一种利用叶片生产盘龙参种苗的组培快繁的方法与流程

1.本发明涉及药用植物组织培养领域，具体涉及一种利用叶片生产盘龙参种苗的组培快繁的方法。


背景技术：

2.盘龙参（spiranthes sinensis（per.）ames）为兰科缓草属多年生草本植物，又名缓草、龙抱柱、盘龙棍、盘龙花等。主要产于云南、四川、浙江、湖南、江西、河南等地，国内其余各省、区、市亦有布于。盘龙参主要生长于海拔200～3400米的山坡林下、灌丛下、草地和河滩沼泽草甸中。盘龙参入药始载于《滇南本草》，以根或全草入药，具益气养阴、清热解毒的功效，主治病后虚弱，阴虚内热，咳嗽吐血，头晕，腰痛酸软，糖尿病，遗精，淋浊带下，咽喉肿痛，毒蛇咬伤，烫火伤，疮疡臃肿。现代医药研究盘龙参内含二氢菲类、黄酮类和苯丙素类、阿魏酸酯类化合物，具有对各类癌细胞都有明显抑制作用，亦对肝细胞具有保护作用，同时还具有极强的抗氧化、清除自由基的作用。
3.盘龙参分布区域虽较广，但盘龙参在治疗效果上较为明显，民间药材需求量较大，再者盘龙参其极具观赏性，常作家庭观赏植物，导致其野生资源被无序采挖，加之生态环境的破坏，使其生境亦受到严重影响，最终使得盘龙参野生资源蕴藏量极具下降。曾被原国家林业部颁布的《国家植物保护名录》列为二级保护植物，同时又被列为国际濒危植物。
4.盘龙参种子蕴藏量大，每个果荚含种子约1万～100万粒，但其继承了大部分兰科植物的通病——种子细小呈粉末状，无胚乳结构，自然条件下发芽率极低。近年来，部分单位进行了盘龙参的组培技术研究，但大多采用隐芽、花序轴、花梗、种子为外植体进行组培快繁技术的研究，未见叶片直接诱导丛生芽的报道，同时，现有报道中，其增殖系数普遍偏低，30天生根率亦存在普遍较低的情况。


技术实现要素：

5.本发明的主要目的是提供一种利用叶片生产盘龙参种苗的组培快繁的方法，以解决盘龙参种苗扩繁问题。
6.为实现以上目的，本发明提供以下技术方案：一种利用叶片生产盘龙参种苗的组培快繁的方法，包括以下步骤：（1）外植体的选择：选择盘龙参的幼嫩心叶为外植体；（2）外植体的消毒；（3）从生芽的诱导：将消毒后的外植体，接种于改良ms 2,4-d0.9～1.2mg/l tdz1.2～1.6mg/l 活性炭0.4g/l；（4）从生芽的增值：将诱导出的丛生芽，将叶片剪成1.0cm长度，与无叶的丛生单芽分别接种于改良ms naa0.6～0.8mg/l tdz2.0～2.4mg/l 椰汁80g/l组合的增殖培养基中；（5）丛生芽的生根：将增殖获得的丛生芽，剪成单芽，接种于1/3改良ms iba1.5～
2.0mg/l 多效唑0.4～0.7mg/l 椰汁50g/l 活性炭0.8g/l组合的生根培养基中；（6）驯化移栽； 所述改良ms培养基为在原ms培养基的基础上，调整硝酸钾为1500mg/l，硝酸铵为1750mg/l，氯化钙为300mg/l，肌醇为110mg/l，vb1为0.3mg/l，硫酸铜为0mg/l，糖浓度20g/l，ph 5.4。
7.本发明有益效果在于1、本发明利用叶片直接诱导丛生芽，使其在实际生产过程中，增殖接种中叶片不在被丢弃，还成为可以继续生产丛生芽的材料，从而极大的提高了增殖系数，使其增殖系数从现有技术的4～6直接提高至16。而增殖系数的提高，一方面可极大的缩短生产周期，另一方面可极大的降低生产成本。
8.2、本发明无论是诱导、增殖还是生根，均以改良ms为基本培养基，使氮、钾、钙、铜元素以及肌醇、vb1、糖浓度进行了改良，减少了盘龙参组织培养过程中，叶片发黄，叶片短窄的情况，最终减少了苗损失率，降低了生产成本；同时，使用改良的ms培养基时，降低了丛生芽间的紧密度，更加有利于实际的生产操作，亦在一定程度上降低了生产操作成本。
9.3、本发明在增殖培养基中添加了一定浓度的椰汁，使得苗更加健壮，可使增殖苗直接用于生根，省略了壮苗步骤，简化了生产工艺。
10.4、本发明的生根培养基是在常规使用生长素的基础上，搭配了一定浓度的多效唑，同时添加了一定浓度的椰汁，一方面使得生根率达到100%，苗达到零损失，节约了生产成本，另一方面，生根苗根系更加粗壮，有利于生根苗的驯化成活，可使驯化成活率达98%以上。
具体实施方式
11.下面通过具体实施例对本发明进行进一步的说明。本发明中使用的原材料，均可以由市场购买。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围，其中，本发明所使用的改良ms培养基调整部分如表1所示。
12.实施例11、外植体的选择：将健壮无病虫害的盘龙参，移栽于室内花盆中，每隔2～3天进行
一次70%多菌灵500倍液喷雾，连续喷3次，后取盘龙参心叶。
13.2、外植体的清洁：将盘龙参心叶，用自来水冲淋80min，置于肥皂水中，涮洗10min，后用自来水漂洗4次，再滴3滴吐温-80，震摇8min，最后用自来水冲淋80min。
14.3、外植体的消毒：将清洁好的外植体，转移至超净工作台，用75%酒精消毒20s后用无菌水涮洗2次，再用8%过氧化氢消毒40min后用无菌水涮洗3次，最后用0.05%升汞溶液消毒9min后无菌水涮洗8次。7天消毒污染率为17.6%，20天叶片死亡率为2.8%。
15.4、丛生芽的诱导：将消毒好的外植体，剪去伤口处以减少消毒剂残留，后在外植体中央用刀片纵向划伤，后剪成1cm长度，接种于改良ms 2,4-d 0.9mg/l tdz 1.2mg/l 活性炭0.4g/l的诱导培养基中，在25
±
2 ℃温度下暗培养，20天后在温度为25
±
2 ℃，光照强度1000～2000lx，光周期12h条件下光暗交替培养30天。20天萌动率88.4%，40天丛生芽诱导率可达98.9%。
16.5、丛生芽的增殖：将诱导出的丛生芽，剪下其叶片，并沿叶片中央用刀片划伤后剪成1cm长度，同时将丛生芽剪成单芽，叶片与丛生芽单芽分别接种于改良ms naa 0.6mg/l tdz 2.2mg/l 椰汁80g/l的增殖培养基中。叶片在25
±
2 ℃温度下暗培养，10天后在温度为25
±
2 ℃，光照强度1000～2000lx，光周期12h条件下光暗交替培养30天；丛生芽单芽在温度为25
±
2 ℃，光照强度1000～2000lx，光周期12h条件下光暗交替培养30天。40天增殖系数平均可达16.6。
17.6、丛生芽的生根：将丛生芽剪成单芽，接种于1/3改良ms iba 1.5mg/l 多效唑 0.5mg/l 椰汁50g/l 活性炭0.8g/l的生根培养基中，在温度为25
±
2 ℃，光照强度2000～3000lx，光周期12h条件下光暗交替培养25天，苗健壮，生根率达100%。
18.7、生根苗的驯化移栽：将盘龙参生根苗，移栽于质量比分别为5:1:2的泥炭土、珍珠岩与锯末混合基质中，按常规的管理方式进行管理，30天驯化成活率为98.1%，约60天大部分可形成肉质根。
19.实施例21、外植体的选择：将健壮无病虫害的盘龙参，移栽于室内花盆中，每隔2～3天进行一次70%多菌灵500倍液喷雾，连续喷3次，后取盘龙参心叶。
20.2、外植体的清洁：将盘龙参心叶，用自来水冲淋80min，置于肥皂水中，涮洗15min，后用自来水漂洗3次，再滴3滴吐温-80，震摇10min，最后用自来水冲淋80min。
21.3、外植体的消毒：将清洁好的外植体，转移至超净工作台，用75%酒精消毒15s后用无菌水涮洗2次，再用8%过氧化氢消毒35min后用无菌水涮洗2～3次，最后用0.05%升汞溶液消毒8min后无菌水涮洗8次。7天消毒污染率为18.2%，20天叶片死亡率为1.5%。
22.4、丛生芽的诱导：将消毒好的外植体，剪去伤口处以减少消毒剂残留，后在外植体中央用刀片纵向划伤，后剪成1cm长度，接种于改良ms 2,4-d 1.2mg/l tdz 1.6mg/l 活性炭0.4g/l的诱导培养基中，在25
±
2 ℃温度下暗培养，20天后在温度为25
±
2 ℃，光照强度1000～2000lx，光周期12h条件下光暗交替培养30天。20天萌动率87.2%，40天丛生芽诱导率可达96.4%。
23.5、丛生芽的增殖：将诱导出的丛生芽，剪下其叶片，并沿叶片中央用刀片划伤后剪成1cm长度，同时将丛生芽剪成单芽，叶片与丛生芽单芽分别接种于改良ms naa 0.8mg/l tdz 2.4mg/l 椰汁80g/l的增殖培养基中。叶片在25
±
2 ℃温度下暗培养，10天后在温度为
25
±
2 ℃，光照强度1000～2000lx，光周期12h条件下光暗交替培养30天；丛生芽单芽在温度为25
±
2 ℃，光照强度1000～2000lx，光周期12h条件下光暗交替培养30天。40天增殖系数可达15.9。
24.6、丛生芽的生根：将丛生芽剪成单芽，接种于1/3改良ms iba 2.0mg/l 多效唑 0.7mg/l 椰汁50g/l 活性炭0.8g/l的生根培养基中，在温度为25
±
2 ℃，光照强度2000～3000lx，光周期12h条件下光暗交替培养25天，苗健壮，生根率达100%。
25.7、生根苗的驯化移栽：将盘龙参生根苗，移栽于质量比分别为5:1:2的泥炭土、珍珠岩与锯末混合基质中，按常规的管理方式进行管理，30天驯化成活率为99.8%，约60天大部分可形成肉质根。
26.对比例对比例1、对比例2、对比例3分别按照专利盘龙参组培培养的方法（专利号：cn201410261197.4）说明书中具体实施方式中的组培方法以及期刊（钟爱清，《名贵畲药盘龙参种子快繁技术研究》[j],农业科技通讯，2018），（吕亚凤，郭德章等，《盘龙参组织培养与快繁研究》[j]，亚热带植物科学，2018）的最佳组培方法进行培养及本发明的组培苗驯化方法进行驯化练苗。对各项数据进行统计分析，结果见下表2。
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由此可见，本发明的利用叶片生产盘龙参种苗的组培快繁新方法，可以显著提高增殖系数，生根率以及驯化成活率，减少叶片黄化率，优于现有技术，可见本发明的组培培养基及培养方法能够显著提高组培效率，缩短生产周期，降低生产成本，具有更高的市场应用价值。