活化部分凝血活酶生成联合纠正试验及检测试剂盒的制作方法

1.本发明涉及体外诊断出血性疾病的检验方法及检测试剂盒。


背景技术：

2.目前临床各种不同的出血性疾病，需不同的检验方法进行筛查、排除、诊断，需要多次采血检验，麻烦、费时、成本高。本方法用一人份试剂盒，用血凝仪对五种出血性疾病进行实验室诊断，免去了单项检测多次采血、延长诊断时间、价格较高的弊端。本方法敏感性、准确性都较高。
3.本发明方法借鉴了上世纪90年代以前的检验方法：《血清凝血酶原生成及纠正试验》、《简易凝血活酶生成及纠正试验》，这类方法试剂制作及检测方法全手工操作，过程繁琐、标准不统一、敏感性、准确性都较低，早已停止应用。
4.本发明方法适合于试剂生产厂家进行标准化生产，凝血仪厂家在全自动凝血仪中固定试剂位，全自动测定、全自动制作标准曲线，保证了检验质量。


技术实现要素：

5.本发明目的是为了给临床提供一种简便、快速、灵敏、准确的检验方法，这个实验方法可一次采血、用一份试剂对五种出血性疾病进行实验室诊断。
6.本发明一方面提供一种可用于临床检测五种出血性疾病的实验方法。其特点在于以下步骤：步骤（1）：采用含有新鲜混合血浆、硫酸钡吸附血浆和储存血清的试剂盒。
7.步骤（2）：在试剂盒的每管中加入一定量待测患者血浆，分别对上述各管测定活化部分凝血活酶时间（aptt）。步骤（3）用储存血清、硫酸钡吸附血浆分别对混合血浆进行不同浓度稀释后，测定活化部分凝血活酶时间（aptt）得到因子
ⅷ
、
ⅸ
标准曲线，对患者因子
ⅷ
、
ⅸ
进行定量测定。通过含试剂管与患者血浆管aptt时间的对比情况(纠正情况)及定量结果对五种出血性疾病进行实验室诊断。
8.本发明第二方面提供一种检测五种出血性疾病的试剂盒，其特征在于包括含有冻干硫酸钡吸附血浆的试剂管、含有冻干储存血清的试剂管和含有冻干正常人混合血浆的试剂管。
9.本发明的试验原理是：当患者血液中内源性凝血因子和共同途径凝血因子减少时，或含有抗凝物质时活化部分凝血活酶时间（aptt）延长。用含有全部凝血因子的正常人血浆、含有因子
ⅷ
因子
ⅸ
的硫酸钡吸附血浆、含有因子
ⅸ
因子
ⅺ
的储存血清进行aptt的纠正试验。根据患者血浆被纠正情况可对因子
ⅷ
、因子
ⅸ
、因子
ⅺ
缺乏症，对多种凝血因子缺乏和有抗凝物质存在的出血性疾病进行实验诊断。
具体实施方式
10.试剂
活化部分凝血活酶试剂：市场有售。
11.硫酸钡吸附血浆制作方法：分别取10人以上正常人血液，以109mmol/l枸橼酸钠1：9抗凝， 3000转/min离心10min，吸取上层血浆，并将10人以上血浆进行混合，得到新鲜混合血浆。用容器取一定量混合血浆按每毫升血浆加入100mg干燥硫酸钡，于37℃水浴中用不断搅拌15min。将上述液体3000转/min离心30分钟，分离出的上清即为硫酸钡吸附血浆。
12.储存血清制作方法：分别取10人以上正常人血液，在容器中自然凝固。放于37℃温箱中24小时，取出后3000转/min离心10min，吸取上层血清，并将10人以上血清进行混合，得到储存血清。
13.正常人混合血浆制作方法：分别取10人以上正常人血液，以109mmol/l枸橼酸钠1：9抗凝， 3000转/min离心10min，吸取上层血浆，并将10人以上血浆进行混合，得到新鲜混合血浆。
14.试剂盒含4个试管：第1管 为空管；第2管 加入硫酸钡吸附血浆0.1ml；第3管 加入储存血清0.1ml；第4管 加入正常人新鲜血浆0.1ml。
15.按生产血浆性检验试剂的方法冻干后，即为1人份的检测试剂盒，冷藏保存。
16.测定方法定性方法取待测患者血液1.8ml，加入到含0.2ml枸橼酸钠抗凝采血管中，轻轻颠倒混匀三次 ，3000转/min离心10min，吸取上层血浆备用。
17.取出试剂盒，回复至室温。
18.每个管中分别加入患者血浆0.1ml，轻轻充分混匀。对4个管分别进行aptt测定（测定方法见全国临床检验操作规程，4版96页），记录每一管凝固时间。
19.结果判定1号管（患者血浆管）aptt时间延长，超过aptt参考值高限10秒以上，说明患者有凝血障碍。如下各管较1号管时间缩短10秒以上即为纠正。
20.测试管因子
ⅷ
缺乏因子
ⅸ
缺乏因子
ⅺ
缺乏多种凝血因子缺乏有抗凝物质或伴凝血因子缺乏2号管纠正不纠正纠正不纠正不纠正3号管不纠正纠正纠正不纠正不纠正4号管纠正纠正纠正纠正不纠正
对因子
ⅷ
、因子
ⅸ
的定量方法标准曲线制备：用储存血浆或硫酸钡吸附血浆分别对正常混合血浆进行如下稀释：原倍(100%)、75%、50%、25%、12.5%、6.25%、不含正常血浆(0%)（相当于因子
ⅷ
或因子
ⅸ
活性百分率），分别进行aptt测定，记录aptt时间，以纵坐标为活性百分率，横坐标为相对应的aptt时间，分别得出因子
ⅷ
(硫酸钡吸附血浆)、因子
ⅸ
(储存血浆)标准曲线。
21.根据患者硫酸钡吸附血浆或储存血浆的aptt时间的结果，由标准曲线中查出或计算出患者因子
ⅷ
或因子
ⅸ
含量的百分率，即得出定量结果。
22.临床意义硫酸钡吸附血浆纠正，储存血浆不纠正，正常血浆纠正，见于因子
ⅷ
缺乏症，即血友病甲。
23.硫酸钡吸附血浆不纠正，储存血浆纠正，正常血浆纠正，见于因子
ⅸ
缺乏症，即血友病乙。
24.硫酸钡吸附血浆、储存血浆、正常血浆均纠正，见于因子
ⅺ
缺乏症。
25.硫酸钡吸附血浆、储存血浆均不纠正，正常血浆纠正，为多种凝血因子缺乏，见于严重的肝病，维生素k缺乏、早期弥漫性血管内凝血等多种疾病。
26.硫酸钡吸附血浆、储存血浆、正常血浆均不纠正，为存在抗凝物质或同时伴多种凝血因子缺乏，见于口服抗凝剂、肝素、fdp存在等等。
27.血浆、血清来源较容易，制作试剂盒过程较简单，试剂生产厂家进行标准化生产；凝血仪厂家可以在全自动凝血仪中固定试剂位，全自动测定、全自动制作标准曲线。还可以用检验科、检验所检测结果（包括凝血4项、梅毒、艾滋、乙丙肝等）完全正常的检验后剩余的血浆、血清积累起来-20℃保存，用于生产试剂，且废物利用，成本非常低，检测收费也会较低。


技术特征：
1.一种在临床上同时检测五种出血性疾病的方法，其特征在于：用新鲜混合血浆、硫酸钡吸附血浆、混合血清制作测定试剂盒。2.在上述试剂盒的试管中分别加入待测患者血浆测定活化部分凝血活酶时间（aptt），通过纠正情况对五种出血性疾病进行实验室诊断。3.用储存血清、硫酸钡吸附血浆分别对混合血浆进行不同浓度稀释后，测定活化部分凝血活酶时间（aptt）得到因子
ⅷ
、
ⅸ
标准曲线，对患者因子
ⅷ
、
ⅸ
进行定量测定。

技术总结
本发明涉及一种在临床上同时对五种出血性疾病进行检测的方法和试剂盒的制作。其特征包括以下步骤:步骤（1）制作含有新鲜混合血浆、硫酸钡吸附血浆和储存血清的试剂盒。步骤（2）在试剂盒的每个管中加入一定量待测患者血浆，分别对上述各管测定活化部分凝血活酶时间（APTT）。通过含试剂管与患者血浆APTT时间的对比情况(纠正情况)对五种出血性疾病进行实验室诊断。步骤（3）用储存血清、硫酸钡吸附血浆分别对混合血浆进行不同浓度稀释后，测定活化部分凝血活酶时间（APTT）得到因子


技术研发人员：周丽艳
受保护的技术使用者：周丽艳
技术研发日：2020.09.02
技术公布日：2022/3/18