一种基于木腐菌菌丝体的复合材料及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及生物材料工程技术领域，具体涉及一种基于木腐菌菌丝体的复合材料及其制备方法和应用。


背景技术：

2.真菌菌丝体的应用最早可追溯到20世纪50年代，当时人们利用纤维素和几丁质(甲壳素)之间的相似性来生产纸张，即在传统造纸工艺中加入真菌菌丝体，以提高纸张的耐火性，而不影响纸张强度。后来发现几丁质和壳聚糖的优良的生物医学特性，而将几丁质-β-葡聚糖片被用作皮肤替代品和伤口愈合剂。然而，直到最近五年，菌丝体的使用才真正引起了人们的极大兴趣，例如纸张、过滤膜和生物聚合物薄片等。这些新型材料主要由几丁质和多糖(如葡聚糖、壳聚糖、聚葡萄糖醛酸或纤维素)、蛋白质组成，可完全生物降解。
3.真菌菌丝体是真菌的营养部分，由被称为菌丝的管状微丝网络组成。构成菌丝的细胞壁主要成分为多糖，其次为蛋白质、类脂，细胞壁占细胞干物质的30％。而构成细胞壁的多糖主要有几丁质(甲壳素)、纤维素、葡聚糖、甘露聚糖等聚合物。其中，几丁质是由n-乙酰葡萄糖胺分子以β-(1,4)葡萄糖苷键连接而成的多聚糖，是一种坚韧、有弹性、惰性和不溶于水的结构性多糖，对维持整个生物体的结构完整性作用极大。对于一些坚硬的木腐真菌而言，其细胞壁中的几丁质含量可达40％以上，在菌丝体复合材料中，含有几丁质的真菌细胞壁对于材料的结构和机械性能至关重要。
4.其中，专利cn1101406c公开了一种真菌细胞壁结构性多糖的制备方法，是以真菌菌丝体为原料，通过破碎、醇洗、碱洗后，以苯甲醛为氨基保护剂，以戊二醛、甲苯二异氰酸酯为交联剂，交联而得，可作为生物吸附剂和微生物细胞、动植物细胞及酶的固定化载体材料。但是该工艺涉及化工试剂，，并且所用真菌均为霉菌属物种，通过液体培养后菌丝体量和壳聚糖要比大型真菌物种少很多，霉菌菌丝体生物量一般4％以下(湿重)，而大型真菌生物量要高于15％(湿重)。此外，霉菌细胞壁的几丁质含量在10-20％之间，所制得的机械强度不足，因此不适用于大型真菌菌丝体复合材料的制备。
5.在申请号为201610946113.x的中国专利申请中公开了一种草菇菌丝体复合材料的培养基组合物及制备方法和包装材料，在申请号为201910058513.0的中国专利申请中公开了一种利用裂褶菌菌丝体制备可降解包装材料的方法，但是草菇是一种可食用的草腐菌，裂褶菌在子实体发育早期也可以食用，这两种菌种的菌丝体的强度均不足，降低了复合材料的物理机械性能，限制了复合材料的应用范围，并且这两种菌丝体容易褐化，影响了复合材料的外观。上述两个专利中声明的制备工艺落后，生产效率低。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是提供绿色环保且可降解的生物质复合材料及其应用。本发明所使用的白蜡多年生卧孔菌的菌丝体强度大，菌丝洁白，克服了上述不足，适合本发明声明的规模化生产工艺
7.一种基于木腐菌菌丝体的复合材料的制备方法，其特征在于，包括：
8.a1)配制固体培养料，调节固体培养料的含水量60-70％，并置于隧道中自然发酵，升温过程中隧道进气量保持5-7m3/h，使培养料温度升至60-70℃，维持5-7天，得到第一次隧道发酵产物；
9.a2)将步骤a1)培养料转移至另一隧道中，待培养料温度回升至65℃时将隧道进气量调至1-1.5m3/h，使料温升高至70-80℃维持3-5天，得到第二次隧道发酵产物；
10.a3)将木腐菌菌种接种于第二次隧道发酵产物中进行第三次隧道发酵，料温维持于22-25℃，空气温度维持于21-24℃，发酵15-20天即得复合材料；
11.其中，
12.以质量分数计，所述固体培养料由木屑59％、小麦秸秆15％、麸皮10％、玉米芯10％、稻壳5％和生石灰1％组成；优选地，所述木屑为阔叶木木屑；更优选为苹果木木屑。
13.在根据本发明的一个实施方案中，所述木腐菌为白蜡多年生卧孔菌(vanderbyliafraxinea)。
14.在根据本发明的一个实施方案中，所述木腐菌菌种是通过包括下述步骤的方法制备得到的：
15.以87％棉籽壳、10％麸皮、2％石灰、1％石膏为基础配方，按相应比例称量原料混匀，按料水比1:1.3加水，边加水边搅拌，充分混匀后装入15cm*27cm的聚丙烯菌袋中，将菌袋放入高压灭菌锅中，121℃灭菌2.5h；待菌袋自然冷却后在无菌环境下接入液体菌种，每袋接种20ml，放于22-24℃恒温发菌室中培养至菌丝长满菌袋，即获得固体菌种。
16.本发明还提供了根据上述的制备方法制备得到的菌种，规模化生产基于木腐菌菌丝体的复合材料的方法。
17.设计固体培养料配方为：苹果木木屑59％、小麦秸秆15％、麸皮10％、玉米芯10％、稻壳5％、生石灰1％(木屑、秸秆和玉米芯用粉碎机粉碎，木屑、玉米芯粒径在0.5cm左右，小麦秸秆长度在2cm左右)。按照配方的配比将各种培养料充分混匀，调节含水量达到65％左右，将搅拌均匀的原料移入隧道中进行第一次发酵，升温过程中隧道进气量保持5-7m3/h，使培养料温度升至65℃左右，维持5-7天。然后将培养料转移至另一隧道进行第二次发酵中，待料温回升至65℃时将隧道进气量调至1-1.5m3/h，使料温升高至70-80℃维持3-5天，待培养料呈棕褐色、有料香味、手感松软时完成第二次隧道发酵。再次转移培养料至另一隧道中，降温后，将菌种粉碎至豆粒大小，均匀混入培养料中，在隧道中通过控温设备使料温维持在22-25℃，通过调节循环风、新鲜空气进气量，使空气温度维持在21-24℃，经15-20天发酵菌丝可长满培养料，结束第三次发酵，即得复合材料。
18.本发明的再一方面提供了一种包装材料的制备方法，包括：
19.b1)将上述的复合材料粉碎后填充于模具中，压实后置于清洁的培养室22-24℃下培养4-8天，获得定型胚体；
20.b2)将所述定型胚体置于室温、相对空气湿度75-80％环境下，直至所述定型胚体外表面被白色菌丝覆盖，得到包装胚体；
21.b3)将所述包装胚体干燥处理后即得包装材料。
22.在根据本发明的一个实施方案中，所述干燥处理是通过室温下风干或者以低于50℃烘干实现的。
23.本发明还提供了一种育苗容器的制备方法，
24.c1)将上述的复合材料粉碎后与缓释肥料、缓释农药均匀混合获得混合物，然后将所述混合物填充于模具中，压实后置于清洁的培养室22-24℃下培养4-8天，获得定型胚体；
25.c2)将所述定型胚体置于室温、相对空气湿度75-80％环境下，直至所述定型胚体外表面被白色菌丝覆盖，得到育苗容器胚体；
26.c3)将所述育苗容器胚体干燥处理后即得育苗容器；优选地，所述育苗容器为育秧盘。
27.在根据本发明的一个实施方案中，所述缓释肥料或缓释农药是通过包括下述步骤的方法制备得到的：
28.将肥料或农药与淀粉以质量比8:1充分混匀得到淀粉包裹的混合物；然后将海藻糖稀释成黏糊状后，将所述淀粉包裹的混合物放入到海藻糖中迅速搅拌捞出，然后摊平后置于45℃烘箱中烘2-4小时，得到干燥的条块，将干燥的条块粉碎、过筛，即得到缓释肥料或缓释农药。
29.本发明的上述技术方案的有益效果如下：
30.本发明利用的白蜡多年卧孔菌(vanderbyliafraxinea)菌种是通过比较菌种的抗杂菌性能、菌丝的密实度、菌丝生长速率等指标筛选出来的优质木腐菌菌株。以菌丝体代替了化工胶合剂，是纯天然的产品，可被生物降解。
31.本发明提供的基于隧道发酵工艺培养复合材料的工艺不仅利于工厂化生产，而且能够降低污染，大幅度提高生产效率和成品率。
32.本发明在培养料中大量使用了烟台当地的丰富的废弃苹果木，充分利用了当地资源。而且，除菌种制备环节需要灭菌装置之外，其他生产工艺流程中只涉及堆置发酵和菌丝体培养，不需要高温、高压装置，因此能耗低，易于推广。本发明利用菌丝对缓释肥料和缓释农药进行了包裹，可进一步提高化肥和农药的利用效率，降低因化肥和农药流失产生的浪费和污染。
附图说明
33.图1为纤维素、半纤维素和木质素的测定流程；
34.图2为红酒包装材料模具设计图；其中，a为正面图，b为侧面图，c为反面图；
35.图3为21孔育秧盘复合材料模具设计图；其中，a为正面图，b为侧面图，c为底侧面图；
36.图4为红酒包装材料实物照片；
37.图5为根据本发明实施例4所制备的育秧盘实物照片；
38.图6为传统育秧盘与复合材料育秧盘中生长的秧苗生长状况对比图；
39.图7为纤维素、半纤维素、木质素的累计降解率柱形图；
40.图8所示为复合材料育秧盘的在土壤中的降解图；育秧成功后，将秧苗与育秧盘一起转移至大田中，40天左右本发明的复合材料育秧盘底部即可被降解。。
具体实施方式
41.为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具
体实施例进行详细描述。
42.本发明所使用的白蜡多年卧孔菌菌种由鲁东大学菌种保存中心友情赠送，菌种保藏编号hmld090929，另外，本发明所利用的白蜡多年卧孔菌菌丝体的特性并非该菌种独有特征，通过常规方式筛选得到的白蜡多年卧孔菌的菌丝体也同样具有相当的性质。
43.实施例1木腐菌菌种的制备和菌丝体复合材料的制备
44.配制pda加富培养基，称取马铃薯200g、葡萄糖20g、kh2po43g、蛋白胨5g、维生素b110mg，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml，将液体培养基装入500ml三角瓶中，封口膜封口后，放于高压灭菌锅中121℃灭菌15min。待培养基降至室温后，将在斜面培养基上保存的菌种通过无菌操作接种到液体培养基中，放于25℃摇床中震荡培养5天，选择菌丝球密集、液体澄清、无异味的菌种备用。将白蜡多年卧孔菌液体菌种接种到发酵罐中25℃搅拌培养7天进行规模扩繁，获得液体菌种。
45.以87％棉籽壳、10％麸皮、2％石灰、1％石膏为基础配方，按相应比例称量原料混匀，按料水比1:1.3加水，边加水边搅拌，充分混匀后装入15cm*27cm的聚丙烯菌袋中，将菌袋放入高压灭菌锅中，121℃灭菌2.5h。待菌袋自然冷却后在无菌环境下接入液体菌种，每袋接种20ml，放于22
‑‑
24℃恒温发菌室中培养，菌丝长满菌袋即获得固体菌种。
46.2.固体培养料的两次隧道发酵
47.固体培养料的配方为：
48.苹果木木屑59％、小麦秸秆15％、麸皮10％、玉米芯10％、稻壳5％、生石灰1％(木屑、秸秆和玉米芯用粉碎机粉碎，木屑、玉米芯粒径在0.5cm左右，小麦秸秆长度在2cm左右)。
49.按照配方的配比将各种培养料充分混匀，调节含水量达到65％左右，将搅拌均匀的原料移入隧道中进行自然发酵，升温过程中隧道进气量保持5-7m3/h，使培养料温度升至65℃左右，维持5-7天。
50.将培养料转移至另一隧道进行二次发酵中，待料温回升至65℃时将隧道进气量调至1-1.5m3/h，使料温升高至70-80℃维持3-5天，待培养料呈棕褐色、有料香味、手感松软时可停止第二次隧道发酵。
51.由于原料中包含木屑、小麦秸秆原料，木屑质地坚硬、小麦秸秆外表面存在蜡质层，一次发酵时原料降解程度可能不足、接种后易污染，通过将培养料在隧道中70-80℃条件下进行第二次发酵(3-5天)，可使原料发酵更加充分、原料中难以被真菌菌丝利用的物质被进一步降解，并可使有益菌—嗜高温“放线菌”充分生长，同时可杀灭原料中的大部分有害杂菌。对经两次发酵的培养料进行接种后培养菌丝(即第三次发酵)，菌丝定植时间更快、菌丝更易利用原料中的养分，菌丝生长更加浓密健壮。前两次发酵的目的是去除杂菌，提高培养料中大分子营养物质的分解程度。第三次发酵是培养本发明中声明的真菌菌丝体。
52.3.在固体培养料中接种及复合材料的制备(第三次隧道发酵)
53.将菌种粉碎至豆粒大小，均匀混入培养料中，在隧道中通过控温设备使料温维持在22-25℃，通过调节循环风、新鲜空气进气量，使空气温度维持在21-24℃，经15-20天发酵菌丝可长满培养料，即得复合材料。
54.通过隧道发酵方式培养菌丝体有利于发酵原料保温保湿；有利于利用机械进行原料翻堆；可利用通风和加热设施对原料的温度和发酵程度进行调节；在隧道内发酵，原料翻
堆更加充分，可提高发酵的均匀度；可通过通风、控温设施为菌丝生长提供适宜条件，缩短发酵周期，同时可降低原料污染率。
55.实施例3菌种抗杂能力实验
56.1、利用pda平板培养基进行抗杂能力对比实验
57.对草菇、白蜡多年卧孔菌、裂褶菌菌种进行活化待用，对木霉、青霉、链孢霉菌种进行转接活化，菌种活化后将供试菌株分别转接到平板培养基中，待其长满后使用。将供试菌株分别与木霉、青霉、链孢霉对峙培养，对峙培养方法如下：用8mm孔径打孔器在供试菌种平板上进行打孔，将接种块转接到平板培养基的一侧，用封口膜密封后放于25℃培养箱中培养三天使菌种块萌发，三天后在供试菌种块3cm左右位置转接入杂菌菌种块，用封口膜封口后继续放于25℃培养箱中培养，每种对峙组合设置三个重复。将草菇、白蜡多年卧孔菌、裂褶菌菌种分别与木霉、青霉、链孢霉菌种对峙培养。观察供试菌株菌丝与杂菌菌丝生长情况，菌丝抗杂能力强弱指标:若菌丝能压过杂菌菌丝继续生长，说明供试菌种抗杂能力强，用“ ”表示；若菌丝与杂菌菌丝相互抑制，不能相互覆盖，说明供试菌种抗杂能力较强，用
“±”
表示；若杂菌菌丝压过供试菌株菌丝生长，说明抗杂能力弱，用“－”表示。
58.表1供试菌种的抗杂菌性能
[0059][0060]
注： ：菌丝能压过杂菌菌丝继续生长；
±
：菌丝与杂菌菌丝相互抑制，不能相互覆盖；－：杂菌菌丝压过供试菌株菌丝生长。
[0061]
如表1所示，综合草菇、白蜡多年卧孔菌和裂褶菌与三种杂菌的对峙培养实验可知，草菇对青霉、链孢霉抗杂能力较强、对木霉抗杂能力弱；白蜡多年卧孔菌与裂褶菌对木霉、青霉抗杂能力较强，对链孢霉抗杂能力强。综上所述：草菇的抗杂菌侵染能力较弱，而白蜡多年卧孔菌和裂褶菌的抗杂菌侵染的能力较强。
[0062]
2、利用固体培养料进行抗杂能力对比实验
[0063]
以苹果木木屑59％，小麦秸秆15％，麸皮10％，玉米芯10％，稻壳5％，生石灰1％为原料配方，按该配方比例称出适量培养料，按1：1.3料水比加水，边加水边混匀，将拌好的原料装入15*24cm的聚丙烯菌袋中，套上菌环和扣盖放于121℃下高温灭菌2h。待温度降至室温取出。将供试菌种分别接入灭菌后的菌袋中，每个供试菌种设置5个重复，接种后放于25℃恒温培养箱中进行培养，培养过程中观察菌丝的色泽及疏密程度。待菌丝长至袋肩以下2cm左右时用记号笔在菌丝前端进行划线，每隔5天划一次线，量出两次划线之间的距离，菌丝平均长速＝两次划线间菌丝生长距离/菌丝生长天数。
[0064]
表2不同菌株特征指标
[0065][0066]
根据表2可知，与草菇和裂褶菌相比，白蜡多年卧孔菌的菌丝不仅更浓密洁白，在菌丝日生长速率上也具有显著优势。所以，将白蜡多年卧孔菌用于生产中可缩短产品的生产时间，同时可使成品的美观度有较高的提升。
[0067]
表3草菇和木腐菌菌种及生产产品性状对比
[0068][0069]
相比于草菇菌种，木腐菌菌种在生长速率、抗杂性、抗污染能力更强，菌丝更加浓白；以木屑为基质主料使得复合材料在结实度和对秧苗的保护能力上有较强的提升。
[0070]
实施例4选用一次隧道发酵培养料和二次隧道发酵培养料进行菌丝体培养时的性状比较
[0071]
表4利用一次发酵培养料与二次发酵培养料培养复合材料时的差异
[0072][0073]
如表4所示，第三次发酵为真菌菌丝体培养阶段，第一次或第二次隧道发酵的培养
料均可用于第三次隧道发酵。但是木腐菌种在二次发酵的培养料中培养时菌丝生长一致性好，与使用一次发酵的培养料相比能降低培养料的污染率；菌丝定植时间短、长速较快；产品成型后破损率低、易从模具中取出。
[0074]
实施例5生产红酒瓶包装材料
[0075]
1.模具设计
[0076]
在本实施例中红酒瓶包装材料的模具是根据张裕生产的解百纳红酒瓶的尺寸进行设计的。
[0077]
利用上述配方和红酒瓶包装模具，可以批量生产可降解的红酒瓶包装材料，取代泡沫塑料包装材料。模具设计图如图2所示。
[0078]
2.培养料在模具中培养及包装盒的二次成型
[0079]
将实施例1中第三次隧道发酵获得的复合材料粉碎，然后填充至模具中，以5kg力压实，于清洁的培养室24-25℃培养5天，然后从模具中取出放置在相对湿度75-80％环境下继续培养至外表面覆盖一层白色菌丝，即得到包装盒的胚体。
[0080]
3.包装盒的干制与保存
[0081]
将包装盒胚体风干或低于50℃烘干，即得红酒缓冲可降解包装盒。该包装盒可置于常温干燥的空间中长期保存。所生产的红酒包装材料实物照片如图4所示。
[0082]
实施例6制备育秧盘
[0083]
1.用黄原胶、壳聚糖、海藻糖等多糖类物质或聚谷氨酸包裹生物农药和生物肥料
[0084]
将生物多糖或聚合多肽溶解后，与钾肥、磷肥或者其他生物肥料、生物农药按照一定的比例进行混合，在干净无菌的平板上均匀摊开烘干或喷雾干燥，燃后用粉碎机打碎成小颗粒粉末，得到缓释型肥料和缓释型农药。
[0085]
2.制备育秧盘胚体
[0086]
将长满白蜡多年卧孔菌(vanderbyliafraxineaa)菌丝体的培养料打碎，与缓释肥料和缓释农药均匀混合，转移至21孔育秧盘模具中，压实后放置于清洁的培养室培养5天左右，从模具(图3为模具设计图)中取出定型的培养料，室温继续培养1-2天，使培养料外表面覆盖一层白色菌丝，得到新型生物质复合材料育秧盘的胚体。
[0087]
3.育秧盘的干制与保存
[0088]
将上述育秧盘胚体进行风干或低于50℃烘干，获得最终的产品。该产品可以放置于常温干燥的空间长期保存。利用本实例所制备的育秧盘育成秧苗后，可以将育秧盘和秧苗一起移栽至大田中，避免了移栽时对秧苗根系的损伤。图5为本实施例所制备的育秧盘实物照片。
[0089]
实施例8复合材料育秧盘在育种中的影响
[0090]
1.传统育秧盘与复合材料育秧盘秧苗情况对比
[0091]
将田园土、草炭土按1:1比例混匀后放在阳光下暴晒2-3天，将土壤分装入普通育秧盘和复合材料育秧盘中，确保装入土量一致，每个育秧盘中浇入适当水量且浇水量相同。选取1个21孔传统育秧盘、1个21孔复合材料育秧盘进行出苗率实验，每个育秧盘中播种黄瓜种子3粒，每天浇适量水分，保持土壤湿润，每天观察种子萌发情况并做好统计。在第28天左右时进行苗高、根茎长、茎粗、叶片长的测定。测定结果如表5。生长状况如图6所示。
[0092]
表5传统育秧盘与复合材料育秧盘秧苗情况对比
[0093]
指标传统育秧盘复合材料育秧盘出苗率95％97％苗高(cm)24.49
±
0.1025.50
±
0.20茎粗(cm)0.35
±
0.150.42
±
0.12主根长(cm)3.52
±
0.213.70
±
0.40叶长(cm)3.21
±
0.253.52
±
0.30
[0094]
对幼苗生长情况进行观察，观察幼苗虫害发生情况，虫害发生时随机选取传统育秧盘、复合育秧盘中植株各6株，选取上部中部下部叶片对蚜虫发生情况进行记录。
[0095]
表6传统育秧盘与复合材料育秧盘秧苗叶片对比
[0096]
育秧盘类型叶片受损程度叶片色泽虫口数(头)传统育秧盘部分叶片发生卷曲黄绿色150
±
16复合材料育秧盘较少叶片发生卷曲绿色130
±
12
[0097]
2.育秧盘降解实验
[0098]
降解测量方法是参考王玉万法的纤维素、半纤维素、木质素的定量分析方法，得到的纤维素、半纤维素、木质素的累计降解率如图7所示，图8所示为复合材料育秧盘的降解图。本发明制备的复合材料育秧盘在育秧过程中从底部开始降解，如图7所示的，60天可降解80％左右，而常规塑料制育秧盘不直接移栽进土地，在移栽之后直接废弃，形成白色垃圾，造成环境污染。
[0099]
实施例8海藻糖包埋方法
[0100]
在复合肥表面撒上一层小麦淀粉，肥料与淀粉比例为8:1，将肥料与淀粉充分混匀，使肥料表面包被一层淀粉，增加海藻糖与肥料的结合机率，同时减慢肥料的融化速率。将海藻糖稀释成黏糊状，将肥料放入后迅速搅拌捞出，将其摊平后放于45℃烘箱中烘2-4小时，将干燥后的肥料进行粉碎、过筛，完成包埋。将肥料在二次发酵结束后粉碎复合材料填充模具时加入。
[0101]
表7传统育秧盘与复合材料育秧盘秧苗叶片对比
[0102][0103]
表7为利用海藻糖包埋的缓释肥料的育秧盘与传统育秧盘的效果对比，
[0104]
由表7可知，与传统育秧盘相比，利用海藻糖包埋的缓释肥料的育秧盘中秧苗的苗高、茎粗和主根的长度及叶片的大小等方面均有显著提高，在出苗率方面也有一定的改善效果。
[0105]
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。