癌症疫苗合成物及其用于预防和/或治疗癌症的方法
1.相关专利申请的交叉引用
2.本技术要求2019年7月19日提交的第62/876,416号美国临时申请的优先权权益；所述申请的全部内容通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。
3.权利声明
4.本发明在政府的支持下完成，美国国立卫生研究院授予的授权号为p50 ca168504、ca233810、ca187918和r35 ca210057。政府对本发明享有一定的权利。
背景技术：
5.转化生长因子β(tgfβ)是一种多能细胞因子，在调控胚胎发育、细胞代谢、肿瘤进展和免疫系统稳态方面发挥着关键作用(david和massague(2018年)，《自然综述-分子细胞生物学》，19:419-435)。tgfβ与细胞膜上的受体结合后，依赖于smad或独立于smad调控其下游基因的表达。tgfβ依赖于分期和细胞环境调控癌症的发生和发展(morikawa等人(2016年)，《冷泉港实验室生物学展望》，8:a021873；prunier等人(2019年)，《癌症趋势》，5:66-78；seoane和gomis(2017年)，《冷泉港实验室生物学展望》，9:a022277)。tgfβ通过诱导癌前细胞生长阻滞和细胞凋亡，抑制肿瘤发生。沉默tgfβ信号通路促进不同小鼠模型中的肿瘤形成(cammareri等人(2016年)，《自然-通讯》，7:12493；yu等人(2014年)，《致癌基因》，33:1538-1547；cohen等人(2009年)，《癌症研究》，69:3415-3424)。同时，在各种人类癌症中，tgfβ信号通路的功能丧失性突变很常见(levy和hill(2006年)，《细胞因子与生长因子评论》，17:41-58)。但是，在癌症晚期，tgfβ会导致肿瘤发生转移，并提高耐药性。一方面，由于致癌突变累积，癌细胞本身克服了tgfβ所诱导的生长阻滞和细胞凋亡。tgfβ诱导癌细胞中的上皮-间充质(emt)转化，增加癌细胞的干性，增加血管生成，并提高耐药性(ahmadi等人(2018年)，《细胞生理学杂志》，234:12173-12187)。另一方面，tgfβ促进cd4 调节性t细胞(treg)、髓样细胞衍生抑制细胞(mdsc)和m2巨噬细胞分化，从而抑制宿主的抗肿瘤免疫反应，支持癌症生长和转移(dahmani和delisle(2018年)，《癌症(巴塞尔)》，10:194)。
6.虽然tgfβ信号通路可作为肿瘤抑制因子和肿瘤启动子，但是，利用tgfβ信号通路达到预期治疗目的的能力仍是一个值得争论的问题。因此，在本领域中需要在更好了解tgfβ信号通路在癌症中作用的基础上，确定抗癌疗法。
技术实现要素：
7.本发明至少部分基于以下发现：包含激活的tgfβ-smad/p63信号的pten和p53缺陷肿瘤细胞(例如，已使用至少一种tgfβ超家族蛋白进行处理)未能在具有免疫能力的宿主中依赖于t细胞形成肿瘤。施用这些肿瘤细胞还可预防宿主出现复发性和转移性肿瘤病灶。基于此类肿瘤细胞获得的癌症疫苗可引起广谱免疫应答，从而克服缺乏肿瘤特异性抗原呈递、肿瘤异质性和低免疫浸润等本领域的顽固障碍。经表明，通过激活肿瘤细胞中的smad/p63转录复合物，调控多个通路的表达，从而促进免疫应答，最终激活细胞毒性t细胞和免疫记忆，至少部分缓解了这些效应。
8.一方面，本文提供了一种包含癌细胞的癌症疫苗，其中，所述癌细胞为：(1)pten缺陷癌细胞；(2)p53缺陷癌细胞；以及(3)经修饰可激活tgfβ-smad/p63信号通路。
9.另一方面，本文提供了一种在受试者中预防癌症发生、延缓癌症发作、预防癌症复发和/或治疗癌症的方法，包括向受试者施用治疗有效量的包含癌细胞的癌症疫苗，其中，所述癌细胞为：(1)pten缺陷癌细胞；(2)p53缺陷癌细胞；以及(3)经修饰可激活tgfβ-smad/p63信号通路，可选地，其中，受试者患有癌症。在一个实施例中，所述癌细胞源自与癌症疫苗所治疗癌症相同类型的癌症。在另一个实施例中，所述癌细胞源自与癌症疫苗所治疗癌症不同类型的癌症。在另一个实施例中，使用癌症疫苗治疗的癌症的特征在于缺失pten、p53和/或p110，可选地，其中，所述癌症进一步表达myc。在另一个实施例中，使用癌症疫苗治疗的癌症包含功能性pten和/或p53，可选地，其中，所述癌症包含kras激活突变g12d。在另一个实施例中，所述癌症疫苗对于受试者是同系的或异种的。在另一个实施例中，所述癌症疫苗对于受试者是自体的、匹配同种异体的、错配同种异体的或同类系的。在另一个实施例中，从包括以下几项的一组中选择使用癌症疫苗治疗的癌症：乳腺癌、卵巢癌或脑癌，例如乳腺肿瘤、卵巢肿瘤或脑肿瘤。
10.本文进一步提供了可应用于本文所述本发明任何方面的诸多实施例。例如，在一个实施例中，使癌细胞与至少一种tgfβ超家族蛋白接触，激活所述tgfβ-smad/p63信号通路。在另一个实施例中，从包括以下几项的一组中选择所述至少一种tgfβ超家族蛋白：lap、tgfβ1、tgfβ2、tgfβ3、tgfβ5、激活素a、激活素ab、激活素ac、激活素b、激活素c、c17orf99、inhba、inhbb、抑制素、抑制素a、抑制素b、bmp-1/pcp、bmp-2、bmp-2/bmp-6异二聚体、bmp-2/bmp-7异二聚体、bmp-2a、bmp-3、bmp-3b/gdf-10、bmp-4、bmp-4/bmp-7异二聚体、bmp-5、bmp-6、bmp-7、bmp-8、bmp-8a、bmp-8b、bmp-9、bmp-10、bmp-15/gdf-9b、decapentaplegic/dpp、artemin、gdnf、neurturin、persephin、lefty a、lefty b、mis/amh、nodal和scube3。在另一个实施例中，从包括以下几项的一组中选择所述至少一种tgfβ超家族蛋白：tgfβ1、tgfβ2和tgfβ3。在另一个实施例中，所述癌细胞在体外、体内和/或离体与tgfβ超家族蛋白接触。例如，所述癌细胞可在体外或离体与tgfβ超家族蛋白接触。在另一个实施例中，向受试者施用所述癌细胞，其中，向受试者施用所述tgfβ超家族蛋白，使其在体内与所述癌细胞接触。在另一个实施例中，在施用癌细胞之前、之后或期间，施用所述tgfβ超家族蛋白。在另一个实施例中，增加表1中所列的至少一种生物标志物的拷贝数、数量和/或活性，和/或降低表2中所列癌细胞中的至少一种生物标志物的拷贝数、数量和/或活性，激活tgfβ-smad/p63信号通路。例如，使所述癌细胞与核酸分子(编码表1中所列的至少一种生物标志物或其片段、表1中所列的至少一种生物标志物的多肽或其片段或与表1中所列的至少一种生物标志物结合的小分子)接触，可增加表1中所列的至少一种生物标志物的拷贝数、数量和/或活性。在另一个实施例中，增加smad2的核定位，激活所述tgfβ-smad/p63信号通路。在另一个实施例中，增加p63和smad2在癌细胞核中的结合，激活所述tgfβ-smad/p63信号通路。在另一个实施例中，使所述癌细胞与小分子抑制剂、crispr引导rna(grna)、rna干扰剂、反义寡核苷酸、肽或类肽抑制剂、适配子、抗体和/或细胞内抗体接触，降低表2中所列的至少一种生物标志物的拷贝数、数量和/或活性。
11.在另一个实施例中，所述癌细胞源自实体癌或血液癌。在另一个实施例中，所述癌细胞源自癌细胞系。在另一个实施例中，所述癌细胞源自原代癌细胞。在另一个实施例中，
所述癌细胞为乳腺癌细胞。在另一个实施例中，所述癌细胞源自三阴性乳腺癌(tnbc)。
12.在另一个实施例中，激活所述tgfβ-smad/p63信号通路，会诱导癌细胞中的上皮-间充质(emt)转化。在另一个实施例中，激活所述tgfβ-smad/p63信号通路，会上调癌细胞中icosl、pycard、sfn、perp、ripk3、casp9和/或sesn1的表达水平。在另一个实施例中，激活所述tgfβ-smad/p63信号通路，会下调癌细胞中ksr1、ksr1、eif4ebp1、itga5、emilin1、cd200和/或csf1的表达水平。在另一个实施例中，所述癌细胞能够在体外激活共培养树突状细胞(dc)。在另一个实施例中，所述癌细胞能够在体外上调共培养树突状细胞中的cd40、cd80、cd86、cd103、cd8、hla-dr、mhc-ii和/或il1-β。在另一个实施例中，所述癌细胞能够在dc存在时在体外激活共培养t细胞。在另一个实施例中，所述癌细胞能够在dc存在时在体外增加共培养t细胞的tnfα和/或ifnγ分泌量。在另一个实施例中，所述癌细胞在具有免疫能力的受试者体内未形成肿瘤。在另一个实施例中，所述癌症疫苗触发细胞毒性t细胞介导的抗肿瘤免疫反应。在另一个实施例中，所述癌症疫苗可增加血液和/或肿瘤微环境中的cd4 t细胞和cd8 t细胞。在另一个实施例中，所述癌症疫苗可增加血液和/或肿瘤微环境中的tnfα和infγ分泌cd4 t细胞和cd8 t细胞。在另一个实施例中，所述癌症疫苗上调肿瘤组织中icos、klrc1、il2rb、pik3cd、h2-d1、ccl8、ifng、icosl、il2ra、cxcr3、ccr7、cxcl10、cd74、h2-ab1、hspa1b、cd45、lifr和/或tnf的表达。在另一个实施例中，所述癌症疫苗可增加肿瘤浸润树突状细胞的数量。在另一个实施例中，所述癌症疫苗上调肿瘤相关dc中的cd80、cd103和/或mhc-ii。在另一个实施例中，所述癌症疫苗减少癌症中增殖细胞的数量和/或减小包含癌细胞的肿瘤的体积或大小。在另一个实施例中，所述癌症疫苗减少癌症中增殖细胞的数量和/或减小免疫原发位点包含癌细胞的肿瘤的体积或大小。在另一个实施例中，所述癌症疫苗减少癌症中增殖细胞的数量和/或减小远离免疫位点的组织中包含癌细胞的肿瘤的体积或大小。在另一个实施例中，所述癌症疫苗诱导肿瘤特异性记忆t细胞应答。在另一个实施例中，所述癌症疫苗可增加脾脏和/或淋巴结中cd4 中央记忆(t
cm
)t细胞和/或cd4 效应记忆(t
em
)t细胞的百分比。在另一个实施例中，所述癌症疫苗可增加脾cd8 t
cm
细胞的百分比。在另一个实施例中，所述癌症疫苗可增加脾脏和/或淋巴结中cd8 t
em
细胞的百分比。在另一个实施例中，所述癌症疫苗可增加肿瘤浸润cd4 t细胞和/或cd8 t细胞的数量。在另一个实施例中，所述癌症疫苗可增加肿瘤浸润cd4 t
cm
细胞和/或cd4 t
em
细胞的数量。在另一个实施例中，所述癌症疫苗可增加肿瘤浸润cd8 t
cm
细胞和/或cd8 t
em
细胞的数量。在另一个实施例中，所述癌细胞不可复制。在另一个实施例中，由于辐照，所述癌细胞不可复制。在另一个实施例中，所述辐照的剂量为亚致死剂量。
13.在另一个实施例中，将所述癌症疫苗与免疫疗法和/或癌症疗法联合施用于受试者，可选地，其中，在施用癌症疫苗之前、之后或期间，施用所述免疫疗法和/或癌症疗法。在另一个实施例中，所述免疫疗法基于细胞。在另一个实施例中，所述免疫疗法采用癌症疫苗和/或病毒。在另一个实施例中，所述免疫疗法抑制免疫检查点。在另一个实施例中，从包括以下几项的一组中选择所述免疫检查点：ctla-4、pd-1、vista、b7-h2、b7-h3、pd-l1、b7-h4、b7-h6、icos、hvem、pd-l2、cd160、gp49b、pir-b、kir家族受体、tim-1、tim-3、tim-4、lag-3、gitr、4-ibb、ox-40、btla、sirpalpha(cd47)、cd48、2b4(cd244)、b7.1、b7.2、ilt-2、ilt-4、tigit、hhla2、嗜乳脂蛋白和a2ar。在另一个实施例中，所述免疫检查点为pd1、pd-l1或cd47。在另一个实施例中，从包括以下几项的一组中选择所述癌症疗法：放疗、放射增敏剂
和化疗。
14.另一方面，本文提供了一种癌症疫苗对癌症受试者疗效的评估方法，包括：a)在受试者样本中，在第一时间点检测癌症中增殖细胞的数量和/或包含癌细胞的肿瘤的体积或大小；b)在施用癌症疫苗后的至少一个后续时间点重复步骤a)；以及c)比较癌症中增殖细胞的数量和/或包含癌细胞的肿瘤的体积或大小(在步骤a)和b)中检测)，其中，与第一时间点样本中的数量和/或体积或大小相比，癌症中增殖细胞的数量和/或后续样本中包含癌细胞的肿瘤的体积或大小为零或显著减小，这表明癌症疫苗可治疗受试者癌症。在一个实施例中，在第一时间点和后续时间点之间，所述受试者已接受治疗、完成治疗和/或处于癌症缓解状态。在另一个实施例中，从包括以下两项的一组中选择所述第一个样本和/或至少一个后续样本：离体样本和体内样本。在另一个实施例中，所述第一个样本和/或至少一个后续样本是从受试者体内获得的单一样本或合并样本的一部分。在另一个实施例中，所述样本包括从受试者体内获得的细胞、血清、周围淋巴器官和/或瘤内组织。在另一个实施例中，本文所述的方法进一步包括通过测量至少一个从包括以下几项的一组中选择的标准，确定对药剂的反应性：临床获益率、直至死亡的生存期、病理完全反应、病理反应的半定量测量、临床完全缓解、临床部分缓解、临床稳定疾病、无复发生存期、无转移生存期、无病生存期、循环肿瘤细胞减少、循环标志物反应和recist标准。在另一个实施例中，所述癌症疫苗的施用形式为可药用制剂。在另一个实施例中，在体内、离体或在体外执行施用步骤。
15.如上所述，某些实施例适用于本文所述本发明的任何方面。例如，在一个实施例中，所述癌症疫苗预防复发性和转移性肿瘤病灶。在另一个实施例中，向受试者瘤内或皮下施用所述癌症疫苗。在另一个实施例中，所述受试者为癌症动物模型，可选地，其中，所述动物模型为小鼠模型。在另一个实施例中，所述受试者为哺乳动物，可选地，其中，所述哺乳动物处于癌症缓解状态。在另一个实施例中，所述哺乳动物为小鼠或人类。例如，所述哺乳动物为人类。
附图说明
16.图1a-1c显示，经tgfβ处理的pp(pp
t
)肿瘤细胞在具有免疫能力的小鼠体内未形成肿瘤。图1a显示了研究tgfβ在tnbc(源自p53(在小鼠中由trp53编码)和pten(称为pp)并发消融)小鼠模型中作用的工作流程。图1b显示了通过实时pcr在pp和经tgfβ处理的pp(pp
t
)细胞中检测到的emt标志物的表达水平。数据为均值
±
均值标准误差。*表示p《0.05，***表示p《0.001，****表示p《0.0001；在每组中，n＝4。图1c显示了pp和pp
t
细胞的体内生长情况(在每组中，n＝10)。向同系fvb野生型小鼠体内注射了pp和经tgfβ处理的pp(pp
t
)肿瘤细胞。
17.图2a-2b显示，pp
t
肿瘤细胞在免疫缺陷小鼠体内形成肿瘤，但潜伏期延长。裸小鼠(图2a)和scid小鼠(图2b)体内pp和pp
t
肿瘤的生长速率；在每组中，n＝10。
18.图3a-3i显示，pp
t
肿瘤细胞诱导的抗肿瘤免疫反应依赖于t细胞。图3a显示了pp和pp
t
细胞在fvb野生型小鼠体内的生长情况(在每组中，n＝10)。图3b显示了pp
t
肿瘤细胞在使用抗cd3或抗igg治疗的fvb野生型小鼠体内的生长情况(在每组中，n＝10)。图3c为分析同系小鼠局部和全身抗肿瘤免疫应答的工作流程示意图。通过流式细胞术检测脾、外周血和肿瘤浸润cd45 cd3 cd4 t细胞(图3d-3f)和cd45 cd3 cd8 t细胞(图3g-3i)。图中显示了脾
脏、血液和肿瘤微环境中tnfα和ifn-γ分泌cd4 (图3e和图3f)和cd8 (图3h和图3i)t细胞的比例。数据为均值
±
均值标准误差。*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001，****表示p《0.0001；在每组中，n＝5。
19.图4a-4i显示，通过增强激活dc和t细胞，引起由激活tgfβ诱导的抗肿瘤免疫反应。为比较pp和pp
t 6日龄肿瘤组织之间的基因表达谱，进行了定制小鼠转录组分析(图4a
–
4c)。对上调基因进行了基因本体(go)富集和kegg通路分析(rpm
ppt
对rpm
pp
》2倍)。图4a显示了相关go术语/kegg通路。图4b显示了转录组数据中一些重要靶点的表达(通过实时pcr验证)。数据为均值
±
均值标准误差。*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001，****表示p《0.0001；在每组中，n＝5。图4c显示了正向调控抗肿瘤免疫反应的相关基因相互作用网络。图4d和4e显示了pp和pp
t 6日龄组织中肿瘤浸润cd45 cd11c dc的比例(通过流式细胞术分析)(图4d)。在dc中封闭mhc-ii、cd80和cd103的表达(图4e)；在每组中，n＝5。图4f为分析pp和pp
t
对dc和t细胞激活效果的工作流程示意图。图4g显示了通过流式细胞术检测dc激活标志物的情况；在每组中，n＝6，****表示p《0.0001。将从同系健康fvb小鼠骨髓中获取的“匹配同种异体”未成熟dc与pp或pp
t
细胞一起培养。图4h和图4i显示了通过流式细胞术确定cd4 (图4h)和cd8 (图4i)t细胞激活的情况；在每组中，n＝6。****表示p《0.0001。在存在或不存在肿瘤细胞的情况下，将t细胞和dc进行过夜共培养。
20.图5a-5d显示，pp
t
肿瘤细胞激活t细胞时，需要树突状细胞。图5a和图5b显示了mhc-ii在6日龄pp和pp
t
肿瘤组织cd45 和cd45-细胞中的表达情况(通过流式细胞术分析)；在每组中，n＝5。****表示p《0.0001。图5c和图5d显示了tnfα和ifn-γ在cd4 (图5c)和cd8 (图5d)t细胞中的表达情况(通过流式细胞术检测)；在每组中，n＝3。将从未经治疗的小鼠中分离的t细胞与pp或ppt细胞进行过夜培养。
21.图6a-6c显示了由tgfβ诱导的smad2/p63复合物介导抗肿瘤免疫反应。图6a显示了pp
t
细胞中的smad相关转录因子网络(基于定制小鼠转录组分析计算结果)。结节大小和颜色表示所示基因每百万读段(rpm)的数值。“smad”代表smad2、smad3和smad4复合物。图6b显示了同系小鼠中pp
t-scramble
或pp
t-shtrp63
肿瘤的生长情况；在每组中，n＝10。图6c显示了mhc-ii、cd80和cd103在dc中的表达情况(通过流式细胞术检测)；在每组中，n＝4。将从同系健康fvb小鼠骨髓中获取的“匹配同种异体”未成熟dc与pp
t-scramble
或pp
t-shtrp63
细胞进行共培养。
22.图7a-7d显示，tgfβ诱导在pp
t
细胞中形成smad2/p63复合物。图7a显示了p63蛋白在pp和pp
t
细胞中的表达情况。图7b和图7c显示了smad2和p63的细胞定位情况(通过共聚焦显微镜(图7b)和western印迹法(图7c)分析)。图7d显示了smad2和p63的蛋白间相互作用(通过免疫共沉淀检测分析)。
23.图8a-8d显示，tgfβ通过p63/smad2信号通路对pp细胞进行了重编程。通过比较对照细胞、p63和smad2基因沉默pp
t
细胞中的转录组，确定通过smad或p63基因沉默共上调(图8a)或共下调(图8b)的基因。图中还显示了相关go术语和kegg通路(下图)。热图显示了通过pp
t
细胞中的p63或smad2基因沉默共上调(图8c)和共下调(图8d)的相关靶点。
24.图9a-9f显示，tgfβ在人乳腺癌细胞中依赖于p63激活了抗肿瘤免疫反应。图9a显示了p63蛋白在人乳腺癌细胞系中的表达水平。图9b显示了将未成熟的人dc与人乳腺癌细胞mcf7或hcc1954一起培养(如图所示)。使用tgfβ处理mcf7
t
和hcc1954
t
。图9c
–
9e显示了cd80、cd86和cd103在dc中的表达情况(通过流式细胞术检测)；在每组中，n＝4；*表示p《
0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001。图9f显示了tp63-smad特征(pycard、ripk3、casp9、sesn1和tp63较高；ksr1、eif4ebp1、itga5和emilin1较低)与患者生存期之间的关系(根据curtis breast数据集)。****表示p《0.0001。
25.图10a-10b显示，当与pp
t
共同注射到同系小鼠体内时，pp肿瘤细胞未生长。向同系小鼠体内注射了pp和pp
t
细胞混合物(1:1)。图中显示了肿瘤生长(图10a；在每组中，n＝10)和长期生存情况(图10b；在每组中，n＝5)。
26.图11a-11d显示，tgfβ激活肿瘤细胞免疫诱导了免疫记忆应答。在注射pp
t
细胞后的第1周、第2周和第6周采集脾脏和淋巴结。通过流式细胞术分析cd45 cd3 cd4 foxp3-cd44 klrg1-cd62l 中央记忆t细胞(cd4 t
cm
细胞)(图11a)、cd45 cd3 cd4 foxp3-cd44 klrg1 cd62l-效应记忆t细胞(cd4 t
em
细胞)(图11b)、cd45 cd3 cd8 foxp3-cd44 klrg1-cd62l 中央记忆t细胞(cd8 t
cm
细胞)(图11c)和cd45 cd3 cd8 foxp3-cd44 klrg1 cd62l-效应记忆t细胞(cd8 t
em
细胞)(图11d)的比例。*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001，****表示p《0.0001；在每组中，n＝5只小鼠。
27.图12a-12g显示，tgfβ激活肿瘤细胞免疫诱导了靶向亲代肿瘤的免疫记忆应答。图12a为确定pp
t
免疫对pp肿瘤排斥反应效果的工作流程示意图。图12b
–
12e显示，向对照小鼠和pp
t
免疫小鼠体内移植了pp细胞或pp肿瘤片段。图中显示了小鼠的肿瘤生长曲线(图12b和图12d；在每组中，n＝10)和长期生存情况(图12c和12e；在每组中，n＝5)。图12f和图12g显示，通过尾静脉注射，向pp
t
免疫小鼠或对照小鼠体内注射了pp肿瘤细胞。4周后，检测到肺转移结节；在每组中，n＝5只小鼠，****表示p《0.0001。
28.图13a-13d显示，pp肿瘤挑战包括pp
t
免疫小鼠肿瘤微环境(tme)中的记忆t细胞应答。图13a显示了确定tme中记忆的工作流程。图13b显示了移植到pp
t
免疫小鼠或对照小鼠体内的pp肿瘤cd45 白细胞中肿瘤浸润cd4 和cd8 t细胞的比例。图13c显示了cd45 cd3 cd4 foxp3-cd44 klrg1-cd62l 中央记忆t细胞(cd4 t
cm
细胞)和cd45 cd3 cd4 foxp3-cd44 klrg1 cd62l-效应记忆t细胞(cd4 t
em
细胞)的比例。图13d显示了cd45 cd3 cd8 foxp3-cd44 klrg1-cd62l 中央记忆t细胞(cd8 t
cm
细胞)和cd45 cd3 cd8 foxp3-cd44 klrg1 cd62l-效应记忆t细胞(cd8 t
em
细胞)的比例。通过流式细胞术完成了分析。*p《0.05，***p《0.001，****p《0.0001；在每组中，n＝6。
29.图14a-14c显示，pp
t
细胞的疫苗效果未因辐照而减弱。使用经100gy伽马射线辐照的pbs、pp或pp
t
细胞使小鼠免疫。接种疫苗后4周，向所示小鼠的第三脂肪垫移植pp肿瘤片段。图中显示了小鼠的pp肿瘤生长(图14b，在每组中，n＝10)和生存情况(图14c，在每组中，n＝5)。
30.图15a-15h显示，可将pp
t
细胞用作靶向不同类型癌症的同种异体疫苗。向pbs或pp
t
细胞接种小鼠注射所示肿瘤细胞系。图中显示了ppa(图15a；一种以p53、pten和p110α三重缺失为特征的小鼠乳腺癌模型)、c260(图15c；一种p53/pten双重缺失和高myc小鼠卵巢癌模型)、d658(图15e；一种从乳腺癌pik3ca
h1047r
小鼠模型中产生的kras突变复发性乳腺癌细胞系)和d333(图15g；一种源自p53和pten双重缺失小鼠的脑肿瘤)肿瘤的生长情况。在每组中，n＝10。图15b、图15d、图15f和图15h显示了移植所示肿瘤的小鼠的生存情况。在每组中，n＝5。
31.图16为tgfβ-smad信号通路和分子事件(改编自zhang等人(2003年)，《细胞科学杂
志》，126:4809-4813)的示意图。
32.图17显示，由于树突状细胞的参与以及后续t细胞激活，肿瘤细胞中的tgfβ激活诱导了抗肿瘤免疫应答。在p63阳性肿瘤细胞中，tgfβ诱导smad核定位并促进形成p63和smad转录复合物，此转录复合物可上调多个免疫调控通路，并下调多个主要致癌信号通路，从而通过激活树突状细胞(dc)和t细胞，触发抗肿瘤免疫反应。
33.图18为本发明所含疫苗平台的一个代表实施例的示意图。
34.图19显示了t细胞群的门控策略。图中显示了脾脏、淋巴结、血液和肿瘤中cd4 、cd8 和cd4 调节性t细胞的流式细胞术门控策略。还显示了脾细胞的代表图。
35.图20显示了记忆t细胞群的门控策略。图中显示了脾脏、淋巴结、血液和肿瘤中cd4 中央记忆t细胞(cd4 t
cm
)、cd4 效应记忆t细胞(cd4 t
em
)、cd8 中央记忆t细胞(cd8 t
cm
)和cd8 效应记忆t细胞(cd8 t
em
)的流式细胞术门控策略。还显示了脾细胞的代表图。
36.图21显示了肿瘤浸润树突状细胞的门控策略。图中显示了肿瘤浸润树突状细胞(dc)的流式细胞术门控策略，以检测mhcii、cd80和cd103的表达。
37.对于显示条形直方图、曲线或与图例相关的其他数据的任何附图，每个指示从左到右呈现的条形、曲线或其他数据按顺序直接对应于图例中从上到下排列的各框。
具体实施方式
38.本文已确定，包含激活tgfβ-smad/p63信号的pten和p53缺陷肿瘤细胞(例如，已使用至少一种tgfβ超家族蛋白进行处理)未能在具有免疫能力的宿主中依赖于t细胞形成肿瘤。例如，在体外使用tgfβ处理源自同系小鼠乳腺肿瘤模型(由p53和pten并发缺失驱动)的肿瘤细胞，会彻底消除其依赖于t细胞在具有免疫能力的小鼠体内形成肿瘤的能力。结果还表明，通过树突状细胞(dc)的参与和激活，这些细胞触发了稳健抗肿瘤免疫反应，进而激活了靶向肿瘤细胞的t细胞。此外，人们发现，p63是tgfβ/smad介导转录以应对tgfβ刺激的一个关键辅因子。例如，激活tgfβ-smad/p63轴会上调转录输出，从而诱导激活多个免疫通路，当p63或smad2耗竭时，这些效应会消除。此外，施用包含激活tgfβ-smad/p63信号的肿瘤细胞可预防宿主因诱导长期记忆t细胞应答而导致出现复发性和转移性肿瘤病灶。人们还发现，乳腺癌患者的生存期与tgfβ-smad/p63特征存在高度相关性。这些结果揭示了一种促使tgfβ在肿瘤发生中发挥相反作用的新分子开关，并提供了一种通过基于tgfβ的重编程研发有效肿瘤疫苗的策略。因此，本文提供了使用包含以下癌细胞的癌症疫苗预防和/或治疗癌症的合成物和方法：(1)pten缺陷癌细胞；(2)p53缺陷癌细胞；以及(3)经修饰可激活tgfβ-smad/p63信号通路。此外，还提供了一种癌症疫苗预防和/或治疗癌症效果的评估方法。
39.i.定义
40.在本文中，冠词“一个(a)”和“一个(an)”系指冠词的一个或多个(即至少一个)语法对象。例如，“一个元素”系指一个元素或多个元素。
41.术语“给药”旨在包括使药剂执行其预期功能的给药途径。可用于身体治疗的给药途径示例包括注射(皮下、静脉内、胃肠外、腹膜内、囊内等)、口服、吸入和经皮途径。注射可以是团注或连续输注。根据给药途径，药剂可包覆所选材料或放置在所选材料中，以防受到自然条件的影响，因为自然条件可能对其执行预期功能的能力产生不利影响。药剂可单独给药，或与可药用载体联合给药。药剂也可作为前药进行给药，在体内转化为其活性形式。
42.术语“数量改变”或“水平改变”系指与对照样本中生物标志物核酸的表达水平或拷贝数相比，生物标志物核酸的拷贝数增加或减少(例如种系和/或体细胞)，例如，癌症样本中的表达水平增加或降低。生物标志物的“数量改变”还包括与正常对照样本中的相应蛋白水平相比，样本(例如癌症样本)中的生物标志物蛋白水平增加或降低。此外，可通过检测翻译后修饰(如标志物的甲基化状态)来确定生物标志物蛋白的数量改变情况，这些修饰可能影响生物标志物蛋白的表达或活性。
43.如果生物标志物数量与正常水平之差大于数量评估检测的标准误差，优选至少为20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、300％、350％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或以上，则受试者体内的生物标志物数量“显著”高于或低于生物标志物的正常水平。或者，如果数量比生物标志物数量分别高或低至少约两倍，优选至少约三倍、四倍或五倍，则受试者体内的生物标志物数量可视为“显著”高于或低于正常水平。此类“显著性”水平同样适用于本文所述的任何其他测量参数，如表达、抑制、细胞毒性、细胞生长参数等。
44.生物标志物的“表达水平改变”系指试样(例如源自癌症患者的样本)中生物标志物的表达水平或拷贝数大于或小于表达或拷贝数评估检测的标准误差，优选至少为对照样本(例如源自无相关疾病的健康受试者的样本)中生物标志物的表达水平或拷贝数的两倍，更优选三倍、四倍、五倍、十倍或更多倍，优选几个对照样本中生物标志物的平均表达水平或拷贝数。所述“表达水平改变”大于或小于表达或拷贝数评估检测的标准误差，优选至少为对照样本(例如源自无相关疾病的健康受试者的样本)中生物标志物的表达水平或拷贝数的20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、300％、350％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多倍，优选几个对照样本中生物标志物的平均表达水平或拷贝数。在一些实施例中，生物标志物的水平系指生物标志物本身、经修饰标志物(例如磷酸化生物标志物)的水平或生物标志物相对于另一测量变量(如对照品(例如磷酸化生物标志物相对于未磷酸化生物标志物))的水平。
45.生物标志物的“活性改变”系指相对于正常对照样本中生物标志物活性，生物标志物的活性在疾病状态(例如，在癌症样本中)下增加或降低。生物标志物活性改变的可能原因是生物标志物的表达改变、生物标志物的蛋白水平改变、生物标志物的结构改变、与其他蛋白(所涉及的通路与生物标志物相同或不同)的相互作用改变或与转录激活因子或抑制剂的相互作用改变。
46.生物标志物的“结构改变”系指与正常或野生型基因或蛋白相比，生物标志物核酸或蛋白内存在突变或等位基因变体，例如，影响生物标志物核酸或蛋白表达或活性的突变。例如，突变包括但不限于取代、缺失或添加突变。生物标志物核酸的编码区或非编码区均可能存在突变。
47.除非本文另有规定，否则术语“抗体”广泛包括天然形式的抗体(如igg、iga、igm、ige)和重组抗体(如单链抗体、嵌合和人源化抗体、多重特异性抗体)及其片段和衍生物，其片段或衍生物至少包含一个抗原结合位点。抗体衍生物可包含与抗体偶联的蛋白或化学部分。
48.此外，胞内抗体是常见的抗原结合分子，具有抗体的特性，但能够在细胞中表达，以结合和/或抑制目标胞内靶点(chen等人(1994年)，《人类基因疗法》，5:595-601)。在本领
和“单克隆抗体合成物”系指一种仅包含一种能够与抗原特定表位发生免疫反应的抗原结合位点的抗体多肽群，而术语“多克隆抗体”和“多克隆抗体合成物”系指一种包含多种能够与特定抗原相互作用的抗原结合位点的抗体多肽群。单克隆抗体合成物通常对与其发生免疫反应的特定抗原具有单一结合亲和性。
52.抗体也可以是“人源化”抗体，拟包括由包含可变区和恒定区的非人类细胞产生的抗体，此类抗体更类似于由人类细胞产生的抗体，例如，通过改变非人类抗体氨基酸序列，加入人类种系免疫球蛋白序列中的氨基酸。本发明所涉及的人源化抗体可包括未由人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，因体外随机或位点特异性诱变或体细胞突变而引起的突变)，例如，在cdr中。在本文中，术语“人源化抗体”还包括将源自另一个哺乳动物物种种系的cdr序列移植到人类构架序列上的抗体。
53.术语“生物标志物”系指本发明的可测量实体，经确定，其可用于预测癌症疗效。生物标志物可包括但不限于核酸(例如基因组核酸和/或转录核酸)和蛋白。许多生物标志物也可用作治疗靶点。
[0054]“封闭”抗体或抗体“拮抗剂”可抑制或降低其所结合抗原的至少一种生物活性。在某些实施例中，本文所述的封闭抗体、拮抗剂抗体或其片段可基本上抑制或完全抑制抗原的给定生物活性。
[0055]
术语“体液”系指从体内排泄或分泌的液体以及通常除以下各项之外的液体：羊水、房水、胆汁、血液和血浆、脑脊液、耵聍和耳垢、考珀液或预射精液、乳糜、食糜、粪便、女性精液、间质液、细胞内液、淋巴液、月经、母乳、粘液、胸膜液、脓液、唾液、皮脂、精液、血清、汗液、滑液、眼泪、尿液、阴道润滑液、玻璃体液、呕吐物。
[0056]
术语“癌症”、“肿瘤”或“过度增殖”系指细胞存在具有致癌细胞的典型特征，如增殖失控、永生化、转移潜能、生长和增殖速度快以及某些独特的形态特征。
[0057]
癌细胞通常以肿瘤的形式存在，但是，此类细胞也可单独存在于动物体内，或可以是非致瘤性癌细胞，如白血病细胞。在本文中，术语“癌症”包括癌前和恶性肿瘤。癌症包括但不限于b细胞癌(如多发性骨髓瘤)、华氏巨球蛋白血症、重链病(如α链病、γ链病和μ链病)、良性单克隆丙种球蛋白病、免疫细胞淀粉样变性、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、支气管癌、结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌症、周围神经系统癌症、食管癌、宫颈癌、子宫或子宫内膜癌、口腔癌或咽癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆道癌、小肠癌或阑尾癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、血液组织癌等。适用于本发明所含方法的癌症类型的其他非限制性示例包括人肉瘤和癌，例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、肝癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、骨癌、脑肿瘤、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤；白血病，例如急性淋巴细胞白血病和急性髓细胞白血病(成髓细胞白血病、早幼粒细胞白血病、粒单核细胞白血病、单核细胞白血病和红白血病)；慢性白血病(慢性粒细胞白血病和慢性淋巴细胞白血
病)；真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金病和非霍奇金病)、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症和重链病。在一些实施例中，癌症本质上为上皮癌，包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、妇科癌症、肾癌、喉癌、肺癌、口腔癌、头颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或皮肤癌。在其他实施例中，癌症为乳腺癌、前列腺癌、肺癌或结肠癌。在其他实施例中，上皮癌为非小细胞肺癌、非乳头状肾细胞癌、宫颈癌、卵巢癌(浆液性卵巢癌)或乳腺癌。可以各种其他方式描述上皮癌，包括但不限于浆液性、子宫内膜样、粘液性、透明细胞性、brenner或未分化上皮癌。
[0058]
术语“编码区”系指包含密码子的核苷酸序列中翻译成氨基酸残基的区域，而术语“非编码区”系指核苷酸序列中未翻译成氨基酸的区域(例如，5’和3’非翻译区)。
[0059]
术语“互补”系指两条核酸链的各区之间或同一核酸链的两个区之间序列互补的广义概念。众所周知，第一核酸区的腺苷残基能够与第二核酸区(如果残基为胸腺嘧啶或尿嘧啶，则与第一区反向平行)的残基形成特异性氢键。同样，众所周知，第一核酸链的胞嘧啶残基能够与第二核酸链(如果残基为鸟嘌呤，则与第一链反向平行)的残基进行碱基配对。核酸的第一区与相同或不同核酸的第二区互补，前提是，当两个区反向平行排列时，第一区的至少一个核苷酸残基能够与第二区的残基进行碱性配对。优选地，第一区包含第一部分，第二区包含第二部分，据此，当第一部分和第二部分反向平行排列时，第一部分至少约50％，优选至少约75％、至少约90％或至少约95％的核苷酸残基能够与第二部分的核苷酸残基进行碱基配对。更优选地，第一部分的所有核苷酸残基均能够与第二部分的核苷酸残基进行碱基配对。
[0060]
在本文中，术语“组合疗法”和“联合疗法”系指施用两种或多种治疗物质。各种药剂(包括联合疗法)可与一种或多种治疗剂合并施用，或在其之前或之后施用。
[0061]
术语“对照”系指适合提供与试样中表达产物比较的任何参考标准。在一个实施例中，所述对照包括获得“对照样本”，在此对照样本中，检测表达产物水平，并与试样中的表达产物水平进行比较。此类对照样本可包括任何适当的样本，包括但不限于结局已知的对照癌症患者的样本(可以是储存样本或先前样本测量值)；从正常患者或癌症患者等受试者体内分离的正常组织或细胞、从正常受试者或癌症患者等受试者体内分离的培养原代细胞/组织、从癌症患者相同器官或身体部位获得的相邻正常细胞/组织、从正常受试者体内分离的组织或细胞样本或从储藏室获得的原代细胞/组织。在另一个优选实施例中，所述对照可包括任何适当来源的参考标准表达产物水平，包括但不限于管家基因、正常组织(或其他先前分析的对照样本)中的表达产物水平范围、一组患者或一组获得某种结局(例如，生存一年、两年、三年或四年等)或接受某种治疗(例如，护理标准癌症治疗)的患者试样内先前确定的表达产物水平范围。相关技术人员理解，在本发明的方法中，此类对照样本和参考标准表达产物水平可组合用作对照。在一个实施例中，所述对照中包含正常或非癌细胞/组织样本。在另一个实施例中，所述对照包括一组患者的表达水平，如一组癌症患者、一组接受某种治疗的癌症患者或一组获得不同结局的患者。在前一种情况下，每名患者的特异性表达产物水平可分配百分位数的表达水平，或以高于或低于参考标准表达水平均值或平均值的水平表达。在另一个实施例中，所述对照可包括正常细胞、接受联合化疗的患者的细胞以及良性肿瘤患者的细胞。在另一个实施例中，所述对照也可包括测量值，例如，一个群体中一个特定基因的平均表达水平(与相同群体中管家基因的表达水平相比)。此类群体可包
括正常受试者、未接受任何治疗(即初治)的癌症患者、接受护理标准治疗的癌症患者或良性肿瘤患者。在另一个优选实施例中，所述对照包括表达产物水平的比值转换，包括但不限于确定试样中两个基因的表达产物水平比值并将其与参考标准品中两个相同基因按照任何适当比值进行比较；确定试样中两个或多个基因的表达产物水平并确定任何适当对照品中表达产物水平的差异；以及确定试样中两个或多个基因的表达产物水平，将其表达归一化为试样中管家基因的表达，并将其与任何适当对照品进行比较。在特别优选的实施例中，所述对照包括与试样具有相同谱系和/或类型的对照样本。在另一个实施例中，所述对照可包括在一组患者样本(如所有癌症患者)内或基于其以百分位数的形式分组的表达产物水平。在一个实施例中，确定了对照表达产物水平，其中，将相对于特定百分位数较高或较低的表达产物水平用作结局预测依据。在另一个优选实施例中，使用结局已知的癌症对照患者的表达产物水平确定对照表达产物水平，并将试样中的表达产物水平与对照表达产物水平进行比较，作为结局预测依据。如以下数据所示，本发明的方法不限于在比较试样中的表达产物水平与对照表达产物水平时使用特定截点。
[0062]
生物标志物核酸的“拷贝数”系指编码特定基因产物的一个细胞(例如种系和/或体细胞)中的dna序列数。一般而言，对于给定基因，在哺乳动物中，每个基因各2个。但是，拷贝数可通过基因扩增或复制增加，或通过缺失减少。例如，种系拷贝数变化包括一个或多个基因组位点变化，其中，所述一个或多个基因组位点不将对照品种系拷贝正常补体中的拷贝数计算在内(例如，物种的种系dna中的正常拷贝数，从此物种中，确定了特异性种系dna和相应拷贝数)。例如，体细胞拷贝数变化包括一个或多个基因组位点变化，其中，所述一个或多个基因组位点不将对照品种系dna中的拷贝数计算在内(例如，受试者的种系dna中的正常拷贝数，从此受试者中，确定了体细胞dna和相应拷贝数)。
[0063]
术语“免疫细胞”系指在免疫应答中发挥作用的细胞。免疫细胞源自造血源，包括淋巴细胞，如b细胞和t细胞；天然杀伤细胞；髓系细胞，如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。
[0064]
巨噬细胞(及其前体细胞—单核细胞)是免疫系统的“大胃王”。这些细胞以不同的形式存在于身体的各个组织中，如小胶质细胞、库普弗细胞和破骨细胞，它们吞噬凋亡细胞和病原体，产生免疫效应分子。组织损伤或感染后，单核细胞被迅速募集到组织中，在此处，它们将分化成组织巨噬细胞。巨噬细胞极具可塑性，可根据其接收到的环境提示改变其功能表型。通过其清除病原体并指导其他免疫细胞的能力，这些细胞在保护宿主方面发挥了核心作用，但也促成了炎症和退行性疾病的发病机制。引发炎症的巨噬细胞被称为m1巨噬细胞，而减少炎症并促进组织修复的巨噬细胞被称为m2巨噬细胞。m1巨噬细胞由lps和ifn-γ激活，并分泌较高水平的il-12和较低水平的il-10。m2是定居组织巨噬细胞的表型，可通过il-4进一步升高。m2巨噬细胞产生较高水平的il-10、tgfβ和较低水平的il-12。肿瘤相关巨噬细胞主要为m2表型，似乎会积极促进肿瘤生长。
[0065]
髓系衍生抑制细胞(mdsc)是髓系细胞谱系的固有部分，是一种异质性群体，由髓系祖细胞以及粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞的前体细胞组成。按髓系来源、未成熟状态和有效抑制t细胞应答的能力来定义mdsc。它们在健康个体中调控免疫应答和组织修复，在炎症、感染和癌症期间，此群体会迅速扩大。mdsc是肿瘤微环境的一个重要组成部分。这些细胞的主要特点是其具有强大的免疫抑制能力。mdsc在骨髓中产生，在荷瘤宿主中，会转移到
外周淋巴器官中，肿瘤会促使形成肿瘤微环境。这一过程受一组已定义趋化因子的控制，其中许多趋化因子在癌症中上调。缺氧似乎在肿瘤中的mdsc分化和功能调控方面发挥了关键作用。目前正在制定治疗策略，以靶向mdsc，从而促进抗肿瘤免疫应答，或在自身免疫性疾病或移植排斥的情况下抑制免疫应答。
[0066]
树突状细胞(dc)是一种专职抗原呈递细胞，位于皮肤、黏膜和淋巴组织中。其主要功能是加工抗原，并将它们呈递给t细胞，以促进对外源性抗原的免疫力以及对自身抗原的耐受性。它们还分泌细胞因子来调控免疫应答。
[0067]
常规t细胞也称为tconv或teffs，具有效应子功能(例如，细胞因子分泌、细胞毒活性、抗自身识别等)，通过表达一个或多个t细胞受体，可增加免疫应答。tcons或teffs通常系指除treg之外的任何t细胞群，包括初始t细胞、激活t细胞、记忆t细胞、静息tcons或向th1或th2谱系分化的tcons。在一些实施例中，teffs是非treg t细胞的一个亚型。在一些实施例中，teffs为cd4 teffs或cd8 teffs，如cd4 辅助性t淋巴细胞(如th0、th1、tfh或th17)和cd8 细胞毒性t淋巴细胞。如本文进一步所述，细胞毒性t细胞为cd8 t淋巴细胞。“初始tcons”为在骨髓中分化的cd4 t细胞，已在胸腺中成功完成阳性和阴性中枢选择过程，但尚未通过接触抗原进行激活。初始tcons通常表面表达l-选择素(cd62l)，缺乏cd25、cd44或cd69等激活标志物，还缺乏cd45ro等记忆标志物。因此，人们认为初始tcons处于静止期，不会分裂，需要白细胞介素-7(il-7)和白细胞介素-15(il-15)才能维持稳态生存(至少见wo 2010/101870)。在抑制免疫应答的情况下，不希望此类细胞存在并活动。与tregs不同，tcons不是无能的，可进行增殖，以应对基于抗原的t细胞受体激活(lechler等人(2001年)，《伦敦皇家学会哲学学报：生物科学》，356:625-637)。在肿瘤中，耗竭细胞是无能的标志。
[0068]
术语“免疫疗法”系指使用受试者免疫系统的某些部分对抗癌症等疾病的任何治疗。出于这一目的，在施用或不施用一种或多种药剂的情况下，受试者的自身免疫系统受到刺激(或抑制)。引起或增强免疫应答的免疫疗法被称为“激活免疫疗法”。减少或抑制免疫应答的免疫疗法被称为“抑制免疫疗法”。可检测对基因修饰移植癌细胞产生免疫系统影响的任何药剂，确定所述药剂是否属于免疫疗法，以及给定基因修饰对免疫应答调节的影响。在一些实施例中，免疫疗法具有癌细胞特异性。在一些实施例中，免疫疗法可以是“非靶向”疗法，即，施用不与免疫系统细胞发生选择性相互作用的药剂，但仍可调节免疫系统功能。非靶向疗法的代表性示例包括但不限于化疗、基因疗法和放疗。
[0069]
免疫疗法是靶向疗法的一种形式，可包括使用癌症疫苗和/或致敏抗原呈递细胞。例如，溶瘤病毒是一种能够感染并溶解癌细胞，同时使正常细胞不受伤害的病毒，因此可在癌症疗法中使用。溶瘤病毒复制会促进破坏肿瘤细胞，也会在肿瘤部位产生剂量扩增现象。它们也可作为抗肿瘤基因的载体，将抗肿瘤基因特异性输送到肿瘤部位。免疫疗法可涉及短期保护宿主的被动免疫，通过施用直接靶向癌症抗原或疾病抗原的预成抗体(例如，向肿瘤抗原施用可选连接化学治疗剂或毒素的单克隆抗体)实现。例如，抗vegf和mtor抑制剂已知可有效治疗肾细胞癌。免疫疗法也可重点使用癌细胞系的细胞毒性淋巴细胞识别表位。或者，反义多核苷酸、核酶、rna干扰分子、三重螺旋多核苷酸等可用于选择性调节与肿瘤或癌症起始、进展和/或病理有关的生物分子。
[0070]
免疫疗法可涉及短期保护宿主的被动免疫，通过施用直接靶向癌症抗原或疾病抗原的预成抗体(例如，向肿瘤抗原施用可选连接化学治疗剂或毒素的单克隆抗体)实现。免
疫疗法也可重点使用癌细胞系的细胞毒性淋巴细胞识别表位。或者，反义多核苷酸、核酶、rna干扰分子、三重螺旋多核苷酸等可用于选择性调节与肿瘤或癌症起始、进展和/或病理有关的生物分子。
[0071]
在一些实施例中，免疫疗法包括一个或多个免疫检查点抑制剂。术语“免疫检查点”系指cd4 和/或cd8 t细胞表面上的一组分子，可通过下调或抑制抗肿瘤免疫应答来微调免疫应答。免疫检查点蛋白在本领域中十分常见，包括但不限于：ctla-4、pd-1、vista、b7-h2、b7-h3、pd-l1、b7-h4、b7-h6、icos、hvem、pd-l2、cd160、gp49b、pir-b、kir家族受体、tim-1、tim-3、tim-4、lag-3、gitr、4-ibb、ox-40、btla、sirpalpha(cd47)、cd48、2b4(cd244)、b7.1、b7.2、ilt-2、ilt-4、tigit、hhla2、嗜乳脂蛋白和a2ar(见wo 2012/177624)。此术语进一步包含生物活性蛋白片段以及编码全长免疫检查点蛋白及其生物活性蛋白片段的核酸。在一些实施例中，此术语进一步包含本文同源性说明中所述的任何片段。在一个实施例中，所述免疫检查点为pd-1。
[0072]“抗免疫检查点疗法”系指使用可抑制免疫检查点核酸和/或蛋白的药剂。抑制一个或多个免疫检查点可阻断或以其他方式中和免疫信号，从而上调免疫应答，更有效地治疗癌症。可用于抑制免疫检查点的示例性药剂包括抗体、小分子、肽、类肽、天然配体及其衍生物，它们可结合和/或抑制免疫检查点蛋白或其片段或使其失活；以及rna干扰、反义、核酸适配子等，它们可下调免疫检查点核酸或其片段的表达和/或活性。用于上调免疫应答的示例性药剂包括靶向一个或多个免疫检查点蛋白(阻断蛋白与其天然受体之间的相互作用)的抗体；一个或多个免疫检查点蛋白的一种非激活形式(如显性阴性多肽)；阻断一个或多个免疫检查点蛋白与其天然受体之间相互作用的小分子或肽；与其天然受体结合的融合蛋白(如融合到抗体或免疫球蛋白fc部分的免疫检查点抑制蛋白的胞外部分)；阻断免疫检查点核酸转录或翻译的核酸分子等。此类药剂可直接阻断一个或多个免疫检查点与其天然受体(如抗体)之间的相互作用，以防产生抑制信号并上调免疫应答。或者，药剂可间接阻断一个或多个免疫检查点蛋白与其天然受体之间的相互作用，以防产生抑制信号并上调免疫应答。例如，免疫检查点蛋白配体(如稳定胞外结构域)的可溶版本可与其受体结合，间接降低与适当配体结合的受体的有效浓度。在一个实施例中，抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体和/或抗pd-l2抗体单独或组合用于抑制免疫检查点。这些实施例也适用于靶向特定免疫检查点的特定疗法，如pd-1通路(例如，抗pd-1通路疗法，也称为pd-1通路抑制剂疗法)。
[0073]
术语“免疫应答”包括t细胞介导的和/或b细胞介导的免疫应答。示例性免疫应答包括t细胞应答，例如，细胞因子的产生和细胞毒性。此外，术语“免疫应答”包括受t细胞激活间接影响的免疫应答，例如，细胞因子应答细胞(例如巨噬细胞)的抗体产生(体液应答)和激活。
[0074]
术语“免疫治疗剂”可包括可在受试者体内刺激宿主免疫系统对肿瘤或癌症产生免疫应答的任何分子、肽、抗体或其他药剂。各种免疫治疗剂可用于本文所述的合成物和方法。
[0075]
术语“抑制”包括减少、降低、限制和/或阻断特定作用、功能和/或相互作用。在一些实施例中，如果相互作用被减少、被阻断、被中断或不稳定，则两个分子之间的相互作用被“抑制”。
[0076]
在一些实施例中，如果癌症的至少一种症状得到缓解、终止、减缓或预防，则癌症
被“抑制”。在本文中，如果癌症复发或转移减少、减缓、延迟或预防，则癌症也被“抑制”。
[0077]
在系指两个分子之间的相互作用时，术语“相互作用”系指分子之间的物理接触(例如结合)。一般而言，此类相互作用使一个或两个所述分子具有活性(产生生物效应)。
[0078]“分离蛋白”系指一种蛋白，在从细胞中分离或通过重组dna技术生产时，基本上不含其他蛋白、细胞物质、分离培养基和培养基，或在化学合成时，基本上不含化学前体或其他化学物质。“分离”或“纯化”蛋白或其生物活性部分基本上不含细胞或组织来源(衍生抗体、多肽、肽或融合蛋白)的细胞物质或其他污染蛋白，或在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物质。“基本上不含细胞物质”包括制备一种生物标志物多肽或其片段，其中，从分离或重组产生蛋白的细胞的细胞组分中分离蛋白。在一个实施例中，“基本上不含细胞物质”包括制备一种生物标志物蛋白或其片段，其中包含少于约30％(按干重计)的非生物标志物蛋白(在本文中也称为“污染蛋白”)，更优选少于约20％的非生物标志物蛋白，更优选少于约10％的非生物标志物蛋白，最优选少于约5％的非生物标志物蛋白。当重组产生抗体、多肽、肽、融合蛋白或其片段(例如，其生物活性片段)时，还优选基本上不含培养基，即培养基少于约20％，更优选少于约10％，最优选少于约5％的蛋白制备体积。
[0079]
在本文中，术语“同种型”系指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如igm、igg1、igg2c等)。
[0080]
生物标志物的“正常”表达水平为未患癌受试者(例如人类患者)细胞中的生物标志物表达水平。生物标志物“过表达”或“表达水平显著较高”系指试样中的表达水平大于表达评估检测的标准误差，优选比对照样本(例如，从未患有生物标志物相关疾病的受试者体内获得的样本)中生物标志物的表达活性或水平以及几个对照样本中生物标志物的平均表达水平(优选)高至少10％，更优选高1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0、2.1倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、10.5倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍或更多倍。生物标志物“表达水平显著较低”系指试样中的表达水平比对照样本(例如，从未患有生物标志物相关疾病的受试者体内获得的样本)中生物标志物的表达水平以及几个对照样本中生物标志物的平均表达水平(优选)低至少10％，更优选低1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0、2.1倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、10.5倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍或更多倍。
[0081]
术语“预测”包括在治疗之前、治疗期间或治疗之后通过生物标志物核酸和/或蛋白状态(例如，活性过高或不足)、肿瘤的出现、表达、生长、缓解、复发或抗性确定癌症对单独的癌症疫苗或对癌症疫苗结合免疫疗法和/或癌症疗法产生反应的可能性。可通过以下方式确认生物标志物的此类预测使用情况：(1)例如，在约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％以上或更多的已检人类癌症类型或癌症样本中，拷贝数增加或减少(例如，通过fish、fish sky、单分子测序(例如，如本领域至少《生物技术杂志》，86:289-301所述)或qpcr)、生物标志物核酸过表达或低表达(例如，通过ish、northern印迹法或qpcr)、生物标志物蛋白增加或减少(例如，通过ihc)或活性增加或降低；(2)其在癌症受试者(例如人类)的生物样
本(例如，包含组织、全血、血清、血浆、颊刮屑、唾液、脑脊液、尿液、粪便或骨髓的样本)中存在或不存在绝对或相对调节；(3)其在癌症患者的临床亚型中存在或不存在绝对或相对调节(例如，对单独的癌症疫苗或癌症疫苗结合免疫疗法和/或癌症疗法产生反应的癌症，或对其产生抗性的癌症)。
[0082]
术语“预防”和“预防性治疗”等系指降低受试者(尚未出现但有可能或容易出现某种疾病、障碍或状况)出现某种疾病、障碍或状况的可能性。
[0083]
术语“癌症反应”、“对免疫疗法的反应”或“对t细胞介导的细胞毒性调节剂/免疫疗法联合疗法的反应”涉及过度增殖障碍(例如癌症)对癌症药剂(如t细胞介导的细胞毒性调节剂和免疫疗法)的任何反应，优选涉及在开始新辅助疗法或辅助疗法后肿瘤肿块和/或体积发生的变化。例如，可针对疗效或在新辅助或辅助环境中评估过度增殖障碍反应，可将全身干预后的肿瘤大小与通过ct、pet、乳房x光检查、超声或触诊测得的初始大小和尺寸进行比较。也可通过卡尺测量或在活检或手术切除后对肿瘤进行病理检查，进行反应评估。可采用定量(如肿瘤体积变化百分比)或定性(如“病理完全反应”(pcr)、“临床完全缓解”(ccr)、“临床部分缓解”(cpr)、“临床稳定疾病”(csd)、“临床进展疾病”(cpd)或其他定性标准)的方式记录反应。开始新辅助疗法或辅助疗法后，可在早期评估过度增殖障碍反应，例如，在几小时、几天或几周后，或优选在几个月后。典型的反应评估终点为新辅助化疗终止时或手术切除残留肿瘤细胞和/或肿瘤床时，通常为开始新辅助疗法后的三个月。在一些实施例中，通过衡量临床获益率(cbr)来确定本文所述治疗的临床疗效。通过确定处于完全缓解(cr)状态的患者百分比、处于部分缓解(pr)状态的患者数量以及在自治疗结束起至少6个月的时间点患有稳定疾病(sd)的患者数量的总和，衡量临床获益率(cbr)。此公式的简写为cbr＝cr pr sd(六个月内)。在一些实施例中，特定癌症治疗方案的cbr为至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或更多。对癌症疗法的反应的附加评估标准涉及“生存期”，包括以下各项：直至死亡的生存期，也称为总生存期(其中，所述死亡可由各种原因造成或与肿瘤相关)；无复发生存期(其中，术语“复发”应包括局部复发和远处复发)；无转移生存期；无病生存期(其中，术语“疾病”应包括癌症及其相关疾病)。可参照已定义的起点(例如，诊断或开始治疗的时间)和终点(例如，死亡、复发或转移)计算所述生存期。此外，疗效标准可扩展至包括对化疗的反应、生存概率、给定时间段内的转移概率以及肿瘤复发概率。例如，为了确定适当的阈值，可向受试者群体施用特定癌症治疗方案，结局可与在施用任何癌症疗法前确定的生物标志物测量有关。结局测量可以是对新辅助设置中给定疗法的病理反应。或者，在生物标志物测量值已知的癌症疗法后的一段时间内，可监测受试者的结局指标(如总生存期和无病生存期)。在某些实施例中，给药剂量为本领域癌症治疗剂的已知标准剂量。受试者的监测时间各有不同。例如，受试者的监测时间可至少为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55或60个月。可使用本领域常见的方法(如“示例”部分所述的方法)，确定与癌症疗法结局有关的生物标志物测量阈值。
[0084]
术语“抗性”系指癌症样本或哺乳动物对癌症疗法的获得性抗性或自然抗性(即，对治疗无反应、反应降低或反应有限)，如对治疗的反应降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多，如2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍或更多倍，或介于两者之间的任何范围(具有包
含性)。可通过与获得抗性之前的相同癌症样本或哺乳动物进行比较，或与已知对治疗无抗性的不同癌症样本或哺乳动物进行比较，衡量反应降低情况。将对化疗的典型获得性抗性称为“多药耐药性”。多药耐药性可由p-糖蛋白或其他机制介导，或可在哺乳动物被一种多药耐药性微生物或微生物组合感染时出现。在本领域以及在普通临床医生的技能范围内，确定对治疗的抗性是常规程序，例如，可通过细胞增殖检测和细胞死亡检测进行测量，在本文中称为“致敏”。在一些实施例中，如果与未经治疗的肿瘤体积相比，单独的主要癌症疗法(例如，化疗或放疗)无法在统计学上显著减小肿瘤体积，术语“逆转抗性”系指与未经治疗的肿瘤体积相比，使用第二种药剂结合主要癌症疗法(例如，化疗或放疗)能够在具有统计学意义的水平上(例如，p《0.05)显著减小肿瘤体积。这通常适用于在未经治疗的肿瘤有节奏地呈对数生长时进行的肿瘤体积测量。
[0085]
术语“反应”或“反应性”系指癌症反应，例如，从缩小肿瘤大小或抑制肿瘤生长的意义上讲。此术语也可系指改善预后，通过复发时间(即首次复发的时间，第二原发癌作为第一个事件或无复发迹象的死亡)增加或总生存期(即从治疗到因任何原因死亡的时间)增加得到体现。为了应对或提供反应手段，在受到刺激时获得了一个有利终点。或者，通过暴露于刺激下，使阴性或有害症状最小化、缓解或减轻。应理解，评估肿瘤或受试者将产生有利反应的可能性等同于评估肿瘤或受试者不会产生有利反应(即，缺乏反应或无反应)的可能性。
[0086]
在本文中，“rna干扰剂”系指通过rna干扰(rnai)干扰或抑制靶生物标志物基因表达的任何药剂。此类rna干扰剂包括但不限于核酸分子(包括与本发明的靶生物标志物基因同源的rna分子或其片段)、短干扰rna(sirna)以及通过rna干扰(rnai)干扰或抑制靶生物标志物基因表达的小分子。
[0087]“rna干扰(rnai)”是一种在进化上保守的过程，通过此过程，与靶生物标志物核酸相同或高度类似的序列rna的表达或引入会导致从靶基因转录的信使rna(mrna)出现序列特异性降解或特异性转录后基因沉默(ptgs)(见coburn和cullen(2002年)，《病毒学杂志》，76:9225，从而抑制靶生物标志物核酸表达。在一个实施例中，rna为双链rna(dsrna)。对植物、无脊椎动物和哺乳动物细胞中的此过程进行了描述。本质上，rnai由dsrna特异性核酸内切酶dicer引发，会促进将长dsrna持续切割成名为sirna的双链片段。sirna包含在可识别并切割靶mrna的蛋白复合物中。rnai也可通过引入核酸分子(例如，合成sirna或rna干扰剂)引发，从而抑制靶生物标志物核酸表达或使其沉默。在本文中，“抑制靶生物标志物核酸表达”或“抑制标志物基因表达”包括靶生物标志物核酸的表达或由靶生物标志物核酸编码的蛋白的蛋白活性或水平降低。与靶生物标志物核酸的表达或由靶生物标志物核酸(rna干扰剂未靶向)编码的蛋白的活性或水平相比，至少降低30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多。
[0088]
除rnai之外，基因组编辑可用于调节目标生物标志物的拷贝数或基因序列，如目标生物标志物的组成型或诱导型敲除或突变。例如，crispr-cas系统可用于对基因组核酸进行精确编辑(例如，用于产生非功能性或无效突变)。在此类实施例中，可表达crispr引导rna和/或cas酶。例如，可向cas9酶转基因动物或细胞施用仅包含引导rna的载体。可使用相似的策略(例如，设计锌指、转录激活因子样效应子(tale)或归位巨核酸酶)。此类系统在本领域中十分常见(见第8,697,359号美国专利；sander和joung(2014年)，《自然生物技术》，
32:347-355；hale等人(2009年)，《细胞》，139:945-956；karginov和hannon(2010年)，《分子细胞》，37:7；美国专利出版物2014/0087426和2012/0178169；boch等人(2011年)，《自然生物技术》，29:135-136；boch等人(2009年)，《科学》，326:1509-1512；moscou和bogdanove(2009年)，《科学》，326:1501；weber等人(2011年)，《plos one》，6:e19722；li等人(2011年)，《核酸研究》，39:6315-6325；zhang等人(2011年)，《自然生物技术》，29:149-153；miller等人(2011年)，《自然生物技术》，29:143-148；lin等人(2014年)，《核酸研究》，42:e47)。此类遗传策略可根据本领域常见的方法，使用组成型表达系统或诱导型表达系统。
[0089]“piwi相互作用rna(pirna)”是最大一类非编码rna小分子。pirna通过与piwi蛋白的相互作用形成rna蛋白复合物。这些pirna复合物与生殖系细胞中的逆转录转座子及其他遗传因子的表观遗传和转录后基因沉默有关(特别是在精子发生中)。它们的大小与微小rna(mirna)不同(26
–
31nt，而不是21
–
24nt)，缺乏序列保守性，且复杂性增加。但是，与其他小rna相同，pirna也参与基因沉默，特别是转座子沉默。大多数的pirna对转座子序列来说是反义的，这表明转座子是pirna靶点。在哺乳动物中，pirna在转座子沉默中的活性似乎在胚胎发育过程中最重要，在秀丽隐杆线虫和人类中，pirna对于精子发生必不可少。pirna通过形成rna诱导沉默复合物(risc)，在rna沉默中发挥作用。
[0090]“适配子”是与特异性靶分子结合的寡核苷酸或肽分子。“核酸适配子”是通过重复体外选择或等效的selex(指数富集配体的系统进化)进行工程化改造的核酸种类，可与各种分子靶点结合，如小分子、蛋白、核酸，甚至细胞、组织和生物体。“肽适配子”是经选择或工程化改造的人造蛋白，可与特异性靶分子结合。这些蛋白由可变序列(通过蛋白支架显示)的一个或多个肽环组成。通常从组合库中分离它们，然后通过直接突变或多轮可变区诱变和选择进行改进。“affimer蛋白”(肽适配子的一种进化)是一种较小且高度稳定的蛋白，经工程化改造后，以肽环的形式显示，为特异性靶蛋白提供了高亲和性结合表面。它是一种低分子量(12
–
14kda)蛋白，源自胱蛋白的半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族。适配子提供分子识别特性，可与常用的生物分子、抗体相媲美，因此可用于生物技术和治疗应用。除区分识别之外，适配子比抗体更具优势，因为它们可在试管中进行完全工程化改造，通过化学合成轻松产生，具有所需储存特性，并且在治疗应用中免疫原性极低或无免疫原性。
[0091]
在本文中，“胞内免疫球蛋白分子”是一种完整的免疫球蛋白，与天然分泌型免疫球蛋白相同，但在合成后仍留在细胞内。“胞内免疫球蛋白片段”系指任何片段，包括胞内免疫球蛋白分子的单链片段。因此，在细胞外表面上，不会分泌或表达胞内免疫球蛋白分子或其片段。单链胞内免疫球蛋白片段在本文中称为“单链免疫球蛋白”。在本文中，术语“胞内免疫球蛋白分子或其片段”包括“胞内免疫球蛋白”、“单链胞内免疫球蛋白”(或其片段)、“胞内免疫球蛋白片段”、“胞内抗体”(或其片段)和“细胞内抗体”(或其片段)。因此，术语“胞内免疫球蛋白”、“胞内ig”、“胞内抗体”和“细胞内抗体”在本文中可互换使用，并且均在“胞内免疫球蛋白分子或其片段”的通用定义范围内。在一些实施例中，本发明胞内免疫球蛋白分子或其片段可能包含两个或多个亚基多肽，例如，一个“第一胞内免疫球蛋白亚基多肽”和一个“第二胞内免疫球蛋白亚基多肽”。但是，在其他实施例中，胞内免疫球蛋白可以是“单链胞内免疫球蛋白”，仅包含一个单一多肽。在本文中，“单链胞内免疫球蛋白”系指具有所需活性(例如，胞内抗原结合活性)的任何单一片段。因此，单链胞内免疫球蛋白包括包含重链和轻链可变区(共同结合抗原)的单链胞内免疫球蛋白以及仅包含一个结合抗原的
单一可变区(例如，本文所述的“驼峰化”重链可变区)的单链胞内免疫球蛋白。基本上可在细胞内的任何位置表达胞内免疫球蛋白或ig片段，如在细胞质内、在细胞膜内表面上或在亚细胞区室(也称为细胞亚区室或细胞区室)内，如细胞核、高尔基体、内质网、内体、线粒体等。其他细胞亚区室包括本文所述且本领域常见的细胞亚区室。
[0092]
用于检测或确定至少一种生物标志物的存在或水平的术语“样本”通常为全血、血浆、血清、唾液、尿液、粪便(例如排泄物)、眼泪以及任何其他体液(例如，上文“体液”定义中所述的体液)或组织样本(例如活检)，如骨髓和骨样本或手术切除组织。在某些情况下，本发明的方法进一步包括在检测或确定样本中至少一种标志物的存在或水平前，从个体中获得样本。
[0093]
术语“致敏”系指改变癌细胞或肿瘤细胞，以便使用癌症疗法(例如，抗免疫检查点疗法、化疗和/或放疗)更有效地治疗相关癌症。在一些实施例中，正常细胞所受的影响不会导致正常细胞因上述疗法而受到过度损伤。根据本领域有关特定治疗的已知方法以及下文所述的方法，衡量对治疗的敏感性增加还是降低，包括但不限于细胞增殖检测(tanigawa n,kern d h,kikasa y,morton d l，《癌症研究》，1982年；42:2159-2164)、细胞死亡检测(weisenthal l m,shoemaker r h,marsden j a,dill p l,baker j a,moran e m，《癌症研究》，1984年；94:161-173；weisenthal l m,lippman m e，《癌症治疗报告》，1985年；69:615-632；weisenthal l m，见：kaspers g j l,pieters r,twentyman p r,weisenthal l m,veerman a j p(编辑)，《白血病和淋巴瘤耐药性》。langhorne,p a：哈伍德学术出版社，1993年：415-432；weisenthal l m，《对妇产科学的贡献》，1994年；19:82-90)。还可以通过在一段时间内测量肿瘤大小减小情况(例如，对于人类，6个月)，测量在动物中的敏感性或抗性。如果与不使用合成物或方法时的治疗敏感性或抗性相比，治疗敏感性增加或抗性降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多，如2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍或更多倍，或介于两者之间的任何范围(具有包含性)，则此类合成物或方法使对治疗的反应敏感。在本领域以及在普通临床医生的技能范围内，确定对治疗的敏感性或抗性是常规程序。应理解，本文所述用于提高癌症疗法疗效的任何方法可同样适用于使过度增殖或癌细胞(例如抗性细胞)对癌症疗法敏感的方法。
[0094]“短干扰rna”(sirna)在本文中也称为“小干扰rna”，系指一种可通过rnai等抑制靶生物标志物核酸表达的药剂。sirna可化学合成，也可通过体外转录产生或在宿主细胞内产生。在一个实施例中，sirna为双链rna(dsrna)分子，长度为约15个至约40个核苷酸，优选约15个至约28个核苷酸，更优选约19个至约25个核苷酸，更优选约19、20、21或22个核苷酸，每条链上可包含一个3’和/或5’突出末端，长度约为0、1、2、3、4或5个核苷酸。两条链的突出末端长度是独立的，即一条链上的突出末端长度不取决于第二条链上的突出末端长度。优选地，sirna能够通过靶信使rna(mrna)的降解或特异性转录后基因沉默(ptgs)促进rna干扰。
[0095]
在另一个实施例中，sirna为小发夹(也称为茎环)rna(shrna)。在一个实施例中，这些shrna由一条短(例如，19-25个核苷酸)反义链、其后面的一个核苷酸环(包含5-9个核苷酸)和类似的有义链组成。或者，有义链可在核苷酸环结构之前，反义链可紧随其后。这些shrna可包含在质粒、逆转录病毒和慢病毒中，并从pol iii u6启动子或另一个启动子中表
达(见stewart等人(2003年)，rna apr；9(4):493-501，所述参考文献通过本发明的引用，成为本发明的一部分)。
[0096]
可向患有癌症或有患癌风险的患者施用rna干扰剂(例如sirna分子)，以抑制生物标志物基因(在癌症中过表达)的表达，从而在受试者中治疗、预防或抑制癌症。
[0097]
术语“小分子”是本领域的一个术语，包括分子量小于约1000或小于约500的分子。在一个实施例中，小分子不只包含肽键。在另一个实施例中，小分子不是寡聚物。可进行活性筛选的示例性小分子化合物包括但不限于肽、类肽、核酸、碳水化合物、有机小分子(例如聚酮化合物)(cane等人(1998年)，《科学》，282:63)，以及天然产物提取库。在另一个实施例中，化合物为较小的有机非肽类化合物。在另一个实施例中，小分子是生物合成的。
[0098]
术语“特异性结合”系指抗体与预定抗原结合。抗体通常以约小于10-7
m的亲和性(kd)结合，如约小于10-8
m、10-9
m或10-10
m，或在将目标抗原用作分析物，并将抗体用作配体，在检测仪器中采用表面等离子体共振(spr)技术进行确定时甚至更低，与预定抗原结合时，亲和性比其与除预定抗原或密切相关抗原之外的非特异性抗原(例如，bsa、酪蛋白)结合时的亲和性高至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0倍、10.0倍或更多倍。短语“抗原识别抗体”和“抗原特异性抗体”在本文中可与“特异性结合抗原的抗体”互换使用。选择性结合是一个相对术语，系指抗体区分抗原结合的能力。
[0099]
术语“受试者”系指任何健康动物、哺乳动物或人类，或患有癌症(例如，脑癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌和/或结直肠癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤等)的任何动物、哺乳动物或人类。术语“受试者”可与“患者”互换使用。
[0100]
术语“生存期”包括以下各项：直至死亡的生存期，也称为总生存期(其中，所述死亡可由各种原因造成或与肿瘤相关)；无复发生存期(其中，术语“复发”应包括局部复发和远处复发)；无转移生存期；无病生存期(其中，术语“疾病”应包括癌症及其相关疾病)。可参照已定义的起点(例如，诊断或开始治疗的时间)和终点(例如，死亡、复发或转移)计算所述生存期。此外，疗效标准可扩展至包括对化疗的反应、生存概率、给定时间段内的转移概率以及肿瘤复发概率。
[0101]
术语“协同效应”系指两种或多种癌症药剂(例如癌症疫苗结合免疫疗法)的联合效应可大于癌症药剂/疗法的单独效应。
[0102]
术语“t细胞”包括cd4 t细胞和cd8 t细胞。术语“t细胞”还包括t辅助性1型t细胞和t辅助性2型t细胞。术语“抗原呈递细胞”包括专职抗原呈递细胞(例如b淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞、朗格汉细胞)以及其他抗原呈递细胞(例如角化细胞、内皮细胞、星形胶质细胞、成纤维细胞和少突胶质细胞)。
[0103]
术语“疗效”系指在动物(特别是哺乳动物，更特别是人类)中因药理活性物质而造成的局部或全身效应。因此，此术语系指拟用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防疾病或增强动物或人类的理想身体或精神发展和状况的任何物质。短语“治疗有效量”系指此类物质以适用于任何治疗的合理效益/风险比产生某些预期局部或全身效应的量。在某些实施例中，化合物的治疗有效量将取决于其治疗指标，如溶解度等。例如，可足量施用通过本发明的方法发现的某些化合物，以产生适用于任何治疗的合理效益/风险比。
[0104]
在本文中，术语“治疗有效量”和“有效量”系指可实现以下目标的化合物、物质或
合成物(包括本发明的化合物)的量：可在动物细胞的至少一个亚群体中以适用于任何医学治疗的合理效益/风险比有效产生某些预期疗效。可通过标准药物程序在细胞培养物或实验动物中确定主体化合物的毒性和疗效(例如，用于确定ld
50
和ed
50
)。优选治疗指标较大的合成物。在一些实施例中，ld
50
(致死剂量)可测量，并且与未施用药剂相比，施用药剂时可降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多。同样，ed
50
(即达到症状半最大抑制的浓度)可测量，并且与未施用药剂相比，施用药剂时可增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多。此外，同样，ic
50
(即对癌细胞达到半最大细胞毒性或静胞效应的浓度)可测量，并且与未施用药剂相比，施用药剂时可增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多。在一些实施例中，可在检测中抑制癌细胞生长，抑制率至少约为10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％，甚至100％。在另一个实施例中，实体恶性肿瘤可减少至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％，甚至100％。
[0105]
术语“基本上不含化学前体或其他化学物质”包括制备抗体、多肽、肽或融合蛋白，其中，从参与蛋白合成的化学前体或其他化学物质中分离蛋白。在一个实施例中，“基本上不含化学前体或其他化学物质”包括制备抗体、多肽、肽或融合蛋白，其中包含少于约30％(按干重计)的化学前体或非抗体、多肽、肽或融合蛋白化学物质，更优选少于约20％的化学前体或非抗体、多肽、肽或融合蛋白化学物质，更优选少于约10％的化学前体或非抗体、多肽、肽或融合蛋白化学物质，最优选少于约5％的化学前体或非抗体、多肽、肽或融合蛋白化学物质。
[0106]“转录多核苷酸”或“核苷酸转录物”是一种多核苷酸(例如，mrna、hnrna、cdna或此类rna或cdna的类似物)，与通过生物标志物核酸转录以及rna转录物的正常转录后加工(即剪接)(如有)和rna转录物的逆转录产生的成熟mrna的全部或部分互补或同源。
[0107]
术语“宿主细胞”系指已引入本发明所含核酸(如本发明所含的重组表达载体)的细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。应理解，此类术语不仅系指特定主体细胞，还系指此类细胞的后代或潜在后代。由于突变或环境影响，后代可能发生某些变化，因此，此类后代实际上可能与母细胞不同，但仍在本文所用术语的范围内。
[0108]
术语“载体”系指一种核酸，能够运输与其相连的另一种核酸。一种载体为“质粒”，即可连接其他dna片段的环状双链dna环。另一种载体为病毒载体，其中，其他dna片段可连接至病毒基因组。某些载体能够在其所在的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体以及游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如，游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后被整合到宿主细胞的基因组中，因此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够引导其可连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”，或简称“表达载体”。一般而言，在重组dna技术中，表达载体通常采用质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体最常用的一种形式。但是，本发明旨在包括表达载体的此类其他形式，如病毒载体(例如，复制缺陷逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，它们具有等效功能。
[0109]
在本文中，术语“无反应性”包括癌细胞对疗法的反应性或治疗性细胞(如免疫细胞)对刺激(例如，通过激活受体或细胞因子进行刺激)的反应性。接触免疫抑制剂或高剂量抗原可导致无反应性。在本文中，术语“无能”或“耐受”包括对激活受体介导刺激的反应性。此类反应性通常具有抗原特异性，在停止接触耐受抗原后仍继续存在。例如，t细胞无能(而不是无反应性)的特征是不产生细胞因子(例如il-2)。当t细胞接触抗原并在没有第二信号(共刺激信号)的情况下接收第一信号(t细胞受体或cd-3介导)时，t细胞无能。在这些条件下，使细胞再次接触相同抗原(即使在存在共刺激多肽时再次接触)会导致未能产生细胞因子，因此未能增殖。但是，与细胞因子(例如il-2)一起培养时，无能t细胞可增殖。例如，通过elisa或通过使用指示细胞系的增殖检测量，确认t淋巴细胞未产生il-2，因此也可观察到t细胞无能情况。或者，可使用报告基因构建体。例如，无能t细胞未能启动由异源启动子(在5’il-2基因增强子的控制下)或ap1序列(可在增强子中发现)的多聚体诱导的il-2基因转录(kang等人(1992年)，《科学》，257:1134)。
[0110]
术语“tgfβ-smad/p63信号通路”系指tgfβ信号通路的一个分支。tgfβ信号通路参与成年生物体和发育胚胎中的许多细胞过程，包括但不限于细胞生长、细胞分化、细胞凋亡、细胞自动调节以及其他细胞功能。在一些实施例中，tgfβ超家族配体(例如，tgfβ1、tgfβ2和/或tgfβ3)与ii型受体结合，ii型受体募集i型受体并使其磷酸化。然后，i型受体使受体调控的smad(r-smad；例如，smad1、smad2、smad3、smad5或smad9)磷酸化，此时即可与cosmad(例如，smad4)结合。r-smad/cosmad复合物积聚在细胞核中，作为转录因子并参与靶基因表达的调控。在“tgfβ-smad/p63信号通路”的分支中，r-smad/cosmad复合物进一步与细胞核中的p63结合，以调控靶基因表达。在一个实施例中，r-smad为smad2。可通过分析smad2磷酸化、smad2核易位、smad2与p63的结合和/或tgfβ-smad/p63特征基因的激活，评估tgfβ-smad/p63信号通路激活情况。tgfβ-smad/p63特征可包括但不限于上调icosl、pycard、sfn、perp、ripk3和/或sesn1，和/或下调ksr1、eif4ebp1、itga5、emilin1、cd200和/或csf1。
[0111]
在一些实施例中，在与其受体结合后，tgfβ促进在细胞质膜上形成tgfbrii和tgfbr1异二聚体。然后，细胞质信号分子r-smad(如smad2和smad3)被激活的tgfbri磷酸化。激活的r-smad与co-smad(如smad4)形成复合物，并易位到细胞核中。如本文所述，通过与p63(或其他p53家族成员p53或p73等)合作，smad/p63转录复合物可上调炎性基因(如icosl、nfkbib、tnfaip3、pik3r1和perp)，并下调致癌基因(如cd200、cxcl5、csf1、pdgfrb、fgfr1、vegfa)。因此，具有激活tgfβ-smad/p63特征的肿瘤细胞会向免疫系统显示强烈的“吃我”信号，并通过募集抗原呈递细胞(如树突状细胞)触发抗肿瘤免疫应答。树突状细胞(dc)吸收肿瘤特异性抗原，并促进肿瘤特异性效应和记忆t细胞应答，从而为宿主提供靶向肿瘤的全面保护。可调节参与此通路的信号分子，激活tgfβ-smad/p63信号通路。在特定实施例中，调节smad超家族(包括smad1、smad2、smad3、smad4、smad5、smad6、smad7和smad9)和p53超家族(包括p53、p63和p73)，以激活本发明所含合成物和方法中的tgfβ-smad/p63信号通路。
[0112]
可提供tgfβ超家族配体或tgfβ信号通路激动剂，激活tgfβ-smad/p63信号通路。此通路也可进行调控和/或处于smad和p63的水平。可用于激活tgfβ-smad/p63信号通路或本文所述的其他生物标志物的示例性药剂包括小分子、肽和核酸等，它们可上调表1中所列的一种或多种生物标志物或其片段的表达和/或活性；和/或降低表2中所列的一种或多种生
物标志物或其片段的拷贝数、数量和/或活性。可用于激活tgfβ-smad/p63信号通路或本文所述的其他生物标志物的示例性药剂还包括tgfβ超家族配体。
[0113]
在一个实施例中，适当的激动剂包括tgfβ超家族成员天然激动剂或其片段和变体。例如，tgfβ信号激动剂可包括一种可溶形式的内皮糖蛋白，见第5,719,120号、第5,830,847号和第6,015,693号美国专利，所述专利通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。在另一个实施例中，适当的激动剂可包括天然tgfβ拮抗剂抑制剂。已确定多种可调控tgfβ信号的天然调节剂。例如，tgfβ配体接近受体受可溶蛋白lap、核心蛋白聚糖和α2巨球蛋白(结合并隔离配体)抑制(balemans和van hul(2002年)，《发育生物学》，250:231-250)。tgfβ配体接近受体还受膜结合受体控制。bambi作为诱骗受体，与i型受体竞争(onichtchouk等人(1999年)，《自然》，401:480-485；β聚糖(tgfβii型受体)会增强tgfβ与ii型受体的结合(brown等人(1999年)，《科学》，283:2080-2082，massagu
é
(1998年)，《生物化学年鉴》，67:753-791，del re等人(2004年)，《生物化学杂志》，279:22765-22772)；内皮糖蛋白会增强内皮细胞中tgfβ与alk1的结合(marchuk(1998年)，《当代血液学观点》，5:332-338；massagu
é
(2000年)《自然综述-分子细胞生物学》，1:169-178；shi和massagu
é
(2003年)，《细胞》，113:685-700)。cripto是一种egf-cfc gpi锚定膜蛋白，作为共受体，可增加tgfβ配体nodal、vg1和gdf1与激活素受体的结合(cheng等人(2003年)，《基因与发育》，17:31-36，shen和schier(2000年)，《遗传学趋势》，16:303-309)，同时阻断激活素信号。适当的激动剂还包括合成或人重组化合物。可用作激动剂的分子类别包括但不限于小分子、抗体(包括其片段或变体，如fab片段、fab
′
2片段和scfv)和类肽。
[0114]
在本文中，术语“tgfβ超家族”系指多功能蛋白的大家族，此类蛋白可调控各种细胞功能，包括细胞增殖、迁移、分化和凋亡。tgfβ超家族目前包括30多个成员，其中包括激活素、抑制素、转化生长因子β(tgfβ)、生长分化因子(gdf)、骨形态发生蛋白(bmp)和苗勒氏管抑制物质(mis)。所有这些分子均为肽生长因子，在结构上与tgfβ相关。它们共享一个名为半胱氨酸结的通用基序，此基序是由7个特别保守的半胱氨酸残基组成的一个刚性结构(massagu
é
(1998年)，《生物化学年鉴》，67:753-791)。与典型的激素不同，tgfβ超家族成员属于多功能蛋白，其效应不仅取决于生长因子本身，还取决于靶细胞的类型和分期。
[0115]
适用于本发明实践的tgfβ超家族成员包括可激活tgfβ-smad/p63信号通路的任何tgfβ超家族成员。在一个实施例中，tgfβ超家族成员来自tgfβ家族，包括但不限于lap、tgfβ1、tgfβ2、tgfβ3和tgfβ5。在另一个实施例中，tgfβ超家族成员来自激活素家族，包括但不限于激活素a、激活素ab、激活素ac、激活素b、激活素c、c17orf99、inhba、inhbb、抑制素、抑制素a和抑制素b。在另一个实施例中，tgfβ超家族来自bmp(骨形态发生蛋白)家族，包括但不限于bmp-1/pcp、bmp-2、bmp-2/bmp-6heterodimer、bmp-2/bmp-7异二聚体、bmp-2a、bmp-3、bmp-3b/gdf-10、bmp-4、bmp-4/bmp-7异二聚体、bmp-5、bmp-6、bmp-7、bmp-8、bmp-8a、bmp-8b、bmp-9、bmp-10、bmp-15/gdf-9b和decapentaplegic/dpp。在另一个实施例中，tgfβ超家族成员来自gdnf家族，包括但不限于artemin、gdnf、neurturin和persephin。其他tgfβ超家族成员包括lefty a、lefty b、mis/amh、nodal和scube3。
[0116]
在某些实施例中，tgfβ超家族成员来自tgfβ家族。tgfβ是tgfβ家族的创始成员，在成体组织中发挥各种用，包括胚胎模式形成、细胞生长调控。哺乳动物细胞可产生以下三种不同的tgfβ异构体：tgfβ1、tgfβ2和tgfβ3。这些异构体具有相同的基础结构(它们是由链内
和链间二硫键稳定的112个氨基酸的同二聚体)，其氨基酸序列具有高度同源性(》70％)。但是，每个异构体由不同的基因编码，表达方式为组织特异性和受发育调控(massagu
é
(1988年)，《生物化学年鉴》，67:753-791)。tgfβ通过信号转导级联发挥其生物功能，最终激活和/或抑制一组特异性基因的表达。交联研究表明，tgfβ主要与三种高亲和性细胞表面蛋白结合，即i型、ii型和iii型tgfβ受体(massagu
é
和like(1985年)，《生物化学杂志》，260:2636-2645，cheifetz等人(1986年)，《生物化学杂志》，261:9972-9978)。在一些实施例中，tgfβ通过首次与其ii型受体结合，然后募集并激活其i型受体，触发其信号。然后，激活i型受体使其胞内信号转导分子(smad蛋白)磷酸化(heldin等人(1997年)，《自然》，390:465-471；derynck等人(1998年)，《细胞》，95:737-740)。
[0117]
术语“tgfβ1”或“转化生长因子β1”系指tgfβ超家族蛋白的一种分泌配体。此家族的配体与各种tgfβ受体结合，从而募集并激活可调控基因表达的smad家族转录因子。编码前原蛋白经蛋白水解加工，产生潜在型结合肽(lap)和成熟肽，并以潜在形式(由一个成熟肽同二聚体、一个lap同二聚体和一个潜在型tgfβ结合蛋白组成)或活性形式(完全由成熟肽同二聚体组成)存在。成熟肽也可与其他tgfβ家族成员形成异二聚体。按不同的步骤激活为成熟形式：切割高尔基体中的原蛋白后，lap和tgfβ1链仍保持非共价连接，储存在细胞外基质中时，导致tgfβ1失活。同时，lap链与“环境分子”(如ltbp1、lrrc32/garp和lrrc33/nrros)发生相互作用，控制tgfβ1激活，并在储存在细胞外环境中时使其处于潜在态。通过整合素，从lap中释放tgfβ1。整合素与lap结合会稳定lap蝴蝶结尾的替代构象，导致lap链变形，随后释放活性tgfβ1。在激活随后的lap释放作用后，tgfβ1通过与tgfβ受体结合(转导信号)发挥作用。在优选实施例中，术语“tgfβ1”系指激活tgfβ1。
[0118]
tgfβ1调控细胞增殖、分化和生长，可调节其他生长因子(包括干扰素γ和肿瘤坏死因子α)的表达和激活。tgfβ1在骨重建中发挥重要作用。tgfβ1作为成骨性骨形成的强大刺激剂，在定型成骨细胞中引起趋化、增殖和分化。它可依赖浓度促进t辅助17细胞(th17)或调节性t细胞(treg)谱系分化。在较高浓度下，tgfβ1导致foxp3介导的rorc抑制和il-17表达下调，有利于细胞发育。在与il-6和il-21协同作用的较低浓度下，tgfβ1导致il-17和il-23受体表达，有利于分化成th17细胞。tgfβ1通过调节性膜内蛋白水解(rip)激活creb3l1，刺激持续产生胶原蛋白。tgfβ1诱导smad2/3磷酸化，随后使其易位到细胞核中，从而介导smad2/3激活(hwangbo等人(2016年)，《致癌基因》，35:389-401)。还可在各种细胞类型中诱导上皮-间充质转化(emt)和细胞迁移(hwangbo等人(2016年)，《致癌基因》，35:389-401)。在肿瘤细胞中，tgfβ1经常上调，此基因突变会导致camurati-engelmann病。
[0119]
术语“tgfβ1”旨在包括其片段、变体(例如等位基因变体)和衍生物。代表性人tgfβ1 cdna和人tgfβ1蛋白序列在本领域中十分常见，可从国家生物技术信息中心(ncbi)公开获取。例如，一种人tgfβ1异构体已知。人tgfβ1转录物(nm_000660.7)编码tgfβ1原蛋白前原蛋白(np_000651.3)。生物体(人类除外)tgfβ1直向同源物的核酸和多肽序列众所周知，包括黑猩猩tgfβ1(xm_016936045.2和xp_016791534.1；xm_512687.6和xp_512687.2；以及xm_009435655.3和xp_009433930.1)；狗tgfβ1(nm_001003309.1和np_001003309.1)、牛tgfβ1(nm_001166068.1和np_001159540.1)、小鼠tgfβ1(nm_011577.2和np_035707.1)以及大鼠tgfβ1(nm_021578.2和np_067589.1)。
[0120]
术语“tgfβ2”或“转化生长因子β2”系指tgfβ超家族蛋白的一种分泌配体。如本文
所述，此家族的配体与各种tgfβ受体结合，从而募集并激活可调控基因表达的smad家族转录因子。编码前原蛋白经蛋白水解加工，产生潜在型结合肽(lap)和成熟肽，并以潜在形式(由一个成熟肽同二聚体、一个lap同二聚体和一个潜在型tgfβ结合蛋白组成)或活性形式(完全由成熟肽同二聚体组成)存在。成熟肽也可与其他tgfβ家族成员形成异二聚体。按不同的步骤激活为成熟形式：切割高尔基体中的原蛋白后，lap和tgfβ2链仍保持非共价连接，储存在细胞外基质中时，导致tgfβ2失活。同时，lap链与“环境分子”(如ltbp1和lrrc32/garp)发生相互作用，控制tgfβ2激活，并在储存在细胞外环境中时使其处于潜在态。在激活随后的lap释放作用后，tgfβ2通过与tgfβ受体结合(转导信号)发挥作用。在优选实施例中，术语“tgfβ2”系指激活tgfβ2。在各种人类癌症中，均涉及tgfβ/smad通路破坏情况。tgfβ2调控血管生成和心脏发育等各种过程(boileau等人(2012年)，《自然遗传学》，44:916-921，lindsay等人(2012年)，《自然遗传学》，44:922-927)。包含tgfβ2基因的染色体易位与peters异常(一种眼前房的先天性缺陷)相关。tgfβ2基因突变可与loeys-dietz综合征相关。
[0121]
术语“tgfβ2”旨在包括其片段、变体(例如等位基因变体)和衍生物。代表性人tgfβ2 cdna和人tgfβ2蛋白序列在本领域中十分常见，可从国家生物技术信息中心(ncbi)公开获取。例如，两种人tgfβ2异构体已知。tgfβ2转录变体1(nm_001135599.3)代表最长的转录物，并编码较长的异构体1(np_001129071.1)。与变体1相比，tgfβ2转录变体2(nm_003238.5)的5’编码区缺少一个框内外显子。获得的异构体2(nm_003238.5)比异构体1短。两种异构体均可进行类似的蛋白水解加工。生物体(人类除外)tgfβ2直向同源物的核酸和多肽序列众所周知，包括黑猩猩tgfβ2(xm_001172158.6和xp_001172158.1以及xm_514203.7和xp_514203.2)；猴tgfβ2(nm_001266518.1和np_001253447.1)；狗tgfβ2(xm_005640824.2和xp_005640881.1、xm_545713.6和xp_545713.2；以及xm_853584.5和xp_858677.1)、牛tgfβ2(nm_001113252.1和np_001106723.1)、小鼠tgfβ2(nm_001329107.1和np_001316036.1；以及nm_009367.4和np_033393.2)、大鼠tgfβ2(nm_031131.1和np_112393.1)以及鸡tgfβ2(nm_001031045.3和np_001026216.2)。
[0122]
术语“tgfβ3”或“转化生长因子β3”系指tgfβ超家族蛋白的一种分泌配体。如本文所述，此家族的配体与各种tgfβ受体结合，从而募集并激活可调控基因表达的smad家族转录因子。编码前原蛋白经蛋白水解加工，产生潜在型结合肽(lap)和成熟肽，并以潜在形式(由一个成熟肽同二聚体、一个lap同二聚体和一个潜在型tgfβ结合蛋白组成)或活性形式(完全由成熟肽同二聚体组成)存在。成熟肽也可与其他tgfβ家族成员形成异二聚体。按不同的步骤将tgfβ3激活为成熟形式：切割高尔基体中的原蛋白后，lap和tgfβ3链仍保持非共价连接，储存在细胞外基质中时，导致tgfβ3失活。同时，lap链与“环境分子”(如ltbp1和lrrc32/garp)发生相互作用，控制tgfβ3激活，并在储存在细胞外环境中时使其处于潜在态。通过整合素，从lap中释放tgfβ3。整合素结合导致lap链变形，随后释放活性tgfβ-3。在激活随后的lap释放作用后，tgfβ3通过与tgfβ受体结合(转导信号)发挥作用。在优选实施例中，术语“tgfβ3”系指激活tgfβ3。
[0123]
tgfβ3参与胚胎发生和细胞分化，在伤口愈合方面发挥一定的作用。tgfβ3在继发腭发育等各种过程中必不可少。tgfβ3基因突变是导致主动脉瘤和夹层以及家族性致心律失常性右心室发育不良1型的一个原因。
[0124]
术语“tgfβ3”旨在包括其片段、变体(例如等位基因变体)和衍生物。代表性人tgfβ3cdna和人tgfβ3蛋白序列在本领域中十分常见，可从国家生物技术信息中心(ncbi)公开获取。例如，三种人tgfβ3异构体已知。tgfβ3转录变体1(nm_003239.4)代表最长的转录物，并编码较长的异构体1(np_003230.1)。与变体1相比，tgfβ3转录变体2(nm_001329939.1)的5'utr不同，但编码与变体1相同的异构体(np_001316868.1)。tgfβ3转录变体3(nm_001329938.2)缺少多个外显子，其3’端外显子延伸超过变体1所用的剪接位点。与变体1相比，这会导致产生提前终止密码子和新的3'utr。编码异构体2(np_001316867.1)的c端比异构体1短。生物体(人类除外)tgfβ3直向同源物的核酸和多肽序列众所周知，包括黑猩猩tgfβ3(xm_016926465.2和xp_016781954.1、xm_016926464.2和xp_016781953.1、xm_001161669.5和xp_001161669.1以及xm_009428178.2和xp_009426453.1)；猴tgfβ3(nm_001257475.1和np_001244404.1)；狗tgfβ3(xm_849026.5和xp_854119.2)、牛tgfβ3(nm_001101183.1和np_001094653.1)、小鼠tgfβ3(nm_009368.3和np_033394.2)、大鼠tgfβ3(nm_013174.2和np_037306.1)以及鸡tgfβ3(nm_205454.1和np_990785.1)。
[0125]
术语“smad”系指受体激活信号转导转录因子家族，可传输来自tgfβ家族受体的信号。根据与果蝇基因母亲dpp(mad)(编码果蝇dpp信号转导通路中的必要元素)的同源性，确定了smad蛋白家族的成员(sekelsky等人(1995年)，《遗传学》，139:1347-1358；newfeld等人(1996年)，《发育》，122:2099-2108)。smad蛋白通常包含高度保守的氨基端结构域和羧基端结构域，这两种结构域由富含脯氨酸的连接肽分离。氨基端结构域(mh1结构域)介导dna结合，而羧基端结构域(mh2结构域)则与受体结合。
[0126]
经确定，至少8种smad蛋白参与由tgfβ家族成员诱导的信号反应(kretzschmar和massague(1998年)，《当代遗传学与发育观点》，8:103-111)。这些smad可分为三个亚组。一组(smad1、2、3、5和9)包括作为tgfβ家族受体激酶直接底物的smad。另一组(smad4)包括不是直接受体底物但通过与受体激活smad结合参与信号转导的smad。第三组smad(smad6和smad7)由前两组中抑制smad激活的蛋白组成。
[0127]
smad在不同的tgfβ家族成员通路中发挥特定作用。在已确定的tgfβ家族成员smad蛋白中，smad2和smad3对tgfβ信号具有特异性(heldin等人(1997年)，《自然》，390:465-471)。激活smad2和smad3与常见的介导因子smad4发生相互作用，并易位到细胞核中，在此处，它们将激活一组特异性基因(heldin等人(1997年)，《自然》，390:465-471)。tgfβ通路使用信号抑制蛋白smad6和smad7来平衡信号的净输出以及smad2和/或smad3的直接激活。
[0128]
虽然smad2和smad3具有与转录因子相同的转录激活活性(zawel等人(1998年)，《分子细胞》，1:611-617)，但研究表明，它们主要通过与其他核因子发生特异性相互作用来激活特异性基因表达(derynck等人(1998年)，《细胞》，95:737-740)。可激活特异性smad蛋白，改变特异性基因的表达，从而对给定细胞类型产生特异性tgfβ介导效应。特别相关的smad蛋白包括smad2(nakao等人(1997年)，《生物化学杂志》，272:2896-2900)。
[0129]
术语“smad2”系指smad家族成员2，属于smad(一个类似于果蝇基因“母亲dpp”(mad)和秀丽隐杆线虫基因sma基因产物的蛋白家族)。smad蛋白为信号转导分子和转录介导因子，可介导多个信号通路。smad2介导tgfβ信号，从而调控细胞增殖、凋亡和分化等多个细胞过程。通过其与smad受体激活(sara)锚着蛋白的相互作用，smad2被募集到tgfβ受体中。为了响应tgfβ信号，tgfβ受体使smad2磷酸化。磷酸化作用诱导smad2与sara解离并与家
族成员smad4结合。与smad4结合对于将smad2易位到细胞核中很重要，在细胞核中，smad2与靶启动子结合，并与其他共因子(例如p63)形成转录抑制因子复合物。smad2与许多基因(受tgfβ调控)启动子区的tre元件结合。smad2也可被1型受体激酶磷酸化，并介导来自激活素的信号。smad2可作为结直肠癌的肿瘤抑制因子。smad2通过刺激其从14-3-3蛋白ywhaq(作为负调控因子)中解离，正向调控pdpk1激酶活性。在一个实施例中，人smad2蛋白包含467个氨基酸，分子质量为52306da。
[0130]
术语“smad2”旨在包括其片段、变体(例如等位基因变体)和衍生物。代表性人smad2cdna和人smad2蛋白序列在本领域中十分常见，可从国家生物技术信息中心(ncbi)公开获取。例如，三种人smad2异构体已知。smad2转录变体2(nm_001003652.4)代表最长的转录物，并编码较长的异构体1(np_001003652.1)。与变体2相比，smad2转录变体1(nm_005901.6)在5'utr中使用替代外显子(1b)，但编码相同的异构体1(np_005892.1)。与变体2相比，smad2转录变体3(nm_005901.6)的5’编码区缺少一个框内外显子，因此形成比异构体1短的异构体2(np_001129409.1)。生物体(人类除外)smad2直向同源物的核酸和多肽序列众所周知，包括黑猩猩smad2(xm_512121.7和xp_512121.1；xm_001149646.5和xp_001149646.1；xm_009433959.2和xp_009432234.1；xm_016933662.1和xp_016789151.1；xm_016933657.1和xp_016789146.1；xm_016933659.1和xp_016789148.1；xm_016933658.1和xp_016789147.1；xm_009433960.3和xp_009432235.1；以及xm_016933663.1和xp_016789152.1)；猴smad2(nm_001266803.1和np_001253732.1)；狗smad2(xm_005622832.3和xp_005622889.1；xm_022421406.1和xp_022277114.1；xm_847706.5和xp_852799.1；xm_005622830.3和xp_005622887.1；xm_005622831.3和xp_005622888.1；xm_861095.5和xp_866188.1；以及xm_022421405.1和xp_022277113.1)；牛smad2(nm_001046218.1和np_001039683.1)；小鼠smad2(nm_001252481.1和np_001239410.1；nm_001311070.1和np_001297999.1；以及nm_010754.5和np_034884.2)；大鼠smad2(nm_001277450.1和np_001264379.1；以及nm_019191.2和np_062064.1)以及鸡smad2(nm_204561.1和np_989892.1)。smad2直向同源物的代表性序列如以下表1所示。
[0131]
适用于smad2蛋白检测的抗smad2抗体在本领域中十分常见，包括抗体am06653su-n和am31101pu-n(傲锐基因科技公司(马里兰州罗克维尔))、af3797、nb100-56462、nbp2-67376和nbp2-44217(由诺伟思生物制品公司(科罗拉多州立托顿)提供的抗体)、ab40855、ab63576和ab202445(由艾博抗公司(马萨诸塞州剑桥)提供的抗体)等。此外，smad2表达检测试剂众所周知。此外，在上述公司的商业产品列表中，可发现多个用于减少smad2表达的sirna、shrna、crispr构建体，如圣克鲁斯生物技术公司的sirna产品#sc-38374和#sc-44338以及crispr产品#sc-400475；rnai产品sr320897、tg309255、tr309255和tl309255、crispr产品kn404604和kn516271(傲锐基因公司)；以及金斯瑞公司(新泽西州皮斯卡塔韦)的多种crispr产品。应注意，术语可进一步用于系指有关smad2分子的本文所述特征的任何组合。例如，序列组成、一致性百分比、序列长度、结构域结构、功能活性等的任何组合均可用于描述本发明所含的smad2分子。
[0132]
术语“p63”或“tp63”系指转录因子p53家族的一个成员。p53家族蛋白的功能结构域包括n端转录激活结构域、中央dna结合结构域和寡聚化结构域。p63基因的可变剪接和可变启动子的使用导致产生多个编码不同异构体(功能特性各有不同)的转录变体。这些异构
体在皮肤发育和保养、成体干细胞/祖细胞调控、心脏发育和过早老化中发挥作用。一些异构体可消除dna受损的卵母细胞或睾丸生殖细胞，从而保护种系。p63基因突变与外胚叶发育不良和唇裂/腭裂综合征3型(eec3)；裂手/足畸形4型(shfm4)；睑缘粘连-外胚层缺陷唇裂/腭裂；adult综合征(肢端-皮肤-缺指-泪腺-牙齿)；肢体-乳腺综合征；rap-hodgkin综合征(rhs)以及唇腭裂8型相关。p63作为序列特异性dna结合转录激活因子或抑制因子。异构体包含各种转录激活和自动调控转录激活抑制结构域，因此具有异构体特异性活性。异构体2激活ripk4转录。为了启动p53/tp53依赖性细胞凋亡，以应对基因毒性损伤和激活致癌基因，可能需要p63以及tp73/p73。p63通过诱导jag1和jag2，参与notch信号转导。p63在上皮形态发生调控中发挥一定的作用。δn型与ta*型异构体的比值可控制维持上皮干细胞区室，并调控未分化胚胎外胚层中上皮分层的开始。从顶端外胚层脊形成肢体时，需要p63。p63激活p21启动子转录。在一个实施例中，人p63蛋白包含680个氨基酸，分子质量为76785da。
[0133]
术语“p63”或“tp63”旨在包括其片段、变体(例如等位基因变体)和衍生物。代表性人p63 cdna和人p63蛋白序列在本领域中十分常见，可从国家生物技术信息中心(ncbi)公开获取。例如，13种人xbp1异构体已知。p63转录变体1(nm_003722.5)代表最长的转录物，并编码最长的异构体，即p63异构体1(np_003713.3)。与变体1相比，p63转录变体2(nm_001114978.2)的3’编码区缺少一个外显子，因此导致移码。与异构体1相比，获得的异构体(2，也称为tap63β和ta-β；np_001108450.1)较短，且c端不同。与变体1相比，p63转录变体3(nm_001114979.2)的3’utr和编码区不同。与异构体1相比，获得的异构体(3，也称为tap63γ、ta-γ和p51a；np_001108451.1)较短，且c端不同。与变体1相比，p63转录变体4(nm_001114980.2)的5'utr和编码区不同。与异构体1相比，获得的异构体(4，也称为δnp63α、δnα、p51δnα、cusp和p73h；np_001108452.1)较短，且n端不同。与变体1相比，p63转录变体5(nm_001114981.2)的5'utr和编码区不同，并且3’编码区缺少一个外显子，因此导致移码。与异构体1相比，获得的异构体(5，也称为δnp63β、p51δnβ和δnβ；np_001108453.1)较短，且n端和c端不同。与变体1相比，p63转录变体6(nm_001114982.2)的5'utr和编码区以及3’utr和编码区均不同。与异构体1相比，获得的异构体(6，也称为δnp63γ、p51δnγ和δnγ；np_001108454.1)较短，且n端和c端不同。与变体1相比，p63转录变体7(nm_001329144.2)的3’编码区缺少两个外显子，因此导致移码。与异构体1相比，编码异构体(7，也称为tap63δ、ta-δ和p51δ；np_001316073.1)的c端较短且不同。p63转录变体8(nm_001329145.2)与变体1存在诸多差异。由于这些差异，使用替代起始密码子，并在3’编码区引入移码。与异构体1相比，编码异构体(8，也称为δnδ；np_001316074.1)的n端和c端较短且不同。与变体1相比，p63转录变体9(nm_001329146.2)缺少多个5’外显子，并使用替代起始密码子。与异构体1相比，编码异构体(9，也称为δnp73l；np_001316075.1)的n端较短且不同。与变体1相比，p63转录变体10(nm_001329148.2)在中心编码区使用替代框内剪接位点。编码异构体(10，也称为p63δ；np_001316077.1)比异构体1短。p63转录变体11(nm_001329149.2)与变体1存在诸多差异。由于这些差异，使用替代起始密码子，并在3’编码区引入移码。与异构体1相比，编码异构体(11)(np_001316078.1)较短，且n端和c端不同。p63转录变体12(nm_001329150.2)与变体1存在诸多差异。由于这些差异，使用替代起始密码子，并在3’编码区引入移码。与异构体1相比，编码异构体(12)(np_001316079.1)较短，且n端和c端不同。与变体1相比，p63转录
变体13(nm_001329964.1)代表使用替代启动子，因此5'utr和5’编码区不同。所述启动子和5’端外显子序列来自内源性逆转录病毒ltr(pmid：21994760)。与异构体1相比，获得的异构体(13，也称为gtap63；np_001316893.1)较短，且n端不同。编码蛋白主要在睾丸生殖细胞中表达，并消除dna受损的生殖细胞。生物体(人类除外)p63直向同源物的核酸和多肽序列众所周知，包括黑猩猩p63(xm_009447014.3和xp_009445289.1；xm_001160376.5和xp_001160376.1；xm_009447013.3和xp_009445288.1；xm_003310173.3和xp_003310221.1；xm_001160425.5和xp_001160425.1；xm_016942495.2和xp_016797984.1；以及xm_001160182.3和xp_001160182.1)；猴p63(xm_028843565.1和xp_028699398.1；xm_015132502.2和xp_014987988.1；xm_015132501.2和xp_014987987.1；xm_001092093.3和xp_001092093.1；xm_028843566.1和xp_028699399.1；xm_028843567.1和xp_028699400.1；xm_001091977.4和xp_001091977.3；xm_015132503.2和xp_014987989.1；以及xm_015132504.2和xp_014987990.2)；狗p63(xm_022414176.1和xp_022269884.1；xm_005639826.3和xp_005639883.1；xm_856247.5和xp_861340.3；xm_005639828.3和xp_005639885.1；xm_005639827.2和xp_005639884.1；xm_856275.3和xp_861368.1；以及xm_022414177.1和xp_022269885.1)、牛p63(nm_001191337.1和np_001178266.1)、小鼠p63(nm_001127259.1和np_001120731.1；nm_001127260.1和np_001120732.1；nm_001127261.1和np_001120733.1；nm_001127262.1和np_001120734.1；nm_001127263.1和np_001120735.1；nm_001127264.1和np_001120736.1；nm_001127265.1和np_001120737.1；以及nm_011641.2和np_035771.1)、大鼠p63(nm_001127339.1和np_001120811.1；nm_001127341.1和np_001120813.1；nm_001127342.1和np_001120814.1；nm_001127343.1和np_001120815.1；nm_001127344.1和np_001120816.1；以及nm_019221.3和np_062094.1)以及鸡p63(nm_204351.1和np_989682.1)。p63直向同源物的代表性序列如以下表1所示。
[0134]
适用于p63蛋白检测的抗p63抗体在本领域中十分常见，包括抗体ta323790和cf811064(傲锐基因科技公司(马里兰州罗克维尔))、af1916(由诺伟思生物制品公司(科罗拉多州立托顿)提供的抗体)、ab124762、ab53039、ab735和ab97865(由艾博抗公司(马萨诸塞州剑桥)提供的抗体)等。此外，p63表达检测试剂众所周知。此外，在上述公司的商业产品列表中，可发现多个用于减少p63表达的sirna、shrna、crispr构建体，如圣克鲁斯生物技术公司的sirna产品#sc-36620和#sc-36621；rnai产品tr308688、tg308688、tl308688和sr322466；crispr产品kn208013和kn208013bn(傲锐基因公司)；以及金斯瑞公司(新泽西州皮斯卡塔韦)的多种crispr产品。应注意，术语可进一步用于系指有关p63分子的本文所述特征的任何组合。例如，序列组成、一致性百分比、序列长度、结构域结构、功能活性等的任何组合均可用于描述本发明所含的p63分子。
[0135]
术语“tp53”系指肿瘤蛋白p53，是一种包含转录激活结构域、dna结合结构域和寡聚化结构域的肿瘤抑制蛋白。编码蛋白对不同的细胞应激作出反应，以调控靶基因表达，从而诱导细胞周期阻滞、细胞凋亡、衰老、dna修复或代谢变化。此基因的突变与各种人类癌症相关，包括遗传性癌症(如李-佛美尼综合征)。tp53突变在各种癌症类型中都很普遍。肿瘤抑制因子缺失通常由大型有害事件造成，如移码突变或存在提前终止密码子。但是，在tp53中，在癌症中观察到的许多突变均为单核苷核错义变体。这些变体广泛分布在整个基因中，但大多数位于dna结合结构域中。dna结合结构域中没有单一热点，大多数突变均出现在氨
基酸位置175、245、248、273和282(nm_000546)。虽然大量的癌症基因组学研究均重点关注体细胞变体，但是，tp53在种系中也值得重视。种系tp53突变是李-佛美尼综合征的标志，人们发现，许多(种系和体细胞)变体均对患者结局具有预后影响。通过诱导生长阻滞或细胞凋亡(取决于生理情况和细胞类型)，tp53在许多肿瘤类型中均作为肿瘤抑制因子。tp53作为转录激活因子，参与细胞周期调控，通过控制此过程所需的一组基因，负向调控细胞分裂。一种激活基因为细胞周期素依赖性激酶抑制剂。凋亡诱导似乎通过刺激bax和fas抗原表达或抑制bcl-2表达介导。tp53与线粒体ppif合作，参与激活氧化应激诱导的坏死，此功能很大程度上不依赖于转录。tp53诱导长链基因间非编码rna p21(lincrna-p21)和lincrna-mkln1转录。lincrna-p21参与tp53依赖性转录抑制，导致细胞凋亡，似乎不得不对细胞周期调控产生影响。在notch信号交叉中，涉及tp53。tp53为应对dna损伤而与cak复合物结合时，阻止了cdk7激酶活性，因此导致细胞周期进程停止。在一些但并非所有tp53诱导型启动子中，tp53的异构体2增强了异构体1的转录激活活性。tp53的异构体4抑制转录激活活性，影响异构体1介导的生长抑制作用。tp53的异构体7抑制异构体1介导的细胞凋亡。tp53抑制clock-arntl/bmal1介导的per2转录激活，从而调控生物钟(miki等人，(2013年)，《自然-通讯》，4:2444)。在一些实施例中，人tp53包含393个氨基酸，分子质量为43653da。tp53的已知结合伴侣包括axin1、ing4、ywhaz、hipk1、hipk2、wwox、grk5、ankrd2、rffl、rnf 34和tp53inp1。
[0136]
术语“tp53”旨在包括其片段、变体(例如等位基因变体)和衍生物。众所周知，可从国家生物技术信息中心(ncbi)公开获取代表性人tp53 cdna和人tp53蛋白序列。例如，至少12种不同的人tp53异构体已知。人tp53异构体a(np_000537.3、np_001119584.1)可由转录变体1(nm_000546.5)和转录变体2(nm_001126112.2)编码。人tp53异构体b(np_001119586.1)可由转录变体3(nm_001126114.2)编码。人tp53异构体c(np_001119585.1)可由转录变体4(nm_001126113.2)编码。人tp53异构体d(np_001119587.1)可由转录变体5(nm_001126115.1)编码。人tp53异构体e(np_001119588.1)可由转录变体6(nm_001126116.1)编码。人tp53异构体f(np_001119589.1)可由转录变体7(nm_001126117.1)编码。人tp53异构体g(np_001119590.1、np_001263689.1和np_001263690.1)可由转录变体8(nm_001126118.1)、转录变体1(nm_001276760.1)和转录变体2(nm_001276761.1)编码。人tp53异构体h(np_001263624.1)可由转录变体4(nm_001276695.1)编码。人tp53异构体i(np_001263625.1)可由转录变体3(nm_001276696.1)编码。人tp53异构体j(np_001263626.1)可由转录变体5(nm_001276697.1)编码。人tp53异构体k(np_001263627.1)可由转录变体6(nm_001276698.1)编码。人tp53异构体l(np_001263628.1)可由转录变体7(nm_001276699.1)编码。生物体(人类除外)tp53直向同源物的核酸和多肽序列众所周知，包括黑猩猩tp53(xm_001172077.5和xp_001172077.2以及xm_016931470.2和xp_016786959.2)、猴tp53(nm_001047151.2和np_001040616.1)、狗tp53(nm_001003210.1和np_001003210.1)、牛tp53(nm_174201.2和np_776626.1)、小鼠tp53(nm_001127233.1和np_001120705.1以及nm_011640.3和np_035770.2)、大鼠tp53(nm_030989.3和np_112251.2)、热带爪蟾tp53(nm_001001903.1和np_001001903.1)以及斑马鱼tp53(nm_001271820.1和np_001258749.1、nm_001328587.1和np_001315516.1、nm_001328588.1和np_001315517.1以及nm_131327.2和np_571402.1)。tp53直向同源物的代表性序列如以下表1所示。
[0137]
适用于tp53蛋白检测的抗tp53抗体在本领域中十分常见，包括抗体ta502925和cf502924(傲锐基因公司)、抗体nb200-103和nb200-171(诺伟思生物制品公司(科罗拉多州立托顿))、抗体ab26和ab1101(艾博抗公司(马萨诸塞州剑桥))、抗体700439(赛默飞世尔科技公司)、抗体33-856(prosci公司)等。此外，tp53检测试剂众所周知。nih基因检测登记处提供多项tp53临床检测(例如，由fulgent临床诊断实验室(加利福尼亚州天普市)提供的gtr检测(id：gtr000517320.2))。此外，在上述公司的商业产品列表中，可发现多个用于减少tp53表达的sirna、shrna、crispr构建体，如圣克鲁斯生物技术公司的sirna产品#sc-29435和sc-44218以及crispr产品#sc-416469；rnai产品sr322075和tl320558v、crispr产品kn200003(傲锐基因公司)；以及金斯瑞公司(新泽西州皮斯卡塔韦)的多种crispr产品。tp53的化学抑制剂也可用，包括环状pifithrin-α氢溴酸盐rita(tocris公司(明尼苏达州))。应注意，术语可进一步用于系指有关tp53分子的本文所述特征的任何组合。例如，序列组成、一致性百分比、序列长度、结构域结构、功能活性等的任何组合均可用于描述本发明所含的tp53分子。
[0138]
特定蛋白的氨基酸序列与可编码所述蛋白的核苷酸序列之间存在已知且明确的对应关系(由遗传密码定义)(如下所示)。同样，特定核酸的核苷酸序列与由此核酸编码的氨基酸序列之间也存在已知且明确的对应关系(由遗传密码定义)。
[0139]
遗传密码：
[0140]
丙氨酸(ala,a)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
gca、gcc、gcg、gct
[0141]
精氨酸(arg,r)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
aga、acg、cga、cgc、cgg、cgt
[0142]
天冬酰胺(asn,n)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
aac、aat
[0143]
天冬氨酸(asp,d)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
gac、gat
[0144]
半胱氨酸(cys,c)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
tgc、tgt
[0145]
谷氨酸(glu,e)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
gaa、gag
[0146]
glutamine(gln,q)
ꢀꢀꢀꢀꢀ
caa、cag
[0147]
甘氨酸(gly,g)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
gga、ggc、ggg、ggt
[0148]
组氨酸(his,h)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
cac、cat
[0149]
异亮氨酸(ile,i)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
ata、atc、att
[0150]
亮氨酸(leu,l)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
cta、ctc、ctg、ctt、tta、ttg
[0151]
赖氨酸(lys,k)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
aaa、aag
[0152]
蛋氨酸(met,m)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
atg
[0153]
苯基丙氨酸(phe,f)
ꢀꢀꢀꢀꢀ
ttc、ttt
[0154]
脯氨酸(pro,p)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
cca、ccc、ccg、cct
[0155]
丝氨酸(ser,s)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
agc、agt、tca、tcc、tcg、tct
[0156]
苏氨酸(thr,t)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
aca、acc、acg、act
[0157]
色氨酸(trp,w)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
tgg
[0158]
酪氨酸(tyr,y)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
tac、tat
[0159]
缬氨酸(val,v)
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
gta、gtc、gtg、gtt
[0160]
终止信号(结束)taa、tag、tga
[0161]
遗传密码的一个重要且常见的特征是其具有丰余性，因此，对于用于产生蛋白的
大多数氨基酸，可使用多个编码核苷酸三连体(如上所述)。因此，许多不同的核苷酸序列均可编码给定氨基酸序列。此类核苷酸序列在功能上等效，因为它们导致在所有生物体中产生相同的氨基酸序列(尽管某些生物体可更有效地翻译某些序列)。此外，偶尔可在给定核苷酸序列中发现嘌呤或嘧啶的甲基化变体。这种甲基化不影响三核苷酸密码子与相应氨基酸的编码关系。
[0162]
鉴于上述内容，编码生物标志物核酸的dna或rna核苷酸序列(或其任何部分)可用于衍生多肽氨基酸序列，使用遗传密码将dna或rna翻译成氨基酸序列。同样，对于多肽氨基酸序列，可从遗传密码(由于其具有丰余性，将针对任何给定氨基酸序列产生多个核酸序列)中推断出可编码多肽的相应核苷酸序列。因此，本文中有关编码多肽的核苷酸序列的说明和/或公开应视为也包括由此核苷酸序列编码的氨基酸序列的说明和/或公开。同样，本文中有关多肽氨基酸序列的说明和/或公开应视为也包括可编码此氨基酸序列的所有可能核苷酸序列的说明和/或公开。
[0163]
最后，本发明所含位点和生物标志物的核酸和氨基酸序列信息以及相关生物标志物(例如，表1和表2中所列的生物标志物)在本领域中十分常见，并且很容易在公开可用的数据库(如国家生物技术信息中心(ncbi))中获取。例如，下文提供了公开可用的序列数据库中的示例性核酸和氨基酸序列。
[0164]
表1
[0165]
smad1
[0166]
smad2
[0167]
smad3
[0168]
smad4
[0169]
smad5
[0170]
smad9
[0171]
p53
[0172]
p63
[0173]
p73
[0174]
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[0175]
[0176]
[0177]
[0178]
[0179]
[0180]
[0181]
[0182]
[0183]
[0184]
[0185][0186]
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[0192][0193]
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[0198]
[0199]
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[0203]
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[0211]
[0212][0213]
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[0214][0215]
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[0503][0504]
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[0505][0506]
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[0507][0508]
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[0511][0512]
[0513][0514]
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[0518][0519]
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[0523][0524]
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[0533][0534]
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[0543][0544]
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[0554][0555][0556]
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[0557][0558][0559]
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[0560][0561]
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[0562][0563]
[0564]
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[0565][0566]
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[0567]
[0568]
[0569][0570]
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[0571][0572]
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[0573]
[0574][0575]
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[0576][0577][0578]
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[0579]
[0580][0581]
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[0584][0585]
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[0588][0589]
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[0590]
[0591][0592]
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[0593][0594]
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[0595][0596]
[0597]
[0598][0599]
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[0600][0601]
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[0602]
[0603]
[0604][0605]
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[0606][0607]
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[0608]
[0609]
[0610][0611]
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[0612][0613]
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[0614]
[0615]
[0616][0617]
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[0618]
[0619][0620]
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[0621]
[0622][0623]
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[0624]
[0625]
[0626][0627]
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[0628][0629]
[0630][0631]
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[0632]
[0633]
seq id no：167小鼠smad5转录变体1 cdna序列(nm_008541.3；cds：288-1685)
[0634][0635]
[0636][0637]
seq id no：168小鼠smad5转录变体2 cdna序列(nm_001164041.1；cds：691-2088)
[0638]
[0639]
[0640][0641]
seq id no：169小鼠smad5转录变体3 cdna序列(nm_001164042.1；cds：311-1708)
[0642]
[0643]
[0644][0645]
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[0646][0647]
seq id no：171人smad9转录变体1 cdna序列(nm_001127217.2；cds：344-1747)
[0648]
[0649]
[0650][0651]
seq id no：172人smad9异构体1氨基酸序列(np_001120689.1)
[0652][0653]
seq id no：173人smad9转录变体2cdna序列(nm_005905.6；cds：310-1602)
[0654]
[0655][0656]
seq id no：174人smad9异构体2氨基酸序列(np_005896.1)
[0657]
[0658]
seq id no：175小鼠smad9cdna序列(nm_019483.5；cds：320-1612)
[0659]
[0660][0661]
seq id no：176小鼠smad9氨基酸序列(np_062356.3)
[0662][0663]
表1中包括核酸分子，其核酸序列与编码dna结合结构域的区域或在其全长范围内与表1中所列任何seq id no的核酸序列的一致性至少为30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高。此类核酸分子可编码具有全长多肽功能的多肽(如本文进一步所述)。
[0664]
表1中包括多肽分子，其氨基酸序列与dna结合结构域或在其全长范围内与表1中所列任何seq id no的氨基酸序列的一致性至少为30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高。此类多肽具有全长多肽的功能(如本文进一步所述)。
[0665]
表2
[0666]
smad6
[0667]
smad7
[0668]
seq id no：177人smad6cdna序列(nm_005585.5；cds：1024-2514)
[0669][0670]
[0671]
seq id no：178人smad6氨基酸序列(np_005576.3)
[0672][0673]
seq id no：179小鼠smad6 cdna序列(nm_008542.3；cds：1036-2523)
[0674]
[0675]
seq id no：180小鼠smad6氨基酸序列(np_032568.3)
[0676][0677]
seq id no：181人smad7转录变体1 cdna序列(nm_005904.3；cds：288-1568)
[0678]
[0679]
seq id no：182人smad7异构体1氨基酸序列(np_005895.1)
[0680][0681]
seq id no：183人smad7转录变体2 cdna序列(nm_001190821.1；cds：288-1565)
[0682]
[0683][0684]
seq id no：184人smad7异构体2氨基酸序列(np_001177750.1)
[0685][0686]
seq id no：185人smad7转录变体3 cdna序列(nm_001190822.2；cds：138-773)
[0687][0688]
seq id no：186人smad7异构体3氨基酸序列(np_001177751.1)
[0689][0690]
seq id no：187人smad7转录变体4 cdna序列(nm_001190823.1；cds：150-866)
[0691][0692][0693]
seq id no：188人smad7异构体4氨基酸序列(np_001177752.1)
[0694][0695]
seq id no：189小鼠smad7 cdna序列(nm_001042660.1；cds：1592-2872)
[0696]
[0697][0698]
seq id no：190小鼠smad7氨基酸序列(np_001036125.1)
[0699]
[0700][0701]
表2中包括核酸分子，其核酸序列与编码dna结合结构域的区域或在其全长范围内与表2中所列任何seq id no的核酸序列的一致性至少为30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高。此类核酸分子可编码具有全长多肽功能的多肽(如本文进一步所述)。
[0702]
表2中包括多肽分子，其氨基酸序列与dna结合结构域或在其全长范围内与表2中所列任何seq id no的氨基酸序列的一致性至少为30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高。此类多肽具有全长多肽的功能(如本文进一步所述)。
[0703]
ii.癌症疫苗
[0704]
本发明提供了一种包含癌细胞的癌症疫苗，其中，所述癌细胞为：(1)pten缺陷癌细胞；(2)p53缺陷癌细胞；以及(3)经修饰可激活tgfβ-smad/p63信号通路。所述癌细胞可源自实体癌或血液癌(例如，乳腺癌)。在某些实施例中，乳腺癌细胞为三阴性乳腺癌(tnbc)细胞。在一个实施例中，所述癌细胞源自受试者。例如，所述癌细胞可源自由p53和pten共缺失而引起的乳腺癌。在另一个实施例中，所述癌细胞源自癌细胞系。所述癌细胞可源自任何癌细胞系或原代癌细胞。例如，所述癌细胞可源自从包括以下几项的一组中选择的细胞系：hcc1954、sum149、bxpc-3、t3m4、143b、a549、h520、h23、hacat、h357、h400、detroit、okf6、bicr6、h103、5pt、jhu12、jhu22、hsc3、scc25和ntert细胞。所述癌细胞可存在不同种类的附加基因突变。所述癌细胞可源自接受癌症疫苗治疗的受试者，同时也可源自未接受癌症疫苗治疗的不同受试者。所述癌细胞可源自与使用癌症疫苗治疗的癌症相同类型的癌症，同时也可源自与使用癌症疫苗治疗的癌症不同类型的癌症。所述癌细胞可源自与使用癌症疫苗治疗的癌症具有相同基因突变的癌症，同时也可源自与使用癌症疫苗治疗的癌症具有不同基因突变的癌症。
[0705]
a.癌细胞分离和纯化
[0706]
在一些实施例中，所述癌细胞源自受试者。从各种肿瘤组织(如外科肿瘤组织、腹水或癌性胸腔积液)中分离和纯化肿瘤细胞是获得纯化肿瘤细胞的一个常用过程。可从癌症患者或动物肿瘤模型的新鲜活检样本中纯化癌细胞。活检样本通常包含异质性细胞群，包括正常组织、血液和癌细胞。优选地，纯化癌细胞合成物的活癌细胞总数可大于10％、20％30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多，或介于两者之间的任何范围或介于两者之间的任何值。为了从异质性群体中纯化癌细胞，可采用许多方法。
[0707]
在一个实施例中，采用激光显微切割术分离癌细胞。可从制备用于显微镜检查的薄组织切片中小心解剖目标癌细胞。在这种方法中，将一层塑料薄膜盖在组织切片上，用聚焦红外激光束脉冲辐照包含所选细胞的区域。这会使一小圈塑料薄膜融化，导致下方细胞结合。取出这些捕获细胞，以进行附加分析。这种技术适用于分离和分析肿瘤不同部分的细
胞，以便比较其相似的特性和不同的特性。近期，将这种技术用于分析解离组织以及培养异质性垂体、甲状腺、类癌瘤细胞群中的垂体细胞，还用于分析在各种肉瘤中发现的单细胞。
[0708]
在另一个实施例中，将荧光激活细胞分选术(facs)(也称为流式细胞术)用于分选和分析不同的细胞群。使用一种抗体或通常使用与细胞标志物结合的抗体混合物来标记包含细胞标志物或其他相关特异性标志物的细胞。将不同标志物的每种定向抗体与可检测分子偶联，特别是可区别于与其他抗体偶联的其他荧光染料的一种荧光染料。一连串的标记或“染色”细胞通过可激发所检测细胞的荧光色素和发射光谱的光源，以确定是否存在特殊标记抗体。通过同时检测不同的荧光色素(在本领域也称为“荧光细胞分选”)，可从群体的其他细胞中识别并分离显示不同细胞标志物的细胞。其他facs参数(包括但不限于侧向散射(ssc)、前向散射(fsc)和活体染料染色(例如，使用碘化丙啶))允许根据大小和活性选择细胞。hsc及相关谱系细胞的facs分选和分析在本领域中十分常见，以下参考文献对此进行了说明：第5,137,809号、第5,750,397号、第5,840,580号和第6,465,249号美国专利；manz等人(202)，《美国国家科学院院刊》，99:11872-11877；以及akashi等人(200)，《自然》，404:193-197。在shapiro(2003年)《实用流式细胞术》第4版以及wiley-liss(2003年)和ormerod(2000年)《流式细胞术：一种实用方法》第3版(牛津大学出版社)中，提供了荧光激活细胞分选术的通用指南。
[0709]
另一种可分离有效细胞群的法涉及与抗体或配体(与特异性细胞表面标志物发生相互作用)结合的固体或不溶性底物。在免疫吸附技术中，细胞与包含抗体的底物(例如，珠柱、烧瓶、磁性颗粒等)接触，去除所有未结合细胞。免疫吸附技术可按比例放大，直接处理临床收获的大量细胞。适当的底物包括但不限于塑料、纤维素、葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖以及本领域已知的其他底物(例如，pharmacia琼脂糖凝胶6mb大珠)。使用包含磁珠或顺磁珠的固体底物时，可使用磁力分离器轻松分离与磁珠结合的细胞(见kato和radbruch(1993年)，《细胞计量学》，14:384-92)。亲和色谱细胞分离通常包括使细胞悬液通过包含选择性配体的支持体(固定在其表面上)。所述配体与细胞上的特异性靶分子发生相互作用，被捕获在基质中。向柱内的运行缓冲液中加入洗脱剂，释放结合细胞，然后通过色谱柱洗涤游离细胞，并作为同质性群体进行收获。对于本领域技术人员来说，显而易见的是，吸附技术不限于利用特异性抗体的技术，还可采用非特异性吸附技术。例如，二氧化硅吸附是在细胞制备时去除吞噬细胞的一种简单程序。这种技术的一个最常见用途为：使用靶向epcam的抗体(一种在上皮癌症中高度表达的细胞表面糖蛋白)从乳腺癌、nsc肺癌、前列腺癌和结肠癌患者的血液中分离循环肿瘤细胞(ctc)。
[0710]
facs和大多数分批免疫吸附技术均可适用于阳性和阴性选择程序(见第5,877,299号美国专利)。在阳性选择中，使用抗体标记所需细胞，并将这些细胞与剩余的未标记/无用细胞分离。在阴性选择中，标记并去除无用细胞。可使用另一种阴性选择类型，即，使用抗体/补体治疗或免疫毒素来去除无用细胞。
[0711]
在另一个实施例中，采用微流控技术(一种最新的技术)分离癌细胞。这种方法使用包含螺旋通道的微流控芯片，可根据细胞大小从血液中分离循环肿瘤细胞(ctc)。将血液样本泵入器械中，在细胞高速流过通道时，由于惯性力和离心力，小细胞沿外壁流动，而大细胞(包括ctc)则沿内壁流动。研究人员采用这种芯片技术，从转移性肺癌或乳腺癌患者的血液中分离ctc。
[0712]
根据最近发表的文章(lin等人，《small》(2015年)，11:4394
–
4402)，荧光纳米金刚石(fnd)可用于标记并分离缓慢增殖/静止期癌症干细胞，研究作者表示，在较长时间内，使用常规荧光标志物将难以分离并跟踪此类癌症干细胞。总而言之，纳米颗粒不会造成dna损伤或影响细胞生长，就长期跟踪能力而言，优于edu和cfse荧光标记。
[0713]
应理解，细胞纯化或分离还包括上述方法的组合。典型组合可包括一种有效去除大量无用细胞和细胞物质的初始程序。第二步可包括通过免疫吸附到与底物结合的抗体上，分离表达某种标志物(对一个或多个祖细胞群通用)的细胞。可通过一个附加步骤，使不同细胞类型(如使用一组特异性细胞标志物抗体的facs分选)的分辨率更高，从而获得基本上纯的所需细胞群。
[0714]
b.癌细胞工程化改造和修饰
[0715]
癌症疫苗中包含的癌细胞为pten和p53缺陷癌细胞。在一些实施例中，由于在癌症转化或进展时癌细胞的基因突变，癌细胞为pten和p53缺陷癌细胞。在一些实施例中，使用可降低pten和/或p53拷贝数、数量和/或活性的药剂，通过癌细胞的工程化改造，促使癌细胞成为pten和p53缺陷癌细胞。
[0716]
降低pten和/或p53拷贝数、数量和/或活性的药剂可以是小分子抑制剂、crispr引导rna(grna)、rna干扰剂、反义寡核苷酸、肽或类肽抑制剂、适配子、抗体或细胞内抗体。
[0717]
在一个实施例中，肽或类肽可用于拮抗pten和/或p53的活性。在一个实施例中，针对拮抗活性筛选突变体(例如截断突变体)组合库，即可识别作为相应全长蛋白调节剂的pten和/或p53变体。在一个实施例中，多样化变体库由核酸水平的组合诱变产生，并由多样化基因库编码。可用酶将合成寡核苷酸混合物连接至基因序列，使一组简并的潜在多肽序列可作为单独多肽(其中包含这组多肽序列)表达，从而产生多样化变体库。可采用不同的方法从简并寡核苷酸序列中产生多肽变体库。可在dna自动合成仪中化学合成简并基因序列，然后，将合成基因连接至适当的表达载体。在一种混合物中，使用一组简并基因，可提供编码一组所需潜在多肽序列的所有序列。简并寡核苷酸的合成方法在本领域中十分常见(见narang,s.a.(1983年)，《四面体》，39:3；itakura等人(1984年)，《生物化学年鉴》，53:323；itakura等人(1984)，《科学》，198:1056；ike等人(1983年)，《核酸研究》，11:477。
[0718]
此外，多肽编码序列片段库可用于产生多样化多肽片段群，以用于筛选并后续选择给定多肽的变体。在一个实施例中，可通过以下步骤产生编码序列片段库：在每个多肽仅产生一个切口的条件下，使用核酸酶处理多肽编码序列的双链pcr片段，使双链dna变性，再使dna复性，以形成双链dna(可包含各种带切口产物的正义/反义对)，使用s1核酸酶进行处理，从改造后的双链体中去除单链部分，并将获得的片段库连接至表达载体。通过这种方法，可产生表达库，编码各种大小的多肽的n端、c端和内部片段。
[0719]
在本领域中，已知可采用多项技术筛选因点突变或截断而产生的组合库的基因产物，以及筛选具有所选特性的基因产物的cdna库。此类技术适用于快速筛选因多肽的组合诱变而产生的基因库。最常用的大基因库筛选技术(适合高通量分析)通常包括将基因库克隆到可复制表达载体中，使用获得的载体库转化适当细胞，并在所需活性检测促进载体(编码其产物受检测的基因)分离的情况下表达组合基因。递归总体诱变(rem)是一种提高库中功能性突变体频率的技术，可与筛选检测结合使用，以识别目标变体(arkin和youvan(1992年)《美国国家科学院院刊》，89:7811-7815；delagrave等人(1993年)，《蛋白工程》，6(3):
327-331)。在一个实施例中，可利用基于细胞的检测来分析多样化多肽库。例如，表达载体库可转染成通常合成pten和/或p53的细胞系。然后，培养转染细胞，产生全长多肽和特定突变体多肽，通过任意一种功能性检测，即可在细胞上清液中检测突变体表达对于全长多肽活性所造成的影响。随后，可从细胞中获得质粒dna，对全长多肽活性的抑制或增强作用进行评分，并进一步说明单独的克隆体。
[0720]
用相同类型的d-氨基酸系统性地取代多肽氨基酸序列的一个或多个氨基酸(例如，用d-赖氨酸代替l-赖氨酸)，可产生更稳定的肽。此外，通过本领域的已知方法，可产生包含一个目标多肽氨基酸序列或基本相同的序列变异的约束肽(rizo和gierasch(1992年)，《生物化学年鉴》，61:387，所述参考文献通过本发明的引用，成为本发明的一部分)；例如，通过添加能够形成分子内二硫键(使肽环化)的内部半胱氨酸残基。
[0721]
本文所公开的氨基酸序列使本领域技术人员能够产生肽序列及其序列变体所对应的多肽。通过表达编码肽序列的多核苷酸(通常是较大多肽的一部分)，可在原核或真核宿主细胞中产生此类多肽。或者，可通过化学方法合成此类肽。异源蛋白在重组宿主中的表达、多肽化学合成以及体外翻译方法在本领域中十分常见，以下参考文献对此进行了进一步的说明：《分子克隆：实验室手册》(1989年)，第2版，冷泉港实验室(纽约)；berger和kimmel，《酶学方法》第152期，“分子克隆技术指南”(1987年)，学术出版社(加利福尼亚州圣地亚哥)；merrifield,j.(1969年)，《美国化学会志》，91:501；chaiken i.m.(1981年)，《crc生物化学评论》，11:255；kaiser等人(1989年)，《科学》，243:187；merrifield,b.(1986年)，《科学》，232:342；kent,s.b.h.(1988年)，《生物化学年鉴》，57:957；以及offord,r.e.(1980年)，“半合成蛋白”，威利出版社；所述参考文献通过本发明的引用，成为本发明的一部分)。
[0722]
通常可通过直接化学合成，产生肽。可以修饰肽的形式产生肽，其非肽部分通过共价键连接至n端和/或c端。在某些优选实施例中，羧基端和/或氨基端经化学修饰。最常见的末端氨基和羧基修饰分别为乙酰化和酰胺化。酰化(例如乙酰化)或烷基化(例如甲基化)等氨基端修饰和酰胺化等羧基端修饰以及其他末端修饰(包括环化)均可纳入本发明的各个实施例中。某些氨基端和/或羧基端修饰和/或肽延伸至核心序列可提供有利的物理、化学、生化和药理特性，如：稳定性增强、效力和/或功效提高、抗血清蛋白酶、理想的药代动力学特性等。通过改变在患者体内的共刺激作用，本文所公开的肽可用于治疗疾病。
[0723]
借助于计算机化分子建模，开发类肽(fauchere(1986年)，《药物研究进展》，15:29；veber和freidinger(1985年)，tins第392页；以及evans等人(1987年)，《医药化学杂志》，30:1229；所述参考文献通过本发明的引用，成为本发明的一部分)。一般而言，类肽在结构上与范例多肽(即,具有生物或药理活性的多肽)相似，但是，通过本领域的已知方法，其一个或多个肽键可选由从包括以下几项的一组中选择的一个键代替：-ch2nh-、-ch2s-、-ch2-ch2-、-ch＝ch-(顺式和反式)、-coch2-、-ch(oh)ch2-和-ch2so-，以下参考文献对此进行了进一步的说明：spatola,a.f.“氨基酸、肽和蛋白化学与生物化学”，weinstein,b.(编辑)，马塞尔
·
德克尔公司(纽约)，第267页(1983年)；spatola,a.f.(1983年)，《vega数据》第1卷，第3期，“肽骨架修饰”(一般性综述)；morley,j.s.(1980年)，《药理学趋势》，463-468(一般性综述)；hudson,d.等人(1979年)，《国际肽和蛋白研究杂志》，14:177-185(-ch2nh-、ch2ch2-)；spatola,a.f.等人(1986年)，《生命科学》，38:1243-1249(-ch2-s)；hann,m.m.(1982年)，《化学会杂志-珀金交易i》，307-314(-ch-ch-，顺式和反式)，almquist,r.g.等人
(1980年)，《医药化学杂志》，23:1392-1398(-coch2-)；jennings-white,c.等人(1982年)，《四面体快报》，23:2533(-coch2-)；szelke,m.等人(1982年)，european appln.ep 45665ca:97:39405(-ch(oh)ch2-)；holladay,m.w.等人(1983年)，《四面体快报》，24:4401-4404(-c(oh)ch2-)；以及hruby,v.j.(1982年)，《生命科学》，31:189-199(-ch2-s-)；所述参考文献通过本发明的引用，成为本发明的一部分。特别优选的非肽键为-ch2nh-。与多肽实施例相比，这种类肽具有更明显的优势，包括：生产经济性提高、化学稳定性增强、药理特性增强(半衰期、吸附性、效力、疗效等)、特异性改变(例如，广谱生物活性)以及抗原性降低等。类肽标记通常包括直接或通过一个间隔区(例如，一个酰胺基)将一个或多个标记共价连接至类肽上的非干扰位置(通过定量结构活性数据和/或分子建模预测)。此类非干扰位置通常是不与类肽结合以产生疗效的大型多肽直接接触的位置。类肽衍生化(例如，标记)不应在本质上干扰类肽的所需生物或药理活性。
[0724]
本发明还包括小分子，这些小分子可调节(例如，抑制)pten和/或p53的活性或其与天然结合伴侣之间的相互作用。可使用本领域已知组合库方法中的任何一种方法，获得本发明的小分子，包括：空间可寻址平行固相或液相库：需要去卷积的合成库方法；“珠一化合物”库方法；以及利用亲和色谱选择的合成库方法。(lam,k.s.(1997年)，《抗癌药物设计》，12:145)。
[0725]
在本领域中，可发现分子库的合成方法示例，例如，见：dewitt等人(1993年)，《美国国家科学院院刊》，90:6909；erb等人(1994年)，《美国国家科学院院刊》，91:11422；zuckermann等人(1994年)，《医药化学杂志》，37:2678；cho等人(1993年)，《科学》，261:1303；carrell等人(1994年)，《德国应用化学(英文版)》，33:2059；carell等人(1994年)，《德国应用化学(英文版)》，33:2061；gallop等人(1994年)，《医药化学杂志》，37:1233。
[0726]
可在溶液中(例如，houghten(1992年)，《生物技术》，13:412-421)或珠(lam(1991年)，《自然》，354:82-84)、芯片(fodor(1993年)，《自然》，364:555-556)、细菌(ladner usp 5,223,409)、孢子(ladner usp
‘
409)、质粒(cull等人(1992年)，《美国国家科学院院刊》，89:1865-1869)或噬菌体(scott和smith(1990年)，《科学》，249:386-390；devlin(1990年)，《科学》，249:404-406；cwirla等人(1990年)，《美国国家科学院院刊》，87:6378-6382；felici(1991年)，《分子生物学杂志》，222:301-310；ladner，见上文)上提供化合物库。可在基于细胞或非细胞的检测中筛选化合物。可在池中(例如，每个试样中包含多种化合物)或作为单独化合物筛选化合物。
[0727]
本文还提供了包含一种或多种核酸的合成物，所述核酸包含或能够表达至少1种、2种、3种、4种、5种、10种、20种或更多种的小核酸、反义寡核苷酸或其衍生物，其中，细胞中的所述小核酸、反义寡核苷酸或其衍生物在细胞条件下与细胞核酸(例如，非编码小rna，如mirna、pre-mirna、pri-mirna、mirna*、抗mirna、mirna结合位点、其变体和/或功能变体、细胞mrna或其片段)进行特异性杂交(例如，结合)。在一个实施例中，例如，通过抑制pten和/或p53的转录、翻译和/或小核酸加工，细胞中的小核酸、反义寡核苷酸或其衍生物的表达可抑制细胞核酸和/或蛋白的表达或生物活性。在一个实施例中，小核酸、反义寡核苷酸或其衍生物为小rna(例如，微小rna)或小rna的补体。在另一个实施例中，小核酸、反义寡核苷酸或其衍生物可以是单链或双链，长度至少为六个核苷酸，但少于约1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、40、30、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15或10个核苷酸。在
另一个实施例中，合成物可包含核酸库，所述核酸库包含或能够表达核酸、反义寡核苷酸或其衍生物，或小核酸、反义寡核苷酸或其衍生物池。核酸池可包含约2-5个、5-10个、10-20个、10-30个或更多核酸，所述核酸包含或能够表达核酸、反义寡核苷酸或其衍生物。
[0728]
在一个实施例中，可通过碱基对互补，或在与dna双链体结合时通过双螺旋大沟中的特异性相互作用，可进行结合。一般而言，“反义”系指本领域通常采用的技术范围，包括依赖于与寡核苷酸特异性结合的任何过程。
[0729]
在本领域中，众所周知，可在不破坏mirna活性的情况下，对mirna或pre-mirna序列进行修饰。在本文中，mirna序列的“功能变体”系指一种寡核苷酸序列，其与天然mirna序列不同，但保留了mirna的一个或多个功能特性(例如，抑制癌细胞增殖、诱导癌细胞凋亡、增强癌细胞对化学治疗剂的敏感性、抑制特异性mirna靶点)。在一些实施例中，mirna序列的功能变体保留了mirna的功能特性。在某些实施例中，mirna的功能变体包含一个核碱基序列，在包含约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多核碱基的一个区域内，其与mirna或其前体至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同，或功能变体在严格的杂交条件下与mirna或其前体的补体杂交。因此，在某些实施例中，功能变体的核碱基序列能够与mirna的一个或多个靶序列杂交。
[0730]
可在mirbase中找到本文所述的微小rna及其相应茎-环序列，mirbase是一个包含mirna序列和注释的在线可搜索数据库，可在万维网microrna.sanger.ac.uk上找到。mirbase序列数据库中的条目代表mirna转录物(茎-环)的一个预测发夹部分，包含有关成熟mirna序列的位置和序列信息。数据库中的mirna茎-环序列不是严格意义上的前体mirna(pre-mirna)，在一些情况下，可包括pre-mirna以及假定初级转录物的一些侧翼序列。本文所述的mirna核碱基序列包括mirna的任何版本，其中包括mirbase序列数据库版本10.0中所述的序列以及早期版本的mirbase序列数据库中的所述序列。在不同的序列数据库版本中，可能对某些mirna进行重新命名。在不同的序列数据库版本中，成熟mirna序列可能发生变化。
[0731]
在一些实施例中，本发明的mirna序列可与位于相同rna分子或作为mirna序列位于单独rna分子上的第二rna序列结合。在这种情况下，mirna序列可称为活性链，而至少与mirna序列部分互补的第二rna序列可称为互补链。活性链与互补链杂交，产生与天然mirna前体相似的双链rna。尽可能增加mirna蛋白复合物(调控基因翻译)对活性链的吸收，并减少对互补链的吸收，可优化mirna的活性。通过修饰和/或设计互补链，可完成此操作。
[0732]
在一些实施例中，对互补链进行修饰，使其5’端包含除磷酸盐或羟基之外的化学基团。5’修饰将会显著消除mirna蛋白复合物对互补链的吸收作用，从而促进对活性链的吸收。5’修饰可以是本领域已知的各种分子，包括nh2、nhcoch3和生物素。
[0733]
在另一个实施例中，在互补链的前2-6个核苷酸中加入包含糖修饰的核苷酸，减少mirna通路对互补链的吸收。应注意，此类糖修饰可与上文所述的5’端修饰结合，进一步增强mirna活性。
[0734]
在一些实施例中，互补链的设计应确保，互补链3’端中的核苷酸不与活性链互补。这会产生双链杂交rna，其活性链的3’端稳定，但活性链的5’端相对不稳定。这种稳定性差异会增强mirna通路对活性链的吸收，同时减少对互补链的吸收，从而增强mirna活性。
[0735]
本文所述方法和合成物的小核酸和/或反义构建体可作为表达质粒运输，在细胞中转录时，会产生与细胞核酸(例如，小rna、mrna和/或基因组dna)的至少一个独特部分互补的rna。或者，小核酸分子可产生编码mrna、mirna、pre-mirna、pri-mirna、mirna*、抗mirna或mirna结合位点或其变体的rna。例如，选择适用于表达mirna的质粒、将核酸序列插入质粒的方法以及将重组质粒运输到目标细胞中的方法均在本领域的技能范围内。例如，见zeng等人(2002年)，《分子细胞》，9:1327-1333；tuschl(2002年)，《自然生物技术》，20:446-448；brummelkamp等人(2002年)，《科学》，296:550-553；miyagishi等人(2002年)，《自然生物技术》，20:497-500；paddison等人(2002年)，《基因与发育》，16:948-958；lee等人(2002年)，《自然生物技术》，20:500-505；以及paul等人(2002年)，《自然生物技术》，20:505-508，所述整个公开通过本发明的引用，成为本发明的一部分。
[0736]
或者，小核酸和/或反义构建体为寡核苷酸探针，可离体产生，在引入细胞中时，会导致与细胞核酸杂交。此类寡核苷酸探针优选为对内源性核酸酶具有抗性的修饰寡核苷酸探针，例如，核酸外切酶和/或核酸内切酶，因此在体内稳定。用作小核酸和/或反义寡核苷酸的示例性核酸分子为dna的氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和甲基膦酸酯类似物(另见第5,176,996号、第5,264,564号和第5,256,775号美国专利)。此外，van der krol等人(1988年)，《生物技术》，6:958-976；以及stein等人(1988年)，《癌症研究》，48:2659-2668已综述了构建适用于反义疗法的寡聚物的通用方法。
[0737]
反义方法可包括设计与细胞核酸互补的寡核苷酸(如dna或rna)，例如，与pten和/或p53基因互补。无需实现绝对互补。对于双链反义核酸，可检测dna双链体的单链，或检测三链体形成情况。杂交能力取决于互补程度以及反义核酸的长度。一般而言，杂交核酸越长，与可包含并仍形成稳定双链体(或三链体(视情况而定))的核酸(例如rna)错配的碱基越多。本领域技术人员可使用标准程序确定杂交复合物的熔点，从而确定错配的可容忍程度。
[0738]
与mrna的5’端互补的寡核苷酸(例如，5’未翻译序列，直到并包括aug起始密码子)应最有效地抑制翻译。但是，近期，经证明，与mrna的3’未翻译序列互补的序列也可有效抑制mrna的翻译(wagner(1994年，《自然》，372:333)。因此，与基因的5’或3’未翻译、非编码区互补的寡核苷酸可用于反义方法中，以抑制内源性mrna的翻译。与mrna的5’未翻译区互补的寡核苷酸可包括aug起始密码子的补体。与mrna编码区互补的反义寡核苷酸是一种效率较低的翻译抑制剂，但也可根据本文所述的方法和合成物使用。无论是否旨在与细胞mrna的5’、3’或编码区杂交，小核酸和/或反义寡核苷酸的长度应至少为六个核苷酸，可少于约1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、40、30、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15或10个核苷酸。
[0739]
无论选择何种靶序列，优选首先进行体外研究，以对反义寡核苷酸的基因表达抑制能力进行量化。在一个实施例中，这些研究通过对照来区分寡核苷酸的反义基因抑制和非特异性生物效应。在另一个实施例中，这些研究将靶核酸或蛋白的水平与内部对照核酸或蛋白的水平进行比较。此外，还设想对比采用反义寡核苷酸获得的结果与采用对照寡核苷酸获得的结果。对照寡核苷酸优选大约与受试寡核苷酸的长度相同，并且寡核苷酸的核苷酸序列与反义序列不同，程度不超过防止与靶序列特异性杂交所需的程度。
[0740]
小核酸和/或反义寡核苷酸可以是dna、rna或其嵌合混合物、衍生物或修饰版本、
单链或双链。可对小核酸和/或反义寡核苷酸的碱基部分、糖部分或磷酸骨架进行修饰，以提高分子、杂交等的稳定性，可包括其他附加基团，如肽(例如，用于靶向宿主细胞受体)或促进跨细胞膜运输的药剂(见letsinger等人(1989)，《美国国家科学院院刊》，86:6553-6556；lemaitre等人(1987)，《美国国家科学院院刊》，84:648-652；第w088/09810号pct出版物)或血脑屏障(见第w089/10134号pct出版物)、杂交触发型切割剂(见krol等人(1988年)，《生物技术》，6:958-976)或嵌入剂。(见zon(1988年)，《药学研究》，5:539-549)。为此，可将小核酸和/或反义寡核苷酸与另一个分子(例如，肽、杂交触发型交联剂、运输剂、杂交触发型切割剂等)偶联。
[0741]
小核酸和/或反义寡核苷酸可包含至少一个从以下一组中选择的修饰碱基部分，包括但不限于：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟乙基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-d-半乳糖基辫苷、肌苷、n6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、n6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-d-甘露糖基辫苷、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-n6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸(v)、怀丁氧苷、假尿嘧啶、辫苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-n-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2,6-二氨基嘌呤。小核酸和/或反义寡核苷酸也可包含至少一个从以下一组中选择的修饰糖部分，包括但不限于阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。
[0742]
在某些实施例中，化合物包含与一个或多个部分偶联的寡核苷酸(例如，编码寡核苷酸的mirna或mirna)，从而增强所获得的寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞吸收。在某些此类实施例中，所述部分为胆固醇部分(例如，antagomir)、脂质部分或脂质体偶联物。其他偶联部分包括碳水化合物、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。在某些实施例中，偶联基通常直接连接至寡核苷酸。在某些实施例中，偶联基通过从以下各项中选择的一个连接部分连接至寡核苷酸：氨基、羟基、羧酸、硫醇、不饱和键(例如双键或三键)、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ado)、4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(smcc)、6-氨基己酸(ahex或aha)、取代c1-c10烷基、取代或未取代c2-c10烯基和取代或未取代c2-c10炔基。在某些此类实施例中，从以下各项中选择取代基：羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基、硫醇、硫代烷氧基、卤素、烷基、芳基、烯基和炔基。
[0743]
在某些此类实施例中，化合物包含寡核苷酸，所述寡核苷酸包含一个或多个连接至寡核苷酸一个或多个末端的稳定基，以增强核酸酶稳定性等特性。稳定基包含端帽结构。这些末端修饰组织寡核苷酸发生核酸外切酶降解，有助于细胞内运输和/或定位。所述端帽可位于5’端(5’端帽)或3’端(3’端帽)，或位于这两端。端帽结构包括反向脱氧脱碱基端帽。
[0744]
适当的端帽结构包括4',5'-亚甲基核苷酸、1-(β-d-赤呋喃糖基)核苷酸、4'-硫代核苷酸、碳环核苷酸、1,5-脱水己糖醇核苷酸、l-核苷酸、α-核苷酸、修饰碱基核苷酸、二硫代磷酸酯键、苏-戊呋喃糖基核苷酸、非环状3',4'-开环核苷酸、非环状3,4-二羟基丁基核苷酸、非环状3,5-二羟基戊基核苷酸、3'-3'-反向核苷酸部分、3'-3'-反向脱碱基部分、3'-2'-反向核苷酸部分、3'-2'-反向脱碱基部分、1,4-丁二醇磷酸酯、3'-氨基磷酸酯、磷酸己
酯、磷酸氨基己酯、3'-磷酸酯、3'-硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、桥连甲基膦酸酯部分和非桥连甲基膦酸酯部分5'-氨基-烷基磷酸酯、1,3-二氨基-2-丙基磷酸酯、3-氨基丙基磷酸酯、6-氨基己基磷酸酯、1,2-氨基十二烷基磷酸酯、羟丙基磷酸酯、5'-5'-反向核苷酸部分、5'-5'-反向脱碱基部分、5'-氨基磷酸酯、5'-硫代磷酸酯、5'-氨基、桥连和/或非桥连5'-氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和5'-巯基部分。
[0745]
小核酸和/或反义寡核苷酸也可包含中性肽样骨架。小分子被称为肽核酸(pna)寡聚物，以下参考文献对此进行了说明：perry-o’keefe等人，(1996年)，《美国国家科学院院刊》，93:14670以及eglom等人(1993年)，《自然》，365:566。pna寡聚物的一个优势在于其与互补dna的结合能力基本上与介质的离子强度无关(由于中性dna骨架)。在另一个实施例中，小核酸和/或反义寡核苷酸包含至少一个从包括以下各项的一组中选择的修饰磷酸骨架：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代磷酰胺酯、氨基磷酸酯、磷酰二胺酯、甲基膦酸酯、烷基磷酸三酯和甲缩醛或其类似物。
[0746]
在其他实施例中，小核酸和/或反义寡核苷酸为α-异头寡核苷酸。α-异头寡核苷酸与互补rna形成特异性双链杂交体，其中，与普通的b单位相比，这两条链相互平行(gautier等人(1987年)，《核酸研究》，15:6625-6641)。寡核苷酸为2
’‑
0-甲基核糖核苷酸(inoue等人(1987年)，《核酸研究》，15:6131-6148)或嵌合rna-dna类似物(inoue等人(1987年)，《欧洲生化学会联合会快报》，215:327-330)。
[0747]
可通过本领域已知的标准方法合成本文所述方法和合成物的小核酸和/或反义寡核苷酸，例如，通过使用dna自动合成仪(如biosearch公司、应用生物系统公司等的市售产品)。例如，可通过以下参考文献中所述的方法合成硫代磷酸酯寡核苷酸：stein等人(1988年)，《核酸研究》，16:3209，可使用可控孔径玻璃聚合物支持体制备甲基膦酸酯寡核苷酸(sarin等人(1988年)，《美国国家科学院院刊》，85:7448-7451)等。例如，可使用本领域的已知方法化学合成或重组产生分离mirna。在一些情况下，采用具有适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规dna/rna合成仪化学合成mirna。合成rna分子或合成试剂的商业供应商包括proligo公司(德国汉堡)、dharmacon研究公司(美国科罗拉多州拉斐特)、皮尔斯化学公司(属于perbio科学公司，美国伊利诺斯州罗克福德)、glen研究公司(美国弗吉尼亚州斯特林)、chemgenes公司(美国马萨诸塞州阿什兰)、cruachem公司(英国格拉斯哥)和exiqon公司(丹麦韦兹拜克)。
[0748]
小核酸和/或反义寡核苷酸可体内运输到细胞中。已开发多种将小核酸和/或反义寡核苷酸dna或rna运输到细胞中的方法；例如，可直接将反义分子注射到组织部位中，或可全身性地施用旨在靶向所需细胞的修饰反义分子(例如，反义连接至特异性结合受体或抗原(在靶细胞表面表达)的肽或抗体)。
[0749]
在一个实施例中，小核酸和/或反义寡核苷酸可包含双链小干扰rna(sirna)或从中产生，其中，与细胞核酸(例如，mrna)序列完全互补的序列介导降解，或与细胞核酸(例如，mrna)序列不完全互补的序列在细胞中表达时介导翻译抑制。在另一个实施例中，可将双链sirna加工成单链反义rna，从而结合单链细胞rna(例如，微小rna)并抑制其表达。rna干扰(rnai)是一种动物和植物序列特异性转录后基因沉默过程，由在序列上与沉默基因同源的双链rna(dsrna)启动。在体内，核糖核酸酶iii切割长dsrna，产生包含21个和22个核苷酸的sirna。结果表明，包含21个核苷酸的sirna双链体特异性抑制不同哺乳动物细胞系(包
括人胚肾(293)和希拉细胞)中内源和异源基因的表达(elbashir等人(2001年)，《自然》，411:494-498)。因此，可使细胞接触长度为约15-30个核苷酸、约18-21个核苷酸或约19-21个核苷酸的短双链rna，从而抑制细胞中的基因翻译。因此，可将编码此类sirna或短发夹rna(shrna)(代谢成sirna)的载体引入靶细胞中(见mcmanus等人(2002年)，《rna》，8:842；xia等人(2002年)，《自然生物技术》，20:1006；以及brummelkamp等人(2002年)，《科学》，296:550)。可使用的载体已市售，例如，oligoengine公司名为psuper rnai system
tm
的载体。
[0750]
旨在催化切割细胞mrna转录体的核酶分子也可用于阻止细胞mrna的翻译和/或细胞多肽的表达(见pct国际出版物wo90/11364(出版日期：1990年10月4日；sarver等人(1990年)，《科学》，247:1222-1225以及第5,093,246号美国专利)。虽然也可使用以位点特异性识别序列切割mrna的核酶来破坏细胞mrna，但是，优选使用锤头状核酶。锤头状核酶在决定于侧翼区(与靶mrna形成互补碱基对)的位置切割mrna。唯一要求是靶mrna包含以下两个碱基的序列：5
’‑
ug-3’。锤头状核酶的构建和产生在本领域中十分常见，以下参考文献对此进行了更充分的说明：haseloff和gerlach(1988年)，《自然》，334:585-591。核酶和经工程化改造，使切割识别位点位于细胞mrna的5’端附近；即，增加效率，并尽量减少非功能性mrna转录体累积。
[0751]
本文所述方法的核酶还包括rna内切核糖核酸酶(以下简称“cech型核酶”)，如四膜虫中天然存在的核酶(称为ivs或l-19ivs rna)，以下参考文献对此进行了充分说明：zaug等人(1984年)，《科学》，224:574-578；zaug等人(1986年)，《科学》，231:470-475；zaug等人(1986年)，《自然》，324:429-433；wo 88/04300；以及been等人(1986年)，《细胞》，47:207-216)。cech型核酶包含一个八碱基对活性位点，此位点与靶rna序列杂交，随后切割靶rna。本文所述的方法和合成物包含靶向八碱基对活性位点序列(存在于细胞基因中)的cech型核酶。
[0752]
与反义方法相同，核酶可由修饰寡核苷酸组成(例如，提高稳定性、靶向性等)。一种优选输送方法包括使用dna构建体(在强组成型pol iii或pol ii启动子的控制下“编码”核酶)，使转染细胞产生足够量的核酶，以破坏内源性细胞消息，并抑制翻译。与反义分子不同，核酶具有催化性，因此，为了提高效率，需要较低的胞内浓度。
[0753]
在三螺旋形成中用于抑制细胞基因转录的核酸分子优选为单链分子，由脱氧核糖核苷酸组成。这些寡核苷酸的碱基组成应通过hoogsteen碱基配对规则促进三螺旋形成，双链体的一条链上通常需要存在一大段嘌呤或嘧啶。核苷酸序列可基于嘧啶，导致tat和cgc三连体跨过所获三螺旋的三条相关链。富嘧啶分子为双链体单链(在与此链平行的方向上)的富嘌呤区提供碱基互补性。此外，可选择富嘌呤核酸分子，例如，包含一段g残基。这些分子将与富含gc对的dna双链体形成三螺旋，其中，大多数嘌呤残基均位于靶双链体的单链上，因此在三链体的三条链上形成cgc三连体。
[0754]
或者，通过创造所谓的“转换”核酸分子，可增加在三螺旋形成中靶向的潜在序列。5
’‑3’
、3
’‑5’
交替合成转换分子，使它们与双链体的第一条链和第二条链依次进行碱基配对，因此，双链体的一条链上无需存在一大段嘌呤或嘧啶。
[0755]
可通过本领域已知的任何dna和rna合成方法制备本文所述方法和合成物的小核酸(例如，mirna、pre-mirna、pri-mirna、mirna*、抗mirna或mirna结合位点或其变体)、反义
寡核苷酸、核酶和三螺旋分子。其中包括本领域常见的寡脱氧核糖核苷酸和寡核糖核苷酸化学合成技术，如固相亚磷酰胺化学合成技术。或者，可通过dna序列(编码反义rna分子)的体外和体内转录，产生rna分子。此类dna序列可包含在各种载体中，此类载体包含适当的rna聚合酶启动子(如t7或sp6聚合酶启动子)。或者，根据所使用的启动子，反义cdna构建体以组成或诱导的方式合成反义rna，可稳定引入细胞系中。
[0756]
此外，为了增加胞内稳定性和半衰期，可对核酸分子进行各种常见的修饰。可能的修饰包括但不限于向核酸的5’端和/或3’端添加核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的侧翼序列，或使用硫代磷酸酯或2’o-甲基，而不是寡脱氧核糖核苷酸骨架内的磷酸二酯酶键。本领域技术人员很容易理解，多肽、小核酸和反义寡核苷酸可进一步连接至另一个肽或多肽(如异源肽)，例如，作为一种蛋白检测手段。适用于本发明所述检测的标记肽或多肽部分的非限制性示例包括但不限于适当的酶，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶)；表位标签，如flag、myc、ha或his标签；荧光团，如绿色荧光蛋白；染料；放射性同位素；洋地黄毒苷；生物素；抗体；聚合物；以及本领域已知的其他物质(例如，《荧光光谱原理》，joseph r.lakowicz(编辑)，普莱南出版公司，第2版(1999年7月))。
[0757]
本发明还考虑了常见的生物体或细胞基因组基因修饰方法，在完成基因修饰后，在生物体或细胞不接触药剂的情况下，即可改变pten和/或p53的表达和/或活性。例如，可采用重组技术，对癌细胞进行基因修饰，以调节pten和/或p53的表达和/或活性，在这种情况下，无需接触癌细胞，即可调节pten和/或p53的表达和/或活性。例如，可使用靶向或非靶向基因敲除方法，在将受试者癌细胞注入到受试者体内前，对其进行离体重组工程化改造。例如，可使用逆转录病毒插入、人工染色体技术、基因插入、组织特异性启动子随机插入、基因靶向、转座因子技术和/或引入外源性dna或产生修饰dna/修饰核dna的任何其他方法，对基因组中的靶dna进行缺失、插入和/或突变处理。其他修饰技术包括从基因组中删除dna序列和/或改变核dna序列。例如，可通过定点诱变，改变核dna序列。此类方法通常使用宿主细胞，通常向此宿主细胞中引入本发明所述的重组表达载体。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。可以理解的是，此类术语不仅系指特定主体细胞，还系指此类细胞的后代或潜在后代。由于突变或环境影响，后代可能发生特定的变化，因此，此类后代实际上可能与母细胞不同，但仍在本文所用术语的范围内。可通过常规转化或转染技术，将载体dna引入原核或真核细胞中。在本文中，术语“转化”或“转染”系指将外源性核酸引入宿主细胞中的各种领域公认技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、deae-葡聚糖介导转染、脂质转染或电穿孔技术。适当的宿主细胞转化或转染方法可见sambrook等人(见上文)以及其他实验室手册。为了稳定转染哺乳动物细胞，众所周知，根据所使用的表达载体和转染技术，仅一小部分的细胞可将外源性dna融入其基因组中。为了识别并选择这些组成部分，编码可选标志物(例如，抵抗抗生素)的基因通常随目标基因被引入宿主细胞中。优选可选标志物包括提供耐药性的标志物，如g418、潮霉素和甲氨蝶呤。可通过药物选择，确定使用所引入的核酸稳定转染的细胞(例如，包含可选标志物基因的细胞存活，而其他细胞则死亡)。
[0758]
同样，crispr-cas系统可用于对基因组核酸进行精确编辑(例如，用于产生无效突变)。在此类实施例中，可表达crispr引导rna和/或cas酶。例如，可向cas9酶转基因动物或细胞施用仅包含引导rna的载体。可使用相似的策略(例如，设计锌指、转录激活因子样效应子(tale)或归位巨核酸酶)。此类系统在本领域中十分常见(见第8,697,359号美国专利；
sander和joung(2014年)，《自然生物技术》，32:347-355；hale等人(2009年)，《细胞》，139:945-956；karginov和hannon(2010年)，《分子细胞》，37:7；美国专利出版物2014/0087426和2012/0178169；boch等人(2011年)，《自然生物技术》，29:135-136；boch等人(2009年)，《科学》，326:1509-1512；moscou和bogdanove(2009年)，《科学》，326:1501；weber等人(2011年)，《plos one》，6:e19722；li等人(2011年)，《核酸研究》，39:6315-6325；zhang等人(2011年)，《自然生物技术》，29:149-153；miller等人(2011年)，《自然生物技术》，29:143-148；lin等人(2014年)，《核酸研究》，42:e47)。此类遗传策略可根据本领域常见的方法，使用组成型表达系统或诱导型表达系统。
[0759]
在一些实施例中，所述癌细胞不可复制。在某些实施例中，由于辐照(例如，γ和/或uv辐照)和/或施用破坏细胞复制能力的药剂(例如，破坏细胞膜的化合物、dna复制抑制剂、细胞分裂时的纺锤体形成抑制剂等)，所述癌细胞不可复制。约3500拉德的最小放射剂量通常就已足够，但高达30000拉德的剂量也可接受。在一些实施例中，可使用亚致死辐照剂量。例如，可在施用癌症疫苗前，辐照所述癌细胞，抑制细胞增殖，以降低产生新肿瘤性病变的风险。可以理解的是，辐照只是使细胞不可复制的一种方法，本发明还包括使癌细胞无法进行细胞分裂但在激活tgfβ-smad/p63信号通路后仍可触发抗肿瘤免疫反应的其他方法。
[0760]
c.激活tgfβ-smad/p63信号通路的药剂
[0761]
本文表明，激活肿瘤细胞中的tgfβ-smad/p63轴可调控多个通路的表达，从而促进免疫应答，最终激活细胞毒性t细胞和免疫记忆。因此，本文所述本发明所含的癌细胞经修饰，以激活tgfβ-smad/p63信号通路。在一个实施例中，所述癌细胞与tgfβ超家族蛋白接触，以激活tgfβ-smad/p63信号通路。在另一个实施例中，所述癌细胞与表1中所列的一种或多种生物标志物的拷贝数、表达和/或活性调节剂接触，以激活tgfβ-smad/p63信号通路。可在2d或3d中(例如，作为肿瘤球或类器官培养)体外或离体培养所述癌细胞(例如，癌细胞系或肿瘤组织)。
[0762]
在一些实施例中，向受试者施用前，可针对某些所需特性或功能，对包含本文所述修饰癌细胞的癌症疫苗进行检测。在一个实施例中，确认修饰癌细胞中缺失pten和p53。在另一个实施例中，在修饰癌细胞中检测到tgfβ-smad/p63信号通路激活情况。在另一个实施例中，针对一个或多个以下特性，对修饰癌细胞进行检测：
[0763]
a)降低2d或3d培养系统中的生长速率；
[0764]
b)激活tgfβ-smad/p63特征，如上调icosl、pycard、sfn、perp、ripk3、casp9和/或sesn1；和/或下调ksr1、eif4ebp1、itga5、emilin1、cd200和/或csf1；
[0765]
c)上调一个或多个树突状细胞(dc)激活标志物，包括但不限于cd40、cd80、cd86、cd8、hla-dr、il1-β等；和/或
[0766]
d)在存在dc时激活t细胞，如在存在dc时增加t细胞的tnfα和/或ifnγ分泌量。
[0767]
i.tgfβ超家族蛋白
[0768]
在一个实施例中，本文所述的pten和p53缺陷癌细胞与tgfβ超家族蛋白接触，以激活tgfβ-smad/p63信号通路。tgfβ超家族蛋白可以是可激活tgfβ-smad/p63信号通路的任何tgfβ超家族成员。tgfβ超家族蛋白可来自tgfβ家族，包括但不限于lap、tgfβ1、tgfβ2、tgfβ3和tgfβ5。tgfβ超家族成员可来自激活素家族，包括但不限于激活素a、激活素ab、激活素ac、
激活素b、激活素c、c17orf99、inhba、inhbb、抑制素、抑制素a和抑制素b。tgfβ超家族可来自bmp(骨形态发生蛋白)家族，包括但不限于bmp-1/pcp、bmp-2、bmp-2/bmp-6heterodimer、bmp-2/bmp-7异二聚体、bmp-2a、bmp-3、bmp-3b/gdf-10、bmp-4、bmp-4/bmp-7异二聚体、bmp-5、bmp-6、bmp-7、bmp-8、bmp-8a、bmp-8b、bmp-9、bmp-10、bmp-15/gdf-9b和decapentaplegic/dpp。tgfβ超家族蛋白可来自gdnf家族，包括但不限于artemin、gdnf、neurturin和persephin。tgfβ超家族蛋白可来自除上述家族之外的一个家族，包括但不限于lefty a、lefty b、mis/amh、nodal和scube3。在某些实施例中，tgfβ超家族蛋白为tgfβ1、tgfβ2和/或tgfβ3。在一个实施例中，所述癌细胞与单一tgfβ超家族蛋白(例如，tgfβ1、tgfβ2或tgfβ3)接触。在另一个实施例中，所述癌细胞与tgfβ超家族蛋白组合(例如，tgfβ1、tgfβ2或tgfβ3的组合)接触。
[0769]
所述癌细胞可在体外、体内和/或离体与tgfβ超家族蛋白单独接触。在一个实施例中，所述癌细胞在体外或离体与tgfβ超家族蛋白接触，然后，向受试者施用所述癌细胞，但不向受试者体内施用tgfβ超家族蛋白。在另一个实施例中，向受试者施用所述癌细胞，其中，向受试者施用所述tgfβ超家族蛋白，使其在体内与所述癌细胞接触。在另一个实施例中，所述癌细胞在体外或离体与tgfβ超家族蛋白接触，然后，向受试者施用所述癌细胞，还向受试者体内施用tgfβ超家族蛋白。可在施用癌细胞之前、之后和/或期间，向受试者施用tgfβ超家族蛋白。在一些实施例中，所述癌细胞与tgfβ超家族蛋白以及免疫检查点阻断剂体外、体内和/或离体接触。可在施用癌症疫苗之前、之后和/或期间，向受试者施用免疫检查点阻断剂。
[0770]
tgfβ超家族蛋白的剂量可能有所不同，以便达到一定量的tgfβ-smad/p63信号通路激活效果，针对特定患者、合成物和给药模式有效实现预期治疗反应，且对患者无毒性。
[0771]
所选剂量水平取决于各种因素，包括所用特定tgfβ超家族蛋白的活性、与之接触的癌细胞的特定类型、给药途径、给药时间、所用特定tgfβ超家族蛋白的排泄或代谢速率、治疗持续时间、与所用特定tgfβ超家族蛋白结合使用的其他药物、化合物和/或物质、正在接受癌症疫苗治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康状况和既往病史以及医学领域常见的类似因素。
[0772]
在一些实施例中，所述癌细胞与tgfβ超家族蛋白接触，剂量超过0.1ng/ml，如超过0.2ng/ml、超过0.3ng/ml、超过0.4ng/ml、超过0.5ng/ml、超过0.6ng/ml、超过0.7ng/ml、超过0.8ng/ml、超过0.9ng/ml、超过1ng/ml、超过1.5ng/ml、超过2ng/ml、超过2.5ng/ml、超过3ng/ml、超过3.5ng/ml、超过4ng/ml、超过4.5ng/ml、超过5ng/ml、超过5.5ng/ml、超过6ng/ml、超过6.5ng/ml、超过7ng/ml、超过7.5ng/ml、超过8ng/ml、超过8.5ng/ml、超过9ng/ml、超过9.5ng/ml、超过10ng/ml等。
[0773]
在一些实施例中，所述癌细胞与tgfβ超家族蛋白接触，剂量为约0.1ng/ml至约100ng/ml。在优选实施例中，所述癌细胞与tgfβ超家族蛋白接触，剂量为约1ng/ml至约10ng/ml，如约1ng/ml、1.5ng/ml、2ng/ml、2.5ng/ml、3ng/ml、3.5ng/ml、4ng/ml、4.5ng/ml、5ng/ml、5.5ng/ml、6ng/ml、6.5ng/ml、7ng/ml、7.5ng/ml、8ng/ml、8.5ng/ml、9ng/ml、9.5ng/ml、10ng/ml或介于两者之间的任何值。
[0774]
在一些实施例中，所述癌细胞与tgfβ超家族蛋白接触一段时间。这段时间可以是几分钟至4周不等，如10分钟、30分钟、1小时、3小时、6小时、9小时、12小时、15小时、18小时、
21小时、24小时、36小时、2天、2.5天、3天、3.5天、4天、4.5天、5天、5.5天、6天、6.5天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天或介于两者之间的任何值。优选时间范围为约6小时至21天、约12小时至约15天、约1天至约10天、约3天至约7天。
[0775]
ii.增加表1中所列的至少一种生物标志物的拷贝数、数量和/或活性的药剂
[0776]
在另一个实施例中，本文所述的pten和p53缺陷癌细胞与表1中所列的一种或多种生物标志物的拷贝数、表达和/或活性调节剂接触，从而激活tgfβ-smad/p63信号通路。增加表1中所列的一种或多种生物标志物的拷贝数、数量和/或活性的药剂可直接或间接实现此类目的。
[0777]
适用于本发明所含方法的药剂包括抗体、小分子、肽、类肽、天然配体及其衍生物等，它们可结合和/或调节表1中所列的一种或多种生物标志物或其片段；rna干扰、反义、核酸适配子、核酸、多肽等，它们可增加表1中所列的一种或多种生物标志物或其片段的表达和/或活性。
[0778]
在一个实施例中，分离核酸分子与表1中所列的一种或多种生物标志物或其生物活性部分进行特异性杂交或对其进行编码。在本文中，术语“核酸分子”旨在包括dna分子(即cdna或基因组dna)和rna分子(即mrna)以及使用核苷酸类似物产生的dna或rna类似物。核酸分子可以是单链分子或双链分子，但优选为双链dna。“分离”核酸分子是与天然核酸来源中存在的其他核酸分子分离的一种分子。优选地，“分离”核酸不含天然存在于衍生核酸的生物体基因组dna核酸旁侧的序列(即，位于核酸5’端和3’端的序列)。例如，在各种实施例中，对应于表1中所列的一种或多种生物标志物的分离核酸分子可能包含不到约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，此序列天然存在于衍生核酸的细胞基因组dna的核酸分子旁侧(即淋巴瘤细胞)。此外，“分离”核酸分子(如cdna分子)在通过重组技术生产时，基本上不含其他细胞物质或培养基，或在化学合成时，基本上不含化学前体或其他化学物质。
[0779]
可使用标准分子生物技术和本文提供的序列信息分离本发明所涉及的核酸分子，例如，包含表1中所列的一种或多种生物标志物的核苷酸序列，或其核苷酸序列与表1中所列的一种或多种生物标志物的核苷酸序列或其部分的同源性为至少约50％，优选至少约60％，更优选至少约70％，更优选至少约80％，更优选至少约90％，最优选至少约95％或更高(例如，约98％)(即100、200、300、400、450、500或更多核苷酸)的核酸分子。例如，可使用全部或部分核酸分子或其片段(作为杂交探针)和标准杂交技术，从人细胞系(来自stratagene公司(加利福尼亚州拉荷亚)或clontech公司(加利福尼亚州帕洛阿尔托))中分离人cdna(即，说明见sambrook,j.,fritsh,e.f.和maniatis t.，《分子克隆：实验室手册》第2版，冷泉港实验室，冷泉港实验室出版社(纽约冷泉港)(1989年))。此外，可使用根据表1中所列的一种或多种生物标志物或其片段或同源核苷酸序列设计的寡核苷酸引物，通过聚合酶链反应分离核酸分子，所述核酸分子包含表1中所列的一种或多种生物标志物的全部或部分核苷酸序列，或其核苷酸序列与所述核苷酸序列或其片段的同源性至少达到约50％，优选至少约60％，更优选至少约70％，更优选至少约80％，更优选至少约90％，最优选至少约95％或更高。例如，可从肌肉细胞中分离mrna(即，通过chirgwin等人(1979年)，《生物化学》，18:5294-5299中的硫氰酸胍提取程序)，可使用逆转录酶(即gibco/brl公司(马里
兰州贝塞斯达)提供的moloney mlv逆转录酶；或seikagaku美国公司(佛罗里达州圣彼得堡)提供的amv逆转录酶)制备cdna。可根据本领域常见的方法设计pcr扩增用合成寡核苷酸引物。根据标准pcr扩扩增技术，可将cdna或基因组dna用作模板或适当的寡核苷酸引物，对本发明所含的核酸进行扩增。可将通过这种方式扩增的核酸克隆到适当的载体中，并通过dna序列分析进行表征。此外，可通过标准合成技术(即，使用dna自动合成仪)制备对应于表1中所列的一种或多种生物标志物核苷酸序列的寡核苷酸。
[0780]
基于表1中所列的一种或多种生物标志物核苷酸序列的探针可用于检测或确认编码相同或同源蛋白的所需转录体或基因组序列。在优选实施例中，探针进一步包含附着在其上的标记组，即标记组可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。此类探针可用作诊断检测试剂盒的一部分，通过在受试者细胞样本中测量表1中所列的一种或多种生物标志物的核酸水平，即检测表1中所列的一种或多种生物标志物的mrna水平，识别表达表1中所列的一种或多种生物标志物的细胞或组织。
[0781]
本文还考虑了编码蛋白(对应于表1中所列的一种或多种生物标志物(来自不同物种))的核酸分子。例如，可根据人和/或小鼠序列的核苷酸序列识别大鼠或猴cdna，此类序列在本领域中十分常见。在一个实施例中，本发明所含的核酸分子编码蛋白或其部分，其氨基酸序列与表1中所列的一种或多种生物标志物的氨基酸序列充分同源，因此，所述蛋白或其部分可调节(例如，增强)以下一种或多种生物活性：a)生物标志物的结合活性；b)生物标志物拷贝数的调节活性；c)生物标志物表达水平的调节活性；以及d)生物标志物活性水平的调节活性。
[0782]
在本文中，“充分同源”系指蛋白或其部分的氨基酸序列包含最小数量的氨基酸残基(与生物标志物或其片段的氨基酸序列相同或等效(例如，侧链与表1中所列的一种或多种生物标志物或其片段中的氨基酸残基侧链相似的氨基酸残基))，因此，所述蛋白或其中部分可调节(例如，增强)以下一种或多种生物活性：a)生物标志物结合活性；b)生物标志物拷贝数调节活性；c)生物标志物表达水平调节活性；以及d)生物标志物活性水平调节活性。
[0783]
在另一个实施例中，蛋白与生物标志物的整个氨基酸序列或其片段的同源性为至少约30％，优选至少约60％，更优选至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。
[0784]
由表1中所列的一种或多种生物标志物的核酸分子编码的蛋白部分优选为蛋白的生物活性部分。在本文中，表1中所列的一种或多种生物标志物的“生物活性部分”旨在包括具有全长蛋白一种或多种生物活性的一个部分，例如，一个结构域/基序。
[0785]
可进行标准结合检测(例如，免疫沉淀和酵母双杂交检测(如上文所述))或功能检测(例如，rnai或过表达实验)，以确定蛋白或其生物活性片段保持全长蛋白生物活性的能力。
[0786]
本发明进一步包括核酸分子，由于遗传密码的简并性，所述核酸分子与表1中所列的一种或多种生物标志物或其片段的核苷酸序列不同，因此编码与由核苷酸序列或其片段编码的蛋白相同的蛋白。在另一个实施例中，本发明所含的分离核酸分子包含一个编码蛋白的核苷酸序列，所述蛋白包含表1中所列的一种或多种生物标志物或其片段的氨基酸序列，或其氨基酸序列与表1中所列的一种或多种生物标志物或其片段的氨基酸序列的同源性为至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或更高。在另一个实施例中，编码多肽的核酸由编码目标全长片段一个部分的核酸序列组成，长度少于195、190、185、180、175、170、165、160、155、150、145、140、135、130、125、120、115、110、105、100、95、90、85、80、75或70个氨基酸。
[0787]
本领域技术人员理解，dna序列多态性可存在于一个群体(例如，哺乳动物和/或人类群体)内，导致表1中所列的一种或多种生物标志物的氨基酸序列发生变化。由于自然等位变异，此类遗传多态性可存在于一个群体内的个体中。在本文中，术语“基因”和“重组基因”系指包含一个开放读码框架的核酸分子，所述开放读码框架编码表1中所列的一种或多种生物标志物，优选哺乳动物(例如，人)蛋白。此类自然等位变异通常可导致表1中所列的一种或多种生物标志物的核苷酸序列发生1-5％的变异。任何及所有此类核苷酸变异以及因此在表1中所列的一种或多种生物标志物中获得的多态性(由自然等位变异导致，但不会改变表1中所列的一种或多种生物标志物的功能活性)均在本发明所含的范围内。此外，本文还考虑了编码表1中所列的一种或多种生物标志物蛋白(来自其他物种)的核酸分子。
[0788]
除了表1中所列的一种或多种生物标志物的天然等位基因变体(可存在于群体中)之外，本领域技术人员进一步理解，核苷酸或其片段突变可导致发生变化，从而导致表1中所列的一种或多种编码生物标志物的氨基酸序列发生变化，但不会改变表1中所列的一种或多种生物标志物的功能活性。例如，可在序列或其片段中进行核苷酸取代，此类取代会导致“非必需”氨基酸残基处发生氨基酸取代。“非必需”氨基酸残基是可从表1中所列的一种或多种生物标志物的野生型序列中改变但不会改变表1中所列的一种或多种生物标志物活性的一种残基，而“必需”氨基酸残基对于获得表1中所列的一种或多种生物标志物活性必不可少。但是，其他氨基酸残基(例如，小鼠与人类之间的非保守或仅半保守氨基酸残基)对于获得活性并非必不可少，因此可能改变，但不会改变表1中所列的一种或多种生物标志物的活性。
[0789]
术语“序列一致性或同源性”系指两个多肽分子或两个核酸分子之间的序列相似性。当两个比较序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个dna分子中的一个位置被腺嘌呤占据，则这两个分子同源，或序列在此位置保持相同。两个序列具有同源性或序列一致性的百分比是两个序列共享匹配或同源相同位置数量除以比较位置数量x 100的函数。例如，如果在两个序列的10个位置中，有6个位置相同，则这两个序列的同源性或序列一致性均为60％。例如，dna序列attgcc和tatggc共享50％的同源性或序列一致性。一般而言，当比对两个序列，应在具有最大同源性时进行比较。除非另有规定，否则将“环出区”(例如，因一个序列缺失或插入而导致)算作错配。
[0790]
可使用数学算法进行序列比较，并确定两个序列之间的同源性百分比。优选地，可采用clustal方法进行比对。多个比对参数包括：空位罚分＝10、空位长度罚分＝10。对于dna比对，双序列比对参数可以是htuple＝2、空位罚分＝5、window＝4以及保存的对角线＝4。对于蛋白比对，双序列比对参可以是ktuple＝1、空位罚分＝3、window＝5以及保存的对角线＝5。
[0791]
在一个优选实施例中，使用needleman和wunsch(《分子生物学杂志》，(48):444-453(1970))算法(已纳入gcg软件包(网上可获得)中的gap程序)，并使用blossom 62矩阵或pam250矩阵以及空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的一致性百分比。在另一个优选实施例中，使用gcg软件包(网上可获得)中的gap
程序，并使用nwsgapdna.cmp矩阵以及空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个序列之间的一致性百分比。在另一个实施例中，使用e.meyers和w.miller(cabios，4:11-17(1989年))算法(已纳入align程序(版本2.0)(网上可获得))，并使用pam120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4，确定两个氨基酸或核苷酸序列之间的一致性百分比。
[0792]
通过将一个或多个核苷酸取代、添加或缺失引入核苷酸序列或其片段或同源核苷酸序列(将一个或多个氨基酸取代、添加或缺失引入编码蛋白)，可产生编码蛋白(与表1中所列的一种或多种生物标志物或其片段同源)的分离核酸分子。可通过定点诱变和pcr介导诱变等标准技术引入突变。优选地，在一个或多个预测非必需氨基酸残基处进行保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是一种用包含相似侧链的一个氨基酸残基代替氨基酸残基的过程。本领域已对包含相似侧链的氨基酸残基家族进行了定义。这些家族包括包含以下侧链的氨基酸：碱性侧链(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、支化侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，优选用相同侧链家族的另一个氨基酸残基代替表1中所列的一种或多种生物标志物中的预测非必需氨基酸残基。或者，在另一个实施例中，可随表1中所列的一种或多种生物标志物的全部或部分编码序列随机引入突变(如通过饱和诱变)，可对合成突变体进行本文所述的活性筛选，以确定保留所需活性的突变体。诱变后，可根据本领域常见的方法对编码蛋白进行重组表达，并通过本文所述的检测确定蛋白的活性。
[0793]
可通过各种常见的转录分子或蛋白表达检测方法，评估表1中所列的一种或多种生物标志物的水平。此类方法的非限制性示例包括蛋白检测的免疫学方法、蛋白纯化方法、蛋白功能或活性检测、核酸杂交方法、核酸逆转录方法以及核酸扩增方法。
[0794]
在优选实施例中，通过测量基因转录体(例如，mrna)、通过测量翻译蛋白数量或通过测量基因产物活性，确定表1中所列的一种或多种生物标志物的水平。可采用多种方式监测表达水平，包括通过检测mrna水平、蛋白水平或蛋白活性，可采用标准技术测量上述任何一个参数。检测可包括对基因表达(例如，基因组dna、cdna、mrna、蛋白或酶活性)水平进行定量，或是一种基因表达水平定性评估，特别是与对照水平相比。从上下文中，将明确所检测的水平类型。
[0795]
在一个特定实施例中，可使用本领域的已知方法，通过生物样本的原位和体外格式，确定mrna表达水平。术语“生物样本”旨在包括从受试者体内分离的组织、细胞、生物体液及其分离物以及受试者体内存在的组织、细胞和体液。许多表达检测方法均使用分离rna。对于体外方法，未选择用于分离mrna的任何rna分离技术均可用于从细胞中纯化rna(见ausubel等人(编辑)，《现代分子生物学实验指南》，约翰
·
威利父子出版公司(纽约)，1987-1999年)。此外，使用本领域技术人员熟知的技术，如chomczynski(1989年，第4,843,155号美国专利)的单步rna分离工艺，可轻松处理大量组织样本。
[0796]
分离mrna可用于杂交或扩增检测，包括但不限于southern或northern分析、聚合酶链反应分析和探针阵列。一种用于检测mrna水平的优选诊断方法包括使分离mrna接触可与mrna(由所检测基因编码)杂交的核酸分子(探针)。核酸探针可以是全长cdna或其部分，
如长度至少为7、15、30、50、100、250或500个核苷酸且足以在严格条件下与mrna或基因组dna(编码表1中所列的一种或多种生物标志物)进行特异性杂交的寡核苷酸。本文还对适用于本发明所含诊断检测的其他探针进行了说明。mrna与探针杂交表明正在表达表1中所列的一种或多种生物标志物。
[0797]
在一种格式中，mrna固定在固体表面，通过在琼脂糖凝胶上运行分离mrna并将mrna从凝胶中转移到膜(如硝化纤维素)上，与探针接触。在另一种替代格式中，探针固定在固体表面，mrna与基因芯片阵列(例如，affymetrixtm基因芯片阵列)中的探针接触。本领域技术人员可轻松适应用于检测表1mrna表达水平中所列的一种或多种生物标志物水平的已知mrna检测方法。
[0798]
用于确定样本中mrna表达水平的一种替代方法包括核酸扩增过程，例如，通过rt-pcr(mullis，1987年，第4,683,202号美国专利中所述的实验实施例)、连接酶链反应(barany，1991年，《美国国家科学院院刊》，88:189-193)、自主序列复制(guatelli等人，1990年，《美国国家科学院院刊》，87:1874-1878)、转录扩增系统(kwoh等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，86:1173-1177)、q-β复制酶(lizardi等人，1988年，《生物技术》，6:1197)、滚环式复制(lizardi等人，第5,854,033号美国专利)或任何其他核酸扩增方法，然后通过使用本领域技术人员熟知的技术检测扩增分子。这些检测方案特别适用于检测极少量的核酸分子。在本文中，扩增引物系指一对核酸分子，它们可退火至基因的5’区或3’区(分别为正链和负链，反之亦然)，并在中间包含一个短区。一般而言，扩增引物的长度为约10-30个核苷酸，旁侧区域的长度为约50-200个核苷酸。在适当条件下，使用适当试剂时，此类引物可使包含引物旁侧核苷酸序列的核酸分子扩增。
[0799]
对于原位方法，检测前，无需从细胞中分离mrna。在此类方法中，使用已知的组织学方法制备/处理细胞或组织样本。然后，将样本固定在支持体(通常为载玻片)上，并使其接触可与表1中所列一种或多种生物标志物mrna杂交的探针。
[0800]
作为根据绝对表达水平进行确定的替代方法，可根据表1中所列的一种或多种生物标志物的归一化表达水平进行确定。通过将其表达与非生物标志物基因(例如，采用组成型表达的管家基因)的表达进行比较，校正绝对表达水平，将表达水平归一化。适用于归一化的基因包括管家基因(如肌动蛋白基因)或上皮细胞特异性基因。这种归一化允许将一个样本(例如，受试者样本)的表达水平与另一个样本(例如，正常样本)的表达水平或将不同来源的两个样本进行比较。
[0801]
通过对表达多肽进行检测或定量，也可对表1中所列的一种或多种生物标志物所对应的蛋白的水平或活性进行检测和/或定量。可通过本领域技术人员熟知的任何方式，对多肽进行检测和定量。其中可包括分析生化方法(如电泳、毛细管电泳、高效液相色谱法(hplc)、薄层色谱法(tlc)、超扩散色谱法等)或各种免疫学方法(如液体或凝胶沉淀素反应、免疫扩散(单向或双向)、免疫电泳、放射免疫检(ria)、酶联免疫吸附检测(elisa)、免疫荧光检测、western印迹法等)。本领域技术人员可轻松适应用于确定细胞是否表达目标生物标志物的已知蛋白/抗体检测方法。
[0802]
本发明进一步提供了表1中所列的一种或多种生物标志物或其片段的可溶、纯化和/或分离多肽形式。此外，应理解，本文所述多肽的任何及所有属性(如一致性百分比、多肽长度、多肽片段、生物活性、抗体等)可以任何顺序结合，或与表1中所列的一种或多种生
物标志物结合。
[0803]
一方面，多肽可包含一个对应于表1中所列的一种或多种生物标志物的全长氨基酸序列或存在1至约20个保守氨基酸取代的全长氨基酸序列。本文所述的氨基酸序列也可与表1中所列的一种或多种生物标志物的全长序列(如本文所述，且在本领域中十分常见)或其片段至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同。另一方面，本发明考虑了一种合成物，所述合成物包含对应于表1所列的一种或多种生物标志物多肽的分离多肽以及少于25％、15％或5％的污染生物大分子或多肽。
[0804]
本发明进一步提供了与产生、检测或表征此类多肽或其他片段有关的合成物，如核酸、载体、宿主细胞等。此类合成物可作为化合物，调节(例如，增强)表1所列的一种或多种生物标志物的表达和/或活性。
[0805]
对应于表1所列的一种或多种生物标志物的分离多肽或其片段(或编码此类多肽的核酸)可用作免疫原，以根据本领域常见的方法，采用标准多克隆和单克隆抗体制备技术，产生与所述免疫原结合的抗体。抗原肽包含至少8个氨基酸残基，其相应全长分子中存在一个表位，因此使对肽产生的抗体与相应全长分子形成特异性免疫复合物。优选地，抗原肽包含至少10个氨基酸残基。在一个实施例中，此类表位可能对源自一个物种(如小鼠或人类)的特定多肽分子具有特异性(即，将跨越多肽分子(物种中的非保守分子)一个区域的抗原肽用作免疫原；可通过比对(如本文所述的比对)确定此类非保守残基)。
[0806]
在一个实施例中，抗体(特别是细胞内抗体)与表1所列的一种或多种生物标志物进行基本特异性结合，并增强其生物功能。在另一个实施例中，抗体(特别是细胞内抗体)与表1所列的一种或多种生物标志物的结合伴侣进行基本特异性结合，并增强其生物功能。
[0807]
可根据本领域常见的方法产生根据本发明使用的抗体。例如，通过使用免疫原使受试者(例如，家兔、山羊、小鼠或其他哺乳动物)免疫，通常将多肽免疫原用于制备抗体。适当的免疫原性制剂可包含对其产生免疫应答的重组表达或化学合成分子或其片段。所述制剂可进一步包括佐剂，如弗氏完全或不完全佐剂或类似的免疫刺激药剂。使用免疫原性制剂使适当的受试者免疫，会诱导对其中的抗原肽产生多克隆抗体应答。
[0808]
使用多肽免疫原使适当的受试者免疫，即可制备多克隆抗体。在一段时间内，可采用标准技术(如使用固定化多肽的酶联免疫吸附检测(elisa))监测免疫受试者的多克隆抗体滴度。如需要，可从哺乳动物(例如，从血液中)中分离靶向抗原的抗体，并采用常见的技术(蛋白a色谱法)进行纯化，以获得igg组分。在实现免疫后的适当时间，例如，当抗体滴度最高时，可从受试者中获取抗体产生细胞，并采用以下标准技术，将其用于制备单克隆抗体：杂交瘤技术(原始说明见kohler和milstein(1975年)，《自然》，256:495-497)(另见brown等人(1981年)，《免疫学杂志》，127:539-46；brown等人(1980年)，《生物化学杂志》，255:4980-83；yeh等人(1976年)，《美国国家科学院院刊》，76:2927-31；yeh等人(1982年)，《国际癌症杂志》，29:269-75)、近期的人b细胞杂交瘤技术(kozbor等人(1983年)，《今日免疫学》，4:72)、ebv杂交瘤技术(cole等人(1985年)，《单克隆抗体与癌症疗法》，alan r.liss公司，第77-96页)或三源杂交瘤技术。单克隆抗体杂交瘤细胞的生产技术众所周知(通常见kenneth,r.h.，《单克隆抗体：生物分析的新维度》，普莱南出版公司(纽约州纽约)(1980年)；lerner,e.a.(1981年)，《耶鲁生物学和医学杂志》，54:387-402；gefter,m.l.等人
(1977年)，《体细胞遗传学》，3:231-36)。简而言之，将永生化细胞系(通常为骨髓瘤细胞系)融合到使用免疫原进行免疫的哺乳动物淋巴细胞(通常为脾细胞)(如上所述)，对获得的杂交瘤细胞培养上清液进行筛选，以识别产生单克隆抗体(与多肽抗原(优选特异性))结合的杂交瘤细胞。
[0809]
用于融合淋巴细胞和永生化细胞系的任何一种常见的方案均可用于针对表1中所列的一种或多种生物标志物或其片段产生单克隆抗体(见galfre,g.等人(1977年)，《自然》，266:55052；gefter等人(1977年)，见上文；lerner(1981年)，见上文；kenneth(1980年)，见上文)。此外，普通技术人员理解，此类方法有多种变体，它们也很有用。永生化细胞系(例如，骨髓瘤细胞系)通常源自与淋巴细胞相同的哺乳动物物种。例如，将使用本发明所含免疫原性制剂进行免疫的小鼠淋巴细胞与永生化小鼠细胞系融合，可产生小鼠杂交瘤细胞。优选永生化细胞系为小鼠骨髓瘤细胞系，此细胞系对包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培养基(“hat培养基”)很敏感。根据标准技术，任何骨髓瘤细胞系均可用作融合伴侣，例如，p3-ns1/1-ag4-1、p3-x63-ag8.653或sp2/o-ag14骨髓瘤细胞系。可从美国模式培养物保藏所(atcc)(马里兰州罗克维尔)获取此类骨髓瘤细胞系。使用聚乙二醇(peg)，将hat敏感型小鼠骨髓瘤细胞系融合到小鼠脾细胞。然后，使用hat培养基选择通过融合获得的杂交瘤细胞，这会杀死未融合和非生产性融合的骨髓瘤细胞(几天后，由于未转化，未融合的脾细胞死亡)。通过标准elisa检测对杂交瘤细胞培养上清液进行抗体(结合给定多肽)筛选，从而检测产生本发明所含单克隆抗体的杂交瘤细胞。
[0810]
作为单克隆抗体分泌杂交瘤细胞的替代制备方法，可在重组组合免疫球蛋白库(例如，抗体噬菌体展示库)中筛选适当的多肽，从而分离结合多肽的免疫球蛋白库成员，确定并分离上述一种多肽的特异性单克隆抗体。用于产生和筛选噬菌体展示库的试剂盒已市售(例如，pharmacia重组噬菌体抗体系统，货号：27-9400-01；stratagene surfzap
tm
噬菌体展示试剂盒，货号：240612)。此外，特别适用于产生和筛选抗体展示库的方法和试剂示例可见：ladner等人，第5,223,409号美国专利；kang等人第wo 92/18619号国际出版物；dower等人，第wo 91/17271号国际出版物；winter等人，第wo 92/20791号国际出版物；markland等人，第wo 92/15679号国际出版物；breitling等人，第wo 93/01288号国际出版物；mccafferty等人，第wo 92/01047号国际出版物；garrard等人，第wo 92/09690号国际出版物；ladner等人，第wo 90/02809号国际出版物；fuchs等人(1991年)，《生物技术》(ny)，9:1369-1372；hay等人(1992年)，《人抗体和杂交瘤细胞》，3:81-85；huse等人(1989年)，《科学》，246:1275-1281；griffiths等人(1993年)，《embo杂志》，12:725-734；hawkins等人(1992年)，《分子生物学杂志》226:889-896；clarkson等人(1991年)，《自然》，352:624-628；gram等人(1992年)，《美国国家科学院院刊》，89:3576-3580；garrard等人(1991年)，《生物技术》(ny)，9:1373-1377；hoogenboom等人(1991年)，《核酸研究》，19:4133-4137；barbas等人(1991年)，《美国国家科学院院刊》，88:7978-7982；以及mccafferty等人(1990年)，《自然》，348:552-554。
[0811]
众所周知，抗体重链和轻链cdr3结构域在抗体对抗原的结合特异性/亲和性方面发挥着特别重要的作用，因此，本发明所含的重组单克隆抗体(制备如上所述)优选包含目标抗体可变区的重链和轻链cdr3。抗体可进一步包含本发明所含可变区的cdr2。抗体可进一步包含本发明所含可变区的cdr1。在其他实施例中，抗体可包含任何cdr组合。
[0812]
上述经工程化改造抗体的cdr1、2和/或3区可包含精确氨基酸序列，作为本发明所含可变区的氨基酸序列。但是，本领域的普通技人员理解，在保留抗体有效结合目标靶点(如表1中所列的一种或多种生物标志物和/或一种或多种天然结合伴侣)能力的同时，可能较精确cdr序列存在某些偏差(例如，保守序列修饰)。因此，在其他实施例中，经工程化改造的抗体可由与本发明所含的一个或多个cdr 50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的一个或多个cdr组成。
[0813]
例如，非人抗体或人抗体(例如，大鼠抗小鼠/抗人抗体)的结构特征可用于产生结构相关的人抗体，特别是细胞内抗体，此类抗体至少保留了本发明所含抗体的一个功能特性，如与表1中所列的一种或多种生物标志物、与表1中所列的一种或多种生物标志物的结合伴侣/底物和/或免疫检查点结合。另一个功能特性包括在竞争elisa检测中抑制最初已知的非人抗体或人抗体的结合。
[0814]
本领域技术人员会注意到，此类同源性百分比与将1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多保守氨基酸取代引入给定cdr内等效，或通过此操作实现。
[0815]
本发明所含的单克隆抗体可包含一个重链，其中，可变结构域包含至少一个cdr(从包括本文所述的重链可变结构域cdr的一组中选择其序列)；以及一个轻链，其中，可变结构域包含至少一个cdr(从包括本文所述轻链可变结构域cdr的一组中选择其序列)。
[0816]
此类单克隆抗体可包含一个轻链，其中，可变结构域包含至少一个cdr(从包括本文所述的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3的一组中选择其序列)；和/或一个重链，其中，可变结构域包含至少一个cdr(从包括本文所述的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3的一组中选择其序列)。在一些实施例中，能够结合表1中所列的一种或多种生物标志物的单克隆抗体包含本文所述的cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3、cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3。
[0817]
本发明所含单克隆抗体的重链可变结构域可包含本文所述的vh氨基酸序列，和/或本发明所含单克隆抗体的轻链可变结构域可包含本文所述的vκ氨基酸序列。
[0818]
本发明进一步提供了所述单克隆抗体的片段(包括但不限于fv、fab、f(ab')2、fab'、dsfv、scfv、sc(fv)2和双体)以及由抗体片段形成的多特异性抗体。例如，pd-l1、pd-1、ctla-4等许多免疫抑制分子均可双特异性或多特异性结合。
[0819]
本文还考虑了本发明所含单克隆抗体的其他片段。例如，本文提供了单独的免疫球蛋白重链和/或轻链，其中，其可变结构域包含至少一个本文所述的cdr。在一个实施例中，免疫球蛋白重链包含至少一个cdr，其序列与本文所述的重链或轻链可变结构域cdr组至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％相同。在另一个实施例中，免疫球蛋白轻链包含至少一个cdr，其序列与本文所述的轻链或重链可变结构域cdr组至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％相同。
[0820]
在一些实施例中，免疫球蛋白重链和/或轻链包含一个可变结构域，其中至少包含本文所述的cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3、cdr-h1、cdr-h2或cdr-h3中的一个。此类免疫球蛋白重链可至少包含cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3中的一个。此类免疫球蛋白轻链可至少包含cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3中的一个。
[0821]
在其他实施例中，本发明所述的免疫球蛋白重链和/或轻链分别包含一个本文所述的vh或vκ可变结构域序列。
[0822]
本发明进一步提供了多肽，从包括以下几项的一组中选择其序列：vh可变结构域、vκ可变结构域、cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3、cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3(如本文所述)。
[0823]
本发明所含的抗体、免疫球蛋白和多肽可以分离(例如，纯化)的形式使用或包含在载体中，如膜囊泡或脂囊泡(例如，脂质体)。
[0824]
还考虑了本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改善抗体的结合亲和性和/或其他生物特性。众所周知，如果仅将源自非人类动物的抗体vh和vl中的cdr简单移植到人抗体vh和vl的fr中，从而产生人源化抗体，与源自非人类动物的原始抗体相比，抗原结合活性降低。人们认为，非人抗体vh和vl的几个氨基酸残基(不仅是在cdr中，而且也在fr中)直接或间接与抗原结合活性有关。因此，用源自人抗体vh和vl的fr的不同氨基酸残基取代这些氨基酸残基，将降低结合活性，可用源自非人类动物原始抗体的氨基酸残基代替上述氨基酸，从而进行校正。
[0825]
可对本发明所含的抗体结构进行修饰和改变，在为其编码的dna序列中，仍获得一种功能性分子，此类分子编码具有理想特性的抗体和多肽。例如，在活性无明显损失的情况下，可用蛋白结构中的其他氨基酸取代某些氨基酸。蛋白的相互作用能力和性质决定了蛋白的生物功能活性，可在蛋白序列及其dna编码序列中进行某些氨基酸取代，同时获得具有类似特性的蛋白。因此，在生物活性无明显损失的情况下，预计可在本发明所含的抗体序列或编码所述多肽的相应dna序列中进行各种改变。
[0826]
改变多肽的氨基酸序列时，可考虑氨基酸的亲水指数。在本领域，人们很清楚亲水氨基酸指数在赋予蛋白相互作用生物功能方面的重要性。人们认为，氨基酸的相对亲水特性有助于合成蛋白的二级结构，反过来决定了蛋白与其他分子(例如，酶、底物、受体、dna、抗体、抗原等)的相互作用。根据疏水性和电荷特性，为每个氨基酸分配了亲水指数，具体如下：异亮氨酸( 4.5)；缬氨酸( 4.2)；亮氨酸( 3.8)；苯丙氨酸( 2.8)；半胱氨酸/胱氨酸( 2.5)；蛋氨酸( 1.9)；丙氨酸( 1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(《rti 3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。
[0827]
在本领域，众所周知，可用其他氨基酸(具有类似亲水指数或分数且仍产生具有类似生物活性的蛋白，即，获得生物功能等效蛋白)取代某些氨基酸。
[0828]
因此，如上所述，氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，其疏水性、亲水性、电荷、大小等。本领域的技术人员均熟知考虑上述各种特性的示例性取代基，其中包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
[0829]
本文所含抗体的另一种氨基酸修饰可用于改变抗体的原始糖基化模式，以增加稳定性。所谓的“改变”系指删除在抗体中发现的一个或多个碳水化合物部分，和/或添加抗体中不存在的一个或多个糖基化位点。抗体糖基化通常为“n连接”型。“n连接”系指将碳水化合物部分连接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-x-丝氨酸和天冬酰胺-x-苏氨酸(其中，x为除脯氨酸之外的任何氨基酸)为识别序列，可将碳水化合物部分酶接到天冬酰胺侧链。因此，如果多肽中包含上述一个三肽序列，则会产生潜在糖基化位点。改变氨基酸序列，使其包含一个或多个上述三肽序列(用于n连接糖基化位点)，可很方便地向抗体添加糖基化位点。另一种共价修饰包括以化学或酶促的方式将糖苷与抗体偶联。此类程序所具有
的优势在于：它们无需在具有糖基化能力的宿主细胞中产生抗体，即可实现n连接或o连接糖基化。根据所使用的偶联模式，糖可附着在(a)精氨酸和组氨酸；(b)游离羧基；(c)游离巯基(如半胱氨酸的游离巯基)；(d)游离羟基(如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的游离羟基)；(e)芳香族残基(如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳香族残基)；或(f)谷氨酰胺的酰胺基上。例如，wo87/05330对此类方法进行了说明。
[0830]
同样，可以化学或酶促的方式删除抗体上存在的任何碳水化合物部分。化学去糖基化需要使抗体接触复合三氟甲磺酸或等效化合物。这种处理会切割大多数或所有糖(连接糖(n-乙酰氨基葡萄糖或n-乙酰半乳糖胺)除外)，同时保持抗体完好无损。sojahr等人(1987年)和edge等人(1981年)对化学去糖基化进行了说明。如thotakura等人(1987年)所述，可使用各种内切糖苷酶和外切糖苷酶对抗体上的碳水化合物部分进行酶切。
[0831]
其他修饰可包括形成免疫偶联物。例如，在一种共价修饰中，抗体或蛋白以第4,640,835号、第4,496,689号、第4,301,144号、第4,670,417号、第4,791,192号或第4,179,337号美国专利所述的方式共价连接至一个非蛋白聚合物，例如，聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。
[0832]
可使用各种双功能蛋白偶联剂，将本发明所含的抗体或其他蛋白与异源剂偶联，包括但不限于：n-琥珀酰亚胺(2-吡啶基二硫基)-丙酸酯(spdp)、琥珀酰亚胺(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯、亚氨基硫烷(it)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如二亚胺代己二酸二甲酯二盐酸盐)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，碳标记的1-异硫氰酸苄基甲基二亚乙基三胺五乙酸(mx-dtpa)是一种将放射性核苷酸与抗体偶联的示例性螯合剂(wo 94/11026)。
[0833]
另一方面，本发明的特征在于抗体与治疗部分(如细胞毒素、药物和/或放射性同位素)偶联。当与细胞毒素偶联时，将这些抗体偶联物称为“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害(杀死)的任何药剂。示例包括紫杉醇、细胞松弛素b、短杆菌肽d、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替诺泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素d、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。治疗剂包括但不限于抗代谢药(如甲氨蝶呤、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)、烷化剂(如氮芥、噻替哌苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(bsnu)和洛莫司汀(ccnu)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素c和顺式二氯二氨基铂(ii)(ddp)顺铂)、蒽环类(如柔红霉素(原名道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(如更生霉素(原名放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(amc))以及抗有丝分裂剂(如长春新碱和长春碱)。本发明所含的抗体可与放射性同位素(例如，放射性碘)偶联，以产生治疗相关障碍(如癌症)的细胞毒性放射性药物。
[0834]
偶联抗体可以诊断或预后的方式用于监测组织内的多肽水平，以作为临床检测程序的一部分，例如，用于确定给定治疗方案的疗效。将抗体与可检测物质偶联(即物理连接)，可便于进行检测。可检测物质的示例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质和放射性物质。适当的酶示例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、p-半乳糖苷酶或乙酰
胆碱酯酶；适当的辅基复合物示例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；适当的荧光物质示例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素(fitc)、罗丹明、二氯三嗪基氨基荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白(pe)；发光物质示例包括鲁米诺；生物发光物质示例包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白；以及适当的放射性物质示例包括
125
i、
131
i、
35
s或3h。[0134]在本文中，就抗体而言，“标记”旨在包括通过将可检测物质(如异硫氰酸荧光素(fitc)、藻红蛋白(pe)或(cy5))与抗体偶联(即物理连接)直接标记抗体以及通过与可检测物质反应间接标记抗体。
[0835]
本发明所含的抗体偶联物可用于修饰给定生物反应。治疗部分不限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所需生物活性的蛋白或多肽。此类蛋白可包括酶活性毒素或其活性片段，如相思豆毒素、蓖麻毒素a、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白，如肿瘤坏死因子或干扰素γ；或生物反应修饰剂，如淋巴因子、白细胞介素-1(“il-1”)、白细胞介素-2(“il-2”)、白细胞介素-6(“il-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“gm-csf”)、粒细胞集落刺激因子(“g-csf”)或其他细胞因子或生长因子。
[0836]
将此类治疗部分与抗体偶联的技术众所周知，见arnon等人，“癌症疗法中药物的免疫靶向单克隆抗体”，《单克隆抗体与癌症疗法》，reisfeld等人(编辑)，第243 56页(alan r.liss公司，1985年)；hellstrom等人，“药物递送抗体”，《受控药物递送》第2版，robinson等人(编辑)，第623 53页(马塞尔
·
德克尔公司，1987年)；thorpe，“癌症疗法中细胞毒性剂的抗体载体：综述”，《单克隆抗体》'84：生物及临床应用，pinchera等人(编辑)，第475 506页(1985年)；“放射性标记抗体在癌症疗法中的治疗应用分析、结果和未来展望”，《癌症检测和治疗用单克隆抗体》，baldwin等人(编辑)，第303 16页(学术出版社，1985年)，以及thorpe等人，“抗体毒素偶联物的制备及细胞毒性特性”，《免疫学评论》，62:119 58(1982年)。
[0837]
在一些实施例中，可采用“可裂解连接肽”(在细胞中促进释放细胞毒性剂或生长抑制剂)进行偶联。例如，可使用酸不稳定连接肽、肽酶敏感连接肽、光不稳定连接肽、二甲基连接肽或含二硫键的连接肽(见第5,208,020号美国专利)。或者，通过重组技术或肽合成，可产生包含抗体和细胞毒性剂或生长抑制剂的融合蛋白。dna长度将包含编码偶联物两个部分的相应区域，这两个部分相邻，或通过编码连接肽中的一个区域进行隔离，但不会破坏偶联物的所需特性。
[0838]
此外，重组多肽抗体(如嵌合和人源化单克隆抗体)在本发明所含的范围内，包含人类部分和非人类部分，可采用标准重组dna技术生产。可采用本领域已知的重组dna技术生产此类嵌合和人源化单克隆抗体，例如，使用以下参考文献中所述的方法：robinson等人，国际专利出版物pct/us86/02269；akira等人，欧洲专利申请184,187；taniguchi,m.，欧洲专利申请171,496；morrison等人，欧洲专利申请173,494；neuberger等人，pct申请wo86/01533；cabilly等人，第4,816,567号美国专利；cabilly等人，欧洲专利申请125,023；better等人(1988年)，《科学》，240:1041-1043；liu等人(1987年)，《美国国家科学院院刊》，84:3439-3443；liu等人(1987年)，《免疫学杂志》，139:3521-3526；sun等人(1987年)，《美国国家科学院院刊》，84:214-218；nishimura等人(1987年)，《癌症研究》，47:999-1005；wood等人(1985年)，《自然》，314:446-449；shaw等人(1988年)，《美国国立癌症研究所杂志》，80:1553-1559)；morrison,s.l.(1985年)，《科学》，229:1202-1207；oi等人(1986年)，《生物技术》，4:214；winter，第5,225,539号美国专利；jones等人(1986年)，《自然》，321:552-525；
verhoeyan等人(1988年)，《科学》，239:1534；以及beidler等人(1988年)，《免疫学杂志》，141:4053-4060。
[0839]
此外，可根据标准方案(如第5,565,332号美国专利中公开的标准方案)生产人源化抗体。在另一个实施例中，可使用本领域的已知技术(如第5,565,332号、第5,871,907号或第5,733,743号美国专利所述的技术)，将包含核酸分子(其编码特异性结合对成员的多肽链与可复制基因展示包组分的融合物)的载体与包含编码单一结合对成员第二多肽链的核酸分子的载体重组，产生抗体链或特异性结合对成员。胞内抗体抑制细胞中蛋白功能的应用在本领域也众所周知(见carlson,j.r.(1988年)，《分子与细胞生物学》，8:2638-2646；biocca,s.等人(1990年)，《embo杂志》，9:101-108；werge,t.m.等人(1990年)，《欧洲生化学会联合会快报》，274:193-198；carlson,j.r.(1993年)，《美国国家科学院院刊》，90:7427-7428；marasco,w.a.等人(1993年)，《美国国家科学院院刊》，90:7889-7893；biocca,s.等人(1994年)，《生物技术》(ny)，12:396-399；chen,s-y.等人(1994年)，《人类基因疗法》，5:595-601；duan,l等人(1994年)，《美国国家科学院院刊》，91:5075-5079；chen,s-y.等人(1994年)，《美国国家科学院院刊》，91:5932-5936；beerli,r.r.等人(1994年)，《生物化学杂志》，269:23931-23936；beerli,r.r.等人(1994年)，《生物化学和生物物理研究通讯》，204:666-672；mhashilkar,a.m.等人(1995年)，《embo杂志》，14:1542-1551；richardson,j.h.等人(1995年)，《美国国家科学院院刊》，92:3137-3141；marasco等人，第wo 94/02610号pct出版物；以及duan等人，第wo 95/03832号pct出版物)。
[0840]
此外，还可产生靶向表1中所列的一种或多种生物标志物或其片段的全人抗体。例如，根据hogan等人，“操纵小鼠胚胎：实验室手册”，冷泉港实验室，可在人免疫球蛋白基因的转基因小鼠中产生全人抗体。简而言之，使用纯化免疫原使转基因小鼠免疫。收获脾细胞，并将其融合到骨髓瘤细胞，产生杂交瘤细胞。根据产生抗体(与免疫原结合)的能力选择杂交瘤细胞。全人抗体将降低此类抗体在人体内的免疫原性。
[0841]
在一个实施例中，用于本发明的抗体为双特异性抗体。双特异性抗体包含单抗体多肽内两个不同抗原的结合位点。可同时或按顺序进行抗原结合。可分泌双特异性抗体的两个细胞系示例包括三源杂交瘤细胞和杂交-杂交瘤细胞。第4,474,893号美国专利公开了杂交-杂交瘤细胞或三源杂交瘤细胞所产生的双特异性抗体示例。通过化学方法(staerz等人(1985年)，《自然》，314:628以及perez等人(1985年)，《自然》，316:354)以及杂交瘤技术(staerz和bevan(1986年)，《美国国家科学院院刊》，83:1453以及staerz和bevan(1986年)，《今日免疫学》，7:241)产生双特异性抗体。第5,959,084号美国专利也对双特异性抗体进行了说明。第5,798,229号美国专利对双特异性抗体的片段进行了说明。
[0842]
融合杂交瘤细胞或产生不同抗体的其他细胞，然后识别产生并共同组装两种抗体的克隆体，从而产生异源杂交瘤细胞，也可产生双特异性药剂。通过完整的免疫球蛋白链或其部分(如fab和fv序列)的化学或基因偶联，也可产生双特异性药剂。抗体组分可与本发明所含的一种或多种生物标志物(包括表1中所列的一种或多种生物标志物或其片段)的多肽或其片段结合。在一个实施例中，双特异性抗体可与多肽或其片段以及其天然结合伴侣或其片段特异性结合。
[0843]
在本发明所含的另一个方面，肽或类肽可用于抑制本发明所含的一种或多种生物标志物(包括表1中所列的一种或多种生物标志物或其片段)的活性。在一个实施例中，针对
激动活性筛选突变体(例如截断突变体)组合库，即可识别作为相应全长蛋白调节剂的表1中所列一种或多种生物标志物的变体。在一个实施例中，多样化变体库由核酸水平的组合诱变产生，并由多样化基因库编码。可使用上述方法产生并筛选多样化变体库。本文还对肽和类肽的产生进行了说明。
[0844]
本发明还包括小分子，这些小分子可调节(例如，增强)表1中所列的一种或多种生物标志物与其天然结合伴侣之间的相互作用。可使用本领域已知组合库方法中的任何一种方法，获得本发明所含的小分子，包括：空间可寻址平行固相或液相库：需要去卷积的合成库方法；“珠一化合物”库方法；以及利用亲和色谱选择的合成库方法。(lam,k.s.(1997年)，《抗癌药物设计》，12:145)。
[0845]
在本领域中，可发现分子库的合成方法示例，例如，见：dewitt等人(1993年)，《美国国家科学院院刊》，90:6909；erb等人(1994年)，《美国国家科学院院刊》，91:11422；zuckermann等人(1994年)，《医药化学杂志》，37:2678；cho等人(1993年)，《科学》，261:1303；carrell等人(1994年)，《德国应用化学(英文版)》，33:2059；carell等人(1994年)，《德国应用化学(英文版)》，33:2061；gallop等人(1994年)，《医药化学杂志》，37:1233。
[0846]
可在溶液中(例如，houghten(1992年)，《生物技术》，13:412-421)或珠(lam(1991年)，《自然》，354:82-84)、芯片(fodor(1993年)，《自然》，364:555-556)、细菌(ladner usp 5,223,409)、孢子(ladner usp
‘
409)、质粒(cull等人(1992年)，《美国国家科学院院刊》，89:1865-1869)或噬菌体(scott和smith(1990年)，《科学》，249:386-390；devlin(1990年)，《科学》，249:404-406；cwirla等人(1990年)，《美国国家科学院院刊》，87:6378-6382；felici(1991年)，《分子生物学杂志》，222:301-310；ladner，见上文)上提供化合物库。可在基于细胞或非细胞的检测中筛选化合物。可在池中(例如，每个试样中包含多种化合物)或作为单独化合物筛选化合物。
[0847]
本发明还涉及本发明所含的生物标志物(包括表1中所列的一种或多种生物标志物或其片段)的嵌合蛋白或融合蛋白。在本文中，“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含本发明所含的一种或多种生物标志物(包括表1中所列的一种或多种生物标志物或其片段)，它们可连接至另一个多肽，此多肽的氨基酸序列对应于与相应生物标志物不基本同源的蛋白。在一个优选实施例中，融合蛋白包含本发明所含的一种或多种生物标志物(包括表1中所列的一种或多种生物标志物或其片段)的至少一个生物活性部分。在融合蛋白内，术语“可连接”旨在表明，生物标志物序列和非生物标志物序列在框内相互融合，保留了在独立于融合无表达时具备的功能。“另一个”序列可分别融合到生物标志物序列的n端或c端。
[0848]
通过编码第一肽的核苷酸序列以及编码第二肽的核苷酸序列的重组表达，可产生此类融合蛋白。第二肽可选对应于改变第一肽溶解度、亲和性、稳定性或化合价的一个部分，例如，免疫球蛋白恒定区。在另一个优选实施例中，第一肽包含生物活性分子的一个部分(例如，多肽的细胞外部分或配体结合部分)。第二肽可包含一个免疫球蛋白恒定区，例如，人cγ1结构域或cγ4结构域(例如，人igcγ1或人igcγ4的铰链区、ch2区和ch3区，见capon等人，第5,116,964号、第5,580,756号和第5,844,095号美国专利等，所述专利通过本发明的引用，成为本发明的一部分)。此类恒定区可保留介导效应子功能(例如，fc受体结合)或可进行更改以减少效应子功能的区域。与独立表达的第一肽相比，获得的融合蛋白在溶解度、结合亲和性、稳定性和/或化合价(即，每个多肽的可用结合位点数)方面均发生改
变，并且蛋白纯化效率提高。从包含蛋白或肽的细胞和培养基混合物中，可分泌并分离通过重组技术生产的融合蛋白和肽。或者，可以细胞质的形式保留蛋白或肽，收获、裂解细胞，并分离蛋白。细胞培养物通常包含宿主细胞、培养基及其他副产物。适当的细胞培养基在本领域中十分常见。采用本领域已知的蛋白和肽纯化技术，可从细胞培养基和/或宿主细胞中分离蛋白和肽。宿主细胞转染及蛋白和肽纯化技术在本领域中十分常见。
[0849]
优选地，采用标准重组dna技术，生产本发明所含的融合蛋白。例如，根据常规技术，编码不同多肽序列的dna片段在框内连接在一起，例如，使用钝端或交错端进行连接、限制性酶消化以提供适当的末端、粘性末端补平(视情况而定)、碱性磷酸酶处理以免不良连接以及酶连接。在另一个实施例中，可采用dna自动合成仪等常规技术，合成融合基因。或者，可使用锚定引物对基因片段进行pcr扩增，此类引物会导致两个连续基因片段之间出现互补突出末端，随后可退火并再次扩增，产生嵌合基因序列(见《现代分子生物学实验指南》，ausubel等人(编辑)，约翰
·
威利父子出版公司：1992年)。
[0850]
在另一个实施例中，融合蛋白的n端包含一个异源信号序列。在某些宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)中，使用异源信号序列，可增加多肽的表达和/或分泌。
[0851]
本发明所含的融合蛋白可用作免疫原，以在受试者体内产生抗体。此类抗体可用于纯化产生融合蛋白的相应天然多肽，或在筛选检测中用于识别抑制一种或多种生物标志物多肽或其片段与其天然结合伴侣或其片段之间相互作用的多肽。
[0852]
本文所述的调节剂(例如，核酸、肽、抗体、小分子或融合蛋白)可包含在药物合成物中，并向受试者体内施用。合成物可包含一个此类分子或药剂或本文所述药剂的任何组合。根据本文提供的方法和合成物，本文所述的“单一活性剂”可与本领域已知的其他药物活性化合物(“第二活性剂”)结合。人们认为，某些组合将协同处理受益于免疫应答调节的各种条件。第二活性剂可以是大分子(例如，蛋白)或小分子(例如，合成无机、有机金属或有机分子)。
[0853]
可根据本文所述的方法和本领域技术人员已知的技术，分析生物标志物核酸和/或生物标志物多肽，以确定适用于本发明的此类基因或表达变化，包括但不限于：1)生物标志物转录物或多肽的水平变化；2)生物标志物基因中缺失或添加一个或多个核苷酸；3)取代生物标志物基因的一个或多个核苷酸；4)生物标志物基因异常修饰，如表达调控区等。
[0854]
1.拷贝数检测方法
[0855]
本领域技术人员熟知生物标志物核酸拷贝数的评估方法。只需确定本文所识别的区域或标志物的拷贝数，即可评估是否存在染色体得失情况。
[0856]
在一个实施例中，对生物样本进行检测，确定包含基因组标志物的基因组位点中是否存在拷贝数变化。
[0857]
生物标志物位点拷贝数的评估方法包括但不限于杂交检测。杂交检测包括但不限于传统的“直接探针”方法(如southern印迹法)、原位杂交(例如，fish和fish加上sky)方法以及“比较探针”方法，如比较基因组杂交(cgh)(例如，基于cdna或寡核苷酸的cgh)。可以各种格式使用所述方法，包括但不限于底物(例如，膜或玻璃)结合方法或基于阵列的方法。
[0858]
在一个实施例中，样本中生物标志物基因拷贝数的评估涉及southern印迹法。在southern印迹法中，基因组dna(通常在电泳凝胶上被分割和分离)与靶区特异性探针杂交。将靶区探针中的杂交信号强度与正常基因组dna(例如，相同或相关细胞、组织、器官等的非
扩增部分)分析中的对照探针信号强度进行比较，提供靶核酸的相对拷贝数估计值。或者，northern印迹法可用于评估样本中编码核酸的拷贝数。在northern印迹法中，mrna与靶区特异性探针杂交。将靶区探针中的杂交信号强度与正常rna(例如，相同或相关细胞、组织、器官等的非扩增部分)分析中的对照探针信号强度进行比较，提供靶核酸的相对拷贝数估计值。或者，可使用本领域常见的其他方法来检测rna，使相对于适当对照品(例如，相同或相关细胞、组织、器官等的非扩增部分)的较高或较低表达提供靶核酸的相对拷贝数估计值。
[0859]
一种基因组拷贝数的替代确定方法为原位杂交(例如，angerer(1987年)，《酶学方法》，152:649)。原位杂交通常包括以下步骤：(1)固定待分析的组织或生物结构；(2)对生物结构进行预杂交处理，以增加靶dna的可及性，并减少非特异性结合；(3)使核酸混合物与生物结构或组织中的核酸杂交；(4)进行杂交后洗涤，去除在杂交中未结合的核酸片段；以及(5)检测杂交的核酸片段。根据特定应用，上述每个步骤所使用的试剂以及使用条件因有所不同。在典型的原位杂交检测中，将细胞固定在固体支持体(通常为载玻片)上。如果使用探针对核酸进行检测，则通常通过加热或加碱，使细胞变形。然后，在适当温度下，使细胞接触杂交溶液，从而使对编码蛋白的核酸序列具有特异性的标记探针退火。然后，通常在预定的严格条件下或在更加严格的条件下对靶点(例如，细胞)进行洗涤，直至获得适当的信噪比。通常使用放射性同位素或荧光报告基因标记探针。在一个实施例中，探针足够长，可在严格条件下与靶核酸进行特异性杂交。探针的长度范围通常为约200个碱基至约1000个碱基。在一些应用中，需要阻断重复序列的杂交能力。因此，在一些实施例中，trna、人基因组dna或cot-i dna用于阻断非特异性杂交。
[0860]
一种基因组拷贝数的替代确定方法为比较基因组杂交。一般而言，从正常的参考细胞以及受试细胞(例如，肿瘤细胞)中分离基因组dna，必要时，进行扩增。采用不同的方式标记两个核酸，然后使其与参考细胞的中期染色体进行原位杂交。去除参考dna和受试dna中的重复序列，或通过某些方法降低其杂交能力，例如，通过与适当的阻断核酸进行预杂交和/或在所述杂交中包括所述重复序列的此类阻断核酸序列。必要时，以可视的形式呈现结合标记dna序列。检测两个dna的信号比发生改变的区域，即可确定受试细胞中拷贝数增加或减少的染色体区。例如，与基因组的其他区域相比，受试细胞中拷贝数减少的这些区域的受试dna信号相对低于参考dna信号。受试细胞中拷贝数增加的区域的受试dna信号相对较高。如果存在染色体缺失或倍增情况，则检查两个标记中的信号比差异，所述比值可用于衡量拷贝数。在cgh、阵列cgh(acgh)的另一个实施例中，用一组阵列上的固体支持体结合靶核酸代替固定化染色体元件，从而在这组固体支持体结合靶点中表示基因组的较大或完整百分比。靶核酸可包含cdna、基因组dna、寡核苷酸(例如，用于检测单核苷酸多态性)等。也可通过单色标记(而不是使用两种不同的染料标记对照品和可能的肿瘤样本，并在杂交前混合它们，由于阵列上的竞争性探针杂交，将提供一个比值)进行基于阵列的cgh。在单色cgh中，标记对照品，使其与一个阵列杂交，并读取绝对信号；标记可能的肿瘤样本，使其与第二阵列(内容物相同)杂交，并读取绝对信号。根据两个阵列的绝对信号，计算拷贝数差异。制备固定化染色体或阵列并进行比较基因组杂交的方法在本领域中十分常见(见第6,335,167号、第6,197,501号、第5,830,645号和第5,665,549号美国专利以及albertson(1984年)，《embo杂志》，3:1227-1234；pinkel(1988年)，《美国国家科学院院刊》，85:9138-9142；
第430,402号epo出版物；《分子生物学方法》第33卷：原位杂交方案，choo(编辑)，胡玛纳出版社，totowa,n.j.(1994年)等)。在另一个实施例中，使用以下参考文献中的杂交方案：pinkel等人(1998年)，《自然遗传学》，20:207-211或kallioniemi(1992年)，《美国国家科学院院刊》，89:5321-5325(1992年)。
[0861]
在另一个实施例中，基于扩增的检测可用于测量拷贝数。在此类基于扩增的检测中，核酸序列在扩增反应(例如，聚合酶链反应(pcr))中作为模板。在定量扩增中，扩增产物的数量与原始样本中模板的数量成比例。与适当的对照品(例如，健康组织)进行比较，可衡量拷贝数。
[0862]
本领域技术人员均熟知“定量”扩增方法。例如，定量pcr包括使用相同引物同时共扩增已知量的对照序列。这将提供一种可用于校准pcr反应的内部标准品。定量pcr的详细方案见innis等人(1990年)，pcr方案，方法和应用指南，学术出版社(纽约))。通过定量pcr分析测量微卫星位点处的dna拷贝数见：ginzonger等人(2000年)，《癌症研究》，60:5405-5409。基因的已知核酸序列足以使本领域技术人员能够常规选择引物来扩增基因的任何部分。荧光定量pcr也可用于本发明所含的方法中。在荧光定量pcr中，基于荧光信号(例如，taqman和sybr green)的数量进行定量。
[0863]
其他适当的扩增方法包括但不限于连接酶链反应(lcr)(见wu和wallace(1989年)，《基因组学》，4:560；landegren等人(1988年)，《科学》，241:1077；以及barringer等人(1990年)，《基因》，89:117)、转录扩增(kwoh等人(1989年)，《美国国家科学院院刊》，86:1173)、自主序列复制(guatelli等人(1990年)，《美国国家科学院院刊》，87:1874年)、点pcr以及连接接头pcr等。
[0864]
杂合性缺失(loh)和主拷贝比例(mcp)映射(wang,z.c.等人(2004年)，《癌症研究》，64(1):64-71；seymour,a.b.等人(1994年)，《癌症研究》第54期，2761-4；hahn,s.a.等人(1995年)，《癌症研究》第55期，4670-5；kimura,m.等人(1996年)，《基因染色体和癌症》第17期，88-93；li等人(2008年)，《mbc生物信息》第9期，204-219)也可用于识别扩增或缺失区。
[0865]
2.生物标志物核酸表达的检测方法
[0866]
可通过各种常见的转录分子或蛋白表达检测方法，评估生物标志物表达情况。此类方法的非限制性示例包括分泌、细胞表面、细胞质或核蛋白检测的免疫学方法、蛋白纯化方法、蛋白功能或活性检测、核酸杂交方法、核酸逆转录方法以及核酸扩增方法。
[0867]
在优选实施例中，通过测量基因转录体(例如，mrna)、通过测量翻译蛋白数量或通过测量基因产物活性，对特定基因的活性进行表征。可采用多种方式监测标志物表达情况，包括通过检测mrna水平、蛋白水平或蛋白活性，可采用标准技术测量上述任何一个参数。检测可包括对基因表达(例如，基因组dna、cdna、mrna、蛋白或酶活性)水平进行定量，或是一种基因表达水平定性评估，特别是与对照水平相比。从上下文中，将明确所检测的水平类型。
[0868]
在另一个实施例中，检测或确定生物标志物及其功能类似同系物(包括其片段或基因变异)的表达水平(例如，在其调控区或启动子区中)包括检测或确定目标标志物的rna水平。在一个实施例中，从待检测的受试者体内获得一个或多个细胞，并从细胞中分离rna。在一个优选实施例中，从受试者体内获得乳腺组织细胞样本。
[0869]
在一个实施例中，从单细胞中获得rna。例如，可通过激光捕获显微切割术(lcm)从组织样本中分离细胞。采用此技术，可从组织切片(包括染色组织切片)中分离细胞，从而保证分离所需细胞(见bonner等人(1997年)，《科学》，278:1481；emmert-buck等人(1996年)，《科学》，274:998；fend等人(1999年)，《美国病理学杂志》，154:61以及murakami等人(2000年)，《国际肾脏杂志》，58:1346)。例如，murakami等人(见上文)对从先前免疫染色的组织切片中分离细胞进行了说明。
[0870]
还可从受试者体内获得细胞，并在体外培养细胞，以获得大量的细胞(从中提取rna)。建立非转化细胞培养(即原代细胞培养)的方法在本领域中十分常见。
[0871]
从组织样本中分离rna或从个体中分离细胞时，在从受试者体内取出组织或细胞后，防止基因表达发生进一步变化可能很重要。扰动(例如，热冲击或用脂多糖(lps)或其他试剂激活)后，已知表达水平会迅速发生变化。此外，组织和细胞中的rna可快速降解。因此，在一个优选实施例中，尽快速冻从受试者体内获得的组织或细胞。
[0872]
通过各种方法(例如，硫氰酸胍裂解，然后是cscl离心)，可从组织样本中提取rna(chirgwin等人，1979年，《生物化学》，18:5294-5299)。如从单细胞中制备cdna库的方法所述，可从单细胞中获得rna，如以下参考文献中所述的方法：dulac,c.(1998年)，《当代发育生物学专题》第36期，245；jena等人(1996年)，《免疫学方法杂志》，190:199。必须注意避免rna降解，例如，通过包含rnasin。
[0873]
然后，可在特定物种中富集rna样本。在一个实施例中，从rna样本中分离poly(a) rna。一般而言，此类纯化利用mrna上的poly-a尾。特别是，如上所述，poly-t寡核苷酸可固定在固体支持体上，作为mrna的亲和配体。适用于这一目的的试剂盒已市售，例如，messagemaker试剂盒(生命技术公司(纽约格兰德艾兰))。
[0874]
在一个优选实施例中，在标志物序列中富集rna群体。通过引物特异性cdna合成或多轮线性扩增(基于cdna合成和模板定向体外转录)，可进行富集(见wang等人(1989年)，《美国国家科学院院刊》，86:9717；dulac等人，见上文；以及jena等人，见上文)。
[0875]
可进一步扩增富集在或未在特定的物种或序列中的rna群体。根据本文中的定义，“扩增工艺”旨在增强、增加或加强rna内的分子。例如，如果rna为mrna，则可利用rt-pcr等扩增工艺来扩增mrna，使信号可检测或增强检测。在生物、组织或肿瘤样本量较小时，此类扩增工艺特别有利。
[0876]
可使用各种扩增和检测方法。例如，将mrna逆转录成cdna，然后进行聚合酶链反应(rt-pcr)；或在两个步骤中使用单一酶(如第5,322,770号美国专利所述)，或将mrna逆转录成cdna，然后进行对称性缺口-连接酶链反应(rt-aglcr)(如r.l.marshall等人，《pcr方法与应用》，4:80-84(1994年)所述)，均在本发明所含的范围内。也可使用实时pcr。
[0877]
本文中可使用的其他已知扩增方法包括但不限于所谓的“nasba”或“3sr”技术(如《美国国家科学院院刊》，87:1874-1878(1990年))和《自然》第350期(第6313号)：91-92(1991年)所述)；q-β扩增(如已出版的第4544610号欧洲专利申请(epa)所述)；链置换扩增(如g.t.walker等人《临床化学》42:9-13(1996年)和第684315号欧洲专利申请所述)；靶介导扩增(如pct出版物wo9322461所述)；pcr；连接酶链反应(lcr)(见wu和wallace，《基因组学》第4期，560(1989年)，landegren等人，《科学》第241期，1077(1988年))；自主序列复制(ssr)(见guatelli等人，《美国国家科学院院刊》第87期，1874(1990年))以及转录扩增(见
kwoh等人，《美国国家科学院院刊》，第86期，1173(1989年))。
[0878]
在现有技术中，已知有许多技术可用于确定基因表达的绝对和相对水平，适用于本发明的常用技术包括northern分析、rnase保护试验(rpa)、微阵列和基于pcr的技术，如定量pcr和差异显示pcr。例如，northern印迹法包括在变性琼脂糖凝胶上运行rna制剂，并将其转移到适当的支持体上，如激活纤维素、硝化纤维素或玻璃或尼龙膜。然后，使放射性标记cdna或rna与制剂杂交，进行洗涤，并通过放射自显影术进行分析。
[0879]
也可利用体外杂交可视化技术，其中，使放射性标记反义rna探针与活检样本的薄切片杂交，然后进行洗涤，用rnase切割，并暴露于感光乳剂，以执行放射自显影术。可用苏木精对样本染色，以显示样本的组织学成分，用适当的滤光器进行暗场成像，显示显影乳液。也可使用非放射性标记，如洋地黄毒苷。
[0880]
或者，可在dna阵列、芯片或微阵列上检测mrna表达。从受试者体内获得的试样的标记核酸可与包含生物标志物dna的固体表面杂交。使用包含生物标志物转录物的样本时，获得阳性杂交信号。dna阵列的制备及其使用方法在本领域中十分常见(见第6,618,6796号、第6,379,897号、第6,664,377号、第6,451,536号、第548,257号美国专利；u.s.20030157485以及schena等人(1995年)，《科学》第20期，467-470；gerhold等人(1999年)，《生物化学趋势》第24期，168-173；以及lennon等人(2000年)，《今日药物发现)第5期，59-65，所述参考文献通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分)。也可进行基因表达系列分析(sage)(见美国专利申请20030215858)。
[0881]
例如，为了监测mrna水平，从待检测的生物样本中提取mrna，产生逆转录、荧光标记cdna探针。然后，用标记cdna探针检测能够与标志物cdna杂交的微阵列，扫描载玻片，并测量荧光强度。此强度与杂交强度和表达水平有关。
[0882]
可用于本文所述方法的探针类型包括cdna、核糖核酸探针、合成寡核苷酸和基因组探针。所用的探针类型通常决定于特定情况，如核糖核酸探针用于原位杂交，以及cdna用于northern印迹法。在一个实施例中，探针被引导到rna特有的核苷酸区。根据要求，探针可以较短，以差异识别标志物mrna转录物，也可短至15个碱基；但是，可使用包含至少17、18、19、20个或更多碱基的探针。在一个实施例中，引物和探针在严格条件下与dna片段(其核苷酸序列对应于标志物)进行特异性杂交。在本文中，术语“严格条件”系指在核苷酸序列的一致性至少为95％时才会发生杂交。在另一个实施例中，当两个序列之间的一致性至少为97％时，在“严格条件”下进行杂交。
[0883]
探针的标记形式可以是任何适当的形式，如使用
32
p和
35
s等放射性同位素。无论使用适当的标记碱基化学合成还是生物合成探针，均可使用放射性同位素进行标记。
[0884]
在一个实施例中，生物样本包含来自受试者的多肽分子。或者，生物样本可包含来自受试者的mrna分子或来自受试者的基因组dna分子。
[0885]
在另一个实施例中，所述方法进一步包括从对照受试者体内获得对照生物样本；使对照样本接触能够检测标志物多肽、mrna、基因组dna或其片段的化合物或药剂，以检测生物样本中标志物多肽、mrna、基因组dna或其片段的存在情况；将对照样本中标志物多肽、mrna、基因组dna或其片段的存在情况与试样中标志物多肽、mrna、基因组dna或其片段的存在情况进行比较。
[0886]
3.生物标志物蛋白表达的检测方法
[0887]
通过对表达多肽进行检测或定量，可对生物标志物蛋白的活性或水平进行检测和/或定量。可通过本领域的技术人员熟知的任何方式，对多肽进行检测和定量。由生物标志物核酸及其功能类似同系物(包括其片段或基因变异)编码的多肽的异常表达水平(例如，在其调控区或启动子区中)与对某种条件(受益于调节对ire1α-xbp1通路调节剂的免疫应答)产生反应的可能性有关。可使用本领域已知的任何多肽检测方法。此类方法包括但不限于免疫扩散、免疫电泳、放射免疫检测(ria)、酶联免疫吸附检测(elisa)、免疫荧光检测、western印迹法、结合剂-配体检测、免疫组化技术、凝集、补体检测、高效液相色谱法(hplc)、薄层色谱法(tlc)、超扩散色谱法等(例如，《基础和临床免疫学》，sites和terr(编辑)，appleton和lange(康涅狄格州诺沃克)，第217-262页，1991年，所述参考文献通过本发明的引用，成为本发明的一部分)。优选结合剂-配体免疫检测方法，包括使抗体与一个表位或多个表位发生反应，并竞争性地取代标记多肽或其衍生物。
[0888]
例如，可执行elisa和ria程序，以便标记所需生物标志物蛋白标准品(使用放射性同位素(如
125
i或
35
s)或可检测酶(如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶))，并与未标记的样本一起接触相应的抗体，在此处，使用第二抗体与第一抗体结合，并进行放射物或固定化酶检测(竞争检测)。或者，样本中的生物标志物蛋白可与相应的固定化抗体发生反应，放射性同位素或酶标记的抗生物标志物蛋白抗体可与系统发生反应，并进行放射物或酶检测(elisa夹心法检测)。如适用，也可使用其他常规方法。
[0889]
上述技术基本上为“一步法”或“两步法”检测。“一步法”检测包括使抗原与固定化抗体接触，并在不洗涤的情况下，使混合物与标记抗体接触。“两步法”检测包括先进行洗涤，然后使混合物与标记抗体接触。如适用，也可使用其他常规方法。
[0890]
在一个实施例中，生物标志物蛋白水平的测量方法包括以下步骤：使生物样本与选择性结合生物标志物蛋白的抗体或其变体(或片段)接触，并检测所述抗体或其变体是否与所述样本结合，从而测量生物标志物蛋白的水平。
[0891]
通过常规方法，可实现生物标志物蛋白和/或抗体的酶和放射性标记。此类方法通常包括为了避免对酶的活性产生不利影响，通过戊二醛等，使酶共价连接至相关抗原或抗体，这意味着酶必须仍能够与其底物发生相互作用，虽然并不需要所有酶均具有活性，但需要足够多的活性酶才能进行有效检测。的确，一些酶结合技术具有非特异性(如使用甲醛)，只能产生一定比例的活性酶。
[0892]
通常需要将检测系统的一个组分固定在支持体上，从而使系统的其他组分与所述组成接触，无需费时费力的劳动，即可轻松移除。可将第二相固定在远离第一相的位置，但是，单相通常便已足够。
[0893]
可将酶本身固定在支持体上，但是，如果需要固相酶，则最佳方法通常为与抗体结合并使抗体附着在支持体、模型和系统上，这在本领域是常见的。简单的聚乙烯可作为适当的支持体。
[0894]
标记用酶不受特别的限制，可从氧化酶组的成员中选择。这些酶通过与其底物发生反应，催化产生过氧化氢，葡萄糖氧化酶具有良好的稳定性、易于获得且成本低，并且其底物立即可用(葡萄糖)，因此经常使用葡萄糖氧化酶。通过测量在酶标记抗体与底物在本领域已知的受控条件下发生反应后形成的过氧化氢的浓度，可检测氧化酶的活性。
[0895]
根据本公开及从业人员的偏好，其他技术也可用于检测生物标志物蛋白。其中一
种技术为western印迹法(towbin等人，《美国国家科学院院刊》，76:4350(1979年))，其中，在sds-page凝胶上运行经适当处理的样本，然后将其转移到固体支持体(如硝化纤维素滤膜)上。然后，使抗生物标志物蛋白抗体(未标记)与支持体接触，并使用标记蛋白a或抗免疫球蛋白等二次免疫试剂进行检测(适当的标记包括
125
i、如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)。也可使用色谱检测法。
[0896]
免疫组织化学法可用于检测活检样本中生物标志物蛋白的表达。例如，使适当的抗体与薄层细胞接触，进行洗涤，然后与第二标记抗体接触。可使用荧光标志物、酶(如过氧物酶)、亲和素或放射性标记进行标记。使用显微镜，对检测进行目视评分。
[0897]
抗生物标志物蛋白抗体(如细胞内抗体)也可用于成像目的，例如，用于检测受试者的细胞和组织中是否存在生物标志物蛋白。适当的标记包括放射性同位素(如碘(
125
i、
121
i)、碳(
14
c)、硫(
35
s)、氚(3h)、铟(
112
in)和锝(
99
mtc))、荧光标记(如荧光素和罗丹明)以及生物素。
[0898]
对于体内成像目的，无法从体外检测到抗体，因此，为了进行检测，必须对其进行标记，或以其他方式进行修饰。用于此目的的标志物可以是实质上不会干扰抗体结合但允许外部检测的任何标志物。适当的标志物可包括通过x射线照相术、nmr或mri可检测的标志物。对于x射线照相技术，适当的标志物包括发射可检测辐射但不对受试者明显有害的任何放射性同位素(如钡或铯)。对于nmr和mri，适当的标志物通常包括包含可检测特性螺旋(如氘)的标志物，通过适当标记相关杂交瘤细胞的营养成分，其可进入抗体中。
[0899]
受试者的个头以及所用的成像系统将决定生成诊断图像所需的成像部分的数量。就放射性同位素部分而言，对于人类受试者，放射物注射量通常为约5-20毫居里的锝99。然后，标记抗体或抗体片段优先在包含生物标志物蛋白的细胞位置处积聚。然后，可采用已知技术，检测标记抗体或抗体片段。
[0900]
可用于检测生物标志物蛋白的抗体包括任何天然抗体、合成抗体、全长抗体或其片段、单克隆抗体或多克隆抗体，它们对待检测的生物标志物蛋白具有足够强的特异性结合性。抗体的kd至多约为10-6
m、10-7
m、10-8
m、10-9
m、10-10
m、10-11
m、10-12
m。短语“特异性结合”系指抗体与表位、抗原或抗原决定簇以某种方式结合，即，可用相同或相似表位、抗原或抗原决定簇的第二制剂取代结合或与其竞争。相对于其他蛋白(如相关蛋白)，抗体可优先与生物标志物蛋白结合。
[0901]
抗体已市售，或可根据本领域的已知方法进行制备。
[0902]
可用抗体及其衍生物包括多克隆抗体或单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体、灵长化抗体(cdr移植抗体)、饰面抗体或单链抗体以及抗体的功能片段，即生物标志物蛋白结合片段。例如，可使用能够与生物标志物蛋白或其片段结合的抗体片段，包括但不限于fv、fab、fab’和f(ab')2。通过酶切或重组技术，可产生此类片段。例如，木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割可分别产生fab或f(ab')2片段。具有必要底物特异性的其他蛋白酶也可用于产生fab或f(ab')2片段。也可使用抗体基因，以各种截短形式产生抗体，其中，已将一个或多个终止密码子引入天然终止位点的上游。例如，编码f(ab')2重链部分的嵌合基因可旨在包含编码重链ch、结构域和铰链区的dna序列。
[0903]
以下参考文献对合成和经工程化改造的抗体进行了说明：cabilly等人，第4,816,567号美国专利；cabilly等人，第0,125,023b1号欧洲专利；boss等人，第4,816,397号美国
专利；boss等人，第0,120,694b1号欧洲专利；neuberger,m.s.等人，wo 86/01533；neuberger,m.s.等人，第0,194,276b1号欧洲专利；winter，第5,225,539号美国专利；winter，第0,239,400b1号欧洲专利；queen等人，第0451216b1号欧洲专利；以及padlan,e.a.等人，ep 0519596 a1。另见newman等人，《生物技术》，10:1455-1460(1992年)(有关灵长化抗体)以及ladner等人，第4,946,778号美国专利和bird,r.e.等人，《科学》，242:423-426(1988年)(有关单链抗体)。也可使用从库(例如，噬菌体展示库)中产生的抗体。
[0904]
在一些实施例中，使用与生物标志物蛋白(抗体除外)特异性结合的药剂，如肽。可通过本领域已知的任何方法识别与生物标志物蛋白结合特异性结合的肽。例如，可使用肽噬菌体展示库筛选生物标志物蛋白的特异性肽结合剂。
[0905]
4.生物标志物结构变化的检测方法
[0906]
以下说明性方法可用于确定生物标志物核酸和/或生物标志物多肽分子是否存在结构变化，以识别表1中所列的一种或多种生物标志物，或本文所述免疫疗法中所用的其他生物标志物。
[0907]
在某些实施例中，变化检测包括在聚合酶链反应(pcr)(见第4,683,195号和第4,683,202号美国专利)(如锚定pcr或race pcr)或连接酶链反应(lcr)(见landegran等人(1988年)，《科学》，241:1077-1080；以及nakazawa等人(1994年)，《美国国家科学院院刊》，91:360-364)中使用探针/引物，后者特别适用于检测生物标志物核酸(如生物标志物基因)中的点突变(见abravaya等人(1995年)，《核酸研究》，23:675-682)。这种方法可包括以下步骤：从受试者体内采集细胞样本、从样本细胞中分离核酸(例如，基因组和/或mrna)、使核酸样本与一个或多个引物(在一定条件下与生物标志物基因特异性杂交，从而使生物标志物基因(如有)杂交和扩增)接触、检测是否存在扩增产物或检测扩增产物的大小并将长度与对照样本的长度进行比较。预计可能需要将pcr和/或lcr用作初步扩增步骤，与本文所述的任何突变检测技术结合使用。
[0908]
替代扩增方法包括：自主序列复制(guatelli,j.c.等人(1990年)，《美国国家科学院院刊》，87:1874-1878)、转录扩增系统(kwoh,d.y.等人(1989年)，《美国国家科学院院刊》，86:1173-1177)、q-β复制酶(lizardi,p.m.等人(1988年)，《生物技术》，6:1197)或任何其他核酸扩增方法，然后使用本领域技术人员熟知的技术进行扩增分子检测。这些检测方案特别适用于检测极少量的核酸分子。
[0909]
在一个替代实施例中，通过改变限制性酶切模式，可识别样本细胞中的生物标志物核酸突变。例如，分离、扩增(可选)并使用一种或多种限制性核酸内切酶消化样本dna和对照dna，通过凝胶电泳确定片段长度大小，并进行比较。如果样本dna和对照dna的片段长度大小之间存在差异，则表明样本dna发生突变。此外，使用序列特异性核酶(见第5,498,531号美国专利)，可针对是否因核酶切割位点形成或缺失而存在特异性突变进行评分。
[0910]
在其他实施例中，使样本核酸和对照核酸(例如，dna或rna)与包含数百个或数千个寡核苷酸探针的高密度阵列杂交，可识别生物标志物核酸的基因突变(cronin,m.t.等人(1996年)，《人类突变》7:244-255；kozal,m.j.等人(1996年)，《自然-医学》，2:753-759)。例如，可在包含光生dna探针的二维阵列中识别生物标志物基因突变，以下参考文献对此进行了说明：cronin等人(1996年)，见上文。简而言之，第一探针杂交阵列可用于扫描样本和对照品中的长段dna，通过使连续、重叠的探针形成线性阵列，识别序列之间的碱基变化。这一
步骤可识别点突变。这一步骤之后为第二杂交阵列，此阵列使用与检测到的所有变体或突变互补的较小专用探针阵列，可对特异性突变进行表征。每个突变阵列由平行探针组组成，其中一个与野生型基因互补，另一个则与突变基因互补。可在各种环境下识别此类生物标志物基因突变，包括种系和体细胞突变。
[0911]
在另一个实施例中，本领域已知的任何测序反应均可用于直接对生物标志物基因进行测序，并通过比较样本生物标志物的序列与相应的野生型(对照)序列来检测突变。测序反应示例包括基于以下人员所开发技术的测序反应：maxam和gilbert(1977年)，《美国国家科学院院刊》，74:560或sanger(1977年)，《美国国家科学院院刊》，74:5463。进行诊断检测(naeve(1995年)，《生物技术》，19:448-53)时，预计也可使用任何自动测序程序，包括通过质谱法进行测序(见第wo 94/16101号pct国际出版物；cohen等人(1996年)，《色谱研究进展》，36:127-162；以及griffin等人(1993年)，《应用生物化学与生物技术》，38:147-159)。
[0912]
生物标志物基因突变的其他检测方法包括利用切割剂防护来检测rna/rna或rna/dna异源双链体中的错配碱基的方法(myers等人(1985年)，《科学》，230:1242)。一般而言，“错配切割”技术从提供异源双链体开始，此类异源双链体通过使包含野生型生物标志物序列的(标记)rna或dna与从组织样本中获得的潜在突变rna或dna杂交形成。使用切割双链体单链区的药剂处理双链体，如因对照链和样本链之间的碱基对错配而存在。例如，可使用rnase处理rna/dna双链体，使用si核酸酶处理dna/dna杂交体，以用酶消化错配区。在其他实施例中，可使用羟胺或四氧化锇以及哌啶处理dna/dna或rna/dna双链体，以消化错配区。消化错配区后，在变性聚丙烯酰胺凝胶上按大小分离获得的物质，以确定突变位点。例如，见cotton等人(1988年)，《美国国家科学院院刊》，85:4397以及saleeba等人(1992年)，《酶学方法》，217:286-295。在一个优选实施例中，可标记对照dna或rna，以进行检测。
[0913]
在另一个实施例中，错配切割反应利用在已定义系统中识别双链dna中错配碱基对的一个或多个蛋白(所谓的“dna错配修复”酶)来检测并定位从细胞样本中获得的生物标志物cdna的点突变。例如，大肠杆菌muty酶在g/a错配时切割a，hela细胞中的胸腺嘧啶dna糖苷酶在g/t错配时切割t(hsu等人(1994年)，《癌症发生》，15:1657-1662)。根据一个示例性实施例，可按照电泳方案等检测基于生物标志物序列(例如，使用dna错配修复酶处理的野生型生物标志物)的探针以及切割产物(如有)(例如，第5,459,039号美国专利)。
[0914]
在其他实施例中，电泳迁移率变化可用于识别生物标志物基因突变。例如，单链构象多态性(sscp)可用于检测突变体与野生型核酸之间的电泳迁移率差异(orita等人(1989年)，《美国国家科学院院刊》，86:2766；另见cotton(1993年)，《突变研究》，285:125-144以及hayashi(1992年)，《遗传分析与技术应用》，9:73-79)。使样本和对照生物标志物核酸的单链dna片段变性，并允许其复性。根据序列，单链核酸的二级结构有所不同，因此导致的电泳迁移率变化允许检测甚至单一碱基变化。可标记或使用标记探针检测dna片段。使用rna(而不是dna)可增强检测灵敏度，其中，所述二级结构对序列变化更加敏感。在一个优选实施例中，主体方法根据电泳迁移率变化，利用异源双链分析来分离异源双链分子(keen等人(1991年)，《遗传学趋势》，7:5)。
[0915]
在另一个实施例中，通过变性梯度凝胶电泳(dgge)，检测突变体或野生型片段在聚丙烯酰胺凝胶(包含变性剂梯度)中的移动情况(myers等人(1985年)，《自然》，313:495)。将dgge用作分析方法时，对dna进行修饰，以确保其不会完全变性，例如，通过pcr添加包含
约40bp高熔点富gc dna的gc封条。在另一个实施例中，用温度梯度来代替变性梯度，以确定对照dna和样本dna的迁移率差异。(rosenbaum和reissner(1987)，《生物物理化学》，265:12753)。
[0916]
点突变的其他检测技术示例包括但不限于选择性寡核苷酸杂交、选择性扩增或选择性引物延伸。例如，可制备寡核苷酸引物，其中，已知突变位于中心，然后在一定条件(即，仅在发现完美匹配时才允许杂交)下与靶dna杂交(saiki等人(1986年)，《自然》，324:163；saiki等人(1989年)，《美国国家科学院院刊》，usa 86:6230)。当寡核苷酸附着在杂交膜上并与标记靶dna杂交时，此类等位基因特异性寡核苷酸与pcr扩增靶dna或许多不同突变杂交。
[0917]
或者，等位基因特异性扩增技术取决于选择性pcr扩增，可与本发明结合使用。用作特异性扩增引物的寡核苷酸可在分子中心(因此扩增取决于差异杂交)(gibbs等人(1989年)，《核酸研究》，17:2437-2448)或在一个引物的最远3’端携带突变，在适当条件下，可防止错配或减少聚合酶延伸(prossner(1993年)，《tibtech》，11:238)。此外，可能需要在突变区引入一个新的限制性位点，以进行基于切割的检测(gasparini等人(1992年)，《分子和细胞探针》，6:1)。在某些实施例中，预计也可使用taq连接酶进行扩增(barany(1991年)，《美国国家科学院院刊》，88:189)。在这种情况下，仅在5’序列的3’端实现完美匹配时才进行连接，在这种情况下，可通过确定是否存在扩增来检测特异性位点处是否存在已知突变。
[0918]
iii.受试者
[0919]
在一个实施例中，所述受试者为哺乳动物(例如，大鼠、灵长类动物、非人类哺乳动物、家畜(如狗、猫、牛、马等))，优选为人类，向所述受试者施用包含癌细胞的癌症疫苗，其中，所述癌细胞为(1)pten缺陷癌细胞；(2)p53缺陷癌细胞；以及(3)经修饰可激活tgfβ-smad/p63信号通路，或确定了癌症疫苗对治疗癌症的预测疗效可能性。在另一个实施例中，所述受试者为癌症动物模型。例如，动物模型可以是人源癌症的原位异种移植动物模型或同系癌症模型的同种异体移植物。
[0920]
在本发明所述方法的另一个实施例中，受试者未接受治疗，如化疗、放疗、靶向疗法和/或免疫疗法。在另一个实施例中，受试者已接受治疗，如化疗、放疗、靶向疗法和/或免疫疗法。在另一个实施例中，受试者先前患有癌症，和/或处于癌症缓解状态。
[0921]
在某些实施例中，受试者已接受手术，切除了癌组织或癌前组织。在其他实施例中，未切除癌组织，例如，癌组织可能位于身体不能手术的部位，如在生命所必需的组织内，或在外科手术会对患者造成相当大的伤害风险的区域内。
[0922]
本发明的方法可用于确定癌症疫苗治疗癌症的反应性：
[0923]
iv.治疗方法
[0924]
本发明提供了适用于有可能(或容易)患癌的受试者的预防和治疗方法。所述癌症可以是实体癌或血液癌。在一个实施例中，所述癌症与癌症疫苗的类型相同，且具有相同的基因突变。在另一个实施例中，所述癌症与癌症疫苗的类型不同，但具有相同的基因突变(例如，p53和pten共缺失)。在另一个实施例中，所述癌症与癌症疫苗的类型相同，但具有不同的基因突变。在另一个实施例中，所述癌症与癌症疫苗的类型不同，且具有不同的基因突变。例如，所述癌症可以是ppa肿瘤(一种侵袭性极高的乳腺癌，其特征在于，p53、pten和p110α三重缺失)、c260肿瘤(一种因p53/pten共缺失和高度myc表达而引起的高级别浆液性
卵巢癌)、d658(一种从乳腺癌的pik3ca
h1047r gemm中产生的kras突变复发性乳腺癌细胞模型)或d333(一种源自p53和pten共缺失gemm的胶质母细胞瘤肿瘤模型)。
[0925]
a.预防方法
[0926]
一方面，本发明提供了一种通过向受试者施用包含癌细胞的癌症疫苗来预防受试者患癌的方法，其中，所述癌细胞为：(1)pten缺陷癌细胞；(2)p53缺陷癌细胞；以及(3)经修饰可激活tgfβ-smad/p63信号通路。可在出现癌症的特有症状前施用预防剂(例如，本文所述的癌症疫苗)，从而预防癌症或延缓其进展。在某些实施例中，施用预防剂(例如，本文所述的疫苗)可预防受试者癌症复发。
[0927]
b.治疗方法
[0928]
本发明的另一个方面涉及通过向受试者施用治疗有效量的包含癌细胞的癌症疫苗来治疗患癌受试者的方法，其中，所述癌细胞为：(1)pten缺陷癌细胞；(2)p53缺陷癌细胞；以及(3)经修饰可激活tgfβ-smad/p63信号通路。
[0929]
如下文所示，在一些实施例中，向受试者施用包含癌细胞的癌症疫苗，其中，所述癌细胞为：(1)pten缺陷癌细胞；(2)p53缺陷癌细胞；以及(3)经修饰可激活tgfβ-smad/p63信号通路。因此，癌细胞与受试者宿主具有免疫相容性关系，根据本发明考虑使用任何此类关系。例如，癌细胞可以是同系细胞。术语“同系”可系指源自、来自基因相同(特别是在抗原或免疫反应方面)的同一物种或属于其成员的状态。其中包括mhc类型相匹配的同卵双胞胎。因此，“同系移植”系指将供体细胞转移到受体，此受体与供体的基因相同或具有足够的免疫相容性，可接受移植，且不会出现不良免疫原性反应(例如，与本文所述免疫筛查结果的解释相矛盾的反应)。
[0930]
如果转移细胞取自并移植到同一受试者，则同系移植可以是“自体的”。“自体移植”系指采集并回输或移植受试者自己的细胞或器官。专门使用或补充使用自体细胞，可消除或减少将细胞送回宿主的不良反应，特别是移植物抗宿主反应。
[0931]
如果转移细胞取自并移植到同一物种的不同成员(有足够匹配的主要组织相容性复合物(mhc)抗原，以免发生不良免疫原性反应)，则同系移植可以是“匹配同种异体的”。可通过本领域已知并使用的标准检测来确定mhc错配程度。例如，在人体中，至少有六大类mhc基因在移植生物学中很重要。hla-a、hla-b、hla-c编码hla i类蛋白，而hla-dr、hla-dq和hla-dp则编码hla ii类蛋白。上述每组内的基因均具有高度多态性，这反映在人类群体的大量hla等位基因或变体上，个体之间这些组的差异与对移植细胞的免疫应答强度有关。mhc匹配程度的标准确定方法将检测hla-b和hla-dr或hla-a、hla-b和hla-dr组内的等位基因。因此，可分别对两个或三个hla组内的至少4个、甚至5个或6个mhc抗原进行检测。在血清学mhc检测中，靶向每个hla抗原类型的抗体与一个受试者(例如，供体)的细胞发生反应，以确定是否存在与抗体反应的某些mhc抗原。将上述结果与其他受试者(例如，受体)的反应模式进行比较。通常将抗体与细胞一起培养，然后加入补体，诱导细胞裂解(例如，淋巴细胞毒性检测)，从而确定抗体与mhc抗原的反应。对反应进行检测，并根据反应中的细胞裂解量进行分级(见mickelson和petersdorf(1999年)，《造血细胞移植》，thomas,e.d.等人(编辑)，第28-37页，布莱克韦尔科学出版(马萨诸塞州摩顿))。基于细胞的其他检测包括使用标记抗体的流式细胞术或酶联免疫检测(elisa)。确定mhc类型的分子方法众所周知，通常利用合成探针和/或引物来检测编码hla蛋白的特异性基因序列。合成寡核苷酸可用作杂交探
针，检测与特定hla类型有关的限制性片段长度多态性(vaughn(2002年)，《分子生物学方法-mhc方案》，210:45-60)。或者，引物可用于扩增hla序列(例如，通过聚合酶链反应或连接酶链反应)，可通过dna直接测序、限制性片段多态性分析(rflp)或与一系列序列特异性寡核苷酸引物(ssop)杂交来进一步检测其产物(petersdorf等人(1998年)，《血液》，92:3515-3520；morishima等人(2002年)，《血液》，99:4200-4206；以及middleton和williams(2002年)，《分子生物学方法-mhc方案》，210:67-112)。
[0932]
如果转移细胞与受试者的细胞在定义位点(如单位点)方面不同，则同系移植可以是“同类系的”(通常通过近亲繁殖)。术语“同类系的”系指源自、来自同一物种或属于其成员，但前提是除一个小基因区(通常为单基因位点(即单基因))之外，此类成员基因相同。“同类系移植”系指将细胞或器官从供体转移到受体，但前提是除一个单基因位点之外，受体与供体的基因相同。例如，cd45以多个等位基因形式存在，对于同类系小鼠系，小鼠系在是否表达cd45.1或cd45.2等位基因版本方面不同。
[0933]
相比之下，“错配同种异体的”系指源自、来自同一物种或属于其成员，但不同的主要组织相容性复合物(mhc)抗原(即蛋白)足以引起不良免疫原性反应(通常通过本领域所用的标准检测确定)，如对一定数量的mhc抗原进行血清学或分子分析。“部分错配”系指在两个成员之间(通常是供体和受体之间)检测到mhc抗原部分匹配。例如，“半错配”系指在两个成员之间检测到50％的mhc抗原的类型不同。“完全”错配系指在两个成员之间检测到所有mhc抗原均不同。
[0934]
同样，相比之下，“异种的”系指源自、来自不同物种或属于其成员，例如，人类和啮齿动物、人类和猪、人类和黑猩猩等。“异种移植”系指将供体的细胞或器官转移到受体，此受体与供体不属于同一物种。
[0935]
此外，可从单一来源或多个来源(例如，一个受试者或多个受试者)获得癌细胞。多个系指至少两个(例如，不止一个)。在另一个实施例中，非人类哺乳动物为小鼠。用于获得目标细胞类型的动物可以是成年、新生(例如，出生48小时之内)、未成熟或未出生的动物。目标细胞类型可以是原代癌细胞、癌症干细胞、确立癌细胞系、永生化原代癌细胞等。在某些实施例中，宿主受试者的免疫系统可经工程化改造或选择，对移植癌细胞具有免疫相容性。例如，在一个实施例中，为了与人癌细胞相容，可将受试者“人源化”。术语“免疫系统人源化”系指包含人hsc谱系细胞和人获得性和先天免疫细胞的动物(如小鼠)生存，且不会被宿主动物排斥，从而在宿主细胞中重建人类造血功能以及获得性和先天免疫。获得性免疫细胞包括t细胞和b细胞。先天免疫细胞包括巨噬细胞、粒细胞(嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞)、dc、nk细胞和肥大细胞。代表非限制性示例包括scid-hu、hu-pbl-scid、hu-src-scid、nsg(nod-scid il2rγ(缺陷型)缺少先天免疫系统、b细胞、t细胞和细胞因子信号)、nog(nod-scid il2rγ(截短型))、brg(balb/c-rag2(缺陷型)il2rγ(缺陷型))和h2drg(stock-h2d-rag2(缺陷型)il2rγ(缺陷型))小鼠(见shultz等人(2007年)，《自然综述免疫学》，7:118；pearson等人(2008年)，《当代免疫学方案》，15:21；brehm等人(2010年)，《临床免疫学》，135:84-98；mccune等人(1988年)，《科学》，241:1632-1639，第7,960,175号美国专利和美国专利出版物2006/0161996)免疫相关基因的相关无效突变体(如rag1(缺少b细胞和t细胞)、rag2(缺少b细胞和t细胞)、tcrα(缺少t细胞)、穿孔素(cd8 t细胞缺少细胞毒性功能)、foxp3(缺少功能性cd4 t调节性细胞)、il2rg或prfl)以及pd-1、pd-l1、tim3和/
或2b4的突变体或敲除允许将人类免疫细胞有效移植到免疫功能不全的动物(如小鼠)体内和/或提供其区室特异性模型(见pct出版物wo2013/062134)。此外，nsg-cd34 (nod-scid il2r-γ(缺陷型)cd34 )人源化小鼠适用于研究小鼠等动物模型中的人类基因和肿瘤活性。
[0936]
在本文中，从生物物质来源“获得”系指从供体采集或分离生物物质来源的任何常规方法。例如，可从实体瘤、血液样本(如外周血或脐带血样本)中获得或从另一种体液(如骨髓或羊水)中采集生物物质。本领域技术人员熟知获得此类样本的方法。在本发明中，样本可以是新鲜的(即从供体中获得且未冷冻)。此外，扩充前，可进一步处理样本，去除多余或无用的组分。也可从保存的库存中获得样本。例如，对于细胞系或体液，如外周血或脐带血，可从低温或以其他方式保存的细胞系或液体库中获得样本。可从任何适当的供体中获得此类样本。
[0937]
获得的细胞群可直接使用或冷冻以备日后使用。各种低温保存培养基和方案在本领域中十分常见。冷冻培养基通常包含5-10％的dmso、10-90％的血清白蛋白以及50-90％的培养基。有助于保存细胞的其他添加剂包括但不限于二糖(如海藻糖)(scheinkonig等人(2004年)，《骨髓移植》，34:531-536)或血浆增量剂(如羟乙基淀粉))。在一些实施例中，可使用等渗缓冲液(如磷酸盐缓冲盐水)。示例性冷冻保存合成物包括含有4％hsa、7.5％二甲亚砜(dmso)和2％羟乙基淀粉的细胞培养基。其他合成物以及低温保存方法在本领域中十分常见，并进行了说明(见broxmeyer等人(2003年)，《美国国家科学院院刊》，100:645-650)。在低于约-135℃的最终温度下保存细胞。
[0938]
c.联合疗法
[0939]
在联合疗法中，癌症疫苗可与化学治疗剂、激素、抗血管生成素、放射性标记化合物或外科手术、冷冻疗法和/或放疗联合施用。上述治疗方法可与各类其他的常规疗法(例如，本领域技术人员熟知的癌症标准护理治疗)连续或在其之前或之后施用。例如，癌症疫苗可与治疗有效剂量的化学治疗剂联合施用。在另一个实施例中，癌症疫苗与化疗联合施用，可增强化学治疗剂的活性和疗效。医生桌上参考手册(pdr)公开了用于治疗各种癌症的化学治疗剂的剂量。上述化学治疗剂的给药方案及治疗有效剂量取决于需治疗的特定癌症、疾病的程度以及本领域精通医术的医生所熟悉的其他因素。
[0940]
癌症疫苗也可与免疫疗法等靶向疗法联合施用。术语“靶向疗法”系指施用与所选生物分子选择性相互作用以治疗癌症的药剂。例如，抑制免疫检查点抑制剂的靶向疗法与本发明所述的方法联合使用。术语“免疫检查点抑制剂”系指cd4 和/或cd8 t细胞表面上的一组分子，可通过下调或抑制抗肿瘤免疫应答来微调免疫应答。免疫检查点蛋白在本领域中十分常见，包括但不限于：ctla-4、pd-1、vista、b7-h2、b7-h3、pd-l1、b7-h4、b7-h6、2b4、icos、hvem、pd-l2、cd160、gp49b、pir-b、kir家族受体、tim-1、tim-3、tim-4、lag-3、btla、sirpα(cd47)、cd48、2b4(cd244)、b7.1、b7.2、ilt-2、ilt-4、tigit和a2ar(见wo 2012/177624)。抑制一个或多个免疫检查点抑制剂可阻断或以其他方式中和免疫信号，从而上调免疫应答，更有效地治疗癌症。在一些实施例中，癌症疫苗与一个或多个免疫检查点抑制剂(如pd1、pd-l1和/或cd47)联合施用。
[0941]
免疫疗法是靶向疗法的一种形式，可包括使用附加癌症疫苗和/或致敏抗原呈递细胞。例如，溶瘤病毒是一种能够感染并溶解癌细胞，同时使正常细胞不受伤害的病毒，因
此可在癌症疗法中使用。溶瘤病毒复制会促进破坏肿瘤细胞，也会在肿瘤部位产生剂量扩增现象。它们也可作为抗肿瘤基因的载体，将抗肿瘤基因特异性输送到肿瘤部位。免疫疗法可涉及短期保护宿主的被动免疫，通过施用直接靶向癌症抗原或疾病抗原的预成抗体(例如，向肿瘤抗原施用可选连接化学治疗剂或毒素的单克隆抗体)实现。例如，抗vegf和mtor抑制剂已知可有效治疗肾细胞癌。免疫疗法也可重点使用癌细胞系的细胞毒性淋巴细胞识别表位。或者，反义多核苷酸、核酶、rna干扰分子、三重螺旋多核苷酸等可用于选择性调节与肿瘤或癌症起始、进展和/或病理有关的生物分子。
[0942]
术语“非靶向疗法”系指施用不会与所选生物分子选择性相互作用以治疗癌症的药剂。非靶向疗法的代表性示例包括但不限于化疗、基因疗法和放疗。
[0943]
在一个实施例中，使用化疗。化疗包括施用化学治疗剂。此类化学治疗剂可包括但不限于从以下化合物组中选择的化学治疗剂：铂化合物、细胞毒性抗生素、抗代谢药、抗有丝分裂剂、烷化剂、砷化合物、dna拓扑异构酶抑制剂、紫杉烷、核苷类似物、植物碱和毒素及其合成衍生物。示例性化合物包括但不限于烷化剂：顺铂、曲奥舒凡和曲洛磷胺；植物碱：长春碱、紫杉醇、多西紫杉醇；dna拓扑异构酶抑制剂：替尼泊苷、克立那托和丝裂霉素；抗叶酸剂：甲氨蝶呤、霉酚酸和羟基脲；嘧啶类似物：5-氟尿嘧啶、去氧氟尿苷和阿糖胞苷；嘌呤类似物：巯嘌呤和硫鸟嘌呤；dna抗代谢物：2'-脱氧-5-氟尿苷、阿非迪霉素甘氨酸盐和吡唑并咪唑；以及抗有丝分裂剂：软海绵素、秋水仙碱和根瘤菌素。也可使用包含一种或多种化学治疗剂(例如，flag、chop)的合成物。flag包括氟达拉滨、阿糖胞苷(ara-c)和g-csf。chop包括环磷酰胺、长春新碱、多柔比星和强的松。上述化学治疗剂示例仅作说明之用，而非加以限制。
[0944]
在另一个实施例中，使用放疗。放疗中所用的辐射可以是电离辐射。放疗也可以是伽马射线、x射线或质子束。放疗示例包括但不限于体外射束放疗、放射性同位素(i-125、钯、铱)间质植入、放射性同位素(如锶89)、胸廓放疗、腹膜内p-32放疗和/或全腹部和盆腔放疗。有关放疗的总体概述，见hellman，第16章：癌症管理原则：放疗，第6版，2001年，devita等人(编辑)，j.b.lippencott公司(费城)。可以体外射束放疗或远距离放疗的形式进行放疗，其中，辐射来自远距离来源。也可以体内疗法或近距离放疗的形式进行放疗，其中，放射源位于体内靠近癌细胞或肿瘤肿块的位置。本文还包括使用光动力疗法，包括施用光敏剂，如血卟啉及其衍生物、维替泊芬(bpd-ma)、酞菁、光敏剂pc4、去甲氧基竹红菌素a；以及2ba-2-dmha。
[0945]
在另一个实施例中，使用激素疗法。激素治疗可包括激素激动剂、激素拮抗剂(例如，氟他胺、比卡鲁胺、三苯氧胺、雷洛昔芬、醋酸亮丙瑞林(lupron)、lh-rh拮抗剂)、激素生物合成和加工抑制剂以及类固醇(例如，地塞米松、维甲酸、类维生素d、倍他米松、皮质醇、可的松、强的松、去氢睾酮、糖皮质激素、盐皮质激素、雌激素、睾酮、孕酮)、维生素a衍生物(例如，全反式维甲酸(atra))；维生素d3类似物；抗孕激素(例如，米非司酮、奥那司酮)或抗雄激素(例如，醋酸环丙孕酮)。
[0946]
在另一个实施例中，使用热疗，其中，将体组织暴露于高温下(高达106
°
f)。高温可破坏细胞或剥夺细胞赖以生存的物质，有助于缩小肿瘤。热疗可以是局部、区域及全身热疗(使用体外及体内加热器械)。热疗几乎总与各类其他的疗法(例如，放疗、化疗和生物疗法)联合使用，以试图提高其效率。局部热疗系指对极小区域(如肿瘤)加热。可使用靶向肿瘤的
高频波(来自体外器械)从外部加热此区域。为了实现内部加热，可使用一种无菌探针，包括装有温水的薄壁加热空心管；植入微波天线；以及射频电极。在区域热疗中，加热一个器官或肢体。将产生较高能量的磁铁和器械放置在待加热区域。在另一种方法(称为“灌注”)中，取出一些患者血液，进行加热，然后泵送(灌注)到内部加热区域中。全身加热用于治疗已经扩散到全身的转移性癌症。使用温水毯、热腊、电感线圈(如电热毯中的电感线圈)或热室(类似于大型孵化器)，即可实现这一目的。热疗不会显著增加放射副作用或并发症。但是，直接加热皮肤可能造成不适，甚至有一半左右的治疗患者出现明显的局部疼痛。也可能引起水泡，这种水泡通常可迅速愈合。
[0947]
在另一个实施例中，光动力疗法(也称为pdt、光放射疗法、光疗或光化学疗法)用于治疗某些类型的癌症。这种疗法基于以下发现：当单细胞生物体暴露在特定类型的光下时，某些称为光敏剂的化学物质可杀死此类生物体。通过联合使用固定频率的激光和光敏剂，pdt可消灭癌细胞。在pdt中，光敏剂被注射到血流中，并被全身的细胞细胞。与正常细胞相比，光敏剂在癌细胞中的停留时间更长。当经治疗的癌细胞暴露在激光下时，光敏剂吸收光并产生一种活性氧，这种活性氧会消灭经治疗的癌细胞。必须仔细注意光照射的时间，当大多数光敏剂已离开健康细胞，但仍然存在于癌细胞中时，即表明照射时间刚好。pdt中所使用的激光可通过光纤元件(极薄的玻璃丝束)。将光纤元件放置在靠近肿瘤的位置，以提供适量的光。光纤元件可通过支气管镜进入肺部，以治疗肺癌，或通过内窥镜进入食管，以治疗食管癌。pdt的一个优势在于：对健康组织的损伤最小。但是，由于目前使用的激光无法穿透约3厘米以上的组织(稍多于1/8英寸)，因此，pdt主要用于治疗皮肤上或皮肤下或内部器官内膜上的肿瘤。光动力疗法使皮肤和眼睛在治疗后6周或更长时间内对光敏感。建议患者至少在6周内避免接触直射阳光和室内强光。如果患者必须出门，则需要穿上防护服(包括太阳镜)。pdt的其他暂时性副作用涉及特定区域的治疗，可包括咳嗽、吞咽困难、腹痛、呼吸痛或气短。1995年12月，美国食品药品监督管理局(fda)批准了一种名为卟吩姆钠或的光敏剂，这种光敏剂可缓解食管癌的梗阻症状以及仅通过激光治疗无法获得满意疗效的食管癌症状。1998年1月，fda批准将卟吩姆钠用于在常规肺癌治疗方法并不适用的患者中治疗早期非小细胞肺癌。美国国家癌症研究所及其他机构支持进行临床试验(研究)，以评估光动力疗法在几种癌症(包括膀胱癌、脑癌、喉癌和口腔癌)中的应用。
[0948]
在另一个实施例中，激光疗法用于利用高强度光来消灭癌细胞。这种技术常用于缓解出血或梗阻等癌症症状，特别是当癌症无法通过其他治疗治愈时。这种技术也可缩小或消灭肿瘤，从而治疗癌症。术语“激光”表示受激辐射发射的光放大。普通光(如来自灯泡的光)具有多种波长，在各个方向上传播。另一方面，激光具有特定波长，聚焦在窄光束中。这种高强度光包含许多能量。激光非常强大，可切断钢铁或调整钻石形状。激光也可用于非常精确的外科工作，如修复眼睛中受损的视网膜或切断组织(代替手术刀)。虽然有多种不同的激光器，但仅以下三种激光器在医学上得到了广泛的应用：二氧化碳(co2)激光器—这种激光器无需穿透深层皮肤，即可从皮肤表面去除薄层。这种技术特别适用于治疗未深度扩散到皮肤中的肿瘤以及某些癌前状况。作为传统手术刀手术的替代方法，co2激光器也可切割皮肤。按这种方式使用此激光器，可消灭皮肤癌。钕钇铝石榴石(nd:yag)激光器—与其他类型的激光器相比，这种激光器发出的光可穿透更深层的组织，使血液快速凝结。可通过光纤将其输送到身体较难接触的部位。这种激光器有时用于治疗喉癌。氩激光器—这种激
光器只能穿透表层组织，因此适用于皮肤科和眼外科。在称为光动力疗法(pdt)的程序中，这种激光器也与光敏染料一起用于治疗肿瘤。与标准外科手术工具相比，激光器具有多种优势，包括：激光器比手术刀更精确。很少与皮肤或其他组织接触，因此，靠近切口的组织受到保护。激光产生的热量可对手术部位消毒，因此，降低了感染风险。激光器精度高，切口小，因此可缩短手术时间。愈合时间通常缩短；激光可热封血管，因此出血、肿胀或结疤少。激光手术复杂性降低。例如，使用光纤元件，无需切出较大切口，即可将激光输送到身体部位。许多程序均可由门诊部完成。可按以下两种方式使用激光器来治疗癌症：通过加热来缩小或消灭肿瘤，或激活一种可消灭癌细胞的化学物质(即“光敏剂”)。在pdt中，光敏剂保留在癌细胞中，通过光刺激，可引发反应，杀死癌细胞。co2和nd:yag激光器用于缩小或消灭肿瘤。医生可将它们与内窥镜、管一起使用，观察身体的某些区域(如膀胱)。某些激光器发出的光可通过装有光纤元件的柔性内窥镜传输。医生可观察并在只能通过外科手术才能接触到的身体部位进行操作，从而使激光束非常精确的瞄准。医生也可将激光器与低倍显微镜一起使用，清晰看到待治疗的部位。与其他仪器一起使用时，激光系统可产生一个直径只有200微米的切割区，这比非常细的螺纹宽度还要小。激光用于治疗多种类型的癌症。激光手术是某些阶段的声门(声带)癌、宫颈癌、皮肤癌、肺癌、阴道癌、外阴癌和阴茎癌的一种标准治疗方法。除用于消灭癌症之外，激光手术也有助于缓解因癌症而引起的症状(姑息治疗)。例如，激光可用于缩小或消灭堵塞患者气管的肿瘤，使患者呼吸顺畅。激光有时也用于结直肠癌和肛门癌的姑息治疗。激光诱导间质热疗(litt)是激光疗法最近的发展之一。litt的理念与一种称为“热疗”的癌症治疗方法相同；高温可破坏细胞或剥夺细胞赖以生存的物质，有助于缩小肿瘤。在这种治疗中，激光直接照射体内的间质区域(器官之间的区域)。然后，激光会使肿瘤的温度升高，破坏或消灭癌细胞。
[0949]
可在施用本文所述的癌症疫苗之前、之后和/或期间，施用免疫疗法和/或癌症疗法。根据特定癌症疫苗或特定联合疗法，使用癌症疫苗治疗的持续时间和/或剂量可能有所不同。本领域技术人员将理解特定癌症治疗剂的适当治疗时间。本发明考虑对每种癌症治疗剂的最佳治疗时间表进行进行持续评估，其中，通过本发明所述的方法确定的受试者癌症表型是确定最佳治疗剂量和时间表的一个因素。
[0950]
v.临床疗效
[0951]
可通过本领域已知的任何方法来衡量临床疗效。例如，对癌症疗法(例如，包含癌细胞的癌症疫苗，其中，所述癌细胞为：(1)pten缺陷癌细胞；(2)p53缺陷癌细胞；以及(3)经修饰可激活tgfβ-smad/p63信号通路)的反应与癌症(例如，肿瘤)对疗法的反应有关，优选与在新辅助或辅助化疗开始后肿瘤肿块和/或体积的变化有关。可在新辅助或辅助情况下评估肿瘤反应，其中，可将全身干预后肿瘤的大小与通过ct、pet、乳房x光检查、超声或触诊测得的初始大小和尺寸进行比较，可从组织学上评估肿瘤的细胞性，并与治疗开始前进行的肿瘤活检的细胞性进行比较。也可通过卡尺测量或在活检或手术切除后对肿瘤进行病理检查，进行反应评估。可采用定量(如肿瘤体积或细胞性的变化百分比或使用半定量评分系统(如残余癌症负荷(symmans等人(2007年)，《临床肿瘤学杂志》，25:4414-4422)或miller-payne评分(ogston等人(2003年)，《乳腺(苏格兰爱丁堡)》，12:320-327))或定性(如“病理完全反应”(pcr)、“临床完全缓解”(ccr)、“临床部分缓解”(cpr)、“临床稳定疾病”(csd)、“临床进展疾病”(cpd)或其他定性标准)的方式记录反应。开始新辅助疗法或辅助疗法后，
可在早期评估肿瘤反应，例如，在几小时、几天或几周后，或优选在几个月后。典型的反应评估终点为新辅助化疗终止时或手术切除残留肿瘤细胞和/或肿瘤床时，
[0952]
在一些实施例中，通过衡量临床获益率(cbr)来确定本文所述治疗的临床疗效。通过确定处于完全缓解(cr)状态的患者百分比、处于部分缓解(pr)状态的患者数量以及在自治疗结束起至少6个月的时间点患有稳定疾病(sd)的患者数量的总和，衡量临床获益率(cbr)。此公式的简写为cbr＝cr pr sd(六个月内)。在一些实施例中，特定癌症疫苗治疗方案的cbr为至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或更多。
[0953]
对癌症疗法(例如，包含癌细胞的癌症疫苗，其中，所述癌细胞为：(1)pten缺陷癌细胞；(2)p53缺陷癌细胞；以及(3)经修饰可激活tgfβ-smad/p63信号通路)的反应的附加评估标准涉及“生存期”，包括以下各项：直至死亡的生存期，也称为总生存期(其中，所述死亡可由各种原因造成或与肿瘤相关)；无复发生存期(其中，术语“复发”应包括局部复发和远处复发)；无转移生存期；无病生存期(其中，术语“疾病”应包括癌症及其相关疾病)。可参照已定义的起点(例如，诊断或开始治疗的时间)和终点(例如，死亡、复发或转移)计算所述生存期。此外，疗效标准可扩展至包括对化疗的反应、生存概率、给定时间段内的转移概率以及肿瘤复发概率。
[0954]
例如，为了确定适当的阈值，可向受试者群体施用本发明所含的特定药剂，并将结果与在施用任何癌症疗法(例如，包含癌细胞的癌症疫苗，其中，所述癌细胞为：(1)pten缺陷癌细胞；(2)p53缺陷癌细胞；以及(3)经修饰可激活tgfβ-smad/p63信号通路)前确定的生物标志物测量相关联。结果测量可以是对新辅助设置中给定疗法的病理反应。或者，在生物标志物测量值已知的癌症疗法(例如，包含癌细胞的癌症疫苗，其中，所述癌细胞为：(1)pten缺陷癌细胞；(2)p53缺陷癌细胞；以及(3)经修饰可激活tgfβ-smad/p63信号通路)后的一段时间内，可监测受试者的结果指标(如总生存期和无病生存期)。在某些情况下，向每个受试者施用相同剂量的药剂。在相关实施例中，给药剂量为本领域治疗剂的已知标准剂量。受试者的监测时间各有不同。例如，受试者的监测时间可至少为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55或60个月。可使用各种方法(如“示例”部分所述的方法)，确定与癌症疗法(例如，包含癌细胞的癌症疫苗，其中，所述癌细胞为：(1)pten缺陷癌细胞；(2)p53缺陷癌细胞；以及(3)经修饰可激活tgfβ-smad/p63信号通路)的结果有关的生物标志物测量阈值。
[0955]
vi.药物合成物及给药
[0956]
就本发明的癌症疫苗而言，对于每千克的受试者体重，癌细胞的施用量为1、10、1000、10,000、0.1x 106、0.2x 106、0.3x 106、0.4x 106、0.5x 106、0.6x 106、0.7x 106、0.8x 106、0.9x 106、1.0x 106、5.0x 106、1.0x 107、5.0x 107、1.0x 108、5.0x 108、1.0x 109个细胞或更多细胞，或介于两者之间的任何范围或介于两者之间的任何值。可根据给定时间内的所需移植水平，调整移植细胞数量。一般而言，可移植1
×
105至约1
×
109个细胞/千克体重、约1
×
106至约1
×
108个细胞/千克体重、约1
×
107个细胞/千克体重或更多细胞(必要时)。在一些实施例中，相对于平均大小的小鼠，有效细胞移植总数至少约为100、1000、10,000、0.1x106、0.5x106、1.0
×
106、2.0
×
106、3.0
×
106、4.0
×
106或5.0
×
106个。
[0957]
可通过本文所述的任何适当途径施用癌症疫苗，如输注。也可在施用抗癌剂之前、
之后或期间，施用癌症疫苗。
[0958]
可通过本领域常见的方法施用癌症疫苗。可通过直接注射或本领域所使用的任何其他方法(包括但不限于静脉内、脑内、胃肠外、腹膜内、静脉内、硬膜外、椎管内、胸骨内、关节内、滑膜内、囊内、动脉内、心内或肌肉内给药)，将药剂(包括细胞)引入所需部位。例如，可通过各种途径将移植细胞移植到目标受试者体内。此类途径包括但不限于静脉内给药、皮下给药、特定组织给药(如病灶性移植)、股骨骨髓腔注射、脾脏注射、胎肝肾包膜下给药等。在某些实施例中，向受试者瘤内或皮下施用本发明的癌症疫苗。可通过一次输注或在给定时间内连续输注，施用细胞，足以产生预期效果。移植细胞的移植、移植评估以及标记表型分析的示例性方法在本领域中十分常见(见pearson等人(2008年)，《当代免疫学方案》，81:15.21.1-15.21.21；ito等人(2002年)，《血液》，100:3175-3182；traggiai等人(2004年)，《科学》，304:104-107；ishikawa等人《血液》，(2005年)，106:1565-1573；shultz等人(2005年)，《免疫学杂志》，174:6477-6489；以及holyoake等人(1999年)，《实验血液学》，27:1418-1427)。
[0959]
可组合并使用两个或多个细胞类型，如癌症疫苗和干细胞的过继细胞转移、癌症疫苗和其他基于细胞的疫苗等。例如，过继细胞免疫疗法可与本发明的癌症疫苗联合使用。常见的过继细胞免疫疗法包括但不限于辐照自体或同种异体肿瘤细胞、肿瘤裂解物或凋亡肿瘤细胞、基于抗原呈递细胞的免疫疗法、基于树突状细胞的免疫疗法、过继t细胞转移、过继car t细胞疗法、自体免疫增强疗法(aiet)、癌症疫苗和/或抗原呈递细胞。此类基于细胞的免疫疗法可进一步进行修饰，以表达一个或多个基因产物(如表达细胞因子(如gm-csf))，从而进一步调节免疫应答，和/或表达肿瘤相关抗原(taa)(如mage-1、gp-100等)。本文所述癌症疫苗中的癌细胞与其他细胞类型的比值可以为1:1，但可调节为任何所需量(例如，1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1、8:1、8.5:1、9:1、9.5:1、10:1或更大)。
[0960]
可通过任何方法来评估移植细胞的移植，包括但不限于肿瘤体积、细胞因子水平、施用时间、在移植后的一个或多个时间从受试者体内获得的目标细胞的流式细胞分析。例如，基于时间的分析(等待1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28天)可指示肿瘤采集时间。任何此类指标均为变量，可根据常见的参数进行调整，以确定变量对抗癌免疫疗法反应的影响。此外，移植细胞可与其他药剂共移植，如细胞因子、细胞外机制、细胞培养支持体等。
[0961]
此外，可向受试者施用或以适用于给药的一种生物相容形式从受试者体外施用本发明的抗癌剂(例如，tgfβ超家族蛋白、增加表1中所列的至少一种生物标志物的拷贝数、数量和/或活性的药剂和/或免疫检查点抑制剂)。“适用于体内给药的生物相容形式”系指一种给药形式，其中，疗效胜于任何毒性作用。可以任何药理学形式施用抗癌剂，包括治疗有效量的单独药剂或与可药用载体结合。在本文中，短语“治疗有效量”系指以合理效益/风险比有效产生某些预期疗效(例如，治疗癌症)的药剂量。
[0962]
施用治疗有效量的本发明所述治疗合成物系指实现预期结果所需的有效量(在剂量和时间方面)。例如，根据个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及肽在个体中引起所需反应的能力等因素，药剂的治疗有效量可能有所不同。可调整给药方案，以提供最佳治疗反应。例如，每天可分几次给药，或根据治疗情况的紧急状态，可按比例减少剂量。
[0963]
组合剂型或单一药剂同时给药可导致患者体内同时存在有效量的每种所需调节剂。
[0964]
本文所述的治疗剂可采用方便的给药方式，如通过注射(皮下、静脉内等)、口服给药、吸入、透皮给药或直肠给药。根据给药途径，活性化合物可包覆在一种材料中，以保护化合物免受酶、酸和其他可能使化合物失活的自然条件的作用。例如，给药时，除胃肠外给药之外，可能需要用一种材料包覆药剂或将药剂与防止其失活的材料共同给药。
[0965]
可使用适当的载体、稀释剂或佐剂向个体施用、与酶抑制剂共同施用或使用适当的载体(如脂质体)施用药剂。可药用稀释剂包括盐水和缓冲水溶液。从广义来看，佐剂包括任何免疫刺激化合物(如干扰素)。本文所考虑的佐剂包括间苯二酚、非离子表面活性剂(如聚氧乙烯油基醚和正十六烷基聚乙烯醚)。酶抑制剂包括胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸(deep)和抑肽酶。脂质体包括水包油包水乳剂以及常规脂质体(sterna等人(1984年)，《神经免疫学杂志》，7:27)。
[0966]
也可胃肠外或腹腔内施用药剂。也可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物以及油中制备分散体。在普通的储存和使用条件下，这些制剂可含有防腐剂，以防止微生物生长。
[0967]
注射用药剂的药物合成物包括无菌水溶液(具有水溶性)或分散体以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，合成物优选为无菌合成物，且必须是容易注射的液体。合成物优选在生产和储存条件下稳定，并在保存时防止微生物(如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，包含水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其适当的混合物。通过使用卵磷脂等涂层、在分散的情况下保持所需粒度以及使用表面活性剂，可保持适当的流动性。使用羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等各种抗菌防霉剂，可防止微生物作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如，合成物中的糖、多元醇(如甘露醇)、山梨糖醇和氯化钠。在合成物中加入延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)，可延长注射合成物的吸收。
[0968]
向适当的试剂中加入所需量的本发明试剂以及上述一种成分或成分组合，然后按需进行过滤灭菌，即可制备无菌注射溶液。通常向无菌运载体(包含基础分散介质以及上述所需其他成分)中加入活性化合物，制备分散体。对于制备无菌注射溶液的无菌粉末，优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥，通过此类方法，可从其先前的无菌过滤溶液中产生包含药剂及任何附加所需成分的粉末。
[0969]
如上所述，当药剂受适当保护时，可使用惰性稀释剂或可吸收的食用载体等口服蛋白。在本文中，“可药用载体”包括任何及所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌防霉剂、等渗吸收延迟剂等。将此类介质和药剂用于药物活性物质在本领域中十分常见。除非任何常规介质或药剂与活性化合物不相容，否则考虑在治疗合成物中使用它们。也可将补充活性化合物加入合成物中。
[0970]
以单位剂型配制胃肠外合成物以易于给药及确保剂量均匀特别有利。在本文中，“单位剂型”系指用作待治疗哺乳动物受试者单位剂量的物理离散单位；每单位含有预定量的活性化合物，经计算，与所需药物载体结合时可产生预期疗效。本发明的单位剂型规格决定于并直接取决于：(a)活性化合物的特性和需达到的特定疗效，以及(b)合成此类活性化合物以进行个体敏感性治疗在领域的固有局限性。
[0971]
vii.试剂盒
[0972]
本发明还包括试剂盒。例如，所述试剂盒可包含pten和p53缺陷癌细胞(经本文所述修饰)、tgfβ超家族蛋白、增加表1中所列的至少一种生物标志物的拷贝数、数量和/或活性的药剂、免疫检查点抑制剂及其组合(包装在适当的容器内)，可进一步包括此类试剂的使用说明书。试剂盒还包含其他组件，如包装在独立容器中的给药工具。
[0973]
本发明的其他实施例见以下示例。通过以下示例对本发明进行了进一步的说明，但这些示例不应视为进一步的限制。本技术中引用的所有出版物、专利和已发表专利申请的内容以及附图通过本发明的引用，成为本发明的一部分。
[0974]
示例
[0975]
示例1：示例2-7的材料和方法
[0976]
a.细胞培养
[0977]
在添加10％胎牛血清(fbs)、25ng/ml氢化可的松、5μg/ml胰岛素、8.5ng/ml霍乱毒素、0.125ng/ml表皮生长因子(egf)、5μm y-27632rock1抑制剂、青霉素(100u/ml)和链霉素(100mg/ml)的dmem/f12(3:1)培养基中培养pp和pp
t
乳腺癌细胞。对于pp
t
细胞，每隔三天向培养基中新加入4ng/ml tgfβ1。在37℃下，在含5％co2的潮湿环境中培养细胞。从美国模式培养物保藏所(atcc)购买nmumg、hmec、mcf10a、zr-75-1、mda-mb-453、mda-mb-231、mcf7、bt549、hcc1954和hcc70细胞，并根据厂商说明书进行培养。
[0978]
b.抗体和试剂
[0979]
从millipore(美国马萨诸塞州比勒利卡)处购买tgfβ1(#gf111)。从biolegend公司(美国加利福尼亚州圣地亚哥)购买fitc抗小鼠cd45(30-f11)、pe/dazzle
tm 594抗小鼠cd3(145-2c11)、apc/cy7抗小鼠cd4(rm4-5)、alexa700抗小鼠cd8(53-6.7)、apc抗小鼠tnfα(mp6-xt22)、pe抗小鼠ifnγ(xmg1.2)、pe/cy7抗小鼠cd11c(n418)、apc/cy7抗小鼠i-a/i-e(m5/114.15.2)、percp/cy5抗小鼠cd103(2e7)、pe抗小鼠cd80(16-10a1)、fitc抗人cd45(h130)、alexa700抗人cd11c(bu15)、percp/cy5抗人cd80(2d10)、pacific blue
tm
抗人cd86(it2.2)和抗人apc cd103(ber-act8)。从细胞信号技术公司购买smad2(d43b4)家兔单克隆抗体(#5339)、phospho-smad2(ser465/467；138d4)家兔单克隆抗体、lamin a/c(4c11)小鼠单克隆抗体以及p63(d9l7l)家兔单克隆抗体(#39692)。从西格玛奥德里奇公司购买抗黏着斑蛋白抗体(#v9131)。
[0980]
c.实时pcr
[0981]
根据制造商说明书，使用applied7300快速实时pcr系统上的select预混液进行实时pcr。简而言之，培养周期如下：在95℃下，培养10分钟；然后在95℃下，培养15秒；在60℃下，培养1分钟。在40个周期后，完成扩增，并测量熔解曲线。用于实时pcr检测的引物见表格3。
[0982]
表3
[0983]
[0984]
[0985]
[0986]
[0987][0988]
d.流式细胞术分析
[0989]
为了获得单细胞悬液，首先通过机械解离破坏肿瘤，然后在37℃下在解离缓冲液(dmem中的1x胶原酶/透明质酸酶[#07912，干细胞技术公司]、10mm hepes、5％fbs、100ng/ml dnase i[#07900，干细胞技术公司]和青霉素-链霉素[#14140122，赛默飞世尔公司])中消化1小时。首先，使脾脏和淋巴结通过70和40μm的细胞过滤器，将其解离。通过眶后出血，使用edta微量毛细管(#47729-742，vwr)和微量采血管(#0266933，赛默飞世尔公司)采集血液，并通过离心分离血细胞。对于所有组织，使用氯化铵(4倍体积的0.8％nh4cl 0.1mm edta[#07850，干细胞技术公司]加上1倍体积的pbs)裂解红细胞。然后，使用抗cd16/32(93，biolegend公司)阻断单细胞悬液，并使用适当的细胞表面抗体进行染色。为进行细胞内染色，根据制造商说明书，使用固定和透化洗涤缓冲液(#421002和#4208801，biolegend公司)固定和透化细胞。门控策略见“补充方法”部分。
[0990]
e.动物实验
[0991]
从taconic生物科学公司购买6-8周龄雌性裸小鼠、scid小鼠和野生型fvb小鼠。在pp和pp
t
细胞肿瘤形成检测中，将1
×
106个细胞注射到50％基质胶的第三脂肪垫中。在肿瘤移植检测中，将1
×
105个经胶原酶消化的pp肿瘤细胞注射到10％基质胶的第三脂肪垫中。在疫苗接种检测中，将1
×
106个pp
t
细胞皮下注射到10％基质胶中。一个月后，将pp细胞或肿瘤注射到免疫小鼠的第三脂肪垫中。在体内耗竭检测中，在肿瘤攻击前一周以及此后每周向小鼠静脉内注射ultra-leaf
tm
纯化抗cd3(200μg/小鼠，145-2c11，biolegend公司)、抗cd4(200μg/小鼠，gk1.5，biolegend公司)、抗cd8(200μg/小鼠，53-6.7，biolegend公司)或抗igg(200μg/小鼠，htk888，biolegend公司)。所有小鼠实验均根据有关动物保护的联邦法律以及当地兽医办公室的许可进行，并符合丹娜法伯癌症研究院和哈佛医学院的机构动物护理和使用委员会所批准的指南。
[0992]
f.小鼠转录组方法和分析
[0993]
在上述研究中，使用包含4604个癌症和免疫相关基因的ion ampliseq
tm custom panel(赛默飞世尔公司使用ion ampliseq
tm designer设计)(goel等人(2017年)，《自然》，548:471-475)。对于每个样本，使用10ng的总rna制备cdna库。使用ion onetouch
tm 2系统对此库进行多路复用和扩增，并在ion torrent proton
tm
系统(赛默飞世尔公司)上进行测序。使用赛默飞世尔公司的torrent suite
tm
和ampliseq
tm rna分析插件，生成计数数据。在基因本体富集和kegg通路分析中，使用平均倍数变化(pp
t
与pp)大于2或小于0.4的基因。使用cytoscape软件和string插件进行基因本体富集和kegg通路分析。
[0994]
g.体外未成熟dc分化及激活
[0995]
根据厂商说明书，使用easysep
tm
小鼠单核细胞分离试剂盒(#19861，干细胞技术公司)，从野生型雌性fvb小鼠中分离小鼠骨髓单核细胞。在包含20ng/ml小鼠重组gm-csf(干细胞技术公司，#78017)、10ng/ml小鼠重组il-4(干细胞技术公司，#78047)和10％fbs的rpmi 1640培养基中培养富集单核细胞1周。然后，按1:1的比率培养未成熟dc和所示细胞24小时。从allcells公司(#abm001，马萨诸塞州)购买人骨髓。根据厂商说明书，使用easysep
tm
人单核细胞分离试剂盒(#19359，干细胞公司)分离单核细胞。然后，在包含10％fbs、20ng/ml人重组gm-csf(#78190，干细胞公司)和10ng/ml人重组il-4(#78045，干细胞公司)的rpmi 1640培养基中培养单核细胞1周。在按1:1的比率与人乳腺癌细胞系培养24小时后，通过流式细胞术确定dc功能。
[0996]
h.混合淋巴细胞反应检测
[0997]
使从野生型雌性fvb小鼠中采集的脾脏通过70μm的细胞过滤器，将其机械解离。然后，根据制造商说明书，使用easysep
tm
小鼠pan-初始t细胞分离试剂盒(干细胞技术公司，#19848)分离初始cd3 t细胞。在存在或不存在未成熟dc的情况下，以10:1的比率共培养纯化t细胞和肿瘤细胞。过夜共培养后，收获细胞，并通过流式细胞术确定t细胞激活情况。
[0998]
i.核蛋白和细胞质蛋白提取、免疫共沉淀和western印迹法
[0999]
使用细胞质提取(ce)缓冲液(包含10mm hepes(ph 7.6)、50mm kcl、0.05％np40、磷酸酶和蛋白酶抑制剂的1x pbs)在冰上裂解细胞5分钟。以2,300g离心力将细胞裂解物离心5分钟，收集上清液，作为细胞质部分。使用ce缓冲液洗涤三次后，在核提取缓冲液(包含20mm hepes ph 7.6、100mm kcl、5％甘油、0.5％np40、磷酸酶和蛋白酶抑制剂的1x pbs)中通过声波降解法裂解沉淀物。以13,400g离心力将细胞裂解物离心5分钟，收集上清液，作为核部分。在免疫共沉淀检测中，将细胞提取物调整为20mm hepes(ph 7.6)、0.1％np40、50mm kcl、5％甘油和2.5mm mgcl2，并在4℃下使用适当的一级抗体或igg过夜培养。向混合物中加入蛋白a/g磁珠，并培养2小时。使用结合缓冲液洗涤三次后，将磁珠重悬于1x western印迹上样缓冲液中，在95℃下变性10分钟。如上所述，进行western印迹法分析(tang等人(2015年)，《自然-通讯》，6:8230)。
[1000]
j.统计分析
[1001]
以均值
±
sem的形式表示定量数据。通过t检验，将两组和anova与三组或更多组的事后分析进行比较，确定是否具有统计学意义。p值《0.05时，认为具有统计学意义。
[1002]
示例2：经tgfβ处理的肿瘤细胞诱导t细胞依赖性抗肿瘤免疫反应。
[1003]
转化生长因子β(tgfβ)是一种多能细胞因子，在调控胚胎发育、细胞代谢、肿瘤进展和免疫系统稳态方面发挥着关键作用(david和massague(2018年)，《自然综述-分子细胞生物学》，19:419-435)。tgfβ在质膜上与其受体结合后，以依赖于smad和独立的方式调控其下游基因的表达(图16)。
[1004]
在人类癌症中，肿瘤抑制因子p53或pten缺失是最常见的一个事件(lawrence等人(2014年)，《自然》，505:495-501)。大多数晚期上皮性肿瘤(包括三阴性乳腺癌(tnbc))均缺失p53和pten(癌症基因组图谱网络(2012年)，《自然》，490:61-70)。生成了tnbc的同系基因工程小鼠模型(gemm)，tnbc源自雌性fvb小鼠(携带k14-cre；trp53
l/l
；pten
l/l
)中p53(在小鼠中由trp53编码)和pten(称为pp)的并发消融(berrueta等人(2018年)，《科学报告》，8:7864)。为了研究含tgfβ信号的肿瘤细胞与免疫系统的相互作用，在很长一段时间(例如，1个月)内，使用tgfβ在体外处理原代pp肿瘤细胞，然后将其移植到fvb雌性小鼠体内。经确认，这些经tgfβ处理的pp细胞(称为pp
t
)包含tgfβ信号，可显著诱导上皮-间充质转化(emt；图1b)。出乎意料的是，虽然向野生型fvb小鼠原位注射了pp细胞，导致肿瘤形成并完全渗透，尽管具有emt表型，但pp
t
细胞在fvb受体中完全无法形成肿瘤，这通常与更具侵袭性的肿瘤相关(图1c)。然而，pp和pp
t
细胞均可在缺乏适应性免疫的免疫受损小鼠宿主(包括无
胸腺裸小鼠和严重联合免疫缺陷(scid)小鼠)中生长，但pp
t
肿瘤的生长速率比pp肿瘤慢(图2a和图2b)。
[1005]
为了进一步评估pp
t
细胞的免疫排斥是否需要t细胞，在移植pp
t
细胞的受体fvb小鼠中注射抗cd3抗体，使cd3 t细胞耗竭。在这种情况下，与包含丰富t细胞的fvb小鼠中pp
t
细胞完全不生长的情况相反，pp
t
细胞能够在t细胞耗竭后形成具有100％外显率的肿瘤(图3a和图3b)。在移植pp或pp
t
肿瘤细胞后6天，从宿主小鼠中采集肿瘤组织、脾脏和血液，并通过流式细胞术分析t细胞(图3c)。与携带pp的小鼠相比，pp
t
移植小鼠肿瘤和血液中的cd4 和cd8 t细胞水平丰度以及tnfα和infγ产生量增加(图3d-3i)。总之，这些结果表明肿瘤细胞中的激活tgfβ信号触发了细胞毒性t细胞介导的抗肿瘤免疫反应。
[1006]
示例3：dc在介导tgfβ诱导抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用。
[1007]
同时，在移植后6天，对从受体小鼠中分离的pp和pp
t
肿瘤组织上的一组4604个癌症和免疫相关基因进行转录组分析。显而易见，与pp肿瘤相比，pp
t
肿瘤中具有与多个免疫途径激活相关的基因本体(go)术语的基因表达显著上调(图4a)。通过实时定量pcr，进一步证实了编码细胞因子、细胞因子受体和t细胞共刺激分子的基因显著上调(图4b)。此外，与pp肿瘤相比，pp
t
肿瘤部位中编码i类和ii类主要组织相容性复合物(mhc)组分的基因(如h2-d1、h2-ab1和cd74)的表达显著上调(图4b)。这些数据进一步证实了pp
t
细胞能够在肿瘤微环境中引起强大的免疫应答。
[1008]
值得注意的是，cd74(也称为hla ii类生物相容性抗原γ链)位于pp
t
肿瘤组织中上调免疫相关网络的顶部(图4c)。流式细胞术分析确定，pp或pp
t
肿瘤细胞均不表达mhc ii类分子(图5a和图5b)，这表明抗原呈递细胞(apc)，特别是树突状细胞(dc)，可能参与宿主动物的pp
t
肿瘤诱导免疫应答。的确，与pp肿瘤相比，pp
t
肿瘤的肿瘤浸润dc数量明显更高(图4d)。进一步的分析表明，pp
t
肿瘤相关dc的cd80(一种t细胞激活所需的共刺激分子)、cd103(一种启动肿瘤特异性cd8 t细胞并运输效应t细胞的关键分子)以及mhc-ii抗原呈递机构的水平也增加(eisenbarth(2019年)，19:89-103；worbs等人(2017年)，《自然综述-免疫学》，17:30-48)(图4e)。这些观察结果表明，肿瘤相关dc在介导对经tgfβ处理的肿瘤细胞的抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用。
[1009]
为了说明pp
t
肿瘤细胞在被引入具有免疫能力的宿主动物中时如何引起抗肿瘤免疫反应，对pp或pp
t
肿瘤细胞与dc或t细胞进行体外共培养实验。对骨髓来源的dc(bmdc)(从未经治疗的小鼠中获得)与肿瘤细胞进行共培养，结果表明，pp
t
细胞(而不是pp)能够激活bmdc(图4f和图4g)。对t细胞(从未经治疗的fvb小鼠脾脏中分离)与肿瘤细胞进行类似的共培养，结果表明，t细胞在与pp或pp
t
细胞共培养时，并未激活(图5c和图5d)。但是，存在dc时，cd4 和cd8 t细胞在与ppt细胞(而不是pp细胞)共培养时均得到激活(图4h和图4i)。这些结果表明，pp
t
细胞触发dc激活，从而启动适应性免疫应答，进而启动t细胞，以靶向pp
t
肿瘤细胞(图17)。
[1010]
示例4：tgfβ通过tgfβ-smad/p63信号轴刺激抗肿瘤免疫反应。
[1011]
接下来，确定分子机制，通过此机制，延长使用tgfβ处理肿瘤细胞的时间，可将免疫原性提高至在pp
t
细胞中观察到的免疫原性。由于smad蛋白为tgfβ信号的特异性转录效应子(xu等人(2016年)，《冷泉港实验室生物学展望》，8:a022087；budi等人(2017年)，《细胞生物学趋势》，27:658-672；cantelli等人(2017年)，《癌症生物学研讨会》，42:60-69)，通过
转录组分析，分析pp
t
细胞中smad和smad相关转录因子表达水平。显而易见，在smad相关转录网络中，p63(在小鼠中由trp63编码)的表达水平最高(图6a)。转录因子p63是p53家族的一个成员，据报告，根据细胞环境，可抑制或促进肿瘤进展(bergholz和xiao(2012年)，《癌症微环境》，5:311-322；adorno等人(2009年)，《细胞》，137:87-98；memmi等人(2015年)，《美国国家科学院院刊》，112:3499-3504；chen等人(2018年)，《细胞与分子生命科学》，75:965-973；yoh等人(2016年)，《美国国家科学院院刊》，113:e6107-e6116)。为了确定p63在pp
t
细胞中的作用，通过短发夹rna(shrna)使p63耗竭，并将p63敲除pp
t
细胞移植到fvb小鼠中。值得注意的是，虽然表达对照shrna的pp
t
细胞未能形成肿瘤，但表达shtrp63-1和不可检测p63蛋白水平的pp
t
细胞迅速形成具有完全外显率的肿瘤(图6b)。与表达shtrp63-1的细胞相比，表达shtrp63-2且p63仍可检测的pp
t
细胞所形成的肿瘤具有较长的潜伏期以及较低的外显率(70％)(图6b)。此外，表达shtrp63-1或shtrp63-2的pp
t
细胞失去在共培养系统中激活bmdc的能力(图6c)。这些结果表明，p63在介导因tgfβ处理诱导的增强免疫原性和免疫敏感性中具有重要的作用，导致未能规避免疫系统攻击，并丧失致瘤性。
[1012]
值得注意的是，pp和pp
t
细胞均表达大量的p63(图7a)。为了研究p63在pp和pp
t
细胞中为何及如何发挥不同的作用，进行了免疫荧光分析，以检测p63和smad2的细胞定位。结果表明，p63在pp和pp
t
细胞核中，而smad2则仅限于pp细胞的细胞质区室中，但位于pp
t
细胞的细胞质和细胞核中(图7b)。通过细胞分离，验证p63和smad2的细胞定位(图7c)，通过免疫共沉淀确认其是否在pp
t
细胞核中结合(图7d)。这些数据表明，p63可作为核smad的辅因子，靶向特定基因组，以便在tgfβ处理后进行转录调控。
[1013]
为了确定由p63和smad2共调控的转录程序，通过shrna介导的p63或smad2表达沉默对pp
t
细胞进行转录组分析。表达shtrp63或shsmad2的pp
t
细胞中约70％的变异基因由p63和smad2共调控(图8a和图8b)。值得注意的是，虽然在表达shtrp63和shsmad2的pp
t
细胞中多个主要致癌信号通路均上调，但许多免疫调控通路均下调(图8c和图8d)。
[1014]
示例5：tgfβ-smad/p63信号激活对人肿瘤细胞进行重编程，以类似方式激活dc。
[1015]
为了确定tgfβ-smad/p63通路是否在人肿瘤细胞与免疫系统的相互作用中也很重要，对一组乳腺癌细胞系进行了筛选，结果表明，大多数细胞系均未表达p63。仅hcc1954和筛选的两个非癌细胞系表达p63，其表达水平可通过western印迹法检测到(图9a)。使用tgfβ处理hcc1954和mcf7细胞，并将其与人dc共培养(图9b)。与上述结果一致，在tgfβ处理后，仅hcc1954细胞(而不是mcf7)能够诱导dc激活(图9c-9e)。这些数据表明，tgfβ-smad/p63信号激活也可对人肿瘤细胞进行重编程，以类似方式激活dc。更重要的是，基于tp63/smad的基因表达特征水平较高的乳腺癌患者的生存结果优于基于tp63/smad的基因表达特征水平较低的乳腺癌患者的生存结果(图9f)。
[1016]
示例6：pp
t
细胞对阻断其亲本pp肿瘤细胞的生长具有疗效。
[1017]
确定由pp
t
细胞引起的增强免疫应答是否可延长其对未经tgfβ处理的亲本pp肿瘤细胞的细胞毒性作用，这对于癌症治疗具有重要的意义。值得注意的是，将pp
t
细胞与pp肿瘤细胞共同注射到fvb小鼠体内，会完全阻断pp肿瘤的生长(图10a和图10b)。结果表明，pp
t
诱导对其亲本pp肿瘤细胞产生抗肿瘤免疫反应。
[1018]
示例7：pp
t
细胞通过诱导记忆t细胞应答，对亲本pp肿瘤细胞具有强大的疫苗活性。
[1019]
为了进一步了解pp
t
细胞的抗肿瘤免疫反应，确定pp
t
细胞是否可诱导肿瘤特异性记忆t细胞应答。在注射pp
t
细胞后1周、2周和6周，分析从携带pp
t
细胞的小鼠脾脏和淋巴结中采集的t细胞，结果表明，cd4 中央记忆(t
cm
)t细胞和/或效应记忆(t
em
)t细胞这两个群体均增加(图11a和图11b)。注射pp
t
细胞后，还这些小鼠中观察到长期脾cd8 t
cm
和t
em
细胞增加(图11c和图11d)。
[1020]
接下来，确定pp
t
细胞是否可防止原发部位以及远端组织(即肺部)中亲本pp细胞的生长。值得注意的是，在将pp肿瘤细胞或肿瘤片段引入fvb小鼠(先前已使用pp
t
细胞进行免疫)的乳腺脂肪垫时，它们被完全排斥(图12a-12e)。此外，通过尾静脉注射，将pp细胞引入pp
t
免疫小鼠中，以在循环中模拟转移肿瘤细胞。在注射后4周进行了分析，发现对照小鼠肺部出现了大量转移性负荷，而pp
t
免疫小鼠的肿瘤病灶已完全清除(图12f和图12g)。
[1021]
结果进一步表明，pp
t
细胞免疫小鼠的pp肿瘤细胞注射部位的肿瘤浸润cd4 和cd8 t细胞显著增加(图13a和图13b)。在免疫小鼠的这些部位，cd4 和cd8 效应记忆t细胞以及中央记忆t细胞也大幅增加(图13c和图13d)。
[1022]
示例8：pp
t
细胞的疫苗效果未因亚致死剂量的辐照而减弱。
[1023]
为了防止进一步的细胞分裂，使用亚致死剂量的辐照(100gy)处理pp
t
肿瘤细胞，并确定辐照是否影响pp
t
肿瘤细胞疫苗效果的效力。如图14a-14c所示，移植pp肿瘤片段时，使用辐照pp
t
细胞进行免疫的小鼠的肿瘤进展完全被阻断(图14a-14c)。相比之下，pp肿瘤片段在非免疫小鼠体内快速移植并生长(图14a-14c)。同时，也使用相同剂量的辐照处理pp肿瘤细胞，并将它们注射到小鼠的一侧，4周后，将pp肿瘤片段移植到这些小鼠的另一侧。辐照pp肿瘤细胞在体内未能生长，这表明辐照可防止pp肿瘤细胞在体内进一步增殖。值得注意的是，预先注射辐照pp肿瘤细胞能够延迟移植pp肿瘤片段的生长并延长生存期，但其作用有限(图14a-14c)。
[1024]
示例9：对于其他肿瘤类型，pp
t
可以是一种有效的同种异体疫苗。
[1025]
自体肿瘤细胞疫苗很大程度上受到肿瘤组织可用性的限制。因此，同样重要的是，确定pp
t
是否也可用作遗传背景相似但具有不同类型肿瘤的其他肿瘤或具有不同基因突变的相同肿瘤类型的同种异体疫苗。结果表明，pp
t
疫苗接种完全阻断了ppa肿瘤(一种侵袭性极高的乳腺癌，其特征在于，p53、pten和p110α三重缺失；图15a和图15b)的生长。值得注意的是，在pp
t
免疫小鼠中，9/10的c260肿瘤移植物(一种因p53/pten共缺失和高度myc表达而引起的高级别浆液性卵巢癌)受到排斥，1/10的c260最终生长，但时间延迟很久(图15c和15d)。此外，pp
t
疫苗接种显著延迟了d658(一种从乳腺癌的pik3ca
h1047r gemm中产生的kras突变复发性乳腺癌细胞模型)和d333(一种源自p53和pten共缺失gemm的胶质母细胞瘤肿瘤模型)的肿瘤潜伏期，并显著延长了这些小鼠的生存期(图15e-15h)。数据表明，pp
t
不仅可用作具有相同基因变化(即p53和pten缺失)的其他上皮性肿瘤的高效同种异体疫苗，也可用作具有不同癌症突变的不同类型癌症的活性生物制剂。本文所述的数据支持基于肿瘤细胞的疫苗(t.vax)平台(图18)。
[1026]
参引合并
[1027]
本文中提及的所有出版物、专利和专利申请通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分，就像各个出版物、专利或专利申请均具体、单独表明通过本发明的引用，成为本发明的一部分。如有冲突，应以本技术(包括其中的任何定义)为准。
[1028]
通过本发明的整体引用，任何多核苷酸和多肽序列也成为本发明的一部分，它们引用与公共数据库(如美国基因组研究所(tigr)在万维网tigr.org和/或美国国家生物技术信息中心(ncbi)在万维网ncbi.nlm.nih.gov维护的公共数据库)中的一个条目相关的登录号。
[1029]
等同
[1030]
本领域技术人员将认识到或能够仅通过常规实验确定本文所述的本发明特定实施例的许多等同。此类等同拟在以下权利要求的范围内。
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
