pAdM3C感染大鼠胰腺导管细胞促进转分化方法与流程

技术特征：
1.一种胰腺导管细胞分离培养基，其特征在于：包括培养基a、培养基b和培养基c，其中，培养基a为含10vol�s的cmrl1066培养基；培养基b为含0.02vol%大豆胰酶抑制剂、10vol�s、100μg /ml pen strep的cmrl1066培养基；培养基c为含20 ng /ml egf、10 ng /ml kgf、10 mm烟酰胺、25 mm glucose、100μg /ml pen strep、10vol�s的dmem / f12培养基。2.一种密度梯度离心分离胰岛细胞的分离液，其特征在于：包括分离液a、分离液b和分离液c，其中，分离液a由biocoll分离液与hanks液按体积比为20:1的比例混合配制而成，密度为1.096 g/ml；分离液b由分离液a与hanks液按体积比为6.4 : 1.1的比例混合配制而成，密度为1.085g/ml；分离液c由分离液b与hanks液按体积比为2.4: 2.6的比例混合配制而成，密度为1.051g/ml。3.pad-m3c感染大鼠胰腺导管细胞促进转分化方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）使用biocoll分离液通过密度梯度离心分离胰岛细胞：利用密度梯度离心分离胰岛细胞的分离液分离胰岛细胞；（2）胰腺导管细胞分离；利用胰腺导管细胞分离培养基分离胰腺导管细胞；（3）利用腺病毒pad-m3c进行转分化诱导：腺病毒pad-m3c感染步骤（2）分离的胰腺导管细胞。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（1）包括以下具体步骤：1)加分离液a液于胰岛中，轻轻混匀，小心勿起气泡；2)再沿离心管壁缓慢依次加入分离液a、分离液b和分离液c，三种分离液的体积比为1:1:1，小心保持界面，轻拿轻放；3)4℃离心，400 rpm，3 min后稳定加速至1700 rpm，14 min，无刹车减速；4)用玻璃吸管吸取交界面细胞团入新的15ml离心管中，加入4℃预冷的洗液至10 ml，1000 rpm，1 min，4℃离心，弃上清，重复洗涤3次，获得移除胰岛细胞后，含有腺泡和导管细胞的沉淀；5)洗涤后的细胞沉淀用2 ml洗液重悬置于培养皿中；所述洗液为含0.1wt% bsa 的hanks液。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（2）包括以下具体步骤：1) 重悬：步骤（1）获得的移除胰岛后，含有腺泡和导管细胞的沉淀加入装有20 ml pbs的50 ml离心管中，在室温下自然沉降10 min，弃上清，以除去包括死细胞的低密度组分；2)清洗：加入20 ml pbs，1000 rpm，1min，弃上清，清洗5次；3)消化：沉淀中加入10 ml的0.025wt％胰酶，涡旋振荡15 s 37℃孵育5 min，将外分泌组织解离成单细胞；4)终止消化：加入10 ml预冷的培养基a，用移液器上下吹打混匀终止消化；5)过滤：用pbs湿润30 ~ 40 μm滤器，过滤入50 ml离心管；
6)离心：1000 rpm，1min，弃上清，细胞沉淀用5ml培养基b重悬；7)细胞计数；8)布板：细胞计数后，用培养基b补齐，1.0
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105/ml接种于胶原蛋白包被过的6孔板上；9)培养：37℃，5% co2，培养2天；10)换液：第3天，将培养基换成培养基c，至第7天形成贴壁的单层上皮细胞，而大部分初始腺泡细胞在此阶段死亡；超过95％的贴壁细胞表达导管细胞特异性标记泛细胞角蛋白；11)传代：根据细胞状态在第10天左右，1:2传代，每2天换液，传3~5代后开始后续实验。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（3）包括以下具体步骤：1）种板：接种12孔板，每孔2.5
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5 个胰腺导管细胞；2）24 h后，移去培养液，每孔加入500 μl新鲜的培养基c；3）换算moi为20、30、50、100、200 μl对应体积的腺病毒pad-m3c病毒上清体积加入步骤2）培养的胰腺导管细胞；4）不断缓慢晃动培养板，培养3 h；5）加入1.5 ml新鲜培养基c培养72 h。7.权利要求1所述一种胰腺导管细胞分离培养基在胰腺导管细胞分离分离中的应用。8.权利要求2所述一种密度梯度离心分离胰岛细胞的分离液在胰岛细胞分离中的应用。9.权利要求3所述ad-m3c感染大鼠胰腺导管细胞促进转分化方法在胰腺导管细胞分化中的应用。

技术总结
本发明提供pAd-M3C感染大鼠胰腺导管细胞促进转分化方法。使用Biocoll分离液通过密度梯度离心分离胰岛能尽可能多的去除胰岛细胞团，使细胞得到初步分离纯化，取用去除了胰岛细胞团的管底细胞，则降低了胰岛细胞的影响；管底细胞经过40μm小过滤器筛选，进一步去除大的胰岛细胞，在培养不同时间段换用培养基a、b、c，且c中的成分烟酰胺、KGF、EGF比例和作用有利于导管细胞的成长，所获得的细胞数量和纯度都有提高；利用腺病毒（pAd-M3C）感染胰腺导管细胞，其中加样体积经过感染力实验得到验证，使胰腺导管细胞的感染率高达80%以上，有利于后续的转分化实验。后续的转分化实验。


技术研发人员：王坤 韩俊永 陈金烟 金静君 薛士杰
受保护的技术使用者：福建省医学科学研究院
技术研发日：2021.12.14
技术公布日：2022/3/18