功能化纳米硒联合二甲双胍制备的NK细胞增敏剂及应用的制作方法

功能化纳米硒联合二甲双胍制备的nk细胞增敏剂及应用
技术领域
1.本发明属于医药化合物技术领域，特别涉及功能化纳米硒联合二甲双胍制备的nk细胞增敏剂，以及在抗肿方面的应用。


背景技术：

2.肝癌作为全球第六大常见癌症，占癌症死亡率达11％。糖尿病是一种以血糖和胰岛素失调的代谢性疾病。许多研究发现，糖尿病患者发病持续时间越长，患有肝癌的风险越大，比无糖尿病患者的发病率高达2～3倍。其可能的致癌机制为患者本身的高血糖症，自身的慢性炎症，肥胖以及高胰岛素血症。高血糖症可通过血红蛋白糖基化从而释放亚铁离子(作为一种促氧化剂)，产生自由基，进而引起氧化应激；自身的慢性炎症可诱导肿瘤坏死因子(tnf-α)和白介素-6(il-6)的表达；肥胖使得人体对胰岛素敏感性降低，为了维持一个正常的胰岛素水平，胰岛β细胞会分泌更多的胰岛素，造成高胰岛素血症，并进一步影响与肝细胞损伤、炎症、纤维化相关基质蛋白的表达；这些复杂的病症降低了免疫系统功能，并大大提高肝癌的发生率。
3.过继性免疫细胞治疗利用活体的免疫活性细胞在体外进行扩增后重新输入回去病人体内，这类免疫活性细胞能够直接或间接的杀伤肿瘤细胞。过继性免疫细胞联合化疗药物用于肿瘤的治疗，能够增强免疫细胞的免疫敏感性，提高免疫细胞敏感性受体的表达，增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。自然杀伤(nk)细胞是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别靶细胞、杀伤介质。
4.nk-92细胞是一种类似nk细胞活性的免疫细胞，具有nk细胞的主要特性以及主要表达受体，它能够大量表达参与穿孔素和颗粒酶过程的细胞因子以及肿瘤坏死因子如fasl、trail、tnf-α等，进而杀伤肿瘤细胞；且nk-92细胞能够高效辨识并杀伤肿瘤细胞，而不影响正常细胞的生存，这一特殊的机制尚不清楚，但推测可能为nk-92细胞不表达nk细胞上的免疫球蛋白样受体(kir)导致的。有研究报道，卡博替尼能够协同nk-92细胞对肾癌造成更大的杀伤效果，其中卡博替尼增加肿瘤细胞中egfr的表达，以及降低肿瘤细胞pd-l1的表达，逆转了免疫抑制。因此，化疗药物联合免疫细胞增强对肿瘤细胞的免疫治疗效果是一个不错的治疗策略。
5.之前研究报道，senps在正常细胞中具有抗氧化，清除自由基的功能，并能降低高血糖症引起的氧化应激效果；在抗肿瘤方面，自身具有杀伤肿瘤的效果，并能够增强免疫细胞杀伤肿瘤细胞。二甲双胍(metformin)作为t2dm一线临床用药，能够降低血糖并具有一定的抗肿瘤效果。因此，怎样复合二甲双胍增强nk细胞的免疫治疗效果，在结合纳米硒的化合物提高治疗肿瘤的新应用领域，寻找用于免疫治疗的纳米免疫治疗增敏剂是肿瘤治疗需要进一步研究的。


技术实现要素：

6.本发明的首要目的是提供功能化纳米硒联合二甲双胍(metformin)作为nk细胞增敏剂的应用方案，具体是将功能化纳米硒联合二甲双胍作为nk细胞增敏剂辅助nk细胞进行增强对肿瘤细胞的免疫治疗效果。
7.本发明的另一目的在于提供一种nk细胞增敏剂的制备方法，以及得到功能化纳米硒联合二甲双胍制备的nk细胞增敏剂。所述nk细胞增敏剂可以是nk-92细胞增敏剂。
8.本发明的再一目的在于提供一种抗肿瘤药物。
9.本发明人发现功能化senps联合二甲双胍具有协同抗肿瘤效果，并进一步研究了功能化senps联合二甲双胍增强nk细胞，比如nk-92细胞的免疫治疗效果，并通过实验对其作用机制进行了初步探讨。
10.本发明提供功能化纳米硒联合二甲双胍作为nk细胞增敏剂的应用方案。
11.进一步，所述功能化纳米硒联合二甲双胍作为nk细胞增敏剂在抗肿瘤中的应用。可以是所述功能化纳米硒联合二甲双胍预先与nk细胞孵育一段时间再处理肿瘤细胞；或是所述功能化纳米硒联合二甲双胍预处理肿瘤细胞后再加入nk细胞；或是所述功能化纳米硒联合二甲双胍与nk细胞同时处理肿瘤细胞。
12.处理的所述肿瘤包括人肝癌、人非小细胞肺癌、人宫颈癌、黑色素瘤、乳腺癌和脑胶质瘤中的任意一种。
13.本发明还提供了功能化纳米硒联合二甲双胍制备nk细胞增敏剂的方法，包括步骤制备功能化纳米硒；加入二甲双胍进行混合反应，得到nk细胞增敏剂。
14.进一步，所述功能化纳米硒为纳米硒(s-senps)、聚烯丙基胺盐酸盐(阿拉丁)修饰的纳米硒(pah-senps)、聚乙烯吡咯烷酮修饰的纳米硒(pvp-senps)、tw80修饰的纳米硒(tw80-senps)、多糖修饰的纳米硒、叶酸修饰的纳米硒(叶酸修饰的肿瘤靶向性纳米硒)、转铁蛋白修饰的纳米硒(转铁蛋白修饰的肿瘤靶向性纳米硒)中的至少一种。
15.作为实施方式，制备功能化纳米硒通过如下任意一种方式制备得到：
16.将h2seo3溶液或na2seo3溶液与vc混合均匀进行反应，透析，得到一种形态纳米硒(s-senps)；
17.或者是，将h2seo3溶液或na2seo3溶液与物质a混合均匀，再加入vc进行反应，透析，得到不同的功能化纳米硒，其中，所述的物质a为pah、pvp、tw80、多糖、叶酸、转铁蛋白中的任意一种；
18.或者是，将物质a和vc混合均匀，再加入h2seo3溶液或na2seo3溶液进行反应，透析，得到不同的功能化纳米硒，其中，所述的物质a为pah、pvp、tw80、叶酸、转铁蛋白中的任意一种；
19.所述的h2seo3溶液或na2seo3溶液的浓度为8～10mmol/l；h2seo3溶液或na2seo3溶液的添加量为按终浓度1～5mmol/l计算；
20.所述的物质a的添加量为按终浓度0.5～10mg/ml计算；
21.所述的vc和h2seo3按摩尔比3～10:1进行配比；或者所述的vc和na2seo3按摩尔比3～10:1进行配比；所述反应的温度是4℃～5℃，时间为0.5～24小时；
22.所述的透析方式为采用透析袋进行透析，透析的时间为12～48小时。
23.本发明还提供一种nk细胞增敏剂，是采用上述方法得到的nk细胞增敏剂，基于功
能化纳米硒联合二甲双胍作为nk细胞增敏剂，可以由纳米硒和药物允许的修饰剂组成，并制成注射剂等多种形式。
24.本发明还提供一种抗肿瘤药物，包含上述方法得到的所述nk细胞增敏剂、以及nk细胞。作为一种实施方式，抗肿瘤药物可由功能化纳米硒、二甲双胍和nk细胞组成；或者作为另一种实施方式，抗肿瘤药物可由功能化纳米硒、二甲双胍、nk细胞和负载其他现有的抗肿瘤化合物组成。
25.所述nk细胞的一种实施例是nk-92细胞(人恶性非霍奇金淋巴瘤患者的自然杀伤细胞)；或用常规方法得到的nk细胞，如通过商业途径购买获得，或用人的外周血、骨髓或脐带血，经单核细胞分离、在体外利用il-2和il-15诱导培养获得。
26.所述抗肿瘤药物用于治疗的肿瘤包括人肝癌、人非小细胞肺癌、人宫颈癌、黑色素瘤、乳腺癌和脑胶质瘤中的任意一种。优选为治疗人肝癌。
27.本发明中功能化纳米硒和二甲双胍能通过nk增敏高效抑制肝癌细胞hepg2增殖，即可以用于治疗肝癌。
28.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
29.(1)本发明公开了功能化纳米硒联合二甲双胍作为nk细胞免疫治疗增敏剂的应用，可以是所述功能化纳米硒联合二甲双胍预先与nk细胞孵育一段时间再处理肿瘤细胞；或是所述功能化纳米硒联合二甲双胍预处理肿瘤细胞后再加入nk细胞；或是所述功能化纳米硒联合二甲双胍与nk细胞同时处理肿瘤细胞。
30.本发明利用修饰的肿瘤靶向性纳米硒具有明显的nk细胞增敏特性，在体外细胞实验中对肝癌细胞hepg2有高效的抑制效果，同时也能够明显抑制人非小细胞肺癌细胞a549，人宫颈癌细胞hela、黑色素瘤细胞a375、乳腺癌细胞mcf-7及脑胶质瘤细胞c6等多种细胞的增殖。其机制主要是通过调节hepg2细胞上nkg2d配体的产生，进而诱导细胞周期阻滞及肿瘤细胞凋亡。试验结果提示，功能化纳米硒联合二甲双胍可作为新型免疫治疗增敏剂进行开发，可显著降低肿瘤细胞的存活率。
31.(2)在我们实验室的前期研究中，发现功能化纳米硒是高效低毒的抗肿瘤药物，同时具有增敏的效果。因此，本发明制备nk细胞增敏剂的方法操作简单，应用性强，大力开发纳米硒联合二甲双胍增敏nk细胞的治疗具有广阔的应用前景。
32.(3)本发明开发了高效低毒的抗肿瘤药物，包含上述方法得到的所述nk细胞增敏剂、以及nk细胞，将功能化纳米硒联合二甲双胍作为nk细胞免疫治疗的增敏剂，是新成分的抗肿瘤药物，具有一定疗效。
33.(4)本发明利用维生素c还原亚硒酸钠制备得到功能化纳米硒，功能化纳米硒联合二甲双胍一起可通过调节机体免疫系统反应性间接杀伤肿瘤细胞，从而大大抑制人肝癌细胞hepg2的增殖。而试验中对照组的senps、二甲双胍、nk细胞不具备这种显著特性。不同形态的硒联合二甲双胍与nk-92细胞联合处理组中，与无机硒和有机硒比较，tw80-senps联合二甲双胍可以显著提高nk-92细胞对hepg2细胞的杀伤作用。修饰的肿瘤靶向性纳米硒与二甲双胍协同作用刺激hepg2细胞招募更多的nk细胞，并使肿瘤细胞对nk细胞更敏感，从而更多杀伤肿瘤细胞。试验结果提示，功能化纳米硒联合二甲双胍可作为有效的新型增敏剂改善肿瘤，比如对肝癌的治疗效果好。
34.(5)本发明所得纳米硒增敏剂的原料廉价易得，合成和纯化步骤可操作性强，制备
步骤简单，可通过优化工艺，适当扩大合成规模，实现药物的商业化和应用。
附图说明
35.图1为功能化senps联合二甲双胍对hepg-2细胞的细胞存活率评估。
36.其中(图1-1a)是功能化senps对肝癌hepg-2细胞存活率评估；(图1-1b)是二甲双胍对肝癌hepg-2细胞存活率评估；(图1-1c)和(图1-2)是功能化senps联合二甲双胍对hepg-2的细胞存活率评估图。
37.图2为药物联合nk-92细胞对hepg-2细胞的细胞存活率评估。
38.其中(图2-1)是功能化senps和metformin对nk-92细胞存活率评估；(图2-2a和图2-2b)是功能化senps和metformin联合nk-92细胞对hepg-2细胞的存活率评估。
39.图3功能化senps联合metformin及nk-92细胞对hepg-2细胞的细胞存活率评估，
40.其中(图3-1)、(图3-2)是功能化senps联合metformin及nk-92细胞对hepg-2细胞的存活率；(图3-3)是聚合物pah,pvp,tw80对hepg-2的细胞存活率评估。
41.图4为不同形态的硒包括(a)na2seo3、(b)tw80-senps以及(c)硒代胱氨酸sec联合二甲双胍及nk-92对hepg-2细胞的细胞存活率评估。
42.图5是tw80-senps联合metformin及活体nk细胞对hepg-2细胞的(图5a)增强倍数及(图5b)病例2和病例6的细胞存活率。
43.图6是tw80-senps联合二甲双胍对hepg-2细胞表面的受体信号的表达情况。
44.其中(图6a)ulbp-1/2/3/4表达情况；(图6b)pd-l1和mica表达情况；(图6c)各个受体的荧光值。
45.图7为tw80-senps联合metformin对hepg-2细胞内部ros的表达水平。
46.图8为ssb纳米乳联合nk细胞对mba-md-231细胞的存活率评估。
具体实施方式
47.下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式、保护范围不限于此。
48.本发明提供功能化纳米硒联合二甲双胍作为nk细胞增敏剂。所述功能化纳米硒联合二甲双胍作为cik细胞增敏剂在抗肿瘤中的应用。可以是所述功能化纳米硒联合二甲双胍预先与nk细胞孵育一段时间再处理肿瘤细胞；或是所述功能化纳米硒联合二甲双胍预处理肿瘤细胞后再加入nk细胞；或是所述功能化纳米硒联合二甲双胍与nk细胞同时处理肿瘤细胞，纳米硒作用浓度为0.5～10μmol/l，nk细胞的添加量为按nk细胞与肿瘤细胞的个数比为2.5～40:1计算。
49.所述肿瘤包括人肝癌、人非小细胞肺癌、人宫颈癌、黑色素瘤、乳腺癌和脑胶质瘤中的任意一种，特别对于治疗肝癌效果最好。
50.本发明还提供了功能化纳米硒联合二甲双胍制备nk细胞增敏剂的方法，包括步骤
51.(1)制备功能化纳米硒。
52.(2)加入二甲双胍进行混合反应，得到nk细胞增敏剂。
53.作为制备功能化纳米硒的第一种实施方式，是将h2seo3溶液或na2seo3溶液与vc混合均匀，在温度是4℃进行反应0.5～24小时，透析，得到纳米硒(s-senps)。所述的h2seo3溶
液或na2seo3溶液的浓度为10mmol/l；h2seo3溶液或na2seo3溶液的添加量为按终浓度1～5mmol/l计算。所述的vc和h2seo3按摩尔比3～10:1进行配比；或者所述的vc和na2seo3按摩尔比3～10:1进行配比。所述的透析方式为采用透析袋进行透析，透析的时间为12～48小时。
54.作为制备功能化纳米硒的第二种实施方式，是将h2seo3溶液或na2seo3溶液与物质a混合均匀，再加入vc在温度是4℃～5℃进行反应0.5～24小时，透析，得到不同的功能化纳米硒。其中，所述的物质a为pah、pvp、tw80、多糖、叶酸、转铁蛋白中的任意一种。所述的h2seo3溶液或na2seo3溶液的浓度为8～10mmol/l；h2seo3溶液或na2seo3溶液的添加量为按终浓度1～5mmol/l计算；所述的物质a的添加量为按终浓度0.5～10mg/ml计算；所述的vc和h2seo3按摩尔比3～10:1进行配比；或者所述的vc和na2seo3按摩尔比3～10:1进行配比。所述的透析方式为采用透析袋进行透析，透析的时间为12～48小时。
55.作为制备功能化纳米硒的第三种实施方式，将物质a和vc混合均匀，再加入h2seo3溶液或na2seo3溶液在温度是4℃～5℃进行反应0.5～24小时，透析，得到不同的功能化纳米硒。其中所述的物质a为pah、pvp、tw80、叶酸、转铁蛋白中的任意一种。所述的h2seo3溶液或na2seo3溶液的浓度为8～10mmol/l；h2seo3溶液或na2seo3溶液的添加量为按终浓度1～5mmol/l计算；所述的物质a的添加量为按终浓度0.5～10mg/ml计算。所述的vc和h2seo3按摩尔比3～10:1进行配比；或者所述的vc和na2seo3按摩尔比3～10:1进行配比。所述的透析方式为采用透析袋进行透析，透析的时间为12～48小时。
56.上述步骤(1)制备的功能化纳米硒为纳米硒(s-senps)、聚烯丙基胺盐酸盐(阿拉丁)修饰的纳米硒(pah-senps)、聚乙烯吡咯烷酮修饰的纳米硒(pvp-senps)、tw80修饰的纳米硒(tw80-senps)、多糖修饰的纳米硒、叶酸修饰的纳米硒(叶酸修饰的肿瘤靶向性纳米硒)、转铁蛋白修饰的纳米硒(转铁蛋白修饰的肿瘤靶向性纳米硒)中的至少一种。
57.本发明还提供一种nk细胞增敏剂，是采用上述方法得到的nk细胞增敏剂，基于功能化纳米硒联合二甲双胍作为nk细胞增敏剂，可以由纳米硒和药物允许的修饰剂组成，并制成注射剂等多种形式。
58.本发明还提供一种抗肿瘤药物，包含上述方法得到的所述nk细胞增敏剂、以及nk细胞。作为一种实施方式，抗肿瘤药物可由功能化纳米硒、二甲双胍和nk细胞组成；或者作为另一种实施方式，抗肿瘤药物可由功能化纳米硒、二甲双胍、nk细胞和负载的其他现有的抗肿瘤化合物组成。
59.所述nk细胞的一种实施例是nk-92细胞(人恶性非霍奇金淋巴瘤患者的自然杀伤细胞)；或用常规方法得到的nk细胞，如通过商业途径购买获得，或用人的外周血、骨髓或脐带血，经单核细胞分离、在体外利用il-2和il-15诱导培养获得。
60.所述抗肿瘤药物用于治疗的肿瘤包括人肝癌、人非小细胞肺癌、人宫颈癌、黑色素瘤、乳腺癌和脑胶质瘤中的任意一种。优选为治疗人肝癌。
61.下面通过实验证明本发明的nk细胞增敏剂在抗肿瘤应用方面的有益效果。
62.实施例1功能化senps联合二甲双胍(metformin)增强nk-92细胞的免疫治疗效果。
63.1、hepg2细胞和nk-92细胞的培养：hepg2细胞以及nk-92细胞从美国标准菌库(atcc)购买，hepg2用完全培养基(dmem,gibco)培养，nk-92细胞用最小必需培养基(mem,gibco)培养，并在培养基中加入体积比10％(v/v)的胎牛血清(fbs，gibco)和1％(v/v)的双
抗(青链霉素混合液，gibco)，在37℃有5％(v/v)二氧化碳的湿润的培养箱中培养。
64.2、用不同修饰的纳米硒和二甲双胍对人肝癌细胞hepg2存活率进行研究。为了检验功能化senps联合metformin是否能够增强nk-92细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。首先，我们检测了功能化senps及metformin对肝癌hepg-2细胞的毒性评估。如图1-1a，图1-1b所示，在se浓度为5～80μm区间，pah-senps对hepg-2细胞的毒性具有浓度梯度效应，在浓度为20μm，40μm，80μm时，细胞存活率分别为64％，25％和16％，在浓度为5μm和10μm的时，细胞存活率为97％和85％，对细胞毒性较低。而pvp-senps和tw80-senps在5～80μm的区间，呈递了一个水平趋势，细胞存活率稳定在60～70％区间，用药浓度并不影响二者对hepg-2细胞的毒性。在metformin浓度为5～80mm的区间，metformin对hepg-2细胞也具有浓度梯度效应，在浓度为20mm，40mm和80mm时，其细胞存活率分别为61％，15％，9％，对细胞的毒性较大。在浓度为5mm和10mm时的细胞存活率分别为95％和81％，对细胞的毒性较低，因此适合用于后续的实验研究。综合以上结果，我们选用se浓度为2.5～10μm的浓度梯度，metformin浓度为5mm和10mm用于后续的实验研究。
65.3、用不同修饰的纳米硒联合二甲双胍对人肝癌细胞hepg2存活率进行研究。我们研究了功能化senps联合metformin是否能对hepg-2细胞具有协同效果。由图1-1c所示，我们选用了不同浓度不同时间点的加药处理方式：i)序号3,4,5,6对应功能化senps预先孵育hepg-2细胞0h，3h，6h，24h后加入metformin；ii)序号7对应metformin预先孵育hepg-2细胞6h后加入功能化senps。由图1-2实验结果可以看出，tw80-senps在预先孵育肿瘤细胞24h后，加入metformin(10mm)后有增强效果，其他功能化senps和加药方式无增强效果。
66.4、用不同修饰的纳米硒和二甲双胍对nk-92细胞存活率进行研究。为了检验功能化senps和metformin对nk-92细胞是否具有毒性效果，我们利用cck8试剂盒优先检测了功能化senps和metformin对于nk-92细胞的毒性效果。如图2-1所示，在se浓度在5～40μm范围内，发现在se浓度为20μm和40μm的情况下，pah-senps和pvp-senps对nk-92细胞具有一定毒性效果，在浓度为5μm和10μm时无明显毒性。而tw80-senps对nk-92细胞在5～40μm范围内没有明显的毒性。在metformin浓度为5～40mm的范围内，metformin对nk-92细胞无显的毒性。
67.5、用不同修饰的纳米硒和二甲双胍联合nk-92细胞对人肝癌细胞hepg2存活率进行研究。为了检验单独功能化senps和metformin能否增强nk-92细胞的免疫治疗效果，如图2-2a，图2-2b所示，我们研究了药物在不同浓度不同时间点加药处理方式：i)序号3,4,5,6对应单独功能化senps和metformin预先孵育肿瘤细胞0h，3h，6h，24h后加入nk-92细胞共孵育24h；ii)序号7对应功能化senps和metformin预先孵育nk-92细胞6h后加入至肿瘤细胞共孵育24h。由实验结果可以看出，在se浓度为5μm和10μm的情况下，功能化senps预先孵育肿瘤细胞24h后加入nk-92细胞具有最显著的增强效果，而metformin在浓度为10mm的情况下预先孵育肿瘤细胞24h加入nk-92细胞具有显著增强效果，而2.5mm和5mm对nk-92细胞的增强效果不够明显。因此，我们选择药物预先加入肿瘤细胞0h和24h再加入nk-92细胞的策略用于进一步的实验研究。
68.6、用不同修饰的纳米硒联合二甲双胍以及nk-92细胞对人肝癌细胞hepg2存活率进行研究。为了检验功能化senps联合metformin能否增强nk-92细胞的治疗效果，如图3-1，图3-2，图3-3所示，我们将功能化senps和metformin共同加入hepg-2细胞中预先处理0h和24h，再加入nk-92细胞中进行共孵育24h。实验结果表明，在功能化senps浓度为2.5μm和5μm
的情况下，联合metformin(10mm)预处理hepg-2细胞24h后加入nk-92细胞，具有一个明显的杀伤肿瘤细胞的效果，且tw80-senps的增强效果更加显著。而当metformin浓度为5mm时，只有pah-senps和tw80-senps(2.5μm)有一个增强效果。为了验证单独的聚合物修饰剂pah，tw80，pvp是否对hepg-2细胞具有毒性。我们通过mtt实验检验单独的修饰剂对hepg-2细胞的细胞存活率，聚合物的量对应于se浓度为5μm，10μm，20μm，40μm和80μm。实验结果表明，对应于se浓度为40μm和80μm，聚合物pah的量对hepg-2细胞具有一定的毒性，而pvp和tw80对hepg-2细胞无明显的毒性。综合以上实验结果，我们选择了2.5μm tw80-senps联合10mm metformin预处理肿瘤细胞24h后加入nk-92(加入hepg2细胞数5倍的nk细胞)细胞作为后续相关抗肿瘤机制的实验研究。
69.实施例2，不同形态的硒(na2seo3、tw80-senps以及sec)联合二甲双胍以及nk-92细胞共作用体外抗肝癌肿瘤活性研究。
70.在hepg2细胞培养(20000/ml)24h后，以不添加nk细胞、二甲双胍和纳米硒为空白对照，实验组分别加入nk细胞(加入hepg2细胞数5倍的nk细胞)、终浓度为5mm的二甲双胍联合2.5μm的不同形态的硒(na2seo3、tw80-senps以及sec)、终浓度为5mm的二甲双胍联合2.5μm的不同形态的硒(na2seo3、tw80-senps以及sec)先处理hepg2细胞24h后再加入nk-92细胞共同处理hepg2细胞24h。结果如图4所示，从图中可以看出，细胞经单独nk-92处理后，细胞存活率下降到90％。当细胞经不同形态的硒联合二甲双胍处理后发现，使hepg2细胞的存活率分别下降到80％、50％和70％。不同形态的硒联合二甲双胍与nk-92细胞联合处理组中，使hepg2细胞的存活率下降到76％、30％和60％。此结果说明，与无机硒和有机硒比较，tw80-senps联合二甲双胍可以显著提高nk-92细胞对hepg2细胞的杀伤作用。
71.实施例3，tw80-senps联合metformin增强病人来源nk细胞的抗肿瘤活性。药物联合能够增强nk-92细胞的免疫治疗效果。那么，药物联合是否能够增强来自病人的nk细胞的治疗效果。因此，我们检测了6例tw80-senps联合metformin对来自病人的nk细胞的免疫治疗效果。如图5a所示的实验结果可知，6例病人nk中，tw80-senps联合metformin对于病人nk细胞的免疫治疗效果增强了0.8～10倍，对于不同的活体nk细胞的增强倍数存在些许差异。其中，病例1的增强倍数在0.8～1.9倍之间；病例2的增强倍数在1.1～1.5倍之间；病例3的增强倍数在0.8～5.2倍之间；病例4的增强倍数在2.8～4.6倍之间；病例5的增强倍数在1.1～1.5倍之间；病例6的增强倍数在4.4～10.6倍之间。由图5b在病例2和病例6的细胞存活率中可知，tw80-senps(5μm) metformin nk组的细胞存活率分别为32％和19％，相对于单独的nk组(65％和95％)和tw80-senps(5μm) metformin组(63％和51％)均存在显著性差异。因此，tw80-senps联合metformin能够显著增强来自病人nk细胞的免疫治疗效果。
72.实施例4，tw80-senps联合metformin对肿瘤细胞表面受体信号表达的调控。
73.可溶性mhc i类分子相关蛋白(mica/b)，ulbps家族蛋白(ulbp-1/2/3/4)作为肿瘤细胞与nk-92细胞表面信号受体(nkg2d)结合的功能性配体，其表达量的上升能够影响nk-92细胞对肿瘤细胞的识别，进而影响nk-92细胞的免疫治疗效果。而肿瘤细胞中细胞程序性死亡配体(pd-l1)能够与免疫细胞表面的程序性死亡受体1(pd-1)结合，增强肿瘤细胞免疫逃逸，因此抑制它们的结合可以增强免疫细胞的免疫治疗效果。因此，我们研究了tw80-senps联合metformin对hepg-2细胞表面信号受体的表达情况。如图6a,图6b,图6c所示，发现pd-l1的表达量在metformin组和药物联合组的表达水平出现下调，说明metformin能够
下调肿瘤细胞中pd-l1的表达；mica/b在se组和药物联合治疗组的表达水平也得到提高；ulbp-1/2在治疗组的表达水平出现下降趋势或无明显变化，而ulbp-3/4在治疗组中得到明显的提高。
74.实施例5，tw80-senps联合metformin诱导hepg-2细胞内部ros水平的提高。
75.在免疫治疗的过程中，肿瘤细胞中ros的升高诱导相应信号通路蛋白的表达，进而增强免疫细胞与肿瘤细胞的结合，对增强免疫细胞杀伤肿瘤细胞的效果起到辅助的作用。因此我们研究了hepg-2细胞在经过tw80-senps和metformin处理8h后，细胞内ros水平的变化情况。实验结果如图7所示，在单独的tw80-senps和metformin处理细胞后，能够明显的增强细胞内ros的水平，二者联合处理后，细胞内ros的水平得到进一步的提高。因此，肿瘤细胞内部ros水平的升高，在增强nk-92细胞的免疫治疗中扮演一个重要的作用。
76.对比实施例1，负载sec和tgf-β抑制剂的纳米乳(ssb)增强nk细胞的抗乳腺癌的作用。
77.由图8可知，含有8μm sec的ssb预处理mda-mb-231肿瘤细胞0、3、6、9、12和24小时，加入nk细胞(nk:mda-mb-231＝5:1)继续处理后，联合处理的效果使细胞存活率降低到30％。而本发明的实施例中2.5μm纳米硒联合二甲双胍和nk就可以使肿瘤细胞的存活率降低到30％(见图4)。
78.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。