一种乙型肝炎病毒富集荧光PCR检测方法与流程

一种乙型肝炎病毒富集荧光pcr检测方法
技术领域
1.本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种乙型肝炎病毒富集荧光pcr检测方法。


背景技术：

2.乙型肝炎病毒（hepatitis b virus,hbv）是乙型病毒性肝炎（简称乙型肝炎）的病原体，通过血液与体液传播，具有慢性携带状态的传染性疾病，主要引起肝脏损害。hbv的感染是世界范围内严重的公共卫生问题之一。hbv感染呈世界性流行，据who报道，全球约20亿人感染过hbv，其中3.5亿人为慢性hbv感染者，每年约有100万人死于hbv感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌（hepatocellular rcinoma,hcc）。我国约有1亿hbv携带者，严重危害国人健康，影响生活质量。近年来，随着检测技术的不断发展，针对乙肝病毒的检测，除了检测乙型肝炎血清免疫标记物外，还有hbv脱氧核糖核酸（dna）的检测。hbv-dna的检测是目前准确判断乙肝病毒复制的重要指标。目前hbv-dna的检测方法主要为实时荧光pcr法。实时荧光pcr检测技术可以将微弱的病毒dna大量的扩增，通过检测器对荧光积累的检测，实现了可视化、可量化的检测，它具有检测灵敏度高、特异性强、单管操作不易污染等特征。
3.虽然荧光pcr方法检测灵敏度高于其他检测手段，但有不少研究也指出，现行的荧光pcr方法仍存在敏感度不足的问题。部分样本使用磁珠法或离心柱法提取样本总核酸（或病毒核酸）后，检测结果处于阳性和阴性之间的“灰区”，还有部分样本当其检测呈阴性结果时，不能排除病人未感染流感病毒。此类现象的原因可能是患者处于感染初期或恢复期，导致样本中病毒含量过低，或临床样本中残存抑制扩增检测的物质等；对于需要高敏感度的临床需求，如血筛项目等，现有方法容易造成漏检。因此需要使用适宜的方法对乙肝病毒进行富集浓缩。
4.目前hbv-dna荧光pcr检测方法，作为一种酶促反应，仍然存在样本处理繁琐、对核酸纯度要求高、pcr检测时间偏长、自动化成本偏高等缺点，另外在血筛等临床检验中现有的检测方法也无法满足其灵敏度的要求；以上的不足导致目前hbv-dna荧光pcr检测方法在临床检验中的应用受到了限制，尤其无法满足门诊和急诊的需求。
5.

技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种乙型肝炎病毒dna检测方法，解决现有检测技术中存在的样本处理繁琐、对核酸纯度要求高、pcr检测时间偏长、自动化成本偏高等缺点。
7.基于上述目的，本发明采用以下技术方案：一种乙型肝炎病毒富集荧光pcr检测方法，该方法包括如下步骤：s1、免疫磁珠的制备：将乙型肝炎病毒抗体偶联至羧基修饰的超顺纳米磁珠上，得到偶联乙肝病毒抗体的免疫磁珠，
s2、乙型肝炎病毒的富集：将乙型肝炎病毒阳性血清或血浆与偶联乙肝病毒抗体的免疫磁珠混合孵育；s3、用磁性工具分离免疫磁珠-病毒复合物，将免疫磁珠-病毒复合物重悬于te缓冲液中加热裂解；s4、用磁性工具分离磁珠，得到富集浓缩的乙型肝炎病毒，用荧光pcr试剂对裂解产物中的液体直接进行检测。
8.上述乙型肝炎病毒抗体一般是指乙肝病毒表面抗体或核心抗体，可以是单克隆抗体，或多克隆抗体。
9.上述荧光pcr检测试剂中含有耐抑制抗干扰的pcr反应缓冲液和快速扩增的dna聚合酶，能对含有各种干扰物质的样本进行有效扩增和荧光检测。
10.作为优选，所述乙型肝炎病毒抗体为单克隆乙肝病毒表面抗体。
11.作为优选，步骤s2所述乙型肝炎病毒的富集具体方法为：取200-600μl血清或血浆与2-5μl免疫磁珠混合，室温下（25-37℃）混匀6-15分钟。
12.作为优选，步骤s3所述的加热裂解是：在85-95℃加热5-15分钟裂解病毒释放核酸。
13.作为优选，步骤s4所述荧光pcr试剂包含：（1）终浓度5-15μg/ml的carrier rna（核苷酸类似物）；（2）终浓度0.10-0.15 m的 tris（三羟甲基氨基甲烷）。
14.一般情况下，carrier rna不会作为pcr添加剂，本发明在荧光pcr试剂中加入carrier rna的目的是降低pcr管壁携带的静电对反应过程的影响；在荧光pcr试剂中，tris一般浓度为0.01-0.05m，本发明中采用0.10-0.15 m高浓度的tris，目的是提高缓冲能力，降低样本中（未进行核酸纯化）抑制物对反应过程的影响。
15.作为优选，所述荧光pcr试剂总反应体积≤40μl。
16.作为优选，所述超顺纳米磁珠直径为200nm-350nm，表面带有羧基（-cooh）基团。
17.作为优选，所述免疫磁珠制备具体为：利用edc活化法将抗单克隆乙肝病毒表面抗体连接到表面带羧基（-cooh）的超顺纳米磁珠表面，并用bsa对偶联了抗体后的磁珠进行封闭。
18.作为优选，所述免疫磁珠的风干保存方法为：将免疫磁珠置于烘箱中，将温度调至30℃-37℃，开启通风，静置10小时以上后取出，于2-8℃密封保存。
19.相对于现有hbv核酸荧光pcr检测技术，本发明的有益效果在于：1、加样体积不受操作设备的限制，风干后的免疫磁珠易于保存和运输，使用超顺磁珠易于操作，容易实现自动化；2、样本处理简单，因进行了富集浓缩而大幅提高检测灵敏度，通过免疫识别和基因识别两道把关而特异性强，使用快速pcr试剂而荧光pcr检测时间短。
附图说明
20.图1为本发明hbv核酸检测流程示意图；图2为样本hbv富集后免纯化荧光pcr检测（本发明）扩增曲线图；图3为样本核酸提取后荧光pcr检测扩增曲线图；
图4为样本原液直接荧光pcr检测扩增曲线图；图5为样本经过病毒免疫富集的血清样本（上清液）加热裂解后荧光pcr检测扩增曲线图。
具体实施方式
21.下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
22.在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
23.上述磁性纳米微球是表面经过修饰的能够与抗体偶联的磁性微球，表面带有羧基基团，微球的大小一般为纳米级，优选直径为200nm~600nm，在本发明实施例中，磁性微球直径为300nm。
24.乙肝病毒进行富集后，可以用于实时荧光pcr、等温扩增等方法进行病毒核酸的定量或定性检测。
25.实施例1一种乙型肝炎病毒富集荧光pcr检测方法，该方法的工艺流程图如图1所示，具体步骤是：1、免疫磁珠的制备（1）活化取 10mg（25 mg/ml）充分摇匀的羧基磁珠置于 2 ml 离心管中， 加 1ml的15mm mes缓冲液(ph6.0)洗涤磁珠3次；用磁分离器分离后，加入 100 μl 浓度为 10mg/ml 的edc溶液（用15mm mes缓冲液(ph6.0)配制）溶液，经涡旋混合仪混匀，固定在混合器上，室温活化30min；用磁分离器分离磁珠，弃去上清液。
26.（2）偶联加入400μg乙型肝炎病毒表面抗体，混合重悬磁珠，将离心管至于水平摇床上，室温混匀3小时（2-4小时）。用磁分离器分离磁珠，弃去上清液， 加入 1ml pbst缓冲液洗涤 3 次， 每次洗涤需在混合器上充分混合洗涤，去除未结合的抗体。
27.（3）封闭在上述装有磁珠的离心管中，加入 1ml含1% bsa的15mm mes缓冲液(ph6.0)，经涡旋混合仪混匀，固定在混合器上，室温封闭 2 h，用磁分离器分离偶联磁珠。
28.（4）风干保存将免疫磁珠置于烘箱中，将温度调至30℃-37℃，开启通风，静置10小时以上后取出，于2-8℃密封保存；在用于免疫富集前加入500μl的1
×
te缓冲液进行复溶。
29.2、配制hbv核酸检测试剂（免提取荧光pcr法）（1）按照表1配制pcr反应液：表1物料终浓度25μl体系用量（μl）5×
qpcrmix（含酶）1
×
5carrierrna（1μg/ul）10μg/ml0.25tris（1m）0.12m3mgcl2（1m）2mm0.05hbv上游引物0.2μm0.05hbv下游引物0.2μm0.05hbv荧光探针0.15μm0.375内标上游引物0.1μm0.025内标下游引物0.1μm0.025内标荧光探针0.05μm0.0125h2o 11.17（2）分装pcr反应液将pcr反应液，按照20μl/反应，分装至pcr管中。
30.3、样本处理取4份临床样本，每个样本均平行进行如下三组处理：（1）处理组-免疫富集组加10μl免疫磁珠到离心管中，再取200μl样本，枪头吹打3次；室温孵育15分钟；离心，再使用磁力架进行磁分离，弃上清，在剩余磁珠中加入25μl te缓冲液（10mm tris-hcl 1mm edta ph=8.0）；90℃加热5分钟。使用磁力架进行磁分离；取上清 5μl加入到pcr管中，准备上机检测；（2）对照组1-提取检测组取200μl样本，加入到核酸提取或纯化试剂中，进行核酸提取，将提取好的核酸5μl 加到pcr管中，准备上机检测；（3）对照组2-原液检测组样本混匀后，直接取样本5μl进行加到pcr管中，准备上机检测；上清检测将（1）免疫富集组磁分离后的上清作为样本，90℃加热5分钟后取上清 5μl加入到pcr管中，准备上机检测。
31.4、上机检测将完成加样的pcr管放入荧光pcr仪中，进行荧光pcr扩增，检测程序：52℃持续2min；95℃持续1min；（95℃持续5s；58℃持续30s并采集荧光）45个循环。设备检测程序运行完成后，观察扩增曲线图，读取ct值；各处理组检测结果（荧光曲线ct值）如表2及图2-图5所示。图2为样本hbv富集后免纯化荧光pcr检测（本发明）扩增曲线图；图3为样本核酸提取后荧光pcr检测扩增曲线图；图4为样本原液直接荧光pcr检测扩增曲线图；图5为样本经过病毒免疫富集的血清样本（上清液）加热裂解后荧光pcr检测扩增曲线图。
32.表2
样本浓度（iu/ml）免疫富集组提取检测直接扩增上清约2e 427.3827.8729.6333.63约2e 330.0430.1133.3636.47约2e 233.0833.7137.9640.55约5034.6635.4339.61noct对表2和图2-5进行分析，可见免疫富集处理后进行检测（本发明），与常规提取后检测对照组的检测效率（ct值小者效率更高）基本一致，在低浓度时本发明检测结果更优；本发明检测结果明显优于直接扩增对照组。而与上清液检测结果的比较说明本发明的免疫富集具有较好的病毒捕获能力。
33.本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其它实施例的不同之处，各个实施例之间相同或相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
34.以上对本发明所提供的一种乙型肝炎病毒富集荧光pcr检测方法进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。