金丝桃苷在制备防治视网膜退行性疾病的药物中的应用的制作方法

1.本发明属于医药技术领域，涉及金丝桃苷在制备防治视网膜退行性疾病的药物中的应用。


背景技术：

2.光感受器细胞是视网膜感受光刺激，并产生神经冲动传向中枢神经的视网膜一级感觉神经元，在外界信息经视觉系统传入大脑过程中扮演着极其重要的角色。光感受器细胞包括视杆细胞和视锥细胞，其中视杆细胞负责暗视觉形成，视锥细胞负责明视觉和精细视觉等。多种环境及遗传因素可导致光感受器细胞不可逆损伤，其退行性改变可直接导致视力障碍甚至失明，是包括年龄相关性黄斑变性、stargardt病、视锥-视杆细胞营养不良、视网膜色素变性等疾病的核心病理学基础。干预光感受细胞死亡及其导致光感受器退行性改变对上述相关视网膜退行性疾病的发生发展可起到有效的防治作用。
3.年龄相关性黄斑变性是世界范围内最常见的严重危害视力健康甚至致盲的视网膜退行性病变的主要类型之一。我国流行病学调查显示，50岁以上人群年龄相关性黄斑变性的患病率近15.5％。人口老龄化直接导致年龄相关性黄斑变性的患病率逐年增加，已构成严重的社会公共卫生问题。年龄相关性黄斑变性的临床表现一般分为“干性”和“湿性”两种类型。干性老年黄斑变性，多发生于50岁以上。视力表现为缓慢进行性下降或视物变形，占年龄相关性黄斑变性的发病的90％以上，目前尚无有效治疗药物。视锥、视杆细胞营养不良是一组遗传病，由abca4等基因突变引起，以视力减退、夜盲、视野缩小、光感受器功能不良为主要特征，目前尚无有效治疗药物。视网膜色素变性是一种以遗传因素为主导的进行性、营养不良性的视网膜退行性病变，涉及基因多样，甚至同一基因可在不同患者中表现为不同的突变。主要表现为慢性进行性视野缺失、视盲、夜盲、视网膜电流图异常、视力障碍甚至失明，目前尚无有效治疗药物。
4.金丝桃苷化合物英文为hyperoside，中文名称简称为金丝桃苷，其化学结构如下式所示：
[0005][0006]
现有文献尚未报道金丝桃苷在治疗以光感受器退行性改变为核心病理的疾病如年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、stargardt病、视锥-视杆细胞营养不良等视网膜退行性疾病干预方面的活性。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的就是提供一种金丝桃苷在制备防治视网膜退行性疾病的药物中的应用。
[0008]
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0009]
一种金丝桃苷在制备防治视网膜退行性疾病的药物中的应用，优选的，所制备的药物，就有效组分而言，包括金丝桃苷单一组分，或金丝桃苷与其他药学上可接受的组分共同构成的组合物，例如其他治疗眼部疾病的药物。
[0010]
进一步地，所述的金丝桃苷为具有如下结构式的化合物，或其药学上可接受的盐，
[0011][0012]
进一步地，所制备的药物包括金丝桃苷，与药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
[0013]
进一步地，所述的载体包括眼用溶剂的附加剂、注射用附加剂、片剂用附加剂、表面活性剂或稳定剂中的至少一种。
[0014]
进一步地，所述的金丝桃苷用于制备能够治疗和/或预防视网膜退行性疾病的药物，所述的视网膜退行性疾病是以视网膜光感受器细胞死亡为核心病理。
[0015]
进一步地，所述的视网膜退行性疾病为年龄相关性黄斑变性、stargardt病、视锥-视杆细胞营养不良、视网膜色素变性中的至少一种而导致的视网膜退行性疾病。
[0016]
进一步地，所述的金丝桃苷在抑制视网膜光损伤中的应用，具体包括以下方面中的至少一种：
[0017]
1)用于预防或治疗视网膜光感受器细胞死亡；
[0018]
2)用于维持视网膜外核层形态；
[0019]
3)用于保护视网膜功能；
[0020]
4)用于防止视网膜外核层厚度降低；
[0021]
5)用于抑制视网膜损伤相关免疫炎症反应。
[0022]
与现有技术相比，本发明采用视网膜光损伤的小鼠模型，模拟多种视网膜退行性病变发生过程中的共同病理环节，即光感受器细胞死亡，对金丝桃苷抗光感受器细胞死亡、抗视网膜损伤相关免疫炎症反应、防治视网膜退行性病变发生的作用进行了研究，结果表明金丝桃苷对光损伤诱导的光感受器细胞死亡、视网膜光感受器细胞退行性改变及视网膜损伤相关免疫炎症反应具有显著的抑制作用，能显著治疗并改善视网膜退行性病变，因此可用于制备治疗包括年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、stargardt病、视锥-视杆细胞营养不良等在内的多种视网膜退行性病变药物。
附图说明
[0023]
图1为金丝桃苷治疗对光感受器细胞保护效应的oct分析结果；
[0024]
图2为金丝桃苷治疗对视网膜保护效应的onl厚度定量对比分析结果；
[0025]
图3为金丝桃苷治疗对光感受器细胞保护效应的erg鉴定结果(左：a波，右：b波)；
[0026]
图4为金丝桃苷治疗对视网膜保护效应的组织病理学研究中，h&e染色切片图像；
[0027]
图5为金丝桃苷治疗对视网膜保护效应的免疫组织化学研究中，rhodopsin/dapi免疫染色切片图像、m-opsin/dapi免疫染色切片图像；
[0028]
图6为金丝桃苷抗视网膜免疫炎症细胞的激活增生的研究中，gfap/dapi免疫染色切片图像、iba1/dapi免疫染色切片图像。
[0029]
图中标记说明：
[0030]
no light：正常对照组，未接受光照刺激且未接受金丝桃苷治疗；
[0031]
light_vehicle：光损伤模型对照组，接受光照刺激且未接受金丝桃苷治疗；
[0032]
light_hyp：金丝桃苷治疗组，接受光照刺激与金丝桃苷治疗。
具体实施方式
[0033]
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0034]
本发明所用术语“可接受的”，指一个处方组分或活性成分对一般治疗目标的健康没有过分的有害影响。
[0035]
本发明所用术语“治疗”，包括缓和、抑制或改善疾病的症状或状况；抑制并发症的产生；改善或预防潜在代谢综合症；抑制疾病或症状的产生，如控制疾病或情况的发展；减轻疾病或症状；使疾病或症状减退；减轻由疾病或症状引起的并发症，或预防或治疗由疾病或症状引起的征兆。如本文所用，某一化合物或药物组合物，给药后，可以使某一疾病、症状或情况得到改善，尤指其严重度得到改善，延迟发病，减缓病情进展，或减少病情持续时间。无论固定给药或临时给药、持续给药或断续给药，可以归因于或与给药有关的情况。
[0036]
本发明所用术语“药学上可接受”这里指一种物质，如载体或稀释液，不会使化合物的生物活性或性质消失，且相对无毒，如，给予个体某物质，不会引起不想要的生物影响或以有害的方式与任何其含有的组分相互作用。
[0037]
本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0038]
实施例：
[0039]
本实施例中，通过非侵入性的视网膜眼底断层扫描oct技术、病理学及免疫组织化学的研究手段，明确了金丝桃苷对视网膜光损伤小鼠模型的干预效应。研究结果表明金丝桃苷可有效干预光感受器细胞死亡及视网膜退行性病变的发生，对视网膜的结构起到显著的保护效应。
[0040]
一、方法
[0041]
1.药物
[0042]
金丝桃苷：购自上海源叶生物科技有限公司，482-36-0，lot#y08n9x74602，纯度≥98％。
[0043]
2.动物模型
[0044]
采用6周龄雌性balb/c小鼠(斯莱克，上海)进行试验。小鼠随机分为正常对照组、光损伤模型对照组、金丝桃苷治疗组。其中正常对照组小鼠与光损伤模型对照组小鼠接受100μl 0.5％羧甲基纤维素钠溶液作为对照治疗，金丝桃苷组小鼠接受100μl金丝桃苷治疗，金丝桃苷剂量为50mg/kg体重，所有治疗均采用腹腔注射给药。除正常对照小鼠外，给药治疗后经过30分钟，各组小鼠接受白光照射刺激，光照刺激将采用弥散白色冷荧光灯，光照条件为15,000lux，持续30分钟。
[0045]
3.视网膜光学相关断层扫描分析
[0046]
药物治疗及光照后的第7天，采用舒泰50(50mg/kg)、注射用盐酸塞拉嗪(10mg/kg)联合麻醉小鼠，0.5％托吡卡胺散瞳后，进行光学相干断层扫描(oct 2with micron iv,phoenix research labs,usa)对各组小鼠视网膜整体结构进行无创影像学分析，结果如图1所示。
[0047]
4.光感受器外核层厚度测定分析
[0048]
oct成像后，从视神经乳头出发，以500μm为间距，对内侧及外侧视网膜光感受器外核层(optic nerve head,onh)厚度进行测量，对各组视网膜结构的保护效应进行定量分析，结果如图2所示。
[0049]
5.视网膜功能分析
[0050]
药物治疗及光照后第7天，采用氯胺酮(66mg/kg)、注射用盐酸塞拉嗪(6.6mg/kg)联合麻醉小鼠，0.5％托吡卡胺散瞳后，采用erg(erg 2,phoenix research labs,usa)，在弱红灯光下(5lux)进行试验，检测a波、b波的通频带为2～1000hz，并用不同强度的绿光进行刺激，以对视网膜功能进行测量和比较，结果如图3所示。
[0051]
6.视网膜组织病理
[0052]
药物治疗及光照后的第7天，oct成像后处死小鼠，解剖取眼球，显微镜下分离并剔除角膜及晶状体，其余含视网膜的眼球组织以4％多聚甲醛固定。固定后的眼球组织进行石蜡包埋和切片处理，石蜡切片厚度为4μm，以进一步的h&e染色，h&e染色的结果进行显微镜观察拍照及分析，结果如图4所示。
[0053]
药物治疗及光照后的第7天，oct成像后处死小鼠，解剖取眼球，显微镜下分离并剔除角膜及晶状体，其余含视网膜的眼球组织以4％多聚甲醛固定。固定后的眼球组织进行冰冻包埋及切片处理。冰冻组织切片厚度为12μm，用于进一步的免疫组织化学染色，包括进行rhodopsin、m-opsin及dapi免疫染色，分别对视杆细胞外节、视锥细胞基质鞘以及细胞核进行免疫标记，免疫组织化学结果进行显微镜观察拍照及分析，结果如图5所示。
[0054]
在光照后的第3天，处死小鼠，解剖取眼球，显微镜下分离并剔除角膜及晶状体，其余含视网膜的眼球组织以4％多聚甲醛固定。固定后的眼球组织进行冰冻包埋及切片处理。冰冻组织切片厚度为12μm，用于进一步的免疫组织化学染色，包括进行gfap、iba1及dapi免疫染色，分别对m
ü
ller胶质细胞、小胶质细胞以及细胞核进行免疫标记，免疫组织化学结果进行显微镜观察拍照及分析，结果如图6所示。
[0055]
7.统计分析
[0056]
数据表达为means
±
s.e，数据分析采用单因素方差分析(one-way anova)，组间两两比较采用dunnett-t检验。p《0.05定义为统计学显著差异。
[0057]
二、结果
[0058]
1.白光照射诱发小鼠视网膜严重损害
[0059]
白光照射后7天，采用oct对视网膜结构进行成像。如图1所示，白光照射诱发严重的以光感受器细胞损伤为主要病理表现的视网膜退行性改变，主要表现为白光照射后7天onl严重损伤。
[0060]
2.金丝桃苷对视网膜保护效应
[0061]
白光照射前30分钟，小鼠接受溶剂或金丝桃苷治疗，金丝桃苷剂量为50mg/kg体重，体积为100μl，腹腔注射。光照后7天，采用oct进行视网膜结构分析。
[0062]
如图1所示，金丝桃苷治疗显著抑制了视网膜光损伤的发生，主要表现为onl形态维持完好。
[0063]
对onl厚度的定量分析数据(图2)表明，与未接受光照的正常小鼠视网膜相比较，光照导致视网膜onl厚度严重降低，而金丝桃苷治疗对视网膜onl起到了显著的保护，其各自onl厚度接近未接受光照的正常小鼠视网膜onl厚度(*光损伤模型组与正常对照组比较，p《0.05；#金丝桃苷治疗组与光损伤模型组比较，p《0.05)。
[0064]
erg研究结果(图3)显示，未接受光照的正常小鼠视网膜a波、b波振幅随着检测光刺激增强而增大，而光损伤模型组视网膜a波和b波振幅显著降低，金丝桃苷治疗组小鼠的视网膜a波和b波振幅与未接受光照组相似(*光损伤模型组与正常对照组比较，p《0.05；#金丝桃苷治疗组与光损伤模型组比较，p《0.05)。
[0065]
组织病理学研究结果(图4)表明，未接受光照的正常小鼠视网膜各层结构完整，而光损伤小鼠表现为onl严重减少，金丝桃苷治疗组小鼠的视网膜各层结构与未接受光照组相似。进一步的免疫组织化学研究结果(图5)表明，dapi标记的onl在光损伤小鼠视网膜严重缺失，与正常对照相比，rhodopsin、m-opsin仅见残余表达。金丝桃苷治疗组rhodopsin、m-opsin表达模式与正常对照组相似，onl未见明显损伤(rhodopsin：红色；m-opsin：绿色；dapi：蓝色)。gfap标记m
ü
ller胶质细胞在未光照的正常对照小鼠中主要表达在神经纤维层(图6)，光损伤模型小鼠视网膜则表现为onl、ipl和inl均有明显gfap表达，金丝桃苷治疗组的gfap表达模式与正常对照组相似(gfap：红色；dapi：蓝色)。iba1标记的小胶质细胞在正常小鼠视网膜主要表达于ipl(图6)，光损伤模型的视网膜在onl、opl均见大量的阳性iba1表达，金丝桃苷治疗组的iba1表达模式与正常对照组相似(iba1：红色；dapi：蓝色)。
[0066]
综上所述，通过采用oct影像学、erg电生理学及视网膜组织病理学手段对视网膜光损伤模型的研究表明金丝桃苷对视网膜光感受器细胞的死亡、视网膜损伤相关免疫炎症反应及其导致的视网膜退行性病变的发生具有显著的防治作用。
[0067]
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。