1h), 4.32-4.27(m,2h),4.19(dd,j＝6.8,11.6hz,1h),4.13-4.07(m,2h), 3.98(t,j＝10.4hz,1h),3.88-3.82(m,3h),3.76-3.64(m,6h),3.62-3.51 (m,6h),3.38(s,3h),3.22-3.08(m,4h),2.93(dd,j＝2.4,9.6hz,1h), 2.92-2.84(m,1h),2.76-2.63(m,2h),2.52(t,j＝6.0hz,2h),2.44-2.29 (m,5h),2.21-1.97(m,8h),1.93-1.83(m,3h),1.80-1.66(m,5h), 1.66-1.28(m,10h),1.11(d,j＝6.4hz,3h),1.07-1.01(m,1h),0.99(d, j＝6.8hz,3h),0.97(d,j＝6.4hz,3h)。lcms(m h)＝1374.9。
[0610]
1.2制备nhs-peg2-val-cit-pab-艾日布林(er-001236940)
[0611][0612]
将val-cit-pab-艾日布林(er-001228950)(45mg，0.04mmol)和 3,3'-(乙烷-1,2-二基双(氧基))二丙酸双(2,5-二氧代基吡咯烷-1-基)酯 (79mg，0.198mmol)混合在dmf(1.5ml)中，且接着添加et3n(44.2 μl，0.317mmol)。将混合物搅拌18小时，直至反应结束，如通过hplc 分析所确定。蒸发溶剂且残余物通过快速色谱法纯化，得到呈白色固 体状的nhs-peg2-val-cit-pab-艾日布林(er-001236940)(38mg，68％ 产率)。1hnmr(400mhz,cd3od)δppm 7.58(d,j＝8.4hz,2h),7.33 (d,j＝8.4hz,2h),5.14(s,1h),5.05(d,j＝12.4hz,1h),5.03(s,1h), 5.01(d,j＝12.4hz,1h),4.87(s,1h),4.83(s,1h),4.71(t,j＝4.4hz, 1h),4.62(t,j＝4.4hz,1h),4.51(dd,j＝4.8,8.8hz,1h),4.50-4.47(m, 1h),4.32-4.27(m,2h),4.21(dd,j＝4.8,6.4hz,1h),4.14-4.08(m,2h), 3.99(t,j＝10.4hz,1h),3.88-3.82(m,3h),3.78-3.70(m,4h),3.62 (s,2h),3.62-3.58(m,1h),3.50-3.46(m,2h),3.39(s,4h),3.36(s,3h), 3.22-3.08(m,3h),2.93(dd,j＝2.0,11.2hz,1h),2.91-2.87(m,1h), 2.84(s,2h),2.80(s,2h),2.75-2.64(m,2h),2.59-2.52(m,2h), 2.44-2.29(m,5h),2.21-1.97(m,10h),1.93-1.83(m,3h),1.79-1.72(m, 5h),1.68-1.29(m,8h),1.11(d,j＝6.8hz,3h),1.08-0.98(m,1h),1.00 (d,j＝7.2hz,3h),0.98(d,j＝7.2hz,3h)。lcms
(m h)＝1421.0。
[0613]
1.3制备nhs-(ch2)
5-val-cit-pab-艾日布林(er-001236941)
[0614][0615]
使庚二酸(1.6g，9.99mmol)溶解于四氢呋喃(thf)(100ml)，且 接着添加1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(2.299g，19.98mmol)，接着添加dcc (4.12g，19.98mmol)。将混合物在室温下搅拌18小时直至hplc分 析指示反应结束。固体通过经硅藻土垫过滤来去除，且用thf(3
×
2 ml)洗涤。将合并的滤液浓缩且通过快速色谱法纯化，得到呈白色固 体状的庚二酸双(2,5-二氧代基吡咯烷-1-基)酯(er-001236140)(2.5g， 71％产率)。1hnmr(400mhz)δppm 2.83(s，8h)，2.64(t,j＝7.6hz, 4h),1.80(dt,j＝7.6hz,4h),1.59-1.51(m,2h)。lcms(m h)＝355.2。
[0616]
使用与以上针对制备nhs-peg2-val-cit-pab-艾日布林 (er-001236940)所述相同的程序，由vcp-艾日布林(er-001228950) 和庚二酸双(2，5-二氧代基吡咯烷-1-基)酯(er-001236140)制备 nhs-(ch2)
5-val-cit-pab-艾日布林(er-001236941)(8.5mg，47％产 率)。1hnmr(400mhz,cd3od)δppm 7.56(d,j＝8.4hz,2h),7.30(d, j＝8.4hz,2h),5.13(s,1h),5.04(d,j＝12.0hz,1h),5.01(s,1h),5.00 (d,j＝12.4hz,1h),4.86(s,1h),4.82(s,1h),4.70(t,j＝4.4hz,1h), 4.60(t,j＝4.4hz,1h),4.50(dd,j＝4.8，8.8hz,1h),4.46(d,j＝10.8 hz,1h),4.36-4.25(m,2h),4.17(dd，j＝4.8，6.4hz,1h),4.13-4.06(m, 2h),3.97(t,j＝10.4hz,1h)，3.87-3.80(m,3h),3.74-3.68(m,2h),3.37 (s,3h),3.20-3.06(m,4h),2.94(dd,j＝2.0,11.2hz,1h),2.90-2.82(m, 1h),2.82(s，4h),2.74-2.65(m,2h),2.61(t,j＝8.0hz,2h),2.46-2.26 (m,7h),2.24-1.81(m,13h),1.78-1.28(m,19h),1.10(d,j＝6.8hz,3h), 1.06-0.96(m,1h),0.97(d,j＝7.2hz,3h),0.95(d,j＝7.2hz,3h)。 lcms(m h)＝1375.1。
[0617]
1.4制备mal-(ch2)
5-val-cit-pab-艾日布林(er-001235638)
[0618][0619]
使艾日布林(er-000086526)(10mg，0.012mmol)溶解于dmf(1 ml)，且与mc-val-cit-pab-pnp(9.02mg，0.012mmol)和许尼希氏碱 (4.44μl，0.025mmol)混合。接着将混合物在室温下搅拌12小时， 直至hplc分析指示反应结束。将反应混合物浓缩且通过快速色谱法 纯化，得到呈白色固体状的mal-(ch2)
5-val-cit-pab-艾日布林 (er-001235638)(11.3mg，63％产率)。1hnmr(400mhz,cd3od)δ ppm 7.57(d,j＝8.4hz,2h),7.31(d,j＝8.4hz,2h),6.79(s,2h),5.13 (s,1h),5.05(d,j＝12.4hz,1h),5.02(s,1h),5.00(d,j＝12.4hz,1h), 4.87(s,1h),4.83(s,1h),4.71(t,j＝4.4hz,1h),4.61(t,j＝4.4hz,1h), 4.56-4.46(m,3h),4.35-4.27(m,2h),4.20-4.07(m,4h),3.98(t,j＝10.8 hz,1h),3.87-3.83(m,3h),3.73-3.70(m,2h),3.48(t,j＝7.6hz,2h), 3.38(s,3h),3.20-3.08(m,4h),2.93(dd,j＝1.6,9.6hz,1h),2.89-2.85 (m,1h),2.69(dt,j＝11.2,16.8hz,2h),2.44-2.33(m,5h),2.27-1.83(m, 13h),1.78-1.68(m,5h),1.66-1.27(m,14h),1.11(d,j＝7.2hz,3h), 1.07-0.98(m,1h),0.98(d,j＝7.2hz,3h),0.96(d,j＝7.2hz,3h)。 lcms(m h)＝1328.9。
[0620]
1.5制备mal-peg8-val-cit-pab-艾日布林(er-001242287)
[0621][0622]
将vcp-艾日布林(er-001228950)(10mg，8.808μmol)和1-(2,5
‑ꢀ
二氧代基-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-3-氧代基-7,10,13,16,19,22,25,28-八 氧杂-4-氮杂三十一烷-31-酸2,5-二氧代基吡咯烷-1-基酯(6.07mg， 8.808μmol)混合在dmf(1ml)中，接着添加et3n(9.82μl，0.07 mmol)。将反应混合物在室温下搅拌18小时，直至hplc分析指示 反应结束。通过蒸发去除溶剂，且残余物通过快速色谱法纯化，得到 呈白色固体状的mal-peg8-val-cit-pab-艾日布林(er-001242287)(3.0 mg，20％产率)。1hnmr(400mhz,cd3od)δppm 7.58(d,j＝8.4hz, 2h),7.29(d,j＝8.4hz,2h),6.80(s,2h),5.12(s,1h),5.04(d,j＝12.4 hz,1h),5.01(s,1h),4.99(d,j＝12.4hz,1h),4.85(s,1h),4.80(s,1h), 4.69(t,j＝4.4hz,1h),4.59(t,j＝4.4hz,1h),4.50-4.42(m,2h), 4.32-4.24(m,2h),4.20-4.14(m,2h),4.12-4.04(m,3h),3.96(t,j＝10.4 hz,1h),3.86-3.80(m,3h),3.76-3.57(m,4h),3.48(t,j＝6.0hz,1h), 3.36(s,3h),3.20-3.08(m,3h),2.91(dd,j＝2.0,11.2hz,1h),2.90-2.82 (m,1h),2.74-2.60(m,2h),2.44-2.29(m,5h),2.21-1.97(m,10h), 1.93-1.83(m,3h),1.79-1.20(m,19h),1.09(d,j＝6.8hz,3h), 1.04-0.98(m,1h),0.99(d,j＝7.2hz,3h),0.97(d,j＝7.2hz,3h)。 lcms(m h)＝1711.6。
[0623]
1.6制备nhs-peg9-val-cit-pab-艾日布林(er-001242288)
[0624][0625]
使用与以上针对制备nhs-peg2-val-cit-pab-艾日布林 (er-001236940)所述相同的程序，由vcp-艾日布林(er-001228950) 和bisnhs-peg9制备nhs-peg9-val-cit-pab-艾日布林 (er-001242288)(13mg，85％产率)。1hnmr(400mhz,cd3od)δppm 7.61(d,j＝8.4hz,2h),7.32(d,j＝8.4hz,2h),5.16(s,1h),5.06(d,j ＝12.4hz,1h),5.01(s,1h),5.00(d,j＝12.4hz,1h),4.87(s,1h),4.82 (s,1h),4.71(t,j＝4.4hz,1h),4.61(t,j＝4.4hz,1h),4.52-4.45(m, 2h),4.34-4.26(m,2h),4.20-4.19(m,1h),4.14-4.06(m,2h),3.98(t,j＝ 10.4hz,1h),3.88-3.80(m,3h),3.76-3.70(m,4h),3.66-3.58(m,37h), 3.38(s,3h),3.24-3.10(m,3h),2.93(dd,j＝2.0,11.2hz,1h),2.91-2.84 (m,1h),2.84(s,4h),2.76-2.64(m,2h),2.58-2.50(m,4h),2.46-2.28(m, 5h),2.22-1.96(m,8h),1.91-1.82(m,3h),1.79-1.68(m,5h),1.64-1.24 (m,8h),1.11(d,j＝6.8hz,3h),1.08-0.96(m,1h),0.99(d,j＝7.2hz, 3h),0.97(d,j＝7.2hz,3h)。lcms(m h)＝1729.7。
[0626]
1.7制备nhs-peg3-三唑-peg3-val-cit-pab-艾日布林 (er-001243700)
[0627][0628]
使vcp-艾日布林(er-001228950)(25mg，0.022mmol)溶解于dmf(2.5ml)，且接着与et3n(24.55μl，0.176mmol)和叠氮化物
ꢀ‑
peg3-nhs(8.34mg，0.024mmol)混合。将混合物在
室温下搅拌18 小时，直至hplc分析指示反应结束。将混合物真空浓缩，且残余物 通过制备型hplc(含0.1％甲酸的mecn和水)纯化。含有叠氮化物
ꢀ‑
peg3-val-cit-pab-艾日布林的洗脱份用二氯甲烷(ch2cl2)(3
×
20ml) 萃取，且蒸发ch2cl2，得到呈白色固体状的叠氮化物
ꢀ‑
peg3-val-cit-pab-艾日布林(er-001243116)(18.9mg，63％产率)。 1
hnmr(400mhz,cd3od)δppm 7.58(d,j＝8.4hz,2h),7.30(d,j＝ 8.4hz,2h),5.14(s,1h),5.04(d,j＝12.4hz,1h),5.03(s,1h),5.01(d, j＝12.4hz,1h),4.85(s,1h),4.81(s,1h),4.70(t,j＝4.4hz,1h),4.61 (t,j＝4.4hz,1h),4.52-4.48(m,2h),4.31-4.25(m,2h),4.20-4.15(m, 1h),4.13-4.07(m,2h),3.99(t,j＝10.4hz,1h),3.84-3.79(m,3h), 3.77-3.65(m,4h),3.64-3.56(m,13h),3.38(s,3h),3.20-3.05(m,3h), 2.95-2.80(m,2h),2.75-2.60(m,2h),2.55-2.50(m,2h),2.43-2.25(m, 5h),2.21-1.97(m,8h),1.93-1.83(m,3h),1.79-1.72(m,5h)，1.68-1.29 (m,10h),1.08(d,j＝6.8hz,3h),1.05-0.95(m,1h),0.98(d,j＝7.2hz, 3h),0.95(d,j＝7.2hz,3h)。lcms(m h)＝1365.1。
[0629]
将叠氮化物-peg3-vcp-艾日布林(er-001243116)(9.6mg，7.035 μmol)和3-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸2,5-二氧代基 吡咯烷-1-基酯(6.61mg，0.021mmol)混合在水(0.6ml)和叔丁醇(1.8 ml)中。混合物用n2鼓泡45min。将amberlyst-21上碘化铜(1.23 mmol/g，10mg)添加至混合物且n2鼓泡穿过混合物又30min。接着 将反应混合物在室温下搅拌72小时，直至起始物质完成消耗。通过 lcms分析未观察到所需nhs酯产物，仅仅水解的羧酸。混合物经 短硅藻土垫过滤以去除cui树脂。滤液真空浓缩，且所得残余物通过 制备型薄层色谱法(制备型tlc)(20％meoh/ch2cl2)纯化，得到呈白 色固体状的酸-peg3-三唑-peg3-val-cit-pab-艾日布林 (er-001243701)(3.7mg，33％产率)。lcms(es)(m h)＝1581.2。
[0630]
使酸-peg3-三唑-peg3-val-cit-pab-艾日布林(er-001243701) (3.0mg，1.898μmol)溶解于dmf(200μl)且添加1-羟基吡咯烷-2,5
‑ꢀ
二酮(0.437mg，3.796μmol)，接着添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基) 碳化二亚胺(edc)(0.728mg，3.796μmol)。在室温下搅拌18小时后， 反应约完成50％。添加edc(1.46mg，7.8μmol)，且将混合物再搅拌 18小时，直至hplc分析指示》95％转变成nhs-peg3-三唑
ꢀ‑
peg3-val-cit-pab-艾日布林。混合物真空浓缩，且残余物通过制备 型tlc(15％meoh/ch2cl2)纯化，得到呈白色固体状的nhs-peg3
‑ꢀ
三唑-peg3-val-cit-pab-艾日布林(er-001243700)(2.2mg，69％产率)。 1
hnmr(400mhz,cd3od)δppm 8.00(s,1h),7.59(d,j＝8.0hz,2h), 7.31(d,j＝8.4hz,2h),5.13(s,1h),5.04(d,j＝12.4hz,1h),5.02(s, 1h),5.00(d,j＝12.4hz,1h),4.87(s,1h),4.83(s,1h),4.71(t,j＝4.0 hz,1h),4.63(s,2h),4.61(t，j＝4.4hz,1h),4.57-4.55(m,2h), 4.51-4.45(m,1h),4.32-4.28(m,2h),4.21-4.17(m,2h),4.13-4.10(m, 2h),3.98(t,j＝10.8hz,1h),3.88-3.80(m,5h),3.75-3.70(m,4h), 3.68-3.55(m,18h)，3.45-3.40(m，2h),3.38(s，3h),3.20-3.08(m,4h), 2.93-2.80(m,2h),2.75-2.50(m,2h),2.68(s,4h),2.48-2.30(m,7h), 2.28-1.92(m,10h),1.90-1.68(m,8h),1.65-1.27(m,8h),1.11(d,j＝ 6.8hz,3h),1.05-0.95(m,1h),0.99(d,j＝7.2hz,3h),0.97(d,j＝6.8 hz，3h)。lcms(m h)＝1678.3。
[0631]
1.8制备mal-peg2-ala-ala-asn-pab-艾日布林(er-001231679) 和mal-peg2-(ala-ala-asn-pab)2-艾日布林(er-001231690)
[0632][0633]
使艾日布林(er-000086526)(10mg，0.014mmol)溶解于dmf(0.5 ml)，且与许尼希氏碱(3.59μl，0.021mmol)混合。接着添加 ((s)-1-(((s)-1-(((s)-4-氨基-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯 基)氨基)-1,4-二氧代基丁-2-基)氨基)-1-氧代基丙-2-基)氨基)-1-氧代基 丙-2-基)氨基甲酸(9h-茀-9-基)甲酯(15.76mg，0.021mmol)，且将所得 黄色溶液在室温下搅拌3天，直至hplc分析指示起始物质完全耗尽。 将二乙胺(14.23μl，0.137mmol)添加至反应混合物，其接着在室温 下再搅拌2小时，直至fmoc保护基100％裂解。将反应混合物浓缩 以去除二乙胺，且残余物再溶于dmf(1.5ml)中。在室温下添加et3n (0.015ml，0.11mmol)，接着添加3-(2-(2-(2,5-二氧代基-2,5-二氢-1h
‑ꢀ
吡咯-1-基)乙氧
基)乙氧基)丙酸2,5-二氧代基吡咯烷-1-基酯(9.71mg， 0.027mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16小时，直至反应结束， 如通过lcms分析所确定。混合物真空浓缩，且通过快速色谱法纯 化，得到呈无色油状的mal-peg2-ala-ala-asn-pab-艾日布林 (er-001231679)(9.2mg，49％产率)和mal-peg2-(ala-ala-asn-pab)2
‑ꢀ
艾日布林(er-001231690)(6.0mg，18％产率)。
[0634]
mal-peg2-ala-ala-asn-pab-艾日布林(er-001231679)：1hnmr (400mhz)δppm 9.23(s,1h),8.00(d,j＝7.6hz,1h),7.61(d,j＝8.4 hz,2h),7.38(d,j＝6.8hz,1h),7.24(d,j＝8.4hz,2h),7.13(d,j＝ 7.2hz,1h),6.68(s,2h),6.30(br s,1h),6.04-6.00(m,1h),5.77(br s, 1h),5.42(br s,1h),5.07(s,1h),5.06-4.98(m,2h),4.93(s,1h),4.88(s, 1h),4.90-4.82(m,1h),4.80(s,1h),4.69(t,j＝4.0hz,1h),4.60(t,j＝ 4.0hz,1h),4.49-4.42(m,1h),4.38-4.25(m,4h),4.19(t,j＝4.8hz, 1h),4.15-4.08(m,1h),4.03(t,j＝4.8hz,1h),3.97-3.85(m,3h), 3.83-3.50(m,12h),3.41(s,3h),3.50-3.10(m,3h),3.02-2.64(m,6h), 2.52-2.30(m,7h),2.30-1.65(m,14h),1.65-1.20(m,12h),1.10(d,j＝ 6.8hz,3h),1.13-1.05(m,1h)。lcms(m na)＝1396.6。
[0635]
mal-peg2-(ala-ala-asn-pab)2-艾日布林(er-001231690)： 1
hnmr(400mhz,cd3od)δppm 7.65(d,j＝8.4hz,2h),7.60(d,j＝ 8.4hz,2h),7.28(d,j＝8.8hz,2h),7.23(d,j＝8.4hz,2h),6.79(s, 2h),5.13(s,1h),5.02(s,1h),5.06-4.98(m,4h),4.87(s,1h),4.82(s, 1h),4.85-4.72(m,2h),4.71(t,j＝4.8hz,1h),4.61(t,j＝4.4hz,1h), 4.47(d,j＝11.2hz,1h),4.30-4.06(m,9h),3.97(t,j＝4.8hz,1h), 3.89-3.80(m,3h),3.75-3.48(m,12h),3.38(s,3h),3.17(d,j＝6.8hz, 2h),2.94-2.62(m,8h),2.50-2.28(m,7h),2.22-1.65(m,14h),1.58-1.30 (m,18h),1.10(d,j＝6.8hz,3h),1.06-0.97(m,1h)。lcms (m na)＝1802.8。
[0636]
1.9制备nhs-peg2-ala-ala-asn-pab-艾日布林 (er-001231691)
[0637][0638]
使用与以上针对制备val-cit-pab-艾日布林(er-001228950)所述 相同的程序，由艾日布林(er-000086526)和 fmoc-ala-ala-asn-pab-pnp制备ala-ala-asn-pab-艾日布林 (er-001231678)(15mg，产率定量)。lcms(m h)＝1135.5。
[0639]
使用与以上针对制备nhs-peg2-val-cit-pab-艾日布林 (er-001236940)所述相同的程序，由ala-ala-asn-pab-艾日布林 (er-001231678)和双nhs-peg2制备nhs-peg2-ala-ala-asn-pab
‑ꢀ
艾日布林(er-001231691)(12.4mg，64％产率)。1hnmr(400mhz)δ ppm 9.21(s,1h),7.95(d,j＝8.0hz,1h),7.62(d,j＝8.8hz,2h), 7.58-7.52(m,1h),7.28(br s,1h),7.24(d,j＝8.4hz,2h),7.10(br s, 1h),6.29(d,j＝12.4hz,1h),5.83(br s,1h),5.38(br s,1h),5.07(s, 1h),5.05-4.95(m,2h),4.93(s,1h),4.88(s,1h),4.90-4.83(m,1h), 4.81(s,1h),4.69(t,j＝4.4hz,1h),4.60(t,j＝4.4hz,1h),4.46-4.41 (m,1h),4.36-4.25(m,4h),4.19(dd,j＝4.8,6.0hz,1h),4.15-4.09(m, 1h),4.03(dd,j＝4.8,6.0hz,1h),3.99-3.89(m,3h),3.85-3.50(m, 10h),3.41(s,3h),3.40-3.10(m,3h),3.01-2.60(m,10h),2.60-2.35(m, 7h),2.35-1.65(m,14h),1.65-1.20(m,14h),1.10(d,j＝6.8hz,3h), 1.15-1.03(m,1h)。lcms(es)(m h)＝1442.7。
[0640]
1.10制备叠氮化物-peg3-二硫化物-pab-艾日布林 (er-001237508)
[0641][0642]
使4-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)苯甲酸(1.0g，3.754mmol) 溶于冷却至0℃的二氯甲烷(dcm)(25ml)。接着添加三乙胺(0.549 ml，3.941mmol)，接着添加叠氮磷酸二苯酯(1.085mg，3.941mmol)。 反应混合物缓慢升温至室温且搅拌14小时。将粗混合物用乙酸乙酯 (etoac)/hep(1:1，100ml)稀释，且通过短二氧化硅塞，用etoac/hep (50％)洗脱。真空去除溶剂，得到1.10g 4-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧 基)甲基)苯甲酰基叠氮化物
(er-001131970)。1h nmr(400mhz)δ ppm 7.98(d,2h,j＝8.0hz),7.40(d,2h,j＝8.0hz),4.79(s,2h), 0.94(s,9h),0.10(s,6h)。
[0643]
将溶于甲苯(20ml)中的4-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)苯 甲酰基叠氮化物(er-001131970)(1.1g,3.775mmol)在110℃下加热3 小时。虽然产物未展示为单个斑点，但薄层色谱(tlc)分析表明起始 物质耗尽。接着反应混合物冷却至室温，且转移至密封在氮气下的小 瓶且呈甲苯溶液存储(1ml＝32.6mg)在-20℃下。
[0644]
将三乙胺(0.099ml，0.709mmol)添加至叔丁基((4-异氰酸基苯甲 基)氧基)二甲基硅烷(165mg，0.626mmol)于甲苯(5ml)中的溶液，接 着添加醇(90.0mg，0.591mmol)，且将反应混合物在36℃下搅拌6小 时。通过uplc/ms监测反应进展。接着添加饱和碳酸氢钠(nahco3) 溶液(10ml)，用etoac/hep(1:1，60ml)萃取，用盐水洗涤，经硫酸 钠干燥，且浓缩。粗物质通过快速色谱法(etoac/hep 10％至40％)纯 化，得到215mg(4-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)苯基)氨基甲酸 2-甲基-2-(甲基二硫基)丙酯(er-001131973)。1h nmr(400mhz,)δ ppm 7.34(d,2h,j＝8.4hz),7.26(d,2h,j＝7.6hz),6.63(br.s,1h), 4.69(s，2h),4.17(s,2h)，2.42(s，3h)，1.35(s，6h)，0.93(s，9h)，0.08 (s,6h)。
[0645]
使(4-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)苯基)氨基甲酸2-甲基
ꢀ‑
2-(甲基二硫基)丙酯(er-001131973)(198mg，0.476mmol)和4-甲基 苯磺酸2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酯(325mg，0.87 mmol)溶于dmf(6.6ml)中。接着添加碳酸铯(621mg，1.905mmol)， 接着添加四丁基碘化铵(45mg，0.122mmol)，且将反应混合物在36℃ 下搅拌15小时。通过uplc/ms监测反应进展。接着添加饱和nh4cl 溶液(30ml)，用etoac/hep(2:1，150ml)萃取，用盐水(10ml)洗涤， 经硫酸钠干燥，且真空浓缩。粗物质通过快速色谱法(etoac/hep 20％ 至50％)纯化，得到248mg(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基) 乙基)(4-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)苯基)氨基甲酸2-甲基
ꢀ‑
2-(甲基二硫基)丙酯(er-001140141)。1h nmr(400mhz)δppm 7.28 (d,2h,j＝8.4hz),7.20(d,2h,j＝8.0hz),4.73(s,2h),4.06(br.s, 2h),3.83(dd,2h，j＝6.4,5.6hz),3.68-3.56(m,12h),3.37(dd,2h, j＝5.6,5.2hz),2.33(s,3h),1.14(br.s,6h),0.93(s,9h),0.09(s,6 h)。
[0646]
使(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)(4-(((叔丁基二 甲基硅烷基)氧基)甲基)苯基)氨基甲酸2-甲基-2-(甲基二硫基)丙酯 (er-001140141)(81mg，0.131mmol)溶解于甲醇(5ml)与水(0.5ml) 的混合物。接着将乙酸(0.5ml，8.734mmol)添加至反应混合物，且 在38℃下搅拌14小时。反应混合物冷却至室温，且真空去除溶剂。 残余物用etoac(30ml)稀释，用水(2
×
5ml)、nahco3和盐水(3ml) 洗涤，经硫酸钠干燥，且真空浓缩。粗物质通过快速色谱法(etoac/hep 30％至90％)纯化，得到61.0mg(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙 氧基)乙基)(4-(羟基甲基)苯基)氨基甲酸2-甲基-2-(甲基二硫基)丙酯 (er-001140549)。1h nmr(400mhz)δppm 7.34(d,2h,j＝8.8hz), 7.26(d,2h,j＝8.0hz),4.69(d,2h,j＝4.4hz),4.06(br.s,2h), 3.84(dd,2h,j＝6.2,6.2hz),3.66-3.56(m,12h),3.37(dd，2h,j＝ 5.2,5.2hz),2.33(s,3h),1.74(br.s,1h),1.14(br.s,6h)。
[0647]
使(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)(4-(羟基甲基) 苯基)氨基甲酸2-甲基-2-(甲基二硫基)丙酯(er-001140549)(60mg， 0.119mmol)溶解于冷却至0℃的dcm(2ml)和py(0.019ml，0.239 mmol)。接着添加含氯甲酸4-硝基苯酯(38.5mg，0.191mmol)的dcm (2ml)和二甲基氨基吡啶(dmap)(2.9mg，0.024mmol)，且将反应混 合物在0℃下搅拌
30min。反应混合物缓慢升温至室温，且搅拌直至 起始物质耗尽(大约2.5小时)。接着溶剂真空去除，且残余物通过快 速色谱法(etoac/hep 10％至35％)纯化，得到78mg(2-(2-(2-(2-叠氮 基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)(4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基) 苯基)氨基甲酸2-甲基-2-(甲基二硫基)丙酯(er-001140550)。1h nmr (400mhz)δppm 8.27(dd,2h,j＝6.8,2.4hz),7.41(d，2h,j＝8.8 hz),7.37(dd，2h,j＝7.2,2.4hz),7.33(d，2h,j＝8.8hz),5.27(s,2 h),4.08(br.s,2h),3.85(dd,2h,j＝5.8,5.8hz),3.66-3.57(m,12h), 3.36(dd,2h,j＝5.2,5.2hz),2.33(br.s,3h),1.19(br.s,6h)。
[0648]
将含(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)(4-((((4-硝基 苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基甲酸2-甲基-2-(甲基二硫基)丙酯 (er-001140550)(30mg，0.045mmol)的dcm(3ml，46.625mmol) 置于氮气下25ml烧瓶，且冷却至0℃。添加含胺(40.8mg，0.049mmol) 的dcm(2ml)和许尼希氏碱(0.024ml，0.135mmol)，接着添加 dmap(1.4mg，0.011mmol)。反应混合物接着缓慢升温至室温，搅 拌3小时，真空浓缩，且通过快速色谱法(etoac/hep 50％至100％， 接着meoh/etoac 3％至8％)纯化，得到45.0mg纯叠氮化物-peg3
‑ꢀ
二硫化物-pab-艾日布林(er-001237508)。1h nmr(400mhz)δppm 7.32(d,2h,j＝8.0hz),7.25(d,2h,j＝7.2hz),5.28(dd,1h,j＝5.6, 5.6hz),5.11-5.04(m,3h),4.93(s,1h),4.88(s,1h),4.81(s,1h),4.69 (dd,1h,j＝4.4,4.4hz),4.60(dd,1h,j＝4.2,4.2hz),4.36(br.s,1h), 4.33(dd,1h,j＝4.0,2.0),4.29(ddd,1h,j＝9.6,4.4,4.4hz),4.18(dd, 1h,j＝6.4,4.4hz),4.14-4.04(m,3h),4.03(dd,1h,j＝6.4,4.4hz), 3.97-3.89(m,3h),3.84-3.78(m,3h),3.67-3.56(m,14h),3.42(s,3h), 3.40-3.35(m,1h),3.37(dd,2h,j＝5.2,5.2hz),3.27(d,1h,j＝3.2 hz),3.20(ddd,1h,j＝12.8,6.0,6.0hz),2.91-2.83(m,2h),2.70(dd,1 h,j＝16.0,10.0hz),2.52-2.40(m,3h),2.35-2.13(m,9h),2.10-2.06(m, 1h),2.01-1.89(m,4h),1.78-1.64(m,4h),1.60-1.52(m,4h), 1.49-1.28(m,5h),1.22-1.07(m,6h),1.09(d,3h,j＝6.0hz)。
[0649]
1.11制备mal-peg4-三唑-peg3-二硫化物-pab-艾日布林 (er-001237504)
[0650][0651]
使叠氮化物(9.0mg，7.151μmol)和3-(2,5-二氧代基-2,5-二氢-1h
‑ꢀ
吡咯-1-基)-n-(3,6,9,12-四氧杂十五-14-炔-1-基)丙酰胺(6.8mg，0.018 mmol)于叔丁醇(1.5ml)和水(0.5ml)中的混合物脱气45min。接着添 加amberlyst-21(1.23mmol/g,10mg)上碘化铜，且再脱气30min。将 反应混合物在室温下搅拌18小时，且通过uplc/ms监测。大部分 起始物质耗尽，且所需产物展示为主要峰。混合物接着从树脂分离， 且在hplc(乙腈/水，含0.05％甲酸)上纯化，得到1.5mg mal-peg4
‑ꢀ
三唑-peg3-二硫化物-pab-艾日布林(er-001237504)。1h nmr(400 mhz)δppm 7.74(s,1h),7.32(d,2h,j＝8.4hz),7.27-7.25(m,2h), 6.69(br.s,2h),5.43(dd,1h,j＝5.6,5.6hz),5.14-5.06(m,3h),4.95(s, 1h),4.89(s,1h),4.82(s,1h),4.70(dd,1h,j＝4.4,4.4hz),4.66(s,2 h),4.62(dd,1h,j＝4.4,4.4hz),4.52(dd,1h,j＝5.2,5.2hz), 4.38-4.31(m,2h),4.30(ddd,1h,j＝10.4,4.0,4.0hz),4.20(dd,1h, j＝6.4,4.4hz),4.16-4.05(m,3h),4.04(dd,1h,j＝6.4,4.4hz), 3.99-3.91(m,3h),3.87-3.80(m,6h),3.70-3.59(m,22h),3.53(dd,2h, j＝5.2,5.2hz),3.44(s,3h),3.43-3.36(m,3h),3.29(d,1h,j＝2.8 hz),3.18(ddd,1h,j＝12.9,6.2,6.2hz),2.92-2.84(m,2h),2.72(dd, 1h,j＝16.0,10.0hz),2.54-2.42(m,5h),2.37-1.90(m,19h), 178-1.52(m,3h),1.50-1.14(m,16h),1.10(d,3h,j＝6.0hz)。lcms (m h)＝1642.1。
[0652]
1.12制备nhs-peg3-三唑-peg3-二硫化物-pab-艾日布林 (er-001244129)
[0653][0654]
使叠氮化物(9mg，7.151μmol)和3-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧 基)乙氧基)丙酸2,5-二氧代基吡咯烷-1-基酯(4.5mg，14.30μmol)于叔 丁醇(1ml)和水(0.5ml)中的混合物脱气45min。接着添加 amberlyst-21上碘化铜(1.23mmol/g，10mg，7.151μmol)，且再脱气 30min。将反应混合物在室温下搅拌18小时，且通过uplc/ms监测。 大部分起始物质耗尽，且所需产物展示为主要峰。混合物接着通过过 滤从树脂分离，用dcm(15ml)萃取，用盐水(3
×
3ml)洗涤，经硫酸 钠干燥，且真空浓缩。残余物(5mg，3.39μmol)与甲苯共沸，溶于 thf(1ml)，且冷却至0℃。添加dcc(4.2mg，0.02mmol)，接着添 加1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(2.2mg，0.019mmol)，且将反应混合物在 室温下搅拌18小时。大部分起始物质耗尽，且如通过uplc/ms确 定，所需产物展示为主要峰。接着将反应混合物浓缩且在制备型tlc (dcm/异丙醇，8％)上纯化，得到2.5mg呈无色油状的nhs-peg3
‑ꢀ
三唑-peg3-二硫化物-pab-艾日布林(er-001244129)。1h nmr(400 mhz,cd2cl2)δppm 7.72(s,1h),7.32(d,2h,j＝8.8hz),7.25(d,2h, j＝8.8hz),5.08-5.04(m,3h),4.93(s,1h),4.85(s,1h),4.78(s,1h), 4.64(dd,1h,j＝4.4,4.4hz),4.58(s,2h),4.55(dd,1h,j＝4.4,4.4 hz),4.48(dd,2h,j＝5.0,5.0hz),4.32(d,1h,j＝6.6hz), 4.27-4.22(m,2h),4.14(dd,1h,j＝6.6,4.8hz),4.10-4.01(m,3h), 4.00(dd,1h,j＝6.8,4.4hz),3.92-3.78(m,9h),3.65-3.53(m,19h), 3.44-3.39(m,4h),3.37(s,3h),3.26(d,1h,j＝3.2hz),3.13(ddd,1h, j＝12.4,6.0,6.0hz),2.91-2.73(m,11h),2.70-2.64(m,2h), 2.54-2.41(m,3h),2.38-1.80(m,16h),1.74-1.52(m,3h),1.41-1.13(m, 10h),1.07(d,3h,j＝6.4hz)。lcms(m h)＝1572.3。
[0655]
1.13制备叠氮化物-peg3-磺酰胺-pab-艾日布林 (er-001138856)
[0656][0657]
使4-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)苯胺(315mg，1.327mmol) 溶解于冷却至0℃的dcm(10ml)。接着添加吡啶(0.268ml，3.317 mmol)，接着经15min添加含5-氰基吡啶-2-磺酰氯(365mg，1.801 mmol)的dcm(10ml)。反应混合物经1小时缓慢升温至室温，且搅 拌2小时。反应混合物用etoac(50ml)稀释，用盐水洗涤，经硫酸 钠干燥，且真空浓缩，得到610mg(103％)n-(4-(((叔丁基二甲基硅烷 基)氧基)甲基)苯基)-5-氰基吡啶-2-磺酰胺(er-001137670)。粗产物理 论上是纯的，不过有颜色。1h nmr(400mhz)δppm 8.94(dd，1h,j＝ 1.8,0.6hz),8.10(dd，1h,j＝8.4,2.0hz),7.99(dd，1h,j＝8.0,0.8 hz),7.18(d,2h,j＝8.2hz),7.15(br.s,1h),7.11(dd,2h,j＝6.8,0.8 hz),4.64(s,2h),0.90(s,9h),0.05
(s,6h)。
[0658]
使n-(4-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)苯基)-5-氰基吡啶-2
‑ꢀ
磺酰胺(er-001137670)(105.0mg，0.26mmol)和4-甲基苯磺酸 2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙酯(143mg，0.383mmol) 溶于dmf(4ml)中。接着添加碳酸钾(k2co3)(144mg，1.041mmol)， 接着添加四丁基碘化铵(19.2mg，0.052mmol)，且将反应混合物在 50℃下搅拌36小时。通过uplc/ms监测反应进展。添加饱和nh4cl 溶液(10ml)，用etoac/hep(2:1，30ml)萃取，用盐水洗涤，经硫酸 钠干燥，且浓缩。粗物质通过快速色谱法(etoac/hep 25％至80％)纯 化，得到118.0mg n-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙 基)-n-(4-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)苯基)-5-氰基吡啶-2-磺酰 胺(er-001138452)(75％)。1h nmr(400mhz)δppm 8.99(dd,1h,j＝ 1.8,0.6hz),8.08(dd,1h,j＝8.2,2.2hz),7.86(dd，1h,j＝8.0,0.8 hz),7.24(d,2h,j＝10hz),7.09(d,2h,j＝8.8hz),4.69(s,2h),4.06 (dd,2h,j＝6.0,6.0hz),3.67(dd,2h,j＝5.2,5.2hz),3.65-3.62(m, 4h),3.58(dd,2h,j＝6.2,6.2hz),3.56-3.53(m,4h),3.38(dd，2h,j ＝5.2,5.2hz),0.93(s,9h),0.08(s,6h)。
[0659]
使n-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-n-(4-(((叔 丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)苯基)-5-氰基吡啶-2-磺酰胺 (er-001138452)(150mg，0.248mmol)溶解于甲醇(6ml)。接着添加 水(0.60ml)，接着添加乙酸(acoh)(0.60ml，10.481mmol)。反应混 合物缓慢升温至38℃，且搅拌14小时。真空去除大部分溶剂。残余 物用etoac(30ml)稀释，用水(2
×
5ml)、nahco3和盐水洗涤，经 硫酸钠干燥，且真空浓缩。粗物质通过快速色谱法(etoac/hep 35％ 至90％)纯化，得到105.0mg n-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧 基)乙基)-5-氰基-n-(4-(羟基甲基)苯基)吡啶-2-磺酰胺(er-001138455) (84％)。1h nmr(400mhz)δppm 8.99(d,1h,j＝1.2hz),8.09(dd，1 h,j＝8.4,2.0hz),7.88(dd,1h,j＝8.4,0.8hz),7.30(d,2h,j＝8.8 hz),7.15(d,2h,j＝8.4hz),4.67(s,2h),4.06(dd,2h,j＝6.2,6.2 hz),3.66(dd,2h,j＝5.0,5.0hz),3.65-3.58(m,6h),3.55-3.51(m, 4h),3.38(dd,2h,j＝5.2,5.2hz。
[0660]
使n-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-5-氰基
ꢀ‑
n-(4-(羟基甲基)苯基)吡啶-2-磺酰胺(er-001138455)(45mg，0.092 mmol)溶解于dcm(3ml)，且在添加吡啶(0.015ml，0.183mmol)后 冷却至0℃。接着添加含氯甲酸4-硝基苯酯(20.3mg，0.101mmol)的 dcm(2ml)和dmap(2.3mg，0.018mmol)。反应混合物缓慢升温至 室温且搅拌2小时。uplc/ms指示剩余一些起始物质。反应混合物 接着真空浓缩，且通过快速色谱法(etoac/hep 12％至40％)纯化，得 到35mg碳酸4-((n-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-5
‑ꢀ
氰基吡啶)-2-磺酰胺基)苯甲酯(4-硝基苯基)酯(er-001235286)(58％) 和20mg起始物质。1h nmr(400mhz)δppm 8.99(d,1h,j＝0.8hz), 8.27(dd,2h,j＝9.2,2.0hz),8.12(dd,1h,j＝7.6,2.0hz),7.92(d,1 h,j＝8.4hz),7.38(d,4h,j＝9.6hz),7.26(d,2h,j＝8.8hz),5.45(s, 2h),4.06(dd,2h,j＝5.8,5.8hz),3.67-3.58(m,8h),3.58-3.50(m, 4h),3.38(dd,2h,j＝6.1,6.1hz)。
[0661]
将碳酸4-(n-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-5-氰 基吡啶-2-磺酰胺基)苯甲酯(4-硝基苯基)酯(er-001235286)(35.0mg， 0.053mmol)置于氮气下25ml烧瓶中，且冷却至0℃。接着添加含胺 (48.5mg，0.059mmol)的dcm(3ml，46.625mmol)和
许尼希氏碱 (0.037ml，0.214mmol)，接着添加dmap(2.61mg，0.021mmol)。 将反应混合物在0℃下搅拌30min，且接着在室温下再搅拌6小时。 反应混合物真空浓缩，且通过快速色谱法(etoac/hep 50％至100％， 接着meoh/etoac 3％至8％)纯化，得到61.0mg纯叠氮化物-peg3
‑ꢀ
磺酰胺-pab-艾日布林(er-001138856)。1h nmr(400mhz)δppm 8.98(d,1h,j＝1.2hz),8.10(dd,1h,j＝8.2,1.8hz),7.87(d,1h,j＝ 8.0hz),7.26(d,2h,j＝6.8hz),7.13(d,2h,j＝8.4hz),5.29(dd,1h, j＝5.6,5.6hz),5.08-5.00(m,3h),4.92(s,1h),4.87(s,1h),4.80(s,1 h),4.68(dd,1h,j＝4.6,4.6hz),4.59(dd,1h,j＝4.6,4.6hz), 4.38-4.30(m,2h),4.28(ddd,1h,j＝10.4,4.0,4.0,hz),4.17(dd,1h, j＝6.2,4.6hz),4.13-4.01(m,4h),3.97-3.88(m,3h),3.82-3.78(m,1h), 3.67-3.50(m,15h),3.41(s,3h),3.40-3.33(m,1h),3.37(dd,2h,j＝ 4.8,4.8hz),3.27(d,1h,j＝3.2hz),3.15(ddd,1h,j＝12.8,6.4,6.4 hz),2.90-2.82(m,2h),2.70(dd,1h,j＝16.0,10.0hz),2.51-2.40(m,3 h),2.34-2.13(m,7h),2.10-2.05(m,1h),1.99-1.88(m,4h), 1.78-1.64(m,5h),1.62-1.52(m,2h),1.50-1.29(m,4h),1.08(d,3h,j ＝6.8hz)。
[0662]
1.14制备mal-peg4-三唑-peg3-磺酰胺-pab-艾日布林 (er-001237505)
[0663][0664]
使叠氮化物(10mg，8.023μmol)和3-(2,5-二氧代基-2,5-二氢-1h
‑ꢀ
吡咯-1-基)-n-(3,6,9,12-四氧杂十五-14-炔-1-基)丙酰胺(9.20mg，0.024 mmol)于叔丁醇(2.1ml)和水(0.7ml)中的混合物脱气45min。接着添 加amberlyst-21上的碘化铜(1.23mmol/g，15mg)，且再脱气30min。 将反应混合物在室温下搅拌18小时，且通过uplc/ms监测。大部 分起始物质耗尽，且所需产物展示为主要峰。反应混合物接着从树脂 分离，且在制备型tlc(dcm/甲醇，7％)上纯化，得到5.5mgmal-peg4-三唑-peg3-磺酰胺-pab-艾日布林(er-001237505)。1hnmr(400mhz,cd2cl2)δppm 9.01(s,1h),8.15(dd,1h,j＝8.0,1.8 hz),7.87(d,1h,j＝8.0hz),7.75(s,1h),7.28(d,2h,j＝8.0hz), 7.14(d,2h,j＝8.4hz),6.68(s,2h),6.47(br.s,1h),5.44(br.s,1h), 5.10-5.02(m,3h),4.94(s,1h),4.86(s,1h),4.80(s,1h),4.68(dd,1h, j＝4.4,4.4hz),4.59(s,2h),4.56(dd,1h,j＝4.4,4.4hz),4.51(dd,
2 h,j＝5.2,5.2,hz),4.34(d,1h,j＝7.6,hz),4.30-4.23(m,2h),4.19
‑ꢀ
4.14(m,2h),4.08(dd,1h,j＝4.0,4.0hz),4.03-3.98(m,2h),3.94
‑ꢀ
3.72(m,8h),3.68-3.46(m,28h),3.38(s,3h),3.38-3.33(m,3h), 3.27(d,1h,j＝3.2hz),3.16-3.02(m,2h),2.90-2.81(m,2h),2.68 (dd,1h,j＝16.2,9.8hz),2.54-2.40(m,7h),2.40-1.8(m,11h), 1.80-1.50(m,3h),1.48-1.25(m,3h),1.09(d,3h,j＝6.4hz)。lcms (m h)＝1630.0。
[0665]
1.15制备nhs-peg3-三唑-peg3-磺酰胺-pab-艾日布林 (er-001244623)
[0666][0667]
使叠氮化物(14mg，0.011mmol)和3-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙 氧基)乙氧基)丙酸2,5-二氧代基吡咯烷-1-基酯(8.80mg，0.028mmol) 于叔丁醇(2ml)和水(1ml)中的混合物脱气45min。接着添加 amberlyst-21上的碘化铜(1.23mmol/g，20mg)，且再脱气30min。将 反应混合物在室温下搅拌18小时，且通过uplc/ms监测。大部分 起始物质耗尽，且所需产物展示为主要峰。反应混合物接着通过用 dcm(2
×
10ml)萃取从树脂分离。dcm层用盐水(4
×
5ml)洗涤，经 硫酸钠干燥，且浓缩成所需产物(其未经任何进一步纯化即用于下一 步)。
[0668]
使粗酸(15.0mg，10.255μmol)溶解于thf(1.5ml)，且冷却至 0℃。接着添加dcc(15.2mg，0.074mmol)，接着添加1-羟基吡咯烷
ꢀ‑
2,5-二酮(8.3mg，0.072mmol)。将反应混合物在室温下搅拌18小时。 uplc/ms指示大部分起始物质耗尽，且所需产物展示为主要峰。反 应混合物浓缩，且在制备型tlc(dcm/异丙醇，8％)上纯化，得到 2.5mg nhs-peg3-三唑-peg3-磺酰胺-pab-艾日布林 (er-001244623)。1h nmr(400mhz,cd2cl2)δppm9.00(s,1h),8.12 (d,1h,j＝8.4hz),8.00(d,1h,j＝8.0hz),7.72(s,1h),7.26(d,2h, j＝8.0hz),7.12(d,2h,j＝8.0hz),5.37(br.s,1h),5.08-5.02(m,3h), 4.93(s,1h),4.85(s,1h),4.78(s,1h),4.66-4.62(m,1h),4.58-4.56(m, 4h),4.33(d,1h,j＝10.8hz),4.29-4.21(m,2h),4.10-3.96(m,4h), 3.93-3.76(m,6h),3.74-3.44(m,27h),3.36(s,3h),3.34-3.24(m,2h), 3.15-3.06(m,1h),2.97(br.s,1h),2.90-2.78(m,8h),2.74-2.08(m,13 h),2.05-1.78(m,
5h),1.73-1.50(m,2h),1.41-1.25(m,4h),1.07(d,3 h,j＝6.0hz)。lcms(m h)＝1560.0。
[0669]
1.16制备mal-peg2-艾日布林
[0670]
使艾日布林(5mg，7μmol)溶解于dmf(0.5ml)，且与顺丁烯二 酰亚胺基-peg2-nhs(5mg，14μmol；broadpharm，目录号bp-21680) 和许尼希氏碱(2.4μl，14μmol)混合。将反应混合物在室温下搅拌2 小时。反应混合物接着通过hplc(水-乙腈梯度30-70％，含有0.1％ 甲酸)纯化。洗脱剂以质量计来收集，且冻干至干燥。最终产率为3.7 mg(3.8μmol，54％)。预测精确质量为968.5da。测量质量为969.6da [m h]。
[0671]
1.17制备mal-peg4-艾日布林
[0672]
使艾日布林(5mg，7μmol)溶解于dmf(0.5ml)，且与顺丁烯二 酰亚胺基-peg4-nhs(6.2mg，14μmol；broadpharm，目录号bp-20554) 和许尼希氏碱(2.4μl，14μmol)混合。将反应混合物在室温下搅拌2 小时。反应混合物接着通过hplc(水-乙腈梯度30-70％，含有0.1％ 甲酸)纯化。洗脱剂以质量计来收集，且冻干至干燥。最终产率为3.7 mg(3.5μmol，50％)。预测精确质量为1056.5da。测量质量为1057.7 da[m h]。
[0673]
1.18制备叠氮基-peg2-艾日布林
[0674]
使艾日布林(5mg，7μmol)溶解于dmf(0.5ml)，且与叠氮基
ꢀ‑
peg2-nhs(4.2mg，14μmol；broadpharm，目录号bp-20524)和许 尼希氏碱(2.4μl，14μmol)混合。将反应混合物在室温下搅拌2小时。 反应混合物接着通过hplc(水-乙腈梯度30-70％，含有0.1％甲酸)纯 化。洗脱剂以质量计来收集，且冻干至干燥。最终产率为2.2mg(2.4 μmol，34％)。预测精确质量为914.5da。测量质量为915.7da[m h]。
[0675]
1.19制备叠氮基-peg4-艾日布林
[0676]
使艾日布林(5mg，7μmol)溶解于dmf(0.5ml)，且与叠氮基
ꢀ‑
peg4-nhs(5.5mg，14μmol；broadpharm，目录号bp-20518)和许 尼希氏碱(2.4μl，14μmol)混合。将反应混合物在室温下搅拌2小时。 反应混合物接着通过hplc(水-乙腈梯度30-70％，含有0.1％甲酸)纯 化。洗脱液以质量计来收集，且冻干至干燥。最终产率为3.0mg(3.0 μmol，43％)。预测精确质量为1002.5da。测量质量为1003.7da [m h]。
[0677]
1.20制备叠氮基-peg4-val-cit-pab-艾日布林
[0678]
使艾日布林(15mg，21μmol)溶解于dmf(1.5ml)，且充分混合。 接着添加许尼希氏碱(5.5μl，32μmol)和fmoc-vcp-pnp(24mg，22 μmol；levena biopharma，目录号vc1003)。将反应混合物在室温下 搅拌过夜(16小时)。反应结束后，将二乙胺(20μl，0.21mmol)添加 至反应混合物，且在室温下搅拌2小时以去除fmoc保护基。使用 waters sqd质谱仪监测脱除保护基反应。反应结束后，将反应混合 物转移至预称重的1.5ml微量离心管。使用冷冻centrivap浓缩器将 溶剂真空蒸发，温度设定在30℃。产率为16mg(14μmol)粗 nh2-val-cit-pab-艾日布林(精确质量1134.6da，67％产率)。
[0679]
使nh2-val-cit-pab-艾日布林(16mg，14.1μmol)溶解于dmf (1.5ml)。接着添加许尼希氏碱(7.2μl，41μmol)和叠氮基-peg4-nhs (11mg，28.2μmol)。将反应混合物在室温下搅拌3小时。反应混合 物接着通过hplc(水-乙腈梯度48-72％，含有0.1％甲酸)纯化。在 m/z 1409下收集洗脱液，且冻干得到叠氮基-peg4-val-cit-pab-艾日 布林(精确质量1407.7da)。获得13mg(9.2μmol)叠氮基
ꢀ‑
peg4-val-cit-pab-艾日布林(65％分步产率，整体44％)。
[0680]
实施例4
[0681]
1.材料与方法
[0682]
除非另有指示，否则所有使用的试剂都从商业供应者以研究级别 或更高级别获得。
[0683]
1.1抗体
[0684]
用于以下研究中的morab-003(人源化抗人类叶酸受体α，25 mg/ml)和morab-009(小鼠-人类嵌合抗人类间皮素，25mg/ml)分 别来自货号nb02962-19和货号030a14。曲妥珠单抗可购得(clingen)， 且来自货号503345。
[0685]
在lccys80具有未配对半胱氨酸的兔-人类嵌合和人源化抗人类 间皮素抗体(表1)在293f细胞中短暂表达或表达为稳定选择的汇集 物。条件培养基如部分1.4.1.2.1中所述纯化和脱半胱氨酸化。
[0686]
1.2细胞毒素
[0687]
可偶联艾日布林化合物如实施例3中所述合成(表46)。原料(10 mm)在dmso中制备且存储在-20℃下，直至使用。
[0688]
1.3肿瘤细胞系
[0689]
在morab-003、morab-009和用顺丁烯二酰亚胺基/丁二酰亚 胺(osu)/叠氮基-连接子-艾日布林化合物制备的曲妥珠单抗adc(表 46)的分析中使用的人类肿瘤细胞系包括igrov1(人类卵巢癌，fr
hi
、 msln
neg
)、nci-h2110(人类非小细胞肺癌，fr
med
、msln
med
)、a431 (fr
neg
、msln
neg
)、nci-n87-luc(人类胃癌，fr
lo
、msln
med
、her2
hi
)、 nugc3(人类胃腺癌，fr
neg
、msln
neg
、her2
neg
)、zr75(人类乳房导 管癌，fr
neg
、msln
neg
、her2
med
)和bt-474(人类乳房导管癌，fr
neg
、 msln
neg
、her2
hi
)。在与mal-peg2-val-cit-pab-艾日布林 (er-001159569)偶联的兔-人类嵌合和人源化抗人类间皮素lccys 80 抗体的分析中使用的人类肿瘤细胞系为a3(经人类间皮素稳定转染 的a431，msln
hi
)、ovcar3(人类卵巢癌，msln
hi
)、hec-251(人 类子宫内膜样，msln
med
)、h226(人类肺鳞状上皮细胞间皮瘤， msln
lo
)和a431亲本(msln
neg
)。使用的所有细胞系直接获自美国典 型培养物保藏中心(atcc)，其中例外为igrov1(在许可下获自美国 国家癌症研究所(national cancer institute))和a3(在morphotek由亲本 a431产生)。
[0690]
1.4抗体-药物偶联
[0691]
1.4.1使用顺丁烯二酰亚胺的基于半胱氨酸的偶联
[0692]
1.4.1.1偶联于链间二硫化物
[0693]
1.4.1.1.1部分还原
[0694]
morab-003和morab-009经缓冲液更换至杜尔贝科磷酸盐缓 冲盐水(dpbs)，然后使用离心浓缩，浓缩至20mg/ml。添加同等体 积的含270μm三(2-羧乙基)膦(tcep)的具2mm edta的1x dpbs， 且在室温下通过轻缓混合80min来还原。除了通过在室温下轻缓混 合40min来还原，曲妥珠单抗以类似方式部分还原。
[0695]
1.4.1.1.2偶联
[0696]
将顺丁烯二酰亚胺基-连接子-艾日布林化合物(于dmso中)以 1:6(mab:化合物)的摩尔比偶联于部分还原的抗体。将化合物添加至 含50％丙二醇的dpbs且充分混合。接着添加同等体积的部分还原的 抗体，且轻缓混合(最终丙二醇浓度为25％)。在室温下偶联
3.5至4 小时。
[0697]
1.4.1.2偶联于lccys80
[0698]
1.4.1.2.1脱半胱氨酰化
[0699]
使用explorer(ge healthcare)，蛋白a柱(ge healthcare) 用10柱体积(cv)20mm磷酸钠、10mm edta ph 7.2(平衡缓冲液) 平衡。然后负载条件培养基，接着用10cv平衡缓冲液洗涤未偶联的 物质。将柱用16cv 20mm磷酸钠、10mm edta、5mm半胱氨酸 ph 7.2以0.5ml/min洗涤16小时，以去除封端基团。接着柱用60cv20mm tris ph 7.5以0.5ml/min洗涤60小时。使用5cv 0.1m甘氨 酸ph 2.9洗脱脱半胱氨酰化的抗体，且使用5体积％2m tris ph 9.0 立即中和。将含有抗体的洗脱份汇集，且使用mwco 20kslide-a-lyzer(thermo fisher)，在dpbs中渗析。
[0700]
1.4.1.2.2偶联
[0701]
将脱半胱氨酰化抗体在dpbs、1mm edta中达至5.0mg/ml， 且在dpbs、1mm edta中制备50％丙二醇。mal-peg2-val-cit-pab
‑ꢀ
艾日布林(er-001159569)(dmso中12mm)添加至50％丙二醇且充分 混合。接着以1:4(mab:化合物)的摩尔比添加同等体积的脱半胱氨酰 化抗体，且轻缓混合。在室温下偶联3.5至4小时。
[0702]
1.4.2使用丁二酰亚胺的基于胺的偶联
[0703]
1.4.2.1偶联
[0704]
抗体(morab-003或morab-009，未还原)在0.1m碳酸氢钠ph 8.3中达至10.0mg/ml。在0.1m碳酸氢钠ph 8.3中制备50％丙二醇。 将丁二酰亚胺(osu)-连接子-艾日布林(于dmso中)添加至50％丙二 醇且充分混合。接着以1:4(mab:化合物)的摩尔比添加同等体积的抗 体，且充分混合。在室温下偶联1小时。通过添加1:20体积的1m trisph 8.0，淬灭偶联反应，且adc如部分1.4.4中所述纯化。
[0705]
1.4.3使用张力促进的炔-叠氮化物化学(spaac)的两步基于胺 的偶联
[0706]
1.4.3.1二苯甲基环辛炔(dbco)衍生化
[0707]
抗体(morab-003或morab-009，未还原)在0.1m碳酸氢钠ph 8.3中达至10.0mg/ml。50％丙二醇在0.1m碳酸氢钠ph 8.3中制备。 将nhs-peg
4-dbco(click chemistry tools，dmso中50mm)添加至 50％丙二醇且充分混合。接着以1:4(mab:化合物)的摩尔比添加同等 体积的抗体，且充分混合。在室温下偶联1小时。如部分1.4.4中所 述纯化，去除未反应的nhs-peg
4-dbco。
[0708]
1.4.3.2偶联
[0709]
在dpbs中制备50％丙二醇。将叠氮基-连接子-艾日布林化合物 添加至50％丙二醇且充分混合。接着将同等体积的经dbco修饰的 morab-003或morab-009以1:4(mab:化合物)的摩尔比添加至混合 物，且充分混合。使spaac偶联在室温下进行过夜。如部分1.4.4 中所述纯化，去除未反应的nhs-peg
4-dbco。
[0710]
1.4.4纯化
[0711]
使用hitrap脱盐柱(ge healthcare)纯化偶联的抗体。在快速蛋白 质液相色谱(fplc)(ge healthcare)上，使用1x dpbs作为操作缓冲 液，进行色谱法，以去除顺丁烯二酰亚胺基/osu/叠氮基-连接子-艾日 布林和丙二醇。如实施例1的部分1.3.1中所述，通过bca测定来测 定最终蛋白质含量。
[0712]
1.5生物物理学表征
[0713]
1.5.1 sec-hplc分析
[0714]
通过尺寸排阻高效液相色谱(sec-hplc)，使用agilent 1260hplc分析adc的聚集。将adc在dpbs中稀释至1mg/ml。接着 将adc(10μl)注射至advanced sec 300a保护柱(4.6mm
×
3.5cm， 2.7μm孔径，agilent)，接着advancedbio 300a柱(4.6mm
×
30cm， 2.7μm孔径)。将adc用含有0.15m nacl和5％ipaph 7.4的0.1m 磷酸钠以0.25ml/min的流速从柱洗脱28min。使用agilentchemstation软件分析所有数据。聚集％计算为[pa
聚集
/pa
全部
]
×
100， 其中pa＝积分峰面积。
[0715]
1.5.2药物抗体比率(dar)的hic-hplc分析
[0716]
使用疏水相互作用hplc(hic-hplc)分析dar。将样品注射至 丁基-np 5，4.6mm id
×
3.5cm，2.5μm无孔尺寸柱(tosoh bioscience)上，且以0.7ml/min洗脱，其中在100％流动相a中平衡 3min，15min梯度(0-100％b)，5min保持在100％b中，1min变成 100％a，和在100％流动相a中再平衡5min。流动相a为25mm磷 酸钠、1.5m硫酸铵ph 7.0。流动相b为25mm磷酸钠、25％异丙醇 ph 7.0。检测在280nm(参考320nm)下进行。通过下式确定dar：
[0717]
[auc
1
2(auc
2
) 3(auc
3
)
…
n(auc
n
)]/σauc
总
]
[0718]
其中auc
1
为对应于与一种细胞毒素偶联的adc的抗体峰的曲 线下面积，auc
2
为对应于与两种细胞毒素偶联的adc的抗体峰的 曲线下面积等等。σauc
总
为所有峰值的组合曲线下面积。
[0719]
1.5.3 lc-ms dar分析
[0720]
还使用lc-ms法，利用waters alliance hplc与sqd/pda检测， 分析dar。在65℃下将样品注射至proteomix rp-1000柱(5μm， 1000a，4.6mm
×
15cm，sepax)上，且洗脱，其中在25％b中平衡3min， 从25％-55％b为27min线性梯度，5min保持在55％b下，1min 变成90％b，5min保持在90％b下，1min变回25％b，和在25％b 下再平衡5min。流动相a为含0.1％tfa的水，且流动相b为含0.1％tfa的乙腈。接着洗脱液分开(10:1)至pda和sqd检测器。将sqd 检测器设定为es ，毛细管电压为3.2kv，锥电压为40v，提取器为 3v，且rf镜为0.2v，源温为150℃，且脱溶剂温度为250℃。质量 数据在200-2000m/z下获得，历时40min，连续模式，扫描时间1 秒。使用masslynx和maxent 1分析数据且脱机反卷积。使用下式计 算dar：
[0721]
2[[auc
lc 1
2(auc
lc 2
) 3(auc
lc 3
)
…
n(auc
lc n
)]/σi
lc
总] 2[[auc
hc 1
2(auc
hc 2
) 3(auc
hc 3
)
…
n(auc
hc n
)]/σauc
hc
总]
[0722]
其中auc
lc 1
为与一种细胞毒素偶联的轻链峰的曲线下面积， auc
lc 2
为与两种细胞毒素偶联的轻链峰的曲线下面积等等。auc
hc
为对应重链的曲线下面积，且σauc
lc
总和σauc
hc
总分别为所有未 偶联和偶联的轻链和重链的组合曲线下面积。
[0723]
1.5.4 lccys80 adc的uplc/esi-ms dar分析
[0724]
通过添加dtt达至20mm的最终浓度，还原adc(1mg/ml)， 接着在60℃下孵育3min。接着使用waters acquity超高效液相色谱 和q-tof premier质谱仪分析样品。在65℃下将样品(各0.5-2μg)注射 至massprep微型脱盐柱上，以0.05ml/min，从柱洗脱，其中在95％ 流动相a中平衡5min，10min梯度(5-90％b)，和在95％流动相a 中再平衡10min。流动相a为含0.1％甲酸的水。流动相b为含0.1％ 甲酸的乙腈。q-tof质谱仪呈正离子电压模式操作，
检测在500-4000 m/z范围内。源参数如下：毛细管电压，2.25kv(完整抗体)-2.50kv(还 原抗体)；取样锥电压，65.0v(完整抗体)或50.0v(还原抗体)；源温， 105℃；脱溶剂温度，250℃；脱溶剂气体流速，550l/小时。使用 masslynx maxent 1函数将轻链蛋白质峰反卷积。未偶联和单偶联的 轻链质量的相对强度用于使用下式计算整体dar：
[0725]
2[lc
1
/σlc
总
]
[0726]
其中lc
1
为与一种细胞毒素偶联的轻链的质量强度，σlc
总
为未 偶联和偶联的轻链的组合强度。
[0727]
1.6结合表征
[0728]
1.6.1 biacore
[0729]
在hbs-p 缓冲液(ge healthcare)中抗体浓度调至2μg/ml。将未 修饰的抗体或adc以10μl/min的流速注射在biacore t100(gehealthcare)上的抗人类igg传感器上，历时1min。为记录抗原与捕 捉抗体的缔合，将一系列递增浓度的抗原以30μl/min的流速注射300 秒。对于抗间皮素抗体，浓度范围为10nm-0.041nm。对于 morab-003和morab-009 adc，浓度范围为100nm-0.41nm。在 相同流速下监测抗原的解离30min。通过以30μl/min的流速注射3mmgcl2达2
×
30秒，来使传感器表面再生。使用biacore t100评估软 件，使用1:1朗缪尔结合模型，分析传感器谱图。
[0730]
1.6.2 elisa-叶酸受体α
[0731]
将重组人类叶酸受体α在涂布缓冲液(50mm碳酸盐-碳酸氢盐缓 冲液，ph 9.6)中稀释至115ng/ml，且在4℃下涂布至96孔maxisorp 黑色板(thermo，目录号43711，100微升/孔)过夜。丢弃涂布溶液， 且使用1x具有0.05％tween-20的pbs(pbst)缓冲液，洗涤板三次。 在室温下在回转式震荡器上板在300μl阻断缓冲液(pbst中1％ bsa)中阻断2小时。将morab-003和morab-003 adc在阻断缓 冲液中稀释至1000ng/ml，接着连续2倍稀释，得到1000ng/ml至 0.98ng/ml的范围。丢弃阻断缓冲液且将100微升/孔稀释抗体添加 至板。板在室温下在回转式震动器上孵育2小时。丢弃抗体溶液且板 使用pbst洗涤三次。将100微升/孔山羊抗人类igg(h l)-hrp(阻 断缓冲液中1:10,000稀释)溶液添加至板，且板在室温下在回转式震 动器上孵育1小时。丢弃二级抗体溶液且板使用pbst洗涤三次。将 100微升/孔quantablu荧光过氧化物酶底物工作溶液(thermo，目录 号15169)添加至板，且板在室温下孵育30min。使用spectramax m5 (molecular devices)，在激发325nm/发射420nm下读取荧光。使用 softmaxpro 5.4.2软件，利用4参数拟合，分析数据。
[0732]
1.6.3 elisa-间皮素
[0733]
将重组人类间皮素在涂布缓冲液(50mm碳酸盐-碳酸氢盐缓冲 液，ph 9.6)中稀释至1μg/ml，且在4℃下涂布至96孔maxisorp黑 色板(thermo，目录号43711，100微升/孔)过夜。丢弃涂布溶液，且 使用1x具有0.05％tween-20的pbs(pbst)缓冲液，洗涤板三次。 在室温下在回转式震荡器上板在300μl阻断缓冲液(pbst中1％ bsa)中阻断2小时。将morab009和morab-009 adc在阻断缓冲 液中稀释至1000ng/ml，接着连续2.5倍稀释，得到1000ng/ml至 0.105ng/ml的范围。丢弃阻断缓冲液且将100微升/孔稀释抗体添加 至板。板在室温下在回转式震动器上孵育2小时。丢弃抗体溶液且板 使用pbst洗涤三次。将100微升/孔山羊抗人类igg(h l)-hrp(阻 断缓冲液中1:10,000稀释)溶液添加至板，且板在室温下在回转式震 动器上孵育1小时。丢弃二级抗体溶液且板使用pbst洗涤三次。将 100微升/孔
quantablu荧光过氧化物酶底物工作溶液(thermo，目录 号15169)添加至板，且板在室温下孵育30min。使用spectramax m5 (molecular devices)，在激发325nm/发射420nm下读取荧光。使用 softmaxpro 5.4.2软件，利用4参数拟合，分析数据。
[0734]
1.7细胞毒性分析
[0735]
1.7.1结晶紫测定
[0736]
将igrov1(fr
hi
、msln
neg
)、nci-h2110(fr
med
、msln
med
)和 a431(fr
neg
、msln
neg
)细胞在96孔组织培养板中在完全生长培养基 中以5,000细胞/孔传代培养和接种，在37℃、5％co2下孵育过夜(16 小时)。测试试剂以1:3在2ml深孔稀释板中连续稀释，起始于200nm (共稀释10次)。将稀释样品(100μl)添加至细胞板(测试样品的起始浓 度为100nm)。将板在37℃、5％co2下再孵育5天。接着丢弃培养 基。用200μl dpbs洗涤板一次，在室温下用50μl 0.2％结晶紫溶液 染色15min，接着用自来水大量洗涤。将板进行空气干燥，且用200 μl 1％sds溶液溶解结晶紫。在570nm下读取板。使用graphpadprism 6分析数据。
[0737]
2.结果
[0738]
2.1 morab-003、morab-009和曲妥珠单抗adc的生物物理 学表征
[0739]
使用表46中所列的可偶联的艾日布林化合物，根据包括以下的 三种偶联方法之一，制备morab-003(人源化抗人类叶酸受体α)、 morab-009(小鼠-人类嵌合抗人类间皮素)和曲妥珠单抗(人源化抗 人类her2)adc：(1)使用非硫醇还原剂tcep，将抗体链间二硫化物 部分还原，接着使用硫醇反应性顺丁烯二酰亚胺基-间隔子-连接子
‑ꢀ
艾日布林构筑体偶联；(2)使用丁二酰亚胺(osu)-间隔子-连接子-艾日 布林构筑体，直接偶联于抗体赖氨酸残基；和(3)使用两步骤方法偶联 于抗体赖氨酸残基，其中osu-peg4-二苯甲基环辛炔首先偶联于赖氨 酸残基，接着使用spaac进行叠氮基-间隔子-连接子-艾日布林构筑 体的正交偶联。
[0740]
在纯化后，通过sec-hplc测定所有morab-003、morab-009 和曲妥珠单抗adc的聚集水平，且使用逆相lc-ms和/或hic-hplc 分析药物抗体比率(dar)。使用逆相lc-ms和hic-hplc分析所有 基于顺丁烯二酰亚胺的adc的dar。通常在所述两种方法之间观察 到小于0.3的dar值差异。相比之下，经由通过赖氨酸残基偶联而 制备的所有adc的dar仅仅用lc-ms分析，因为这些adc的高 度非均质性阻止通过hic-hplc拆分个别dar物质。对于morab-003和morab-009 adc，还使用elisa分析与标靶抗原的 结合。dar和聚集分析的结果展示于表47中，紧邻相应的adc。
[0741]
[0742]
[0743]
[0744]
[0745]
[0746][0747]
2.1.1 morab-003、morab-009和曲妥珠单抗adc
[0748]
就偶联效率与生物物理学参数而言，在morab-003、 morab-009和曲妥珠单抗之间
未观察到显著差异。所有adc证明 类似的dar值和聚集体形成水平。
[0749]
2.1.2基于顺丁烯二酰亚胺的adc
[0750]
对于基于顺丁烯二酰亚胺的adc，除低(《5％)聚集水平外，通过 逆相lc-ms和hic-hplc，与val-cit-pab裂解位点配对的戊基和 peg2间隔子以及与ala-ala-asn-pab裂解位点配对的peg2间隔子都提 供3.5与4.0之间的dar值。然而，当间隔子加长至peg8(与 val-cit-pab裂解位点配对)时，聚集水平增加(11-18％)，且偶联效率降 低，使得dar值在1.1与2.3之间。参见例如表47中 morab003/morab009-er-001159569(短peg连接子)和 morab003/morab009-1242287(长peg连接子)的聚集百分比和 dar值。
[0751]
对于用二硫基-pab裂解位点制备的adc，观察到低dar值(1. 0-1.6)，以及相对较高的聚集水平(10-14％)。与hic-hplc相比，当 这些adc通过lc-ms分析时，观察到显著较低的dar值(参见例如 表47中morab003/morab009-er1237504和morab003/morab0 09-er1237505的lc-ms/hic-hplc dar值)。此结果表明连接子裂 解位点显示ph不稳定性，因为lc-ms分析的流动相为大约3.0，而 hic-hplc分析的流动相为中性。
[0752]
对于用磺酰胺裂解位点制备的adc，观察到低(《5％)聚集水平。 类似于二硫基-pab adc，与hic-hplc(3.9)相比，当通过lc-ms (1.8-2.3)分析时，观察到较低dar值，此再次表明连接子裂解位点显 示ph不稳定性。
[0753]
对于peg2和peg4不可裂解连接子，观察到有效偶联，所得dar 值在4.0与4.7之间。使用这些不可裂解连接子的morab-009 adc 也显示低聚集水平(《2％)，而对应morab-003 adc则观察到略微较 高的聚集水平(peg2和peg4分别为4％和10％)。
[0754]
2.1.3基于丁二酰亚胺的adc
[0755]
使用与间隔子-连接子-艾日布林偶合的丁二酰亚胺制备的所有 adc得到dar值《1.0。为证实此较低偶联效率(相对于顺丁烯二酰亚 胺)并非是偶联程序本身引起的，使用更高化合物:抗体比率重制这些 adc且使用相同dar分析方法重新分析。获得类似结果，此表明不 受理论限制，较低dar值为丁二酰亚胺与艾日布林的组合的固有性 质，且顺丁烯二酰亚胺可以更有效地偶联。通过使用两步法，增加丁 二酰亚胺偶联的效率，其中使用nhs-dbco将dbco首先添加至抗 体，接着添加至叠氮基化合物。如通过逆相hplc分析所测量，与直 接偶联于抗体赖氨酸残基相比，此方法产生更高的dar值。对于具 有磺酰胺(可裂解)、val-cit-pab(可裂解)或peg2/peg4(不可裂解)连 接子的基于丁二酰亚胺的adc，由两步骤偶联所产生的dar值类似 于针对具有磺酰胺裂解位点的基于顺丁烯二酰亚胺的adc所测定的 dar值。不受理论束缚，此结果再次表明丁二酰亚胺-间隔子-连接子
ꢀ‑
艾日布林偶联反应的较低dar值为丁二酰亚胺与艾日布林的组合 的固有性质。
[0756]
2.2 morab-003和morab-009 adc的结合表征
[0757]
对于morab-003 adc，就标靶抗原结合而言，在不可裂解的基 于顺丁烯二酰亚胺的连接子-艾日布林adc与亲本morab-003之间 未观察到显著差异。对于其它基于顺丁烯二酰亚胺的连接子-艾日布 林morab-003 adc，典型地通过elisa分析，观察到相对于亲本 morab-003的标靶抗原结合2至3倍的损失。然而，连接子长度或 连接子组成与较低ec
50
值之间无明显相关性。类似地，对于基于丁 二酰亚胺的连接子-艾日布林morab-003 adc，一般观察到相对于 未偶联的morab-003的标靶抗原结合0至3倍的损失。再次，连接 子长度或连接子组成与较低ec
50
值之间明显无相关性。对于 morab-009 adc，所有adc的ec
50
值相对于
亲本morab-009都 减小2倍。
[0758]
2.3 morab-003、morab-009和曲妥珠单抗adc的体外细胞 毒性分析
[0759]
所制备的morab-003、morab-009和曲妥珠单抗adc的体外 效力使用结晶紫基于细胞的细胞毒性测定来评估。选择用于筛选 morab-003和morab-009 adc的细胞系为igrov1、nci-h2110 和a431。igrov1细胞来源于人类卵巢上皮癌，且表达高水平叶酸 受体α，但无间皮素(即morab-003反应性)。nci-h2110细胞来源 于人类非小细胞肺癌，且表达中等水平的叶酸受体α和间皮素(即 morab-003和morab-009反应性)。a431对照细胞来源于人类表 皮癌且不表达任一标靶抗原。此筛选的结果展示于表48中。还在包 括以下的其它胃癌和乳腺癌细胞系中评估morab-003、morab-009 和包含连接子-毒素顺丁烯二酰亚胺基-peg2-val-cit-pab-艾日布林 (vcp-艾日布林)的曲妥珠单抗adc：nci-n87(fr
lo
、msln
med
、 her2
hi
)、bt-474(fr
neg
、msln
neg
、her2
hi
)、zr-75(fr
neg
、msln
neg
、 her2
med
)和nugc3(fr
neg
、msln
neg
、her2
neg
)。此筛选的结果展示于 表49中。
[0760]
[0761]
[0762]
[0763]
[0764]
[0765]
[0766]
[0767][0768]
2.3.1基于顺丁烯二酰亚胺的adc的细胞毒性
[0769]
所有基于顺丁烯二酰亚胺的morab-003和morab-009 adc都 在igrov1细胞上呈现
特定细胞毒性，其中在抗体之间观察到效力相 差2-3个数量级。val-cit-pab-艾日布林morab-003 adc显示在 igrov1细胞系上的效力高于peg2或peg4不可裂解morab-003adc，但特异性倍数不变。针对morab-009 adc观察到类似倾向， 其中不可裂解morab-009 adc显示在igrov1细胞上的细胞毒性 低于val-cit-pab-艾日布林morab-009 adc。
[0770]
具有基于二硫基和磺酰胺的连接子的基于顺丁烯二酰亚胺的 morab-009 adc显示对nci-h2110细胞系的效力高于igrov1细 胞系。如下所述，这可以归因于培养物中连接子的潜在不稳定性。在 对应morab-003 adc下也观察到有效细胞毒性。相比之下，具有 不可裂解的连接子的基于顺丁烯二酰亚胺的morab-003和 morab-009 adc显示在nci-h2110细胞上相对较低的效力。不受 理论限制，此结果表明在较低标靶表达下，有效负载的有效裂解和释 放可以提高细胞毒性。
[0771]
具有val-cit-pab酶能够裂解的连接子或不可裂解连接子的adc 显示在a431对照细胞上低水平的脱靶杀死(ic
50
》100nm)，而具有 ala-ala-asn-pab酶能够裂解的连接子的adc呈现弱的但可检测的这 些对照细胞杀死。这表明val-cit-pab酶能够裂解的连接子可能比培 养物中ala-ala-asn-pab酶能够裂解的连接子更稳定。另外，具有较短 peg2间隔子的morab-009 adc显示在igrov1细胞中的细胞毒性 高于具有较长peg8间隔子的对应adc。在nci-h2110细胞中，观 察到morab-003和morab-009 adc的此相同倾向，较短间隔子长 度引起较高细胞毒性。
[0772]
具有基于磺酰胺的连接子的adc一般显示比具有基于二硫基的 连接子的对应adc更高的dar值和更低的聚集水平。然而，在这 些类别的adc中都观察到a431对照细胞的nm水平杀死，这表明 基于二硫基和磺酰胺的连接子在培养物中在所检查的分析条件下不 如酶能够裂解的连接子稳定。
[0773]
进一步检查特定连接子-毒素顺丁烯二酰亚胺基
ꢀ‑
peg
2-val-cit-pab-艾日布林(vcp-艾日布林)在不同胃癌和乳腺癌细 胞系上的特异性和效力。除抗人类her2抗体曲妥珠单抗外，vcp-艾 日布林偶联于morab-003和morab-009。morab-003-vcp-艾日 布林显示对表达低水平的叶酸受体α(fr)的nci-n87细胞的弱的但 特异性的杀死，和对剩余三种fr阴性细胞系的较少杀死。 morab-009-vcp-艾日布林还显示对表达中等水平的间皮素的 nci-n87细胞的有效细胞毒性。曲妥珠单抗-vcp-艾日布林对表达高 水平her2的nci-n87和bt-474细胞非常有效(3-6pm，ic
50
)，且还 对仅仅中等表达her2的zr-75乳腺癌细胞有效。morab-003、 morab-009和曲妥珠单抗vcp-艾日布林adc都显示对不表达fr、 间皮素或her2(相应的标靶抗原)的nugc3细胞的低细胞毒性。
[0774]
2.3.2基于丁二酰亚胺的adc的细胞毒性
[0775]
对于igrov1细胞，基于丁二酰亚胺的adc的细胞毒性的倾向 类似于基于顺丁烯二酰亚胺的adc，其中除低dar值外，peg8间 隔子adc还显示低细胞毒性。与对应的基于顺丁烯二酰亚胺的adc 相比较，一般观察到具有酶能够裂解的连接子的基于丁二酰亚胺的 adc对igrov1与nci-h2110细胞的较低细胞毒性，这很可能归因 于较低非dar值。类似于对应的基于顺丁烯二酰亚胺的adc，在基 于二硫基和磺酰胺的连接子下也观察到a431细胞的脱靶杀死。这表 明增加的不稳定性可能由裂解位点引起，而非偶联化学。
[0776]
当进行两步骤偶联时，相对于由直接丁二酰亚胺偶联方法得到的 dar值，观察到较高dar值。这些较高dar值与较高效力相关。 对于vcp-艾日布林morab-003 adc，观察到对
igrov1和nci-h2110细胞的有效细胞毒性。虽然不可裂解的morab-003 adc 证明对igrov1细胞有效(1-4nm)，但其效力仍低于用此方法制备的 vcp-艾日布林morab-003 adc(38pm)，即使dar值可比。另外， 使用两步法制备的不可裂解morab-003 adc对igrov1细胞系的 效力略低于对应的基于顺丁烯二酰亚胺的adc，这可能归因于其较 低的dar值。类似于其基于顺丁烯二酰亚胺的对应物，使用两步法 制备的不可裂解adc也丧失了对nci-2110细胞几乎所有的细胞毒 性。
[0777]
2.4抗人类间皮素(lccys 80)adc的生物物理学表征
[0778]
mal-peg2-val-cit-pab-艾日布林(er-001159569)偶联于八种不 同的抗人类间皮素抗体(表1)。如以上在部分1.6.1中所述，通过 biacore分析来测定亲本抗体的结合亲和力。通过sec-hplc测定所 有抗人类间皮素adc的聚集水平，且使用hic-hplc分析dar。使 用结晶紫基于细胞的细胞毒性测定，在a3(经人类间皮素(msln)稳 定转染的a431，msln
hi
)、ovcar3(人类卵巢，msln
hi
)、hec-251 (人类子宫内膜样，msln
med
)、h226(人类肺鳞状上皮细胞间皮瘤， msln
lo
)和a431亲本(msln
neg
)细胞中评估体外效力。dar、聚集和 细胞毒性分析的结果展示于表50中。
[0779]
表50.抗人类间皮素(lccys 80)adc的生物物理学表征
[0780][0781]
缩写：xi-嵌合；zu-人源化。
[0782]
所有抗人类间皮素adc都保持低聚集水平(《10％聚集体)且显示 对标靶细胞系的高效力。在a3和ovcar3上观察到高效力，而 hec-251和h226细胞对adc细胞毒性具有相对抗性。
[0783]
所选序列：
[0784]
seq id no:1(morab-003重链(hc))
[0785][0786]
seq id no:2(morab-003hc cdr1；kabat):gygls
[0787]
seq id no:3(morab-003hc cdr2；kabat): missggsytyyadsvkg
[0788]
seq id no:4(morab-003hc cdr3；kabat):hgddpawfay
[0789]
seq id no:5(morab-003重链全长前体蛋白氨基酸序列；前导 序列加下划线)
[0790][0791]
seq id no:6(morab-003轻链(lc))
[0792][0793]
seq id no:7(morab-003lc cdr1；kabat):svsssissnnlh
[0794]
seq id no:8(morab-003lc cdr2；kabat):gtsnlas
[0795]
seq id no:9(morab-003lc cdr3；kabat):qqwssypymyt
[0796]
seq id no:10morab-003轻链全长前体蛋白氨基酸序列(前导 序列加下划线)
[0797][0798]
seq id no:11(morab-003hc nt)
[0799][0800]
seq id no:12(morab-003lc nt)
[0801][0802]
seq id no:13(morab-003hc cdr1；imgt):gftfsgyg
[0803]
seq id no:14(morab-003hc cdr2；imgt):issggsyt
[0804]
seq id no:15(morab-003hc cdr3；imgt): arhgddpawfay
[0805]
seq id no:16(morab-003lc cdr1；imgt):ssissnn
[0806]
seq id no:17(morab-003lc cdr2；imgt):gts
[0807]
seq id no:18(morab-003lc cdr3；imgt): qqwssypymyt
[0808]
seq id no:19(人类fra)
[0809][0810]
seq id no:20(人类fra核苷酸)
[0811][0812]
seq id no:21(人类her2)
[0813]
[0814][0815]
seq id no:22(人类her2核苷酸)
[0816]
[0817]
[0818]
[0819][0820]
本技术涉及以下各项：
[0821]
1.一种抗体-药物偶联物，其具有式(i)：
[0822]
ab-(l-d)
p
ꢀꢀꢀ(i)[0823]
其中ab为靶向肿瘤细胞的内化抗体或其内化抗原结合片段；
[0824]
d为艾日布林；
[0825]
l为将ab共价附接于d的可裂解连接子；且
[0826]
p为整数1至20。
[0827]
2.如项1所述的抗体-药物偶联物，其中p为1至8，或1至6。
[0828]
3.如项1或项2所述的抗体-药物偶联物，其中p为2至8，或2 至5。
[0829]
4.如项1至3中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中p为3至 4。
[0830]
5.如项1至4中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中p为4。
[0831]
6.如项1至5中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述可裂 解连接子包含被定位成使得所述连接子或所述抗体或抗原结合片段 中没有部分在裂解后保持结合于艾日布林的可裂解部分。
[0832]
7.如项1至6中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述可裂 解连接子包含可裂解肽部分。
[0833]
8.如项7所述的抗体-药物偶联物，其中所述可裂解肽部分能够 由酶裂解。
[0834]
9.如项7或项8所述的抗体-药物偶联物，其中所述可裂解肽部 分能够由组织蛋白酶裂解。
[0835]
10.如项7至9中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述可裂 解肽部分能够由组织蛋白酶b裂解。
[0836]
11.如项1至10中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述可 裂解肽部分或可裂解连接子包含氨基酸单元。
[0837]
12.如项11所述的抗体-药物偶联物，其中所述氨基酸单元包含 缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)。
[0838]
13.如项11所述的抗体-药物偶联物，其中所述氨基酸单元包含 丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺(ala-ala-asn)。
[0839]
14.如项1至6中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述可裂 解连接子包含可裂解磺酰胺部分。
[0840]
15.如项1至6中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述可裂 解连接子包含可裂解二硫化物部分。
[0841]
16.如项14或项15所述的抗体-药物偶联物，其中所述可裂解连 接子在还原条件下能够裂解。
[0842]
17.如项1至16中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述可 裂解连接子包含至少一种间隔子单元。
[0843]
18.如项1至17中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述间 隔子单元或可裂解连接子包含聚乙二醇(peg)部分。
[0844]
19.如项18所述的抗体-药物偶联物，其中所述peg部分包含
ꢀ‑
(peg)
m-且m为整数1至10。
[0845]
20.如项19所述的抗体-药物偶联物，其中m为2至8。
[0846]
21.如项19或项20所述的抗体-药物偶联物，其中m为2至5。
[0847]
22.如项19至21中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中m为 2。
[0848]
23.如项1至17中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述间 隔子单元或可裂解连接子包含烷基部分。
[0849]
24.如项23所述的抗体-药物偶联物，其中所述烷基部分包含
ꢀ‑
(ch2)
n-且n为整数1至10。
[0850]
25.如项24所述的抗体-药物偶联物，其中n为5。
[0851]
26.如项17至25中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述间 隔子单元经由顺丁烯二酰亚胺部分(mal)附接于所述抗体或抗原结合 片段。
[0852]
27.如项26所述的抗体-药物偶联物，其中所述mal-间隔子单元 与所述抗体或抗原结合片段上的半胱氨酸残基反应。
[0853]
28.如项26或项27所述的抗体-药物偶联物，其中所述mal-间 隔子单元经由所述抗体或抗原结合片段上的半胱氨酸残基接合于所 述抗体或抗原结合片段。
[0854]
29.如项26至28中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述可 裂解连接子包含所述mal-间隔子单元和可裂解肽部分。
[0855]
30.如项29所述的抗体-药物偶联物，其中所述可裂解肽部分包 含氨基酸单元。
[0856]
31.如项29或项30所述的抗体-药物偶联物，其中所述可裂解肽 部分或氨基酸单元包含val-cit。
[0857]
32.如项29或项30所述的抗体-药物偶联物，其中所述可裂解肽 部分或氨基酸单元包含ala-ala-asn。
[0858]
33.如项26至28中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述可 裂解连接子包含所述mal-间隔子单元和可裂解磺酰胺部分。
[0859]
34.如项26至28中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述可 裂解连接子包含所述mal-间隔子单元和可裂解二硫化物部分。
[0860]
35.如项26至34中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述 mal-间隔子单元包含peg部分。
[0861]
36.如项26至34中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述 mal-间隔子单元包含烷基部分。
[0862]
37.如项26至36中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述 mal-间隔子单元将所述抗体或抗原结合片段附接于所述连接子中的 所述可裂解部分。
[0863]
38.如项37所述的抗体-药物偶联物，其中所述连接子中的所述 可裂解部分包含可裂解肽部分。
[0864]
39.如项38所述的抗体-药物偶联物，其中所述可裂解肽部分包 含氨基酸单元。
[0865]
40.如项38或项39所述的抗体-药物偶联物，其中所述可裂解肽 部分或氨基酸单元包含val-cit或ala-ala-asn。
[0866]
41.如项37至40中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述可 裂解连接子包含mal-(peg)
2-val-cit。
[0867]
42.如项37至40中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述可 裂解连接子包含mal-(peg)
8-val-cit。
[0868]
43.如项37至40中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述可 裂解连接子包含mal-(ch2)
5-val-cit。
[0869]
44.如项37至40中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述可 裂解连接子包含mal-(peg)
2-ala-ala-asn。
[0870]
45.如项37至40中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述可 裂解肽部分或氨基酸单元包含val-cit。
[0871]
46.如项37所述的抗体-药物偶联物，其中所述连接子中的所述 可裂解部分包含可裂解磺酰胺部分。
[0872]
47.如项46所述的抗体-药物偶联物，其中所述可裂解连接子包 含mal-(peg)
4-三唑-(peg)
3-磺酰胺。
[0873]
48.如项37所述的抗体-药物偶联物，其中所述连接子中的所述 可裂解部分包含可裂解二硫化物部分。
[0874]
49.如项48所述的抗体-药物偶联物，其中所述可裂解连接子包 含mal-(peg)
4-三唑-(peg)
3-二硫化物。
[0875]
50.如项37至49中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述 mal-间隔子单元包含peg部分。
[0876]
51.如项37至49中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述 mal-间隔子单元包含烷基部分。
[0877]
52.如项17至25中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述间 隔子单元经由丁二酰亚胺部分(osu)附接于所述抗体或抗原结合片 段。
[0878]
53.如项52所述的抗体-药物偶联物，其中所述osu-间隔子单元 与所述抗体或抗原结合片段上的赖氨酸残基反应。
[0879]
54.如项52或项53所述的抗体-药物偶联物，其中所述osu-间 隔子单元经由赖氨酸残基接合于所述抗体或抗原结合片段。
[0880]
55.如项52至54中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述可 裂解连接子包含所述osu-间隔子单元和可裂解肽部分。
[0881]
56.如项55所述的抗体-药物偶联物，其中所述可裂解肽部分包 含氨基酸单元。
[0882]
57.如项55或项56所述的抗体-药物偶联物，其中所述可裂解肽 部分或氨基酸单元包含val-cit。
[0883]
58.如项55或项56所述的抗体-药物偶联物，其中所述可裂解肽 部分或氨基酸单元包含ala-ala-asn。
[0884]
59.如项52至54中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述可 裂解连接子包含所述osu-间隔子单元和可裂解磺酰胺部分。
[0885]
60.如项52至54中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述可 裂解连接子包含所述osu-间隔子单元和可裂解二硫化物部分。
[0886]
61.如项52至60中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述 osu-间隔子单元包含peg部分。
[0887]
62.如项52至60中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述 osu-间隔子单元包含烷基部分。
[0888]
63.如项52至62中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述 osu-间隔子单元将所述抗体或抗原结合片段附接于所述连接子中的 所述可裂解部分。
[0889]
64.如项63所述的抗体-药物偶联物，其中所述连接子中的所述 可裂解部分包含可裂解肽部分。
[0890]
65.如项64所述的抗体-药物偶联物，其中所述可裂解肽部分包 含氨基酸单元。
[0891]
66.如项64或项65所述的抗体-药物偶联物，其中所述可裂解肽 部分或氨基酸单元包含val-cit或ala-ala-asn。
[0892]
67.如项63至66中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述可 裂解连接子包含osu-(peg)
2-val-cit。
[0893]
68.如项63至66中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述可 裂解连接子包含osu-(peg)
9-val-cit。
[0894]
69.如项63至66中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述可 裂解连接子包含osu-(peg)
3-三唑-(peg)
3-val-cit。
[0895]
70.如项63至66中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述可 裂解连接子包含osu-(ch2)
5-val-cit。
[0896]
71.如项63至66中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述可 裂解连接子包含osu-(peg)
2-ala-ala-asn。
[0897]
72.如项63至66中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述可 裂解肽部分或氨基酸单元包含val-cit。
[0898]
73.如项63所述的抗体-药物偶联物，其中所述连接子中的所述 可裂解部分包含可裂解磺酰胺部分。
[0899]
74.如项73所述的抗体-药物偶联物，其中所述可裂解连接子包 含osu-(peg)
3-三唑-(peg)
3-磺酰胺。
[0900]
75.如项63所述的抗体-药物偶联物，其中所述连接子中的所述 可裂解部分包含可裂解二硫化物部分。
[0901]
76.如项75所述的抗体-药物偶联物，其中所述可裂解连接子包 含osu-(peg)
3-三唑-(peg)
3-二硫化物。
[0902]
77.如项63至76中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述osu-间隔子单元包含peg部分。
[0903]
78.如项63至76中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述 osu-间隔子单元包含烷基部分。
[0904]
79.如项17至78中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中将所述 连接子中的所述可裂解部分直接接合于艾日布林，或其中间隔子单 元将所述连接子中的所述可裂解部分附接于艾日布林。
[0905]
80.如项所述79项的抗体-药物偶联物，其中所述偶联物的裂解 自所述抗体和连接子释放艾日布林。
[0906]
81.如项79或项80所述的抗体-药物偶联物，其中将所述连接子 中的所述可裂解部分附接于艾日布林的所述间隔子单元为自消耗 的。
[0907]
82.如项79至81中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中将所述 连接子中的所述可裂解部分附接于艾日布林的所述间隔子单元包含 对氨基苯甲氧基羰基(pab)。
[0908]
83.如项82所述的抗体-药物偶联物，其中所述pab将所述连接 子中的所述可裂解
部分附接于艾日布林。
[0909]
84.如项82或项83所述的抗体-药物偶联物，其中所述pab经 由c-35胺共价附接于艾日布林。
[0910]
85.如项79至84中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述连 接子中的所述可裂解部分包含可裂解肽部分。
[0911]
86.如项85所述的抗体-药物偶联物，其中所述可裂解肽部分包 含氨基酸单元。
[0912]
87.如项85或项86所述的抗体-药物偶联物，其中所述可裂解肽 部分或氨基酸单元包含val-cit或ala-ala-asn。
[0913]
88.如项85至87中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述可 裂解连接子包含val-cit-pab。
[0914]
89.如项85至87中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述可 裂解连接子包含ala-ala-asn-pab。
[0915]
90.如项85至87中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述可 裂解肽部分或氨基酸单元包含val-cit。
[0916]
91.如项79至84中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述连 接子中的所述可裂解部分包含可裂解磺酰胺部分。
[0917]
92.如项91所述的抗体-药物偶联物，其中所述可裂解连接子包 含磺酰胺-pab。
[0918]
93.如项79至84中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述连 接子中的所述可裂解部分包含可裂解二硫化物部分。
[0919]
94.如项93所述的抗体-药物偶联物，其中所述可裂解连接子包 含二硫化物-pab。
[0920]
95.如项1至94中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗 体或抗原结合片段为抗叶酸受体α抗体。
[0921]
96.如项95所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗体或抗原结合 片段包含：如kabat编号系统所定义，三个重链互补决定区 (hcdr)，其包含seq id no:2(hcdr1)、seq id no:3(hcdr2)和 seq id no:4(hcdr3)的氨基酸序列；和三个轻链互补决定区 (lcdr)，其包含seq id no:7(lcdr1)、seq id no:8(lcdr2)和 seq id no:9(lcdr3)的氨基酸序列；或如imgt编号系统所定义， 三个重链互补决定区(hcdr)，其包含seq id no:13(hcdr1)、 seq id no:14(hcdr2)和seq id no:15(hcdr3)的氨基酸序列； 和三个轻链互补决定区(lcdr)，其包含seq id no:16(lcdr1)、seq id no:17(lcdr2)和seq id no:18(lcdr3)的氨基酸序列。
[0922]
97.如项95或项96所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗体或抗 原结合片段包含有包含seq id no:23的氨基酸序列的重链可变区和 包含seq id no:24的氨基酸序列的轻链可变区。
[0923]
98.如项1至94中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗 体或抗原结合片段为抗人类表皮生长因子受体2(her2)抗体。
[0924]
99.如项98所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗体或抗原结合 片段包含：如kabat编号系统所定义，三个重链互补决定区 (hcdr)，其包含seq id no:71(hcdr1)、seq id no:72(hcdr2) 和seq id no:73(hcdr3)的氨基酸序列；和三个轻链互补决定区 (lcdr)，其包含seq id no:74(lcdr1)、seq id no:75(lcdr2) 和seq id no:76(lcdr3)的
氨基酸序列；或如imgt编号系统所定 义，三个重链互补决定区(hcdr)，其包含seq id no:191 (hcdr1)、seq id no:192(hcdr2)和seq id no:193(hcdr3)的 氨基酸序列；和三个轻链互补决定区(lcdr)，其包含seq idno:194(lcdr1)、seq id no:195(lcdr2)和seq id no:196 (lcdr3)的氨基酸序列。
[0925]
100.如项98或项99所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗体或 抗原结合片段包含有包含seq id no:27的氨基酸序列的重链可变区 和包含seq id no:28的氨基酸序列的轻链可变区。
[0926]
101.如项1至94中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗 体或抗原结合片段为抗间皮素抗体。
[0927]
102.如项101所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗体或抗原结 合片段包含：如kabat编号系统所定义，三个重链互补决定区 (hcdr)，其包含seq id no:65(hcdr1)、seq id no:66(hcdr2) 和seq id no:67(hcdr3)的氨基酸序列；和三个轻链互补决定区(lcdr)，其包含seq id no:68(lcdr1)、seq id no:69(lcdr2) 和seq id no:70(lcdr3)的氨基酸序列；或如imgt编号系统所定 义，三个重链互补决定区(hcdr)，其包含seq id no:185 (hcdr1)、seq id no:186(hcdr2)和seq id no:187(hcdr3)的 氨基酸序列；和三个轻链互补决定区(lcdr)，其包含seq idno:188(lcdr1)、seq id no:189(lcdr2)和seq id no:190 (lcdr3)的氨基酸序列。
[0928]
103.如项101或项102所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗体 或抗原结合片段包含有包含seq id no:25的氨基酸序列的重链可变 区和包含seq id no:26的氨基酸序列的轻链可变区。
[0929]
104.一种抗体-药物偶联物，其具有式(i)：
[0930]
ab-(l-d)
p(i)[0931]
其中
[0932]
(i)ab为内化抗叶酸受体α抗体或其内化抗原结合片段，其包 含：如kabat编号系统所定义，三个重链互补决定区(hcdr)，其包 含seq id no:2(hcdr1)、seq id no:3(hcdr2)和seq id no:4 (hcdr3)的氨基酸序列；和三个轻链互补决定区(lcdr)，其包含 seq id no:7(lcdr1)、seq id no:8(lcdr2)和seq id no:9 (lcdr3)的氨基酸序列；或如imgt编号系统所定义，三个重链互补 决定区(hcdr)，其包含seq id no:13(hcdr1)、seq id no:14 (hcdr2)和seq id no:15(hcdr3)的氨基酸序列；和三个轻链互补 决定区(lcdr)，其包含seq id no:16(lcdr1)、seq id no:17 (lcdr2)和seq id no:18(lcdr3)的氨基酸序列；
[0933]
(ii)d为艾日布林；
[0934]
(iii)l为包含mal-(peg)
2-val-cit-pab的可裂解连接子；且
[0935]
(iv)p为整数1至8。
[0936]
105.如项104所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗体或抗原结 合片段包含有包含seq id no:23的氨基酸序列的重链可变区和包含 seq id no:24的氨基酸序列的轻链可变区。
[0937]
106.一种抗体-药物偶联物，其具有式(i)：
[0938]
ab-(l-d)
p(i)[0939]
其中
[0940]
(i)ab为内化抗her2抗体或其内化抗原结合片段，其包含：如 kabat编号系统所定义，三个重链互补决定区(hcdr)，其包含seq id no:71(hcdr1)、seq id no:72(hcdr2)和seq id no:73 (hcdr3)的氨基酸序列；和三个轻链互补决定区(lcdr)，其包含 seq id no:74(lcdr1)、seq id no:75(lcdr2)和seq id no:76 (lcdr3)的氨基酸序列；或如imgt编号系统所定义，三个重链互补 决定区(hcdr)，其包含seq id no:191(hcdr1)、seq id no:192 (hcdr2)和seq id no:193(hcdr3)的氨基酸序列；和三个轻链互 补决定区(lcdr)，其包含seq id no:194(lcdr1)、seq id no:195(lcdr2)和seq id no:196(lcdr3)的氨基酸序列；
[0941]
(ii)d为艾日布林；
[0942]
(iii)l为包含mal-(peg)
2-val-cit-pab的可裂解连接子；且
[0943]
(iv)p为整数1至20。
[0944]
107.如项106所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗体或抗原结 合片段包含有包含seq id no:27的氨基酸序列的重链可变区和包含 seq id no:28的氨基酸序列的轻链可变区。
[0945]
108.一种抗体-药物偶联物，其具有式(i)：
[0946]
ab-(l-d)
p(i)[0947]
其中
[0948]
(i)ab为内化抗间皮素抗体或其内化抗原结合片段，其包含：如 kabat编号系统所定义，三个重链互补决定区(hcdr)，其包含seq id no:65(hcdr1)、seq id no:66(hcdr2)和seq id no:67 (hcdr3)的氨基酸序列；和三个轻链互补决定区(lcdr)，其包含 seq id no:68(lcdr1)、seq id no:69(lcdr2)和seq id no:70 (lcdr3)的氨基酸序列；或如imgt编号系统所定义，三个重链互补 决定区(hcdr)，其包含seq id no:185(hcdr1)、seq id no:186 (hcdr2)和seq id no:187(hcdr3)的氨基酸序列；和三个轻链互 补决定区(lcdr)，其包含seq id no:188(lcdr1)、seq id no:189(lcdr2)和seq id no:190(lcdr3)的氨基酸序列；
[0949]
(ii)d为艾日布林；
[0950]
(iii)l为包含mal-(peg)
2-val-cit-pab的可裂解连接子；且
[0951]
(iv)p为整数1至20。
[0952]
109.如项108所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗体或抗原结 合片段包含有包含seq id no:25的氨基酸序列的重链可变区和包含 seq id no:26的氨基酸序列的轻链可变区。
[0953]
110.如项104至109中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中p 为1至8，或1至6。
[0954]
111.如项104至110中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中p 为2至8，或2至5。
[0955]
112.如项104至111中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中p 为3至4。
[0956]
113.如项104至112中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中p 为4。
[0957]
114.一种抗体-药物偶联物，其具有式(i)：
[0958]
ab-(l-d)
p
ꢀꢀꢀ(i)[0959]
其中
[0960]
(i)ab为内化抗叶酸受体α抗体或其抗原结合片段，其包含有包 含seq id no:23的氨基酸序列的重链可变区和包含seq id no:24 的氨基酸序列的轻链可变区；
[0961]
(ii)d为艾日布林；
[0962]
(iii)l为包含mal-(peg)
2-val-cit-pab的可裂解连接子；且
[0963]
(iv)p为整数3至4。
[0964]
115.如项114所述的抗体-药物偶联物，其中p为4。
[0965]
116.如项114或项115所述的抗体-药物偶联物，其中所述抗体 包含人类igg1重链恒定域和人类igκ轻链恒定域。
[0966]
117.如项1至116中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中p由 疏水作用色谱-高效液相色谱(hic-hplc)确定。
[0967]
118.如项1至116中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中p由 反相液相色谱-质谱分析(lc-ms)确定。
[0968]
119.如项1至118中任一项所述的抗体-药物偶联物，其中所述 可裂解连接子经由c-35胺共价附接于艾日布林。
[0969]
120.一种组合物，其包含多个拷贝的如项1至119中任一项所 述的抗体-药物偶联物，其中所述组合物中所述抗体-药物偶联物的平 均p为约3.2至约3.8。
[0970]
121.一种组合物，其包含多个拷贝的如项95至97中任一项所 述的抗体-药物偶联物，其中所述组合物中所述抗体-药物偶联物的平 均p为约3.2至约3.8。
[0971]
122.一种组合物，其包含多个拷贝的如项1至119中任一项所 述的抗体-药物偶联物，其中所述组合物中所述抗体-药物偶联物的平 均p为约3.6至约4.4。
[0972]
123.一种组合物，其包含多个拷贝的如项95至97中任一项所 述的抗体-药物偶联物，其中所述组合物中所述抗体-药物偶联物的平 均p为约3.6至约4.4。
[0973]
124.一种治疗患有表达标靶抗原的癌症或处于患有表达标靶抗 原的癌症的风险中的患者的方法，其包括向所述患者施用治疗有效 量的如项1至119中任一项所述的抗体-药物偶联物，或如项120至 123中任一项所述的组合物。
[0974]
125.如项124所述的方法，其中所述标靶抗原为叶酸受体α。
[0975]
126.如项125所述的方法，其中所述癌症表达高水平的叶酸受 体α。
[0976]
127.如项125所述的方法，其中所述癌症表达中等水平的叶酸 受体α。
[0977]
128.如项125所述的方法，其中所述癌症表达低水平的叶酸受 体α。
[0978]
129.如项125至128中任一项所述的方法，其中所述表达叶酸 受体α的癌症为胃癌、浆液性卵巢癌、透明细胞卵巢癌、非小细胞 肺癌、结肠直肠癌、三阴性乳腺癌、子宫内膜癌、浆液性子宫内膜 癌、肺类癌或骨肉瘤。
[0979]
130.如项125至129中任一项所述的方法，其中(a)当抗叶酸受 体α抗体单独施用时，所述患者对用其治疗不起反应或反应不良， 和/或(b)当艾日布林单独施用时，所述患者对用其治疗不起反应或反 应不良。
[0980]
131.如项125至130中任一项所述的方法，其中当艾日布林单 独施用时，所述患者对用其治疗不耐受，不起反应，或反应不良。
[0981]
132.如项124所述的方法，其中所述标靶抗原为人类表皮生长 因子受体2。
[0982]
133.如项132所述的方法，其中所述癌症表达高水平的人类表 皮生长因子受体2。
[0983]
134.如项132所述的方法，其中所述癌症表达中等水平的人类 表皮生长因子受体2。
[0984]
135.如项132所述的方法，其中所述癌症表达低水平的人类表 皮生长因子受体2。
[0985]
136.如项132至135中任一项所述的方法，其中所述表达人类 表皮生长因子受体2的癌症为乳腺癌、胃癌、膀胱癌或尿路上皮细 胞癌。
[0986]
137.如项132至136中任一项所述的方法，其中(a)当抗人类表 皮生长因子受体2抗体单独施用时，所述患者对用其治疗不起反应 或反应不良，和/或(b)当艾日布林单独施用时，所述患者对用其治疗 不起反应或反应不良。
[0987]
138.如项132至137中任一项所述的方法，其中当艾日布林单 独施用时，所述患者对用其治疗不耐受，不起反应，或反应不良。
[0988]
139.如项124所述的方法，其中所述标靶抗原为间皮素。
[0989]
140.如项139所述的方法，其中(a)当抗间皮素抗体单独施用 时，所述患者对用其治疗不起反应或反应不良，和/或(b)当艾日布林 单独施用时，所述患者对用其治疗不起反应或反应不良。
[0990]
141.如项139或项140所述的方法，其中当艾日布林单独施用 时，所述患者对用其治疗不耐受，不起反应，或反应不良。
[0991]
142.一种减少或抑制表达标靶抗原的肿瘤的生长的方法，其包 括施用治疗有效量的如项1至119中任一项所述的抗体-药物偶联 物，或如项120至123中任一项所述的组合物。
[0992]
143.如项142所述的方法，其中所述标靶抗原为叶酸受体α。
[0993]
144.如项143所述的方法，其中所述肿瘤为表达叶酸受体α的 胃癌、浆液性卵巢癌、透明细胞卵巢癌、非小细胞肺癌、结肠直肠 癌、三阴性乳腺癌、子宫内膜癌、浆液性子宫内膜癌、肺类癌或骨 肉瘤。
[0994]
145.如项143或项144所述的方法，其中当抗叶酸受体α抗体 单独施用时，所述肿瘤对用其治疗具有抗性或为其难治，和/或当艾 日布林单独施用时，所述肿瘤对用其治疗具有抗性或为其难治。
[0995]
146.如项142所述的方法，其中所述标靶抗原为人类表皮生长 因子受体2。
[0996]
147.如项146所述的方法，其中所述肿瘤为表达人类表皮生长 因子受体2的乳腺癌、胃癌、膀胱癌或尿路上皮细胞癌。
[0997]
148.如项146或项147所述的方法，其中当抗人类表皮生长因 子受体2抗体单独施用时，所述肿瘤对用其治疗具有抗性或为其难 治，和/或当艾日布林单独施用时，所述肿瘤对用其治疗具有抗性或 为其难治。
[0998]
149.如项142所述的方法，其中所述标靶抗原为间皮素。
[0999]
150.如项149所述的方法，其中当抗间皮素抗体单独施用时， 所述肿瘤对用其治疗具有抗性或为其难治，和/或当艾日布林单独施 用时，所述肿瘤对用其治疗具有抗性或为其难治。
[1000]
151.如项1至119中任一项所述的抗体-药物偶联物或如项120 至123中任一项所述的组合物，其用于治疗表达标靶抗原的癌症。
[1001]
152.如项151所述的用于使用的抗体-药物偶联物，其中所述标 靶抗原为叶酸受体α。
[1002]
153.如项152所述的用于使用的抗体-药物偶联物，其中所述表 达叶酸受体α的癌
浆液性子宫内膜癌、肺类癌或骨肉瘤。
[1022]
173.如项171所述的方法，其中所述生物样品为来源于患有表 达人类表皮生长因子受体2的癌症或处于患有表达人类表皮生长因 子受体2的癌症的风险中的患者的肿瘤活检，其中所述癌症为乳腺 癌、胃癌、膀胱癌或尿路上皮细胞癌。
[1023]
174.如项171所述的方法，其中所述生物样品为来源于患有表 达间皮素的癌症或处于患有表达间皮素的癌症的风险中的患者的肿 瘤活检。
[1024]
175.一种包含-l-d的组合物，其中d为艾日布林；且l为共价 附接于d的可裂解连接子。
[1025]
176.如项175所述的组合物，其中所述可裂解连接子经由c-35 胺共价附接于艾日布林。
[1026]
177.如项175或项176所述的组合物，其中所述可裂解连接子 包含缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)。
[1027]
178.如项175至177中任一项所述的组合物，其中所述可裂解 连接子包含peg间隔子单元。
[1028]
179.如项175至178中任一项所述的组合物，其中所述可裂解 连接子包含mal-(peg)
2-val-cit-pab。
[1029]
180.一种组合物，其包含多个拷贝的具有式(i)的抗体-药物偶联 物：
[1030]
ab-(l-d)
p(i)[1031]
其中
[1032]
(i)ab为内化抗叶酸受体α抗体或其内化抗原结合片段，其包 含：如kabat编号系统所定义，三个重链互补决定区(hcdr)，其包 含seq id no:2(hcdr1)、seq id no:3(hcdr2)和seq id no:4 (hcdr3)的氨基酸序列；和三个轻链互补决定区(lcdr)，其包含 seq id no:7(lcdr1)、seq id no:8(lcdr2)和seq id no:9 (lcdr3)的氨基酸序列；或如imgt编号系统所定义，三个重链互补 决定区(hcdr)，其包含seq id no:13(hcdr1)、seq id no:14 (hcdr2)和seq id no:15(hcdr3)的氨基酸序列；和三个轻链互补 决定区(lcdr)，其包含seq id no:16(lcdr1)、seq id no:17 (lcdr2)和seq id no:18(lcdr3)的氨基酸序列；
[1033]
(ii)d为艾日布林；
[1034]
(iii)l为包含mal-(peg)
2-val-cit-pab的可裂解连接子；且
[1035]
(iv)p为每一ab的-l-d部分的平均数目，其中所述组合物中所 述抗体-药物偶联物的平均p为约3.6至约4.4；且所述平均p由疏水 作用色谱-高效液相色谱(hic-hplc)确定。
[1036]
181.如项180所述的组合物，其中所述抗体或抗原结合片段包 含有包含seq id no:23的氨基酸序列的重链可变区和包含seq idno:24的氨基酸序列的轻链可变区。
[1037]
182.如项120至123中任一项所述的组合物，其中所述组合物 中所述抗体-药物偶联物的平均p由疏水作用色谱-高效液相色谱 (hic-hplc)确定。
[1038]
183.如项120至123中任一项所述的组合物，其中所述组合物 中所述抗体-药物偶联物的平均p由反相液相色谱-质谱分析(lc-ms) 确定。