针对sars-cov-2的无ade效应的中和抗体
技术领域：
：1.本发明涉及针对sars-cov-2新冠病毒的无ade效应的中和抗体及其抗原结合片段，以及制备和使用所述中和抗体及其抗原结合片段的方法。
背景技术：
：：2.2019年全球流行的冠状病毒疾病(covid-19)由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2；亦称为2019-ncov或hcov-19)引起(coronaviridaestudygroupoftheinternationalcommitteeontaxonomyof,2020；jiang等人,2020a；jiang等人,2020c)。冠状病毒有4个主要亚科，称为α、β、γ和δ。sars-cov-2，与2003年鉴定的sars-cov-1和2012年鉴定的中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)一起，属于β-cov属(zhou等人,2020；zhu等人,2020)。3.对于每个冠状病毒颗粒，病毒基因组被核衣壳(n)蛋白包装并且被含有结构蛋白的被膜包围。这些结构蛋白之一(刺突蛋白；s-蛋白)三聚化并介导病毒进入宿主细胞(li,2016)，并且是人中和抗体的主要靶标(jiang等人,2020b；premkumar等人,2020；wu,f.等人,2020)。其含有1273个氨基酸，包括大的胞外结构域(s-ecd)、一个跨膜螺旋和小的胞内c-末端。已经鉴定了s-ecd内的两个主要结构域为s1头区和s2茎区，并且关键的受体-结合结构域(rbd)位于s1部分。4.因为sars-cov-2rbd与其人受体血管紧张素转化酶-2(ace2)的结合是病毒进入靶细胞的关键起始步骤，用抗体阻断该相互作用可能是用于治疗和预防的有前景的方法。对于靶向不同冠状病毒中存在的保守表位的广泛中和抗体，特别如此，所述冠状病毒例如sars-cov-1和新出现的sars-cov-2，这二者来自相同的冠状病毒亚科并共有相同的人受体ace2。5.已通过各种方法，投入许多努力来获得针对rbd的人中和抗体，所述方法包括：噬菌体展示(liu,x.等人,2020；sun等人,2020；wu,y.等人,2020a)、人源化小鼠(hansen等人,2020)、从sars-cov-1-恢复个体的抗体筛选(pinto等人,2020；wec等人,2020)和从sars-cov-2恢复期供体的单个b细胞抗体克隆(andreano等人,2020；brouwer等人,2020；cao等人,2020；chen等人,2020；chi等人,2020；ju等人,2020；kreer等人,2020；liu,l.等人,2020；robbiani等人,2020；rogers等人,2020；seydoux等人,2020；wan等人,2020；wu,y.等人,2020b；zost等人,2020a；zost等人,2020b)。尽管一些报道的抗体显示交叉中和活性(lv等人,2020；pinto等人,2020；wec等人,2020)，但它们针对sars-cov-1和sars-cov-2的效力不同等高。此外，尚未评价这些抗体的抗体依赖性增强(ade)效应，并且尚未确定ade和不同的sars-cov-2s-蛋白表位之间的关系。6.在ade效应发生期间，通过病毒-抗体免疫复合物的fc受体介导的内化，病毒侵入宿主细胞。这种现象已对于登革病毒、冠状病毒和其它病毒得到证明(eroshenko等人,2020；iwasaki和yang,2020；katzelnick等人,2017；miner和diamond,2017；salje等人,2018)。在sars-cov-1感染中，结合s-蛋白的抗体促进ace2-非依赖性病毒内化到巨噬细胞、单核细胞和b细胞内(jaume等人,2011；wang等人,2014；yip等人,2014)。病毒颗粒通过ade途径的摄入可能导致促炎细胞因子的产生升高。在sars-cov-2感染期间，在病危患者中一致观察到显著升高的igg抗体应答(zhang等人,2020；zhao等人,2020)和显著增加的促炎细胞因子在血清中的水平(huang等人,2020；wang,j.等人,2020)。然而，仍然没有研究结果表明针对sars-cov-2新冠病毒的抗体是否能够诱发ade效应。7.在本发明中，发明人选择了具有高水平的针对sars-cov-2的血清igg中和活性的恢复期个体，并分离了表达具有相同的ig可变基因区段和高度类似的cdr3序列的密切相关抗体的记忆b细胞的许多扩展克隆。有近一半的分离抗体靶向于s-蛋白的rbd结构域上的5个不同抗体结合表位。这些抗体的中和与增强活性的表征鉴定了一系列抗体，其不仅能有效地中和sars-cov-2而且不诱发ade效应。特别引人注意的是，本发明的某些抗体对具有1个氨基酸突变的一系列sars-cov-2毒株保持敏感性。此外，发明人鉴定了rbd结构域结合抗体，其有效地广谱中和sars-cov-1和sars-cov-2二种病毒，且没有ade效应。技术实现要素：8.本发明提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段特异性地结合sars-cov-2的s蛋白，其特征在于所述分离的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区vh和轻链可变区vl，所述重链可变区vh包含互补决定区cdrh1、cdrh2和cdrh3，所述轻链可变区vl包含互补决定区cdrl1、cdrl2和cdrl3，其中cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3选自以下氨基酸序列：a)seqidno:1的cdrh1、seqidno:29的cdrh2、seqidno:57的cdrh3、seqidno:113的cdrl1、seqidno:141的cdrl2和seqidno:169的cdrl3；b)seqidno:2的cdrh1、seqidno:30的cdrh2、seqidno:58的cdrh3、seqidno:114的cdrl1、seqidno:142的cdrl2和seqidno:170的cdrl3；c)seqidno:3的cdrh1、seqidno:31的cdrh2、seqidno:59的cdrh3、seqidno:115的cdrl1、seqidno:143的cdrl2和seqidno:171的cdrl3；d)seqidno:4的cdrh1、seqidno:32的cdrh2、seqidno:60的cdrh3、seqidno:116的cdrl1、seqidno:144的cdrl2和seqidno:172的cdrl3；e)seqidno:5的cdrh1、seqidno:33的cdrh2、seqidno:61的cdrh3、seqidno:117的cdrl1、seqidno:145的cdrl2和seqidno:173的cdrl3；f)seqidno:6的cdrh1、seqidno:34的cdrh2、seqidno:62的cdrh3、seqidno:118的cdrl1、seqidno:146的cdrl2和seqidno:174的cdrl3；g)seqidno:7的cdrh1、seqidno:35的cdrh2、seqidno:63的cdrh3、seqidno:119的cdrl1、seqidno:147的cdrl2和seqidno:175的cdrl3；h)seqidno:8的cdrh1、seqidno:36的cdrh2、seqidno:64的cdrh3、seqidno:120的cdrl1、seqidno:148的cdrl2和seqidno:176的cdrl3；i)seqidno:9的cdrh1、seqidno:37的cdrh2、seqidno:65的cdrh3、seqidno:121的cdrl1、seqidno:149的cdrl2和seqidno:177的cdrl3；j)seqidno:10的cdrh1、seqidno:38的cdrh2、seqidno:66的cdrh3、seqidno:122的cdrl1、seqidno:150的cdrl2和seqidno:178的cdrl3；k)seqidno:11的cdrh1、seqidno:39的cdrh2、seqidno:67的cdrh3、seqidno:123的cdrl1、seqidno:151的cdrl2和seqidno:179的cdrl3；l)seqidno:12的cdrh1、seqidno:40的cdrh2、seqidno:68的cdrh3、seqidno:124的cdrl1、seqidno:152的cdrl2和seqidno:180的cdrl3；m)seqidno:13的cdrh1、seqidno:41的cdrh2、seqidno:69的cdrh3、seqidno:125的cdrl1、seqidno:153的cdrl2和seqidno:181的cdrl3；n)seqidno:14的cdrh1、seqidno:42的cdrh2、seqidno:70的cdrh3、seqidno:126的cdrl1、seqidno:154的cdrl2和seqidno:182的cdrl3；o)seqidno:15的cdrh1、seqidno:43的cdrh2、seqidno:71的cdrh3、seqidno:127的cdrl1、seqidno:155的cdrl2和seqidno:183的cdrl3；p)seqidno:16的cdrh1、seqidno:44的cdrh2、seqidno:72的cdrh3、seqidno:128的cdrl1、seqidno:156的cdrl2和seqidno:184的cdrl3；q)seqidno:17的cdrh1、seqidno:45的cdrh2、seqidno:73的cdrh3、seqidno:129的cdrl1、seqidno:157的cdrl2和seqidno:185的cdrl3；r)seqidno:18的cdrh1、seqidno:46的cdrh2、seqidno:74的cdrh3、seqidno:130的cdrl1、seqidno:158的cdrl2和seqidno:186的cdrl3；s)seqidno:19的cdrh1、seqidno:47的cdrh2、seqidno:75的cdrh3、seqidno:131的cdrl1、seqidno:159的cdrl2和seqidno:187的cdrl3；t)seqidno:20的cdrh1、seqidno:48的cdrh2、seqidno:76的cdrh3、seqidno:132的cdrl1、seqidno:160的cdrl2和seqidno:188的cdrl3；u)seqidno:21的cdrh1、seqidno:49的cdrh2、seqidno:77的cdrh3、seqidno:133的cdrl1、seqidno:161的cdrl2和seqidno:189的cdrl3；v)seqidno:22的cdrh1、seqidno:50的cdrh2、seqidno:78的cdrh3、seqidno:134的cdrl1、seqidno:162的cdrl2和seqidno:190的cdrl3；w)seqidno:23的cdrh1、seqidno:51的cdrh2、seqidno:79的cdrh3、seqidno:135的cdrl1、seqidno:163的cdrl2和seqidno:191的cdrl3；x)seqidno:24的cdrh1、seqidno:52的cdrh2、seqidno:80的cdrh3、seqidno:136的cdrl1、seqidno:164的cdrl2和seqidno:192的cdrl3；y)seqidno:25的cdrh1、seqidno:53的cdrh2、seqidno:81的cdrh3、seqidno:137的cdrl1、seqidno:165的cdrl2和seqidno:193的cdrl3；z)seqidno:26的cdrh1、seqidno:54的cdrh2、seqidno:82的cdrh3、seqidno:138的cdrl1、seqidno:166的cdrl2和seqidno:194的cdrl3；aa)seqidno:27的cdrh1、seqidno:55的cdrh2、seqidno:83的cdrh3、seqidno:139的cdrl1、seqidno:167的cdrl2和seqidno:195的cdrl3；和bb)seqidno:28的cdrh1、seqidno:56的cdrh2、seqidno:84的cdrh3、seqidno:140的cdrl1、seqidno:168的cdrl2和seqidno:196的cdrl3，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段中和sars-cov-2而没有ade效应。9.在一个实施方案中，所述重链可变区vh和轻链可变区vl选自以下氨基酸序列：a)seqidno:85的vh和seqidno:197的vl；b)seqidno:86的vh和seqidno:198的vl；c)seqidno:87的vh和seqidno:199的vl；d)seqidno:88的vh和seqidno:200的vl；e)seqidno:89的vh和seqidno:201的vl；f)seqidno:90的vh和seqidno:202的vl；g)seqidno:91的vh和seqidno:203的vl；h)seqidno:92的vh和seqidno:204的vl；i)seqidno:93的vh和seqidno:205的vl；j)seqidno:94的vh和seqidno:206的vl；k)seqidno:95的vh和seqidno:207的vl；l)seqidno:96的vh和seqidno:208的vl；m)seqidno:97的vh和seqidno:209的vl；n)seqidno:98的vh和seqidno:210的vl；o)seqidno:99的vh和seqidno:211的vl；p)seqidno:100的vh和seqidno:212的vl；q)seqidno:101的vh和seqidno:213的vl；r)seqidno:102的vh和seqidno:214的vl；s)seqidno:103的vh和seqidno:215的vl；t)seqidno:104的vh和seqidno:216的vl；u)seqidno:105的vh和seqidno:217的vl；v)seqidno:106的vh和seqidno:218的vl；w)seqidno:107的vh和seqidno:219的vl；x)seqidno:108的vh和seqidno:220的vl；y)seqidno:109的vh和seqidno:221的vl；z)seqidno:110的vh和seqidno:222的vl；aa)seqidno:111的vh和seqidno:223的vl；和bb)seqidno:112的vh和seqidno:224的vl。10.在一个实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合s蛋白的rbd结构域。11.在一个实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合s蛋白的s1结构域但非rbd结构域。12.在一个实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合s蛋白的s2结构域。13.本发明还提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段特异性地结合sars-cov-2s蛋白的rbd结构域，其特征在于所述分离的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区vh和轻链可变区vl，所述重链可变区vh包含互补决定区cdrh1、cdrh2和cdrh3，所述轻链可变区vl包含互补决定区cdrl1、cdrl2和cdrl3，其中cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3选自以下氨基酸序列：a)seqidno:26的cdrh1、seqidno:54的cdrh2、seqidno:82的cdrh3、seqidno:138的cdrl1、seqidno:166的cdrl2和seqidno:194的cdrl3；b)seqidno:27的cdrh1、seqidno:55的cdrh2、seqidno:83的cdrh3、seqidno:139的cdrl1、seqidno:167的cdrl2和seqidno:195的cdrl3；和c)seqidno:28的cdrh1、seqidno:56的cdrh2、seqidno:84的cdrh3、seqidno:140的cdrl1、seqidno:168的cdrl2和seqidno:196的cdrl3，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段中和sars-cov-2及其单氨基酸突变株而没有ade效应。14.在一个实施方案中，所述重链可变区vh和轻链可变区vl选自以下氨基酸序列：a)seqidno:110的vh和seqidno:222的vl；b)seqidno:111的vh和seqidno:223的vl；和c)seqidno:112的vh和seqidno:224的vl。15.在一个实施方案中，所述sars-cov-2的单氨基酸突变株包括rbd结构域中的v341i、f342l、v367f、r408i、a435s、g476s和v483a突变。16.在一个实施方案中，本文所述的分离的抗体或其抗原结合片段以小于10μg/ml的50%抑制浓度ic50值体外中和sars-cov-2及其单氨基酸突变株，如通过基于细胞的萤光素酶活性所测定。17.在一个实施方案中，本文所述的分离的抗体或其抗原结合片段以小于25ng/ml的50%抑制浓度ic50值体外中和sars-cov-2及其单氨基酸突变株。18.本发明还提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段特异性地结合sars-cov-2s蛋白的rbd结构域，其特征在于所述分离的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区vh和轻链可变区vl，所述重链可变区vh包含互补决定区cdrh1、cdrh2和cdrh3，所述轻链可变区vl包含互补决定区cdrl1、cdrl2和cdrl3，其中cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3选自以下氨基酸序列：a)seqidno:27的cdrh1、seqidno:55的cdrh2、seqidno:83的cdrh3、seqidno:139的cdrl1、seqidno:167的cdrl2和seqidno:195的cdrl3；和b)seqidno:28的cdrh1、seqidno:56的cdrh2、seqidno:84的cdrh3、seqidno:140的cdrl1、seqidno:168的cdrl2和seqidno:196的cdrl3，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段交叉中和sars-cov-2和sars-cov-1而没有ade效应。19.在一个实施方案中，所述重链可变区vh和轻链可变区vl选自以下氨基酸序列：a)seqidno:111的vh和seqidno:223的vl；和b)seqidno:112的vh和seqidno:224的vl。20.在一个实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段以小于25ng/ml的50%抑制浓度ic50值体外中和sars-cov-2，并且以小于10ng/ml的ic50值体外中和sars-cov-1，如通过基于细胞的萤光素酶活性所测定。21.在一个实施方案中，本文所述的分离的抗体或其抗原结合片段的fc受体-结合位点包括grlr突变g236r和l328r。22.在一个实施方案中，本文所述的分离的抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗体片段。23.在一个实施方案中，所述抗原结合片段为fab片段、fab'片段、f(ab')2片段、fv片段、双抗体或单链抗体分子。24.在一个实施方案中，本文所述的分离的抗体或其抗原结合片段为igg1型、igg2型、igg3型或igg4型。25.本发明还提供了一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码本文所述的分离的抗体或其抗原结合片段。26.本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体包含本文所述的多核苷酸。27.本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本文所述的表达载体。28.本发明还提供了一种产生本文所述的分离的抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于所述方法包括在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下培养本文所述的宿主细胞，以及回收由所述宿主细胞产生的抗体或其抗原结合片段。29.本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的分离的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载剂。30.本发明还提供了所述分离的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗或预防有需要的受试者的sars-cov-2感染的药物中的用途。31.本发明还提供了所述分离的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗或预防有需要的受试者的sars-cov-2及其单氨基酸突变株感染的药物中的用途。32.本发明还提供了所述分离的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗或预防有需要的受试者的sars-cov-2和/或sars-cov-1感染的药物中的用途。33.在某些方面，本发明提供了用于治疗或预防有需要的受试者的sars-cov-2感染的方法，所述方法包括给予受试者有效量的至少一种本文公开的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段不产生抗体依赖性增强(ade)效应。34.在某些方面，本发明提供了用于在有需要的受试者中有效中和sars-cov-2病毒而不产生抗体依赖性增强(ade)效应的方法，所述方法包括给予受试者有效量的至少一种本文公开的抗体或其抗原结合片段。35.在某些方面，本发明提供了用于治疗或预防有需要的受试者的sars-cov-2和/或sars-cov-1感染的方法，所述方法包括给予受试者有效量的至少一种本文公开的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段不产生抗体依赖性增强(ade)效应。36.在某些方面，本发明提供了本文公开的分离的抗体或其抗原结合片段，用于治疗或预防有需要的受试者的sars-cov-2感染，其中所述抗体或其抗原结合片段不产生抗体依赖性增强(ade)效应。37.在某些方面，本发明提供了本文公开的抗体或其抗原结合片段，用于在有需要的受试者中有效中和sars-cov-2病毒而不产生抗体依赖性增强(ade)效应。38.在某些方面，本发明提供了本文公开的抗体或其抗原结合片段，用于治疗或预防有需要的受试者的sars-cov-2和/或sars-cov-1感染，其中所述抗体或其抗原结合片段不产生抗体依赖性增强(ade)效应。39.在某些方面，本发明提供了针对sars-cov-2的中和抗体或其抗原结合片段，所述中和抗体或其抗原结合片段结合s-蛋白(seqidno:225)中的表位。在一个实施方案中，所述表位位于seqidno:225的rbd(aa319-541)、s1(aa14-685)、s2(aa686-1213)或s-ecd(aa14-1213)结构域中。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合具有与seqidno:225或其上述子序列至少90%同一性的氨基酸序列中的表位。附图说明40.结合附图，本发明将得到更好地理解。41.图1显示了sars-cov-2s-蛋白的不同结构域的示意图。42.图2显示了24名供体的年龄和性别柱状图。43.图3显示了在从sars-cov-2感染恢复的个体中的抗体应答。(a-e)血清样品的elisa。来自24名志愿者，包括16名sars-cov-2恢复期个体(供体#1~#16)和8名sars-cov-2-未暴露的未感染个体(供体#17~#24)的各种血清稀释度针对sars-cov-2rbd(a)、s1(b)、s2(c)、s-ecd(d)和n(e)蛋白通过elisa评价(上图)。elisa曲线下面积(elisaauc)值通过prism软件计算并作为柱状图呈现(下图)。在恢复期和未感染供体之间的统计学差异(p值)对于rbdelisa(a)通过studentt检验确定，或对于其它(b-e)通过wilcoxon秩和检验确定。显示了至少2次实验。(f-h)在不同稀释度的血清(上图，f和g)或不同浓度的纯化的igg抗体(上图，h)的存在下，针对sars-cov-1(g)或sars-cov-2假病毒(f和h)的萤光素酶报告子假病毒依赖性中和作用测定。导致半最大抑制作用的血清稀释度的倒数作为50%中和效价(nt50)报告并作为柱状图显示(下图，f和g)。显示了来自至少2次独立实验的纯化的igg抗体的半最大抑制浓度(ic50)值(下图，h)。阴影指示最有效的样品来自供体#16。缩写“b.d.”表示“低于检测限”。(i)通过不同的s-蛋白结构域阻断中和作用。不同量的指定蛋白(sars-cov-2s-蛋白的rbd、s1、s2和s-ecd)与纯化的多克隆igg(5μg/ml，来自供体#16)孵育，然后与sars-cov-2假病毒孵育用于体外感染。y轴显示标准化的萤光素酶读出值作为感染效率的指示物。44.图4显示了细胞分选的门控策略。双重阳性(诱饵蛋白-pe 和诱饵蛋白-apc )细胞经单细胞分选用于抗体克隆。45.图5显示了在未感染的对照供体(上图)和所选供体#16(下图)中识别sars-cov-2蛋白的b淋巴细胞的频率。代表性的流式细胞术绘图显示了结合生物素化avi-tag标记的rbd(a)、化学生物素化s-ecd(b)和生物素化avi-tag标记的s-ecd(c)的cd19 cd20 b细胞的百分比。所有诱饵蛋白用别藻蓝蛋白(apc)或藻红蛋白(pe)标记，用于双荧光-染料分选策略。实验重复至少2次。46.图6显示了供体#16的抗体饼图。总共克隆获得了292个测序的抗体具有天然配对的ig重链和轻链。具有igh和igl可变基因序列的相同组合和密切相关的cdr3的抗体一起分组并作为不同片层表示。鉴定了总共25个片层。单独克隆的抗体以一个浅灰色片层显示。对于扩展克隆的抗体和48种选择的抗体(xg001~xg048)显示了对于配对的igh和igl的vh、vl基因和cdr3氨基酸序列。47.图7显示了来自同一扩展克隆的代表性抗体的v(d)j氨基酸序列比对。xg001/xg002、xg003/xg004和xg020/xg044分别来自密切扩展b细胞克隆。共有的氨基酸残基以灰色盒显示。48.图8显示了在sars-cov-2s蛋白中的抗体表位。(a-d)人单克隆抗体与sars-cov-2s-蛋白的不同结构域的结合。显示了来自至少2次独立实验的使用s-ecd结构域(a)、rbd结构域(b)、s1结构域(c)和s2结构域(d)的elisa的代表性曲线下面积(auc)值。pbs用作阴性对照。(e)基于抗原-结合测定，将48种抗体分类为5个类型，rbd-结合抗体、s1但非rbd结合抗体、s2-结合抗体、s-ecd结合抗体、无结合抗体。(f)竞争性elisa定义了4组的rbd-结合抗体。第一抗体(x轴)是非生物素化的并用于阻断表位，而第二抗体(y轴)是生物素化的，用于通过链霉亲和素-hrp检测。竞争性elisa的结果作为与pbs-阻断的参考相比通过第二生物素化抗体的结合百分比显示，并通过颜色标出：黑色，0%–25%；深灰色，25%–50%；浅灰色，50%–75%；白色，》75%。所有测试的抗体阻断它们自身的生物素化形式的结合。xg008和xg038结合rbd组iii的2个互相排斥的子表位。抗-hbs抗体h004(wang,q.等人,2020)用作阴性对照。弱rbd结合剂(xg015、xg042、xg045、xg047)从该测定中排除。代表性的2次实验。49.图9显示了竞争性elisa和4个主要的rbd抗体组。(a-b)验证rbd上5个非竞争表位的竞争性elisa。代表性抗体选自每个抗体组，其中xg011选自rbd组i，xg025选自rbd组ii，xg008和xg038选自rbd组iii，和xg014选自组iv。xg008和xg038结合rbd组iii中的2个互相排斥的子表位。第一抗体是未标记的rbd-结合抗体并用于阻断包被的rbd(a)或包被的s-ecd蛋白(b)上的表位。第二抗体是生物素化rbd抗体用于链霉亲和素-hrp依赖性检测。pbs-阻断孔是标准化参考。50.图10显示了来自4个rbd组的抗体，标出了ighv和igkv/iglv。51.图11显示了体外中和活性。(a)使用基于萤光素酶的sars-cov-2假病毒，代表性的人单克隆抗体的中和效力。萤光素酶信号(感染的代替物)在各种浓度的所示单克隆抗体存在下测定并标准化至无抗体对照(虚线)。在测定中没有中和能力的测试抗体以灰色线显示。(b)针对sars-cov-2假病毒的体外中和测定。显示了对于各抗体的ic50值。所有实验重复最少2次。缩写“n.n.”表示“在测定中无中和”。(c)ic50低于10或0.1μg/ml的中和抗体的抗原表位以柱状图概述。(d)用于针对sars-cov-2真病毒的体外中和测定的sars-cov-2n-蛋白的免疫荧光染色。使用抗-n-蛋白多克隆抗体(gu等人,2020)的免疫荧光用于评价所选单克隆抗体的中和作用。(e和f)针对sars-cov-2真病毒的体外中和测定的定量反转录pcr结果(e)和相应的ic50值(f)。sars-cov-2n-蛋白rna拷贝数是基于n-蛋白dna样品的标准曲线所计算得到，而此标准曲线使用了包含10倍连续稀释的7个浓度的n-蛋白dna样品所绘制。进行至少2次独立实验。(g)聚类分析鉴定了与中和活性相关的抗体表位。在9个稀释度的45种单克隆抗体的存在下使用sars-cov-2假病毒中和数据进行无监督分层聚类。鉴定了簇a、b、c和d。针对测试的抗原没有elisa结合的抗体(xg021、xg034、xg039)被排除。具有s-蛋白或rbd上的不同表位的抗体分别用颜色编码或形状编码。52.图12显示了针对sars-cov-2真病毒的基于免疫荧光的体外中和测定。(a-g)在sars-cov-2真病毒感染后在不同的单克隆抗体xg005(a)、xg008(b)、xg013(c)、xg014(d)、xg016(e)、xg017(f)和xg020(g)的存在下sars-cov-2n-蛋白的免疫荧光染色。使用抗-n-蛋白多克隆抗体(gu等人,2020)的免疫荧光用于使感染的细胞可视化，其中dapi染色显示总细胞密度。53.图13显示了单克隆抗体的交叉中和活性。(a-b)xg014(a)和xg038(b)针对具有不同rbd突变的sars-cov-2假病毒的体外中和测定。测定萤光素酶活性，标准化并视为感染的代替物。用于标准化的参考没有加入抗体(虚线)。(c-d)针对sars-cov-1假病毒的体外中和实验(c)和对于各抗体的相应ic50值(d)。缩写“n.n.”表示“在测定中无中和”。在测定中没有中和能力的测试抗体在(c)中以浅灰色线显示。用所示的代表性抗体进行至少2次实验。54.图14显示了通过xg014和xg041抗体针对sars-cov-1假病毒的体外中和测定。(a-b)xg014(a)和xg038(b)针对sars-cov-1假病毒的体外中和测定。测定萤光素酶活性并使用未加入抗体的参考样品(虚线)的萤光素酶信号标准化。55.图15显示了通过单克隆抗体的体外抗体依赖性病毒进入。(a-b)在不同稀释度的抗体的存在下，使用表达萤光素酶的sars-cov-2假病毒的体外raji细胞测定抗体的ade效应。诱导高水平的萤光素酶信号的抗体显示于(a)，包括9种rbd-结合抗体和2种s1结合但非rbd-结合的抗体(b)。所有其它测试抗体的存在显示背景或低水平的萤光素酶信号。由2μg/ml的抗体xg003诱导的萤光素酶信号用作标准化参考，和其它表示为萤光素酶活性的倍数变化。(c)计算每种单克隆抗体的相应的曲线下面积(auc)值。进行至少2次独立实验。认为虚线上方的信号表现出ade。(d-e)使用grlr形式的xg005(d)和xg006(e)抗体的在体外raji细胞中测定抗体的ade效应。在同一个板上平行进行野生型人抗体和其fc受体变体grlr，实验重复至少2次。(f)用fc受体阻断的体外raji细胞后测定抗体的ade效应。在没有抗-人fcγrii抗体孵育的情况下用raji细胞进行阴性对照。实验重复2次。56.图16显示了在raji细胞中通过单克隆抗体的抗体依赖性增强(ade)效应。(a)使用表达萤光素酶的sars-cov-2的体外raji细胞依赖性测定，代表性单克隆抗体诱导ade效应。通过2μg/ml的抗体xg003诱导的萤光素酶信号用作标准化参考，和其它表示为萤光素酶活性的倍数变化。在许多不同的抗体浓度下，xg005和xg016诱导了高水平的萤光素酶信号，而抗体xg014和xg038不诱导ade。xg006仅在高浓度下诱导病毒进入，而对于xg029相反。(b)在测定中定义ade参数的草图：增强能力和ade的曲线下面积(auc)值。(c)各单克隆抗体的增强能力值。进行至少2次独立实验。虚线上方的信号被视为指示ade。(d-f)在增强能力和adeauc之间(d)、ic50和adeauc之间(e)以及ic50和增强能力之间(f)的相关性。图中每一个点表示一个单克隆抗体(对于d，n=48；对于e和f，n=24)。相关性的rs和p值用spearman秩相关方法确定。57.图17显示了聚类分析鉴定与抗体中和或增强效应相关的rbd表位。(a)使用sars-cov-2假病毒中和作用(neu)和raji细胞抗体依赖性增强(ade)效应数据进行无监督分层聚类。鉴定了簇x、y和z。针对测试的抗原没有elisa结合的抗体(xg021、xg034、xg039)被排除。该聚类分析使用其它组中和与ade值重复。(b-c)三个簇中抗体的adeauc(b)或ic50值(c)的小提琴图。统计学分析使用dunn'skruskal-wallis多重比较检验进行。(d)三个簇中具有不同结合表位的抗体数的柱状图。参考(a)中抗体表位的标记指导。统计学分析使用fisher精确检验进行。(e)具有不同表位组的rbd-结合抗体的adeauc值的小提琴图。统计学分析使用wilcoxon秩和检验进行。58.图18显示了聚类分析鉴定与ade效应相关的rbd组iv表位。使用sars-cov-2假病毒在raji细胞中的抗体依赖性增强(ade)效应数据进行无监督分层聚类。鉴定了簇m和n。具体实施方式59.本文公开了结合sars-cov-2s蛋白的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合s蛋白的rbd、s1、s2或s-ecd结构域中的表位。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段可阻止sars-cov-2病毒进入宿主细胞，从而治疗或预防受试者的sars-cov-2感染。在某些实施方案中，所述抗体为人单克隆抗体。60.如本领域技术人员所了解，根据本公开内容，本发明的结合s蛋白结构域的抗体或其抗原结合片段可中和受试者中的sars-cov-2，而没有产生抗体依赖性增强(ade)效应。因此，本发明的可用于各种方法和组合物中，所述方法和组合物用于治疗或预防受试者的sars-cov-2感染。61.为方便起见，以下章节概述了本文所用术语的各种含义，之后论述了关于抗体或其抗原结合片段的各个方面，接着通过具体实施例证明了抗体或其抗原结合片段的各种实施方案。62.一、定义应该理解，前述一般说明及以下详述仅为例示性和解释性，并非限制所要求保护的本发明。在本技术中，除非另外明确说明，否则单数的使用包括复数。在本技术中，除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括”以及其它形式例如“包含”的使用并非限制性的，并涵盖术语“由……组成”。63.本文所用章节标题仅用于组织目的，不能理解为限制所述的主题。为任何目的，本技术中所引用的所有文献或文献的部分(包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍及论文)都在此以其整体引作参考。64.术语“s-蛋白”亦称为刺突蛋白，是病毒结构蛋白之一，其介导病毒进入宿主细胞。s-蛋白含有1273个氨基酸(seqidno:225)，包括大的胞外结构域(s-ecd)、一个跨膜螺旋和小的胞内c-末端。已经鉴定了s-ecd内的两个主要结构域为s1头区和s2茎区，并且关键的受体-结合结构域(rbd)位于s1部分。参见图1。65.mfvflvllplvssqcvnlttrtqlppaytnsftrgvyypdkvfrssvlhstqdlflpffsnvtwfhaihvsgtngtkrfdnpvlpfndgvyfasteksniirgwifgttldsktqsllivnnatnvvikvcefqfcndpflgvyyhknnkswmesefrvyssannctfeyvsqpflmdlegkqgnfknlrefvfknidgyfkiyskhtpinlvrdlpqgfsaleplvdlpiginitrfqtllalhrsyltpgdsssgwtagaaayyvgylqprtfllkynengtitdavdcaldplsetkctlksftvekgiyqtsnfrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnfnfngltgtgvltesnkkflpfqqfgrdiadttdavrdpqtleilditpcsfggvsvitpgtntsnqvavlyqdvnctevpvaihadqltptwrvystgsnvfqtragcligaehvnnsyecdipigagicasyqtqtnsprrarsvasqsiiaytmslgaensvaysnnsiaiptnftisvtteilpvsmtktsvdctmyicgdstecsnlllqygsfctqlnraltgiaveqdkntqevfaqvkqiyktppikdfggfnfsqilpdpskpskrsfiedllfnkvtladagfikqygdclgdiaardlicaqkfngltvlpplltdemiaqytsallagtitsgwtfgagaalqipfamqmayrfngigvtqnvlyenqklianqfnsaigkiqdslsstasalgklqdvvnqnaqalntlvkqlssnfgaissvlndilsrldkveaevqidrlitgrlqslqtyvtqqliraaeirasanlaatkmsecvlgqskrvdfcgkgyhlmsfpqsaphgvvflhvtyvpaqeknfttapaichdgkahfpregvfvsngthwfvtqrnfyepqiittdntfvsgncdvvigivnntvydplqpeldsfkeeldkyfknhtspdvdlgdisginasvvniqkeidrlnevaknlneslidlqelgkyeqyikwpwyiwlgfiagliaivmvtimlccmtsccsclkgccscgscckfdeddsepvlkgvklhyt(seqidno:225)术语“多核苷酸”或“核酸”包括单链和双链核苷酸聚合体二者。包含多核苷酸的核苷酸可为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或经修饰形式的任一种类型核苷酸。所述修饰包括：碱基修饰，例如溴尿苷和肌苷衍生物；核糖修饰，例如2’,3’-二脱氧核糖；和核苷酸间连接修饰，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯和氨基磷酸酯等。术语“寡核苷酸”意指包含200个或更少核苷酸的多核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸长10-60个碱基。在其它实施方案中，寡核苷酸长度为12、13、14、15、16、17、18、19或20-40个核苷酸。寡核苷酸可为单链或双链，例如用于构建突变基因的单链或双链。寡核苷酸可为有义或反义寡核苷酸。寡核苷酸可包括用于检测测定的标记，包括放射性标记、荧光标记、半抗原或抗原标记。寡核苷酸可用作例如pcr引物、克隆引物或杂交探针。66.术语“载体”意指用于将蛋白编码信息转移到宿主细胞的任何分子或实体(例如核酸、质粒、噬菌体或病毒)。67.术语“表达载体”或“表达构建体”是指适于转化宿主细胞并含有指导和/或调控一个或多个可操作地与其连接的异源编码区的表达的核酸序列的载体。表达构建体可包括但不限于：影响或调控转录、翻译的序列；和若存在内含子，则影响可操作地与其连接的编码区的rna剪接的序列。68.本文所用“可操作地连接”意指使用该术语的组分处于允许所述组分在合适的条件下实行其固有的功能的关系中。例如，让“可操作地连接”到蛋白编码序列的载体中的调控序列与蛋白编码序列连接，以便在与调控序列的转录活性兼容的条件下完成所述蛋白编码序列的表达。69.术语“宿主细胞”意指业已被或能够被核酸序列转化并藉此表达目的基因的细胞。不管后代在形态上或在遗传构成上与原始母细胞是否相同，只要后代存在目的基因，该术语就包括所述母细胞的后代。70.术语“转染”意指细胞吸收外来或外源dna，当将所述外源dna引入到细胞膜内时所述细胞就被“转染”了。多种转染技术在本领域众所周知并公开于本文中。参见例如graham等，1973,virology52:456；sambrook等，2001,molecularcloning:alaboratorymanual，见上述；davis等，1986,basicmethodsinmolecularbiology,elsevier；chu等，1981,gene13:197。所述技术可用于将一种或多种外源dna部分引入到合适的宿主细胞中。71.术语“转化”是指细胞中遗传特性的改变，当细胞被修饰成含有新dna或rna时，所述细胞就被转化了。例如，当通过经由转染、转导或其它技术引入新遗传物质来对细胞天然状态进行遗传修饰时，细胞被转化了。转染或转导后，转化的dna可通过在物理上整合到细胞染色体而与细胞dna重组，或可作为染色体外元件不被复制而短暂保留，或可作为质粒独立复制。当转化的dna随着细胞分裂复制时，认为细胞已经被“稳定地转化”了。72.术语“氨基酸”包括其在本领域中的一般含义。本文使用常规的单字母氨基酸代码和三字母氨基酸代码，如表1中所示。73.表1(devereux等，1984,nucl.acidres.12:387；geneticscomputergroup,universityofwisconsin,madison,wi)。将计算机算法gap用于比对待测定序列同一性百分比的两个多肽或多核苷酸。根据其各自的氨基酸或核苷酸的最佳匹配对序列进行比对(由算法来确定“匹配跨度”)。结合所述方法使用空位开放罚分(计算为3x平均对角线，其中所述“平均对角线”为所用比较矩阵的对角线的平均值；所述“对角线”为通过特定比较矩阵分配给每一完美的氨基酸匹配的分值或数值)和空位延伸罚分(其通常为空位开放罚分的1/10倍)以及比较矩阵例如pam250或blosum62。在某些实施方案中，所述算法也使用标准比较矩阵(对于pam250比较矩阵，参见dayhoff等，1978,atlasofproteinsequenceandstructure，5:345-352；对于blosum62比较矩阵，参见henikoff等，1992,proc.natl.acad.sci.u.s.a.89:10915-10919)。77.在用gap程序测定多肽或核苷酸序列的同一性百分率中可采用的参数实例如下：算法：needleman等，1970,j.mol.biol.48:443-453；比较矩阵：来自henikoff等，1992，上述的blosum62；空位罚分：12(但对末端空位不罚分)；空位长度罚分：4；相似性阀值：0。78.用于比对两个氨基酸序列的某些比对设计可导致仅两个序列的短区域匹配，即使在两个全长序列间没有显著的关系，这种小比对区也可具有极高的序列同一性。因此，如果需要产生跨越靶标多肽的至少50个或其它数目的邻接氨基酸的比对，则可调整所选择的比对方法(gap程序)。79.术语“衍生物”是指包括除氨基酸(或核酸)的插入、缺失或取代外的化学修饰的分子。在某些实施方案中，衍生物包括共价修饰，其包括但不限于与聚合物、脂类或其它有机或无机部分化学键合。在某些实施方案中，化学修饰的抗原结合蛋白可比未进行化学修饰的抗原结合蛋白具有更长的循环半衰期。在某些实施方案中，化学修饰的抗原结合蛋白可改进靶向所期需细胞、组织和/或器官的能力。在某些实施方案中，对衍生的抗原结合蛋白进行共价修饰以使其包含一种或多种水溶性聚合连接物，其包括但不限于聚乙二醇、聚氧乙二醇或聚丙二醇。在某些实施方案中，衍生的抗原结合蛋白包含一种或多种聚合物，其包括但不限于单甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、纤维素或基于其它基于糖类的聚合物、聚-(n-乙烯吡咯烷酮)-聚乙二醇、丙二醇同聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化的多元醇(例如乙二醇)和聚乙烯醇以及所述聚合物的混合物。80.在某些实施方案中，用聚乙二醇(peg)亚单位共价修饰衍生物。在某些实施方案中，在一个或多个特定位置(例如在衍生物的氨基末端)键合一种或多种水溶性聚合物体。在某些实施方案中，将一种或多种水溶性聚合物随机连接到衍生物的一个或多个侧链上。在某些实施方案中，将peg用于改进抗体或其抗原结合片段的治疗能力。在某些实施方案中，将peg用于改进人源化抗体的治疗能力。某些所述方法于例如美国专利第6,133,426号中论述，其为任何目的在此引作参考。81.术语“抗体”是指任何同种型的完整免疫球蛋白或其可与完整抗体竞争特异性结合靶抗原的片段，并且包括例如嵌合抗体、人源化抗体、人全抗体和双特异性抗体。“抗体”是一类抗原结合蛋白。完整抗体通常将包含至少两条全长重链和两条全长轻链，但在某些情况下可包括较少的链，例如骆驼中天然存在的抗体可仅包含重链。抗体可仅来源于单一来源，或可为“嵌合”的，也即抗体的不同部分可来源于两种不同的抗体。可在杂交瘤中；通过重组dna技术或通过酶学或化学裂解完整抗体，来产生抗原结合蛋白、抗体或结合片段。除非另外指出，否则术语“抗体”除包括包含两条全长重链和两条全长轻链的抗体外，还包括其衍生物、变体和片段。此外，除非明确将其排除在外，否则抗体分别包括单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、双特异性抗体、结构域抗体、合成抗体(本文有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体融合体(本文有时称为“抗体缀合物”)及其片段。82.天然存在的抗体结构单元通常包含四聚体。每一四聚体通常由两个同样的多肽链对组成，每一对具有一条全长“轻链”(在某些实施方案中，约25kda)和一条全长“重链”(在某些实施方案中，约50-70kda)。每条链的氨基末端部分通常包含约100-110个或更多个氨基酸的可变区，所述可变区通常负责抗原识别。每条链的羧基末端部分通常定义为可负责效应功能的恒定区。人轻链通常分为κ和λ轻链。重链通常分为μ、δ、γ、α或ε链，并且抗体的同种型分别定义为igm、igd、igg、iga和ige。igg有若干亚类，包括但不限于igg1、igg2、igg3和igg4。igm具有亚类，包括但不限于igm1和igm2。iga同样被再分为亚类，包括但不限于iga1和iga2。在全长轻链和重链内，通常可变区和恒定区由约12个或更多个氨基酸的“j”区连接，且重链还包括约10个以上氨基酸的“d”区。参见例如fundamentalimmunology,ch.7(paul,w.编辑，第二版，ravenpress,n.y.(1989))(其为所有目的以其整体在此引作参考)。每一轻链/重链对的可变区通常形成抗原结合位点。83.在某些实施方案中，即使是在同一物种的抗体之间，不同的抗体可变区在氨基酸序列上广泛变化。抗体可变区通常决定特定抗体针对其靶标的特异性。84.可变区通常表现出由三个高变区连接的相对保守的构架区(fr)的相同一般结构，所述高变区也被称为互补决定区或cdr。通常通过构架区定位来自每对两条链的cdr，所述cdr使得可结合特异性表位。两条轻链和重链可变区从n-末端到c-末端通常包含结构域fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4。向每一结构域的氨基酸分配通常与如下定义一致：kabatsequencesofproteinsofimmunologicalinterest(nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1987和1991))或chothia&lesk,j.mol.biol.,196:901-917(1987)；chothia等，nature,342:878-883(1989)。国际免疫遗传学(imgt)数据库(http://www.imgt.org)提供了抗原结合位点的标准化编号和定义。cdr与imgt划分之间的对应性在lefrancetal.,devcomparatimmunol27:55-77,2003中有所描述。85.按惯例，重链中的cdr区通常被称为h1、h2和h3，并且从氨基末端到羧基末端的方向按顺序编号。轻链中的cdr区通常被称为l1、l2和l3，并且从氨基末端到羧基末端的方向按顺序编号。86.术语“轻链”包括全长轻链及其具有足以赋予结合特异性的可变区序列的片段。全长轻链包含可变区结构域vl和恒定区结构域cl。轻链的可变区结构域位于多肽的氨基末端。轻链包括κ链和λ链。87.术语“重链”包括全长重链及其具有足以赋予结合特异性的可变区序列的片段。全长重链包含可变区结构域vh和三个恒定区结构域ch1、ch2和ch3。vh结构域位于多肽的氨基末端，而ch结构域位于羧基末端，且ch3最接近多肽的羧基末端。重链可为任何同种型，包括igg(包括igg1、igg2、igg3和igg4亚型)、iga(包括iga1和iga2亚型)、igm和ige。88.术语“抗原结合片段”包括但不限于fab片段、fab'片段、f(ab')2片段、fv片段、双抗体以及单链抗体分子。[0089]“fc”区包含两个含抗体ch1和ch2结构域的重链片段。所述两个重链片段通过两个或多个二硫键并通过ch3结构域的疏水作用保持在一起。[0090]“fab片段”包含一条轻链和一条重链的ch1及可变区。fab分子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。[0091]“fab’片段”包含一条轻链和含有vh结构域及ch1结构域还有ch1和ch2结构域之间的区域的一条重链的部分，因此在两个fab’片段的两条重链间可形成链间二硫键以形成f(ab’)2分子。[0092]“f(ab’)2片段”含有两条轻链和含有ch1和ch2结构域之间的恒定区的部分的两条重链，由此在两条重链之间形成链间二硫键。因此f(ab’)2片段由通过两条重链之间的二硫键保持在一起的两个fab’片段组成。[0093]“fv片段”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺乏恒定区。[0094]“单链抗体”为fv分子，其中重链和轻链可变区由弹性接头连接在一起以形成单多肽链，从而形成抗原结合区。单链抗体详述于国际专利申请公开号wo88/01649和美国专利第4,946,778号及第5,260,203号中，它们的内容在此引作参考。[0095]“单克隆抗体”是指具有单一分子组成的同质抗体群。单克隆抗体可以是非特异性的，也可以是多特异性的。[0096]“结构域抗体”为只含有重链可变区或轻链可变区的具免疫学功能的免疫球蛋白片段。在某些情况下，两个或多个vh区与肽接头共价连接以形成二价结构域抗体。二价结构域抗体的这两个vh区可靶向相同或不同的抗原。[0097]“多特异性抗体”为靶向不止一种抗原或表位的抗体。“双特异性”、“双重特异性”或“双功能”抗体分别为具有两个不同的抗原结合位点的杂合抗体。双特异性抗体的两个结合位点将结合两种不同的表位，所述表位可位于相同或不同的蛋白靶标上。[0098]当抗体结合一个靶标比其结合第二个靶标更紧密时，其为“选择性”抗体。[0099]“重组抗体”为用重组技术制备的抗体。用于制备重组抗体的方法和技术在本领域众所周知。[0100]双特异性或双功能抗体通常为人工杂合抗体，其具有两个不同的重链/轻链对和两个不同的结合位点。可通过多种方法(包括但不限于融合杂交瘤或连接fab’片段)来制备双特异性抗体。参见例如songsivilai等，clin.exp.immunol.,79:315-321(1990)；kostelny等，j.immunol.,148:1547-1553(1992)。[0101]每个单独的免疫球蛋白链通常由若干个“免疫球蛋白结构域”组成，每个免疫球蛋白结构域由大约90-110个氨基酸组成并具有特有的折叠方式。这些结构域为组成抗体多肽的基本单元。在人中，iga和igd同种型含有四条重链和四条轻链；igg和ige同种型含有两条重链和两条轻链；而igm同种型含有五条重链和五条轻链。重链c区通常包含一个或多个可负责效应功能的结构域。重链恒定区结构域的数目将视同种型而定。例如，igg重链含有三个称为ch1、ch2和ch3的c区结构域。提供的抗体可具有任何这些同种型和亚型。[0102]术语“中和”指结合配体并防止或降低配体的生物学作用。这可例如通过直接封阻配体上的结合位点或通过结合配体并通过间接方式(例如配体的结构或能量改变)改变配体的结合能力来实现。在评估抗体或其抗原结合片段的结合情况和/或特异性中，当过量的抗体降低结合到配体的结合配偶体的量至少约1-20、20-30%、30-40%、40-50%、50-60%、60-70%、70-80%、80-85%、85-90%、90-95%、95-97%、97-98%、98-99%或更多(根据体外竞争性结合测定所测量)时，抗体或片段可基本上抑制配体与其结合配偶体的结合。在某些实施方案中，在本发明的情况下，所述中和抗体可降低rbd与其受体ace2的结合。在某些实施方案中，经由竞争测定来表征和/或描述中和能力。在某些实施方案中，中和能力以50%抑制浓度(ic50)值来描述。[0103]术语“抗体依赖性增强(ade)效应”指某些病毒特异性抗体与病毒结合后，与病毒结合的抗体可通过其fc区与表面表达fcr的细胞结合从而介导病毒进入这些细胞，导致增强了病毒的感染性过程。[0104]人体感染冠状病毒后，免疫系统能够产生各种各样的针对病毒颗粒及其组分的特异性抗体。在这些抗体中，只有针对病毒表面s蛋白的抗体能够结合病毒颗粒；而那些针对病毒其他元件和组分的抗体并不能与病毒颗粒发生结合，这是因为这些组分被包裹在病毒内部，抗体无法与其接触。这些结合病毒表面s蛋白的抗体各式各样，在s蛋白上分别具有不同的结合位点。其中有一部分抗体，其结合位点恰恰与病毒表面s蛋白上细胞受体的结合部位重合。这类抗体不仅能结合病毒颗粒，还能够与细胞表面受体竞争性地结合病毒颗粒。若抗体的结合力够强，这类抗体就能阻止病毒表面蛋白与细胞受体的结合，从而抑制病毒感染，这类抗体称为中和抗体。而另外大部分能结合病毒颗粒却不具备体外中和效力的抗体，在人体内也能通过其恒定区的fc区域起到非常重要的作用。抗体的fc区域可以结合效应细胞上的fc受体，从而招募各类效应细胞：招募自然杀伤细胞，引发抗体依赖性细胞毒性作用(adcc)；招募结合血清中的补体分子，引发补体依赖性细胞毒性作用(cdc)；招募巨噬细胞，引发抗体依赖细胞介导的吞噬作用(adcp)。[0105]然而，ade效应使疫苗开发复杂化。登革病毒有4类血清型，而人体在感染某个血清型的登革病毒后，机体产生针对该血清型的具有终身保护效力的抗体(guzmanmg,2007)。但是，登革病毒导致威胁生命的登革出血热症状并非发生在第一次感染的时段(screatong,2015)，而往往发生在第二次感染不同血清类型病毒之后（氨基酸序列差异为30%～35%）。这是因为第一次感染后诱导产生的针对某一血清型登革病毒的抗体，其浓度或亲和力不足以中和第二次感染中另一血清型的病毒，相反促进病毒感染增强。这种现象被称为ade效应。[0106]在ade效应发生时，结合病毒颗粒的抗体，通过其fc区域使病毒颗粒被拥有fc受体或补体受体的细胞吞噬，反而促进其对这类细胞的侵染。某些种类的病毒感染细胞时，病毒颗粒通过内吞作用进入宿主细胞体内，在溶酶体中完成病毒膜与宿主膜的融合过程。而依赖于抗体的内吞作用反而促进了病毒颗粒被宿主细胞所吞噬，加重病毒感染。因此，抗体是否抑制或促进病毒感染，是其中和效力与ade效应共同平衡的结果；而血清对病毒的影响则是其中所包含的所有抗体分子（中和效力与ade效应）的综合表现。[0107]术语“靶标”是指能够被抗体或其抗原结合片段结合的分子或分子部分。在某些实施方案中，靶标可具有一个或多个表位。在某些实施方案中，靶标为抗原。在短语“抗原结合片段”中“抗原”的使用仅表示包含可被抗体结合的抗原的蛋白序列。在该情况下，所述蛋白不一定是外源的或不一定能够诱导免疫反应。[0108]当术语“竞争”用于竞争相同表位的中和抗体的情况中时，意指在抗体之间竞争，其通过以下测定法来测定：在所述测定法中，待检测的抗体或其抗原结合片段防止或抑制(例如降低)参考抗体与共同抗原(例如s蛋白或其结构域)的特异性结合。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗体是否与另一种竞争，这些测定例如：固相直接或间接放射免疫测定(ria)、固相直接或间接酶免疫测定(eia)、夹心竞争测定(参见例如stahli等，1983,methodsinenzymology9:242-253)；固相直接生物素-亲和素eia(参见例如kirkland等，1986,j.immunol.137:3614-3619)、固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见例如harlow和lane,1988,antibodies,alaboratorymanual(抗体，实验室手册),coldspringharborpress)；用i-125标记物的固相直接标记ria(参见例如morel等，1988,molec.immunol.25:7-15)；固相直接生物素-亲和素eia(参见例如cheung,等，1990,virology176:546-552)；和直接标记的ria(moldenhauer等，1990,scand.j.immunol.32:77-82)。通常所述测定法涉及使用结合荷有未标记的检测抗体及标记的参考抗体任一种的固态表面或细胞的纯化抗原。通过测量在所测抗体存在下结合固态表面或细胞的标记量来测量竞争性抑制。通常所测抗体过量存在。通常当竞争的抗体过量存在时，其将抑制(例如降低)至少40-45%、45-50%、50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%或75%或更多参考抗体与共同抗原的特异性结合。在某些情况下，结合被抑制至少80-85%、85-90%、90-95%、95-97%或97%或更多。[0109]术语“抗原”是指能够被选择性结合剂例如抗体或其免疫学功能片段结合的分子或分子部分。在某些实施方案中，能够将抗原用于动物以产生能够结合该抗原的抗体。抗原可拥有能够与不同的抗体作用的一个或多个表位。[0110]术语“表位”包括能够被抗体结合的任何决定簇。表位为抗原区域，其被靶向该抗原的抗体结合。当抗原为蛋白时，其包含直接与抗体接触的特定氨基酸。大部分情况下，表位位于蛋白上，但在某些情况下，可位于其它种类的分子上，例如核酸。表位决定簇可包括分子的化学活性表面簇，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并可具有特定的三维结构特点和/或特定的电荷特点。[0111]术语“扩展克隆”又称b细胞扩展克隆或扩展克隆抗体，是指初始b细胞结合抗原后进入到淋巴结的生发中心，在生发中心，b细胞在t细胞的帮助下不断扩增，同时抗体的可变区进一步突变，最终生成结合力非常强的抗体。通常认为同一扩展克隆产生的抗体在功能和性质方面具有极大相似性，例如cdr序列类似，结合相同的表位，实现相同的生物学作用等。[0112]术语“单独克隆”又称单独克隆抗体，在实验中没有发现与其具有极为相似的cdr序列的抗体。很有可能的是，实验样本有限而没有发现扩展克隆抗体，因此将该抗体称为单独克隆。[0113]术语“治疗有效量”是指确定在哺乳动物中产生治疗反应的本发明的抗体或其抗原结合片段的量。所述治疗有效量易于由本领域一般技术人员确定。[0114]术语“患者”和“受试者”可互换使用，包括人和非人动物受试者以及患有正式确诊的疾病的对象、患未被正式确定的疾病的对象、接受医学治疗的对象、有发展疾病风险的对象等。[0115]术语“治疗”包括治疗性治疗、预防性治疗及在降低受试者发展疾病的风险或其它风险因素中的应用。治疗不需要完全治愈疾病，而是包括在其中减轻症状或减轻潜在风险因素的实施方案。[0116]术语“预防”不需要100%消除事件的可能性。更准确地说，它表示在所述抗体或方法存在下事件发生的可能性得到降低。[0117]可将标准技术用于重组dna、寡核苷酸合成和组织培养及转化(例如电穿孔、脂质转染)。可按照厂商说明书来实施酶学反应及纯化技术，或根据本领域通用的方法来完成或如本文所述进行。通常可按照本领域众所周知的常规方法，以及阐述于在本说明书中各处引用并讨论的各种一般性及更特定的参考文献，来实施前述技术和方法。参见例如sambrook等，molecularcloning:alaboratorymanual(第2版，coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.(1989))，其为任何目的在此引作参考。除非提供明确定义，否则所使用的与本文所述的分析化学、合成有机化学及医药和制药化学相关的术语及实验方法和技术为本领域众所周知并在本领域常常使用。可将标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制及递送和治疗患者。[0118]二、抗体及其制备方法本公开内容提供了能够结合sars-cov-2并中和其活性的有效抗体或其抗原结合片段(以下统称为“抗体”)，所述抗体不产生ade效应。本发明至少部分地基于sars-cov-2rbd与其人受体血管紧张素转化酶-2(ace2)的结合是病毒进入靶细胞的关键起始步骤的理解，用抗体阻断该相互作用可能是用于治疗和预防sars-cov-2感染的有前景的方法。本发明人还鉴定了增强与中和活性和sars-cov-2s蛋白结构域的抗体表位之间的关系。本发明人出人意料地发现了能够中和sars-cov-2而无ade效应的一系列抗体，并特别发现了能够交叉中和sars-cov-2和sars-cov-1而无ade效应的一系列抗体。本发明人还发现一系列sars-cov-2突变株显示对本发明的某些抗体保持敏感性。[0119]在一些实施方案中，本文所述的抗体以小于10μg/ml的50%抑制浓度(ic50)值体外中和sars-cov-2。在一些实施方案中，本文所述的抗体以小于0.1μg/ml的50%抑制浓度(ic50)值体外中和sars-cov-2。在一些实施方案中，本文所述的抗体以小于50ng/ml的50%抑制浓度(ic50)值体外中和sars-cov-2。在一些实施方案中，本文所述的抗体以小于25ng/ml的50%抑制浓度(ic50)值体外中和sars-cov-2。在一些实施方案中，本文所述的抗体以约1-20ng/ml的50%抑制浓度(ic50)值体外中和sars-cov-2。如实施例中基于细胞的体外中和测定所述，通过萤光素酶活性测量本文所述的抗体的ic50值。[0120]在一些实施方案中，本文所述的抗体以小于10μg/ml的50%抑制浓度(ic50)值体外中和sars-cov-1。在一些实施方案中，本文所述的抗体以小于0.1μg/ml的50%抑制浓度(ic50)值体外中和sars-cov-1。在一些实施方案中，本文所述的抗体以小于50ng/ml的50%抑制浓度(ic50)值体外中和sars-cov-1。在一些实施方案中，本文所述的抗体以小于25ng/ml的50%抑制浓度(ic50)值体外中和sars-cov-1。在一些实施方案中，本文所述的抗体以小于10ng/ml的50%抑制浓度(ic50)值体外中和sars-cov-1。在一些实施方案中，本文所述的抗体以小于6ng/ml的50%抑制浓度(ic50)值体外中和sars-cov-1。在一些实施方案中，本文所述的抗体以约1-6ng/ml的50%抑制浓度(ic50)值体外中和sars-cov-1。如实施例中基于细胞的体外中和测定所述，通过萤光素酶活性测量本文所述的抗体的ic50值。[0121]在一些实施方案中，本文所述的抗体没有产生ade效应，如实施例中基于细胞的体外增强测定所述，通过ade曲线下面积(auc)和增强功效所测量。[0122]本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明涉及结合sars-cov-2s蛋白的分离的抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，本发明涉及结合s-ecd的分离的抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，本发明涉及结合s1结构域的分离的抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，本发明涉及结合s2结构域的分离的抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，本发明涉及结合rbd的分离的抗体或其抗原结合片段。[0123]在一个方面，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：a)选自以下的一个或多个重链互补决定区(cdrh)：(i)选自以下氨基酸序列的cdrh1：seqidno:1-28；(ii)选自以下氨基酸序列的cdrh2：seqidno:29-56；(iii)选自以下氨基酸序列的cdrh3：seqidno:57-84；和(iv)在一处或多处含有不超过2个氨基酸的取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的cdrh；b)选自以下的一个或多个轻链互补决定区(cdrl)：(i)选自以下氨基酸序列的cdrl1：seqidno:113-140；(ii)选自以下氨基酸序列的cdrl2：seqidno:141-168；(iii)选自以下氨基酸的序列的cdrl3：seqidno:169-196；和(iv)在一处或多处含有不超过2个氨基酸的取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的cdrl；或c)一个或多个a)的cdrh和一个或多个b)的cdrl，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2而无ade效应。[0124]在某些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含至少一个a)的cdrh和至少一个b)的cdrl。在某些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含至少两个a)的cdrh和至少两个b)的cdrl。在某些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含所述cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3。[0125]在一个方面，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：a)一个或多个选自以下氨基酸序列的重链可变区(vh)：seqidno:85-112，或与seqidno:85-112中任一序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列；和/或b)一个或多个选自以下氨基酸序列的轻链可变区(vl)：seqidno:197-224，或与seqidno:197-224中任一序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2而无ade效应。[0126]在某些实施方案中，所述重链可变区(vh)的氨基酸序列与seqidno:85-112中任一序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。在某些实施方案中，所述轻链可变区(vl)的氨基酸序列与seqidno:197-224中任一序列具有85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。[0127]在一个实施方案中，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：a)选自以下的一个或多个cdrh：(i)选自seqidno:7、8、11-21、24-28的氨基酸序列的cdrh1；(ii)选自seqidno:35、36、39-49、52-56的氨基酸序列的cdrh2；(iii)选自seqidno:63、64、67-77、80-84的氨基酸序列的cdrh3；和(iv)在一处或多处含有不超过2个氨基酸的取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的cdrh；b)选自以下的一个或多个cdrl：(i)选自seqidno:119、120、123-133、136-140的氨基酸序列的cdrl1；(ii)选自seqidno:147、148、151-161、164-168的氨基酸序列的cdrl2；(iii)选自seqidno:175、176、179-189、192-196的氨基酸序列的cdrl3；和(iv)在一处或多处含有不超过2个氨基酸的取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的cdrl；或c)一个或多个a)的cdrh和一个或多个b)的cdrl，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合s蛋白的rbd结构域，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2而无ade效应。[0128]在另一个实施方案中，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：a)一个或多个选自以下氨基酸序列的重链可变区(vh)：seqidno:91、92、95-105、108-112，或与seqidno:91、92、95-105、108-112中任一序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列；和/或b)一个或多个选自以下氨基酸序列的轻链可变区(vl)：seqidno:203、204、207-217、220-224，或与seqidno:203、204、207-217、220-224中任一序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合s蛋白的rbd结构域，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2而无ade效应。[0129]在某些实施方案中，所述重链可变区(vh)的氨基酸序列与seqidno:91、92、95-105、108-112中任一序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。在某些实施方案中，所述轻链可变区(vl)的氨基酸序列与seqidno:203、204、207-217、220-224中任一序列具有85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。[0130]在一个实施方案中，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：a)选自以下的一个或多个cdrh：(i)选自seqidno:1-6、22、23的氨基酸序列的cdrh1；(ii)选自seqidno:29-34、50、51的氨基酸序列的cdrh2；(iii)选自seqidno:57-62、78、79的氨基酸序列的cdrh3；和(iv)在一处或多处含有不超过2个氨基酸的取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的cdrh；b)选自以下的一个或多个cdrl：(i)选自seqidno:113-118、134、135的氨基酸序列的cdrl1；(ii)选自seqidno:141-146、162、163的氨基酸序列的cdrl2；(iii)选自seqidno:169-174、190、191的氨基酸序列的cdrl3；和(iv)在一处或多处含有不超过2个氨基酸的取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的cdrl；或c)一个或多个a)的cdrh和一个或多个b)的cdrl，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合s蛋白的s1但非rbd结构域，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2而无ade效应。[0131]在另一个实施方案中，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：a)一个或多个选自以下氨基酸序列的重链可变区(vh)：seqidno:85-90、106、107，或与seqidno:85-90、106、107中任一序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列；和/或b)一个或多个选自以下氨基酸序列的轻链可变区(vl)：seqidno:197-202、218、219，或与seqidno:197-202、218、219中任一序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合s蛋白的s1但非rbd结构域，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2而无ade效应。[0132]在某些实施方案中，所述重链可变区(vh)的氨基酸序列与seqidno:85-90、106、107中任一序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。在某些实施方案中，所述轻链可变区(vl)的氨基酸序列与seqidno:197-202、218、219中任一序列具有85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。[0133]在一个实施方案中，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：a)选自以下的一个或多个cdrh：(i)选自seqidno:9、10的氨基酸序列的cdrh1；(ii)选自seqidno:37、38的氨基酸序列的cdrh2；(iii)选自seqidno:65、66的氨基酸序列的cdrh3；和(iv)在一处或多处含有不超过2个氨基酸的取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的cdrh；b)选自以下的一个或多个cdrl：(i)选自seqidno:121、122的氨基酸序列的cdrl1；(ii)选自seqidno:149、150的氨基酸序列的cdrl2；(iii)选自seqidno:177、178的氨基酸序列的cdrl3；和(iv)在一处或多处含有不超过2个氨基酸的取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的cdrl；或c)一个或多个a)的cdrh和一个或多个b)的cdrl，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合s蛋白的s2结构域，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2而无ade效应。[0134]在另一个实施方案中，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：a)一个或多个选自以下氨基酸序列的重链可变区(vh)：seqidno:93、94，或与seqidno:93、94中任一序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列；和/或b)一个或多个选自以下氨基酸序列的轻链可变区(vl)：seqidno:205、206，或与seqidno:205、206中任一序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合s蛋白的s2结构域，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2而无ade效应。[0135]在某些实施方案中，所述重链可变区(vh)的氨基酸序列与seqidno:93、94中任一序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。在某些实施方案中，所述轻链可变区(vl)的氨基酸序列与seqidno:205、206中任一序列具有85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。[0136]在一个方面，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体选自以下表2中所示的抗体：表2：抗体及相应的cdr氨基酸序列抗体名称cdrh1seqidnocdrh2seqidnocdrh3seqidnocdrl1seqidnocdrl2seqidnocdrl3seqidnoꢀ12957113141169xg02823058114142170xg03033159115143171ꢀ43260116144172ꢀ53361117145173xg03563462118146174ꢀ73563119147175xg01183664120148176xg01293765121149177ꢀ103866122150178xg017113967123151179ꢀ124068124152180ꢀ134169125153181xg036144270126154182xg025154371127155183ꢀ164472128156184xg041174573129157185xg010184674130158186ꢀ194775131159187xg008204876132160188ꢀ214977133161189ꢀ225078134162190xg027235179135163191ꢀ245280136164192xg022255381137165193xg038265482138166194xg014275583139167195ꢀ285684140168196其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2而无ade效应。[0137]本领域技术人员将理解，本发明的分离的抗体或其抗原结合片段还包括在一处或多处含有不超过2个氨基酸的取代、缺失或插入的表2中所示的相应cdr序列。[0138]在一个方面，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体选自以下表3中所示的抗体：表3：抗体及相应的vh和vl氨基酸序列抗体名称vhseqidnovlseqidnoꢀ85197xg02886198xg03087199ꢀ88200ꢀ89201xg03590202ꢀ91203xg01192204xg01293205ꢀ94206xg01795207ꢀ96208ꢀ97209xg03698210xg02599211ꢀ100212xg041101213xg010102214ꢀ103215xg008104216ꢀ105217ꢀ106218xg027107219ꢀ108220xg022109221xg038110222xg014111223ꢀ112224其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2而无ade效应。[0139]在某些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：具有与表3中所示的氨基酸序列至少80%序列同一性的重链可变区(vh)；和/或具有与表3中所示的氨基酸序列至少80%序列同一性的轻链可变区(vl)。在某些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：具有与表3中所示的氨基酸序列至少90%序列同一性的重链可变区(vh)；和/或具有与表3中所示的氨基酸序列至少90%序列同一性的轻链可变区(vl)。[0140]在一个方面，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体选自以下表4中所示的抗体：表4：抗体及相应的cdr氨基酸序列抗体名称cdrh1seqidnocdrh2seqidnocdrh3seqidnocdrl1seqidnocdrl2seqidnocdrl3seqidnoꢀ73563119147175xg01183664120148176xg017113967123151179ꢀ124068124152180ꢀ134169125153181xg036144270126154182xg025154371127155183ꢀ164472128156184xg041174573129157185xg010184674130158186ꢀ194775131159187xg008204876132160188ꢀ214977133161189ꢀ245280136164192xg022255381137165193xg038265482138166194xg014275583139167195ꢀ285684140168196其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合s蛋白的rbd结构域，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2而无ade效应。[0141]在一个方面，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体选自以下表5中所示的抗体：表5：抗体及相应的vh和vl氨基酸序列抗体名称vhseqidnovlseqidnoꢀ91203xg01192204xg01795207ꢀ96208ꢀ97209xg03698210xg02599211ꢀ100212xg041101213xg010102214ꢀ103215xg008104216ꢀ105217ꢀ108220xg022109221xg038110222xg014111223ꢀ112224其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合s蛋白的rbd结构域，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2而无ade效应。[0142]在一个方面，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体选自以下表6中所示的抗体：表6：抗体及相应的cdr氨基酸序列抗体名称cdrh1seqidnocdrh2seqidnocdrh3seqidnocdrl1seqidnocdrl2seqidnocdrl3seqidnoꢀ12957113141169xg02823058114142170xg03033159115143171ꢀ43260116144172ꢀ53361117145173xg03563462118146174ꢀ225078134162190xg027235179135163191其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合s蛋白的s1但非rbd结构域，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2而无ade效应。[0143]在一个方面，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体选自以下表7中所示的抗体：表7：抗体及相应的vh和vl氨基酸序列抗体名称vhseqidnovlseqidnoꢀ85197xg02886198xg03087199ꢀ88200ꢀ89201xg03590202ꢀ106218xg027107219其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合s蛋白的s1但非rbd结构域，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2而无ade效应。[0144]在一个方面，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体选自以下表8中所示的抗体：表8：抗体及相应的cdr氨基酸序列抗体名称cdrh1seqidnocdrh2seqidnocdrh3seqidnocdrl1seqidnocdrl2seqidnocdrl3seqidnoxg01293765121149177ꢀ103866122150178其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合s蛋白的s2结构域，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2而无ade效应。[0145]在一个方面，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体选自以下表9中所示的抗体：表9：抗体及相应的vh和vl氨基酸序列抗体名称vhseqidnovlseqidnoxg01293205ꢀ94206其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合s蛋白的s2结构域，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2而无ade效应。[0146]在一个方面，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体选自以下表10中所示的抗体：表10：抗体及相应的cdr氨基酸序列抗体名称cdrh1seqidnocdrh2seqidnocdrh3seqidnocdrl1seqidnocdrl2seqidnocdrl3seqidnoxg038265482138166194xg014275583139167195ꢀ285684140168196其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2及其单氨基酸突变株而无ade效应。[0147]在一个实施方案中，所述sars-cov-2的单氨基酸突变株包括rbd中的v341i、f342l、v367f、r408i、a435s、g476s和v483a突变。在一个优选的实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段为包含seqidno:27的cdrh1、seqidno:55的cdrh2、seqidno:83的cdrh3、seqidno:139的cdrl1、seqidno:167的cdrl2、seqidno:195的cdrl3的抗体或其抗原结合片段。在另一个优选的实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段为包含seqidno:28的cdrh1、seqidno:56的cdrh2、seqidno:84的cdrh3、seqidno:140的cdrl1、seqidno:168的cdrl2、seqidno:196的cdrl3的抗体或其抗原结合片段。[0148]在一个方面，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体选自以下表11中所示的抗体：表11：抗体及相应的vh和vl氨基酸序列抗体名称vhseqidnovlseqidnoxg038110222xg014111223ꢀ112224其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2及其单氨基酸突变株而无ade效应。[0149]在一个实施方案中，所述sars-cov-2的单氨基酸突变株包括rbd中的v341i、f342l、v367f、r408i、a435s、g476s和v483a突变。在一个优选的实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段为包含seqidno:111的vh和seqidno:223的vl的抗体或其抗原结合片段。在另一个优选的实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段为包含seqidno:112的vh和seqidno:224的vl的抗体或其抗原结合片段。[0150]在一个方面，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段选自：包含seqidno:27的cdrh1、seqidno:55的cdrh2、seqidno:83的cdrh3、seqidno:139的cdrl1、seqidno:167的cdrl2、seqidno:195的cdrl3的抗体或其抗原结合片段，以及包含seqidno:28的cdrh1、seqidno:56的cdrh2、seqidno:84的cdrh3、seqidno:140的cdrl1、seqidno:168的cdrl2、seqidno:196的cdrl3的抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效交叉中和sars-cov-2和sars-cov-1而无ade效应。[0151]在一个方面，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段选自：包含seqidno:111的vh和seqidno:223的vl的抗体或其抗原结合片段，以及包含seqidno:112的vh和seqidno:224的vl的抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效交叉中和sars-cov-2和sars-cov-1而无ade效应。[0152]本发明的抗体识别的表位如下：抗体名称识别的表位位置xg028s1但非rbdxg030s1但非rbdxg035s1但非rbdxg011rbdxg012s2xg017rbdxg036rbdxg025rbdxg041rbdxg010rbdxg008rbdxg027s1但非rbdxg022rbdxg038rbdxg014rbd本发明的抗体的序列表信息如下：包含上文所述的vh或vl氨基酸序列的本发明抗体的变体在本发明的范围之内。例如，变体可在vh和/或vl中包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个不会对抗体特性产生不利影响的immunol28:489-499,1991)、特异性决定残基表面重塑（美国专利公布号20100261620）、人改型（或人框架改型）（美国专利公布号us2009/0118127）、超人源化（美国专利号7,709,226）和定向选择（osbournetal(2005)methods36:61-68,2005；美国专利号5,565,332）。[0157]可采用诸如国际专利公布号wo90/007861和国际专利公布号wo92/22653中所述的那些公开的技术，通过引入修改的框架支持残基来保持结合亲和力（回复突变），来进一步优化人源化抗体以改善其对所需抗原的选择性或亲和力。[0158]可使用基因组中携带人免疫球蛋白(ig)基因座的转基因小鼠来产生抗目标蛋白质的人抗体，这描述于例如国际专利公布号wo90/04036、美国专利号6150584、国际专利公布号wo99/45962、国际专利公布号wo02/066630、国际专利公布号wo02/43478；lonbergetal(1994)nature368:856-9；greenetal(1994)naturegenet.7:13-21；green&jakobovits(1998)exp.med.188:483-95；lonbergandhuszar(1995)int.rev.immunol.13:65-93；bruggemannetal(1991)eur.j.immunol.21:1323-ꢀ1326；fishwildetal(1996)nat.biotechnol.14:845-851；mendezetal(1997)nat.genet.15:146-156；green(1999)j.immunol.methods231:11-23；yangetal(1999)cancerres.59:1236-1243；brüggemannandtaussig(1997)curr.opin.biotechnol.8:455-458；国际专利公布号wo02/043478）。可破坏此类鼠中的内源性免疫球蛋白基因座或使该基因座缺失，并且可使用转染色体或微小基因，通过同源或非同源重组将至少一种完整或部分的人免疫球蛋白基因座插入小鼠基因组中。[0159]人抗体可选自噬菌体展示文库，其中噬菌体经工程改造以表达人免疫球蛋白或其部分，诸如fab、单链抗体(scfv)或者未配对或配对抗体可变区（knappiketal(2000)j.mol.biol.296:57-86；krebsetal(2001)j.immunol.meth.254:67-84；vaughanetal(1996)naturebiotechnology14:309-314；sheetsetal(1998)pitas(usa)95:6157-6162；hoogenboomandwinter,(1991)j.mol.biol.227:381；marksetal(1991)j.mol.biol.222:581）。本发明的抗体可分离自例如噬菌体展示文库，所述噬菌体展示文库将抗体的重链可变区和轻链可变区表达为具有噬菌体pix外壳蛋白的融合蛋白，如shietal(2010)j.mol.biol.397:385-96和国际专利公布no.wo09/085462中所述。可筛选文库中结合至s蛋白的噬菌体，并可进一步表征获得的阳性克隆，从克隆裂解物分离fab，将其表达为全长igg。此类用于分离人抗体的噬菌体展示方法描述于例如：授予ladner等人的美国专利号5,223,409、5,403,484和5,571,698；授予dower等人的美国专利号5,427,908和5,580,717；授予mccafferty等人的美国专利号5,969,108和6,172,197；以及授予griffiths等人的美国专利号5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915和6,593,081。[0160]免疫原性抗原的制备以及单克隆抗体的产生可用任何合适的技术诸如重组蛋白产生来执行。免疫原性抗原可按纯化蛋白质或蛋白质混合物（包括全细胞、细胞提取物或组织提取物）的形式施用于动物，或者抗原可在动物体内由编码所述抗原或其部分的核酸从头形成。[0161]本发明的另一个实施方案是一种分离的多核苷酸，其编码本发明的任一个抗体重链可变区和/或抗体轻链可变区。鉴于在给定表达系统中的遗传密码简并性或密码子优先性而编码本发明的同一抗体的多种多核苷酸也在本发明的范围内。编码本发明抗体的vh或vl或它们的片段的多核苷酸序列可有效连接至一个或多个调控元件，诸如启动子或增强子，所述调控元件允许核苷酸序列在预期宿主细胞中表达。多核苷酸可为cdna。[0162]本发明的另一个实施方案是一种包含本发明的多核苷酸的载体。此类载体可以是质粒载体、病毒载体、用于杆状病毒表达的载体、基于转座子的载体或任何其他适于通过任何手段将本发明的合成多核苷酸引入给定生物体或遗传背景的载体。例如，将任选地连接至恒定区并且编码本发明抗体的轻链可变区和/或重链可变区的多核苷酸插入表达载体中。可将轻链和/或重链克隆到相同或不同的表达载体中。可将编码免疫球蛋白链的dna片段有效连接至一个或多个表达载体中确保免疫球蛋白多肽表达的对照序列。此类对照序列包括信号序列、启动子（例如，天然相关联的或异源的启动子）、增强子元件和转录终止子序列，对此类对照序列进行选择，以使其与选择用于表达抗体的宿主细胞相容。一旦载体被结合到适当的宿主中，该载体将宿主保持在适于高水平表达蛋白质的条件下，所述蛋白质由结合的多核苷酸编码。[0163]合适的表达载体通常可以在宿主生物体中作为游离基因或宿主染色体dna的一部分进行复制。通常，表达载体包含选择标记，诸如氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性、卡那霉素抗性或新霉素抗性，以便对那些转化了所需dna序列的细胞进行检测。[0164]合适的启动子和增强子元件是本领域已知的。对于在细菌细胞中的表达，示例性启动子包括lacl、lacz、t3、t7、gpt、λp和trc。对于真核细胞中的表达，示例性启动子包括轻链和/或重链免疫球蛋白基因启动子和增强子元件；细胞巨化病毒极早期启动子；单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；早期和晚期sv40启动子；存在于逆转录酶病毒长末端重复序列中的启动子；小鼠金属硫蛋白-i启动子；以及各种本领域已知的组织特异性启动子。对于酵母细胞中的表达，示例性启动子是组成型启动子，诸如adh1启动子、pgk1启动子、eno启动子、pyk1启动子等等；或调控型启动子，诸如gal1启动子、gal10启动子、adh2启动子、ph05启动子、cup1启动子、gal7启动子、met25启动子、met3启动子、cyc1启动子、his3启动子、adh1启动子、pgk启动子、gapdh启动子、adc1启动子、trp1启动子、ura3启动子、leu2启动子、eno启动子、tp1启动子和aox1（例如，用于毕赤酵母(pichia)）。对合适的载体和启动子的选择在本领域普通技术人员的能力范围内。[0165]大量合适的载体和启动子都是本领域的技术人员已知的；许多可商购获得用于生成受试者重组构建体。以下载体以举例的方式提供。细菌载体：pbs、phagescript、psix174、pbluescriptsk、pbsks、pnh8a、pnh16a、pnh18a、pnh46a(stratagene,lajolla,calif.,usa)；ptrc99a、pkk223-3、pkk233-3、pdr540和prit5(pharmacia,uppsala,sweden)。真核载体：pwlneo、psv2cat、pog44、pxr1、psg(stratagene)，psvk3、pbpv、pmsg和psvl(pharmacia)。[0166]本发明的另一个实施方案是一种包含一个或多个本发明的载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”是指其中已引入载体的细胞。应当理解，术语“宿主细胞”不仅旨在指特定的受试细胞，还指这种细胞的子代，而且也指由特定受试细胞产生的稳定细胞系。由于突变或者由于环境影响，在后代中可能出现某些修饰，因此这种子代可能与亲本细胞不同，但仍包含在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。此类宿主细胞可以是真核细胞、原核细胞、植物细胞或古菌细胞。[0167]大肠杆菌(escherichiacoli)、杆菌属(bacilli)（诸如枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)）和其他肠杆菌科(enterobacteriaceae)（诸如沙门氏菌(salmonella)、沙雷氏菌(serratia)）以及各种假单胞菌属(pseudomonas)物种是原核宿主细胞的示例。其他微生物诸如酵母也可用于表达。酵母属(saccharomyces)（例如，酿酒酵母(s.cerevisiae)）和毕赤酵母属(pichia)是合适的酵母宿主细胞的示例。示例性的真核细胞可以来自哺乳动物、昆虫、鸟类或其他动物来源。哺乳动物真核细胞包括无限增殖化细胞系，诸如杂交瘤或骨髓瘤细胞系，诸如sp2/0（美国典型培养物保藏中心(atcc)，manassas,va,crl-1581）、ns0（欧洲细胞培养物保藏中心(ecacc)，salisbury,wiltshire,uk，ecaccno.85110503）、fo(atcccrl-1646)和ag653(atcccrl-1580)鼠细胞系。一种示例性人骨髓瘤细胞系是u266(attccrl-tib-196)。其他可用的细胞系包括来源于中国仓鼠卵巢(cho)细胞的那些细胞系，诸如cho-k1sv(lonzabiologics,walkersville,md)、cho-k1(atcccrl-61)或dg44。[0168]本发明的另一个实施方案是一种制备本发明的抗体的方法，该方法包括在使该抗体表达的条件下培养本发明的宿主细胞，然后回收由该宿主细胞产生的抗体。制备抗体并将其纯化的方法是本领域所熟知的。全部抗体、其二聚体、各条轻链和/或重链、或者其他抗体片段（诸如vh和/或vl）一旦被合成（以化学方式或重组方式），就可根据标准程序进行纯化，所述标准程序包括硫酸铵沉淀、亲和色谱柱、柱层析法、高效液相色谱(hplc)纯化、凝胶电泳等等（参见generallyscopes,proteinpurification(springer-ꢀverlag,n.y.,(1982)）。抗体可以基本上是纯净的，例如，至少约80%至85%纯净、至少约85%至90%纯净、至少约90%至95%纯净、或至少约98%至99%纯净，或者更加纯净，例如不含污染物（诸如细胞碎片、除受试抗体之外的大分子等）。[0169]本发明的另一个实施方案是一种用于制备本发明的抗体的方法，该方法包括：将编码抗体vh的第一多核苷酸和编码抗体vl的第二多核苷酸结合到表达载体中；用该表达载体转化宿主细胞；在使vl和vh表达以及形成所述抗体的条件下，在培养基中培养宿主细胞；然后从宿主细胞或培养基回收抗体。[0170]使用标准分子生物方法将编码本发明的特定vh或vi序列的多核苷酸结合到载体中。使用熟知的方法完成宿主细胞转化、培养、抗体表达和纯化。[0171]三、组合物和给药方法本发明提供了药物组合物，这些药物组合物包含本文所述的抗体，以及药学上可接受的载剂。出于治疗用途，本发明的抗体可被制备成药物组合物，这些药物组合物包含有效量的抗体，作为药学上可接受的载体中的活性成分。术语“载剂”是指据以施用所述活性化合物的稀释剂、辅助剂、赋形剂或媒介物。此类媒介物可以是液体，诸如水和油，包括那些来源于石油、动物、植物的油或合成的油，诸如花生油、大豆油、矿物油和芝麻油等。例如，可使用0.4%的盐水和0.3%的甘氨酸。这些溶液是无菌的，并且通常不含颗粒物。它们可通过熟知的常规灭菌技术（例如，过滤）进行灭菌。所述组合物可根据需要含有药学上可接受的辅助物质，以接近生理条件，所述辅助物质诸如ph调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。此类药物制剂中的本发明抗体的浓度可在很大范围内变化，即，从小于约0.5重量%，通常到至少约1重量%至多达15重量%、20重量%、25重量%、30重量%、35重量%、40重量%、45重量%或50重量%，并且将根据所选择的具体施用方式，主要基于所需的剂量、流体体积、粘度等进行选择。合适的媒介物及制剂（包含其他人蛋白例如人血清白蛋白在内）描述于例如remington:thescienceandpracticeofpharmacy，第21版，troy，d.b.编辑，lipincottwilliamsandwilkins,philadelphia,pa2006，第5部分，pharmaceuticalmanufacturing，第691-1092页，特别参见第958-989页。[0172]本文所述的本发明方法中的施用本发明的抗体的方式可为任何合适的途径，诸如胃肠外施用，例如真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下、肺、粘膜（口腔、鼻内、阴道内、直肠）或技术人员了解的其他方式，这是本领域众所周知的。[0173]本文所述的本发明方法中的抗体可通过任何合适的途径施用至患者，例如通过静脉内(i.v.)输注或推注进行肠胃外施用，肌肉内施用、皮下施用或腹膜内施用。可在例如15、30、60、90、120、180或240分钟内，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时内给予静脉内输注。[0174]在一个实施方案中，本文所述的本发明方法中将治疗有效量的本发明的抗体施用于受试者。抗体的“治疗有效量”可通过标准研究技术确定。例如，可采用体外测定法来帮助鉴定最佳剂量范围。任选地，本发明抗体的治疗有效量可通过将抗体施用至本领域熟知的相关动物模型来确定。对具体的有效剂量的选择可由本领域的技术人员基于对若干种因素的考量（例如，经由临床试验）来确定。此类因素包括待治疗或预防的疾病、所涉及的症状、患者体重、患者免疫状态以及技术人员已知的其他因素。在制剂中待使用的精确剂量也将取决于给药途径以及疾病的严重程度，并且应该根据医生的判断和每位患者的情况来决定。有效剂量可通过来自体外或动物模型测试体系的剂量响应曲线来推导。可以使用本文所述模型中的任何一个来测试本发明抗体的功效和有效剂量。[0175]本发明的方法中的抗体可在一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、一个月、五周、六周、七周、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或更长时间之后重复施用。也可以重复治疗疗程，按照慢性施用一样。重复施用可为相同剂量或不同剂量。[0176]本发明的方法中的抗体也可被预防性地施用，以降低受试者感染sars-cov-2/sars-cov-1的风险，延迟sars-cov-2/sars-cov-1感染的发作，和/或降低处于缓解状态的sars-cov-2/sars-cov-1感染复发的风险。[0177]本文所述的本发明方法中的抗体可冻干储存，并在使用之前在合适的载体中复原。此项技术已被证实对常规的蛋白制剂有效，并且可采用熟知的冻干和复原技术。[0178]现结合以下具体的非限制性实施例描述本发明，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。[0179]材料与方法人受试者根据舟山医院研究伦理委员会批准的方案(2020-003)，在舟山医院进行志愿者招募和血液收集。根据机构伦理委员会批准的方案(2020-c007)在复旦大学基础医学院进行涉及所有人样品的实验。研究参与者，16名感染已通过pcr证实的恢复期供体，和8名未暴露的未感染供体。所有供体年龄范围为7-67岁，平均值为37岁，和女性:男性比率为14:10(图2)。[0180]细胞系人胚肾293t(hek293t)细胞、人肝细胞瘤huh-7细胞和非洲绿猴肾vero-e6细胞(xia等人,2020a)在补充有10%热灭活的胎牛血清(fbs)、100u/ml青霉素和100mg/ml链霉素的dulbecco氏改良的eagle培养基(dmem)中维持。raji细胞(人伯基特淋巴瘤b成淋巴细胞)(jaume等人,2011)在补充有10�s、100u/ml青霉素和100mg/ml链霉素的rpmi1640中维持。所有细胞系在37℃下在5%co2中培养。人胚肾hek293f悬浮细胞使用hek293无血清opm-293-cd05培养基(opmbiosciences)在37℃下在5%co2中培养，同时以100rpm摇动。[0181]病毒本研究中使用的sars-cov-2真病毒ncov-sh01(genbank:mt121215.1)在复旦大学上海医学院的生物安全水平3(bsl-3)实验室从感染的患者中分离(wu,y.等人,2020a)。sars-cov-2病毒在vero-e6细胞中繁殖。将浓缩的病毒贮液分装后储存在液氮中。一个等份的细胞系传代的sars-cov-2真病毒，最初来自患者血清并在-80℃下储存，经融化用于体外细胞感染实验。[0182]细菌大肠杆菌trans5α(transgenbiotech)在37℃下培养，同时以230rpm摇动。[0183]收集人样品在浙江省舟山医院从sars-cov-2患者收集外周血样品。血清样品在56℃下热灭活60分钟，通过离心凝固的全血分离，并分装储存于-80℃。在从供体#16抽取400ml血液后，人外周血单核细胞(pbmc)使用带有玻璃料屏障的细胞分离管分离。将分离的pbmc重悬于补充有10%二甲基亚砜(dmso)的90%热灭活fbs中并在液氮中冷冻保存。[0184]抗体所有克隆的人单克隆抗体和它们的grlr形式通过瞬时转染哺乳动物hek293f细胞制备，如之前报道的(wang,q.等人,2020)。[0185]elisa测量血清样品或来自血清样品的纯化的igg抗体部分或针对sars-cov-2蛋白(包括s-ecd-、rbd-、s1-、s2-和n-蛋白)的重组igg抗体(见关键资源表的细节)的elisa结合，如之前报道的(wang,q.等人,2020)。简言之，elisa板首先用在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中的10μg/ml的抗原在4℃下包被过夜，然后用在pbs中的2%牛血清白蛋白(bsa)封闭。血清或第一抗体按1:3在pbs中连续稀释(最大浓度，对于血清样本为1:10，对于单克隆抗体样本为10μg/ml)，总共8个稀释度，并加入以在室温下孵育1小时。用hrp缀合的山羊抗-人igg(thermofisherscientific)或hrp缀合的小鼠抗-人iggfab(genscript)可视化。通过使用prism软件分析对于各抗体计算曲线下面积(auc)以评价抗原-结合能力。[0186]竞争性elisa竞争性elisa如之前所述进行(wang,q.等人,2020)。简言之，板用2μg/mlsars-cov-2rbd或2μg/mlsars-cov-2s-ecd包被并用15μg/ml第一阻断抗体孵育2小时。在室温下直接加入生物素化第二抗体(0.25μg/ml)，持续30分钟。用链霉亲和素-hrp(bdbiosciences)进行检测。pbs缓冲液代替第一阻断抗体用作标准化参考，而抗-hbs抗体h004(wang,q.等人,2020)，其不能阻断第二抗体的结合，用作阴性对照。[0187]制备sars-cov-2和sars-cov-1假型病毒如之前所报道的，产生假型病毒(xia等人,2020a)。简言之，使用转染试剂vigofect(vigorousbiotechnology,beijing)将质粒pnl4-3.luc.re(表达萤光素酶报告子的cttctcctgctagaat，seqidno:226)、sars-cov-2-n-r(5’-cagacattttgctctcaagctg，seqidno:227)和sars-cov-2-n-探针(5’-fam-ttgctgctgcttgacagatt-tamra-3’，seqidno:228)。将通过sars-cov-2-n-f和sars-cov-2-n-r引物的pcr扩增子插入puc57质粒中用于标准曲线产生。定量反转录pcr的程序使用mastercyclereprealplexreal-timepcrsystem(eppendorf)如下进行：95℃5分钟；95℃10秒、50℃30秒、72℃30秒的40个循环。[0193]检测抗体依赖性病毒进入的体外测定如之前所报道的(jaume等人,2011)，使用raji细胞进行体外sars-cov-2假病毒ade测定。简言之，将3×104个raji细胞接种到用0.01%聚l-赖氨酸/pbs包被的96孔板的每个孔中，并培养24小时。将抗体按1:2(最大浓度，100μg/ml)在rpmi1640中连续稀释，总共9个稀释度，并与sars-cov-2假病毒孵育30分钟。将混合物施加到raji细胞中，并培养60小时。如上所述使用萤火虫萤光素酶测定试剂盒(promega)进行萤光素酶活性的测量。将萤光素酶信号标准化至存在于同一板上的用2μg/ml的抗体xg003(参考对照)获得的信号，并表示为萤光素酶活性的倍数变化。[0194]对于阻断抗体依赖性病毒进入的实验，将不同浓度的抗-hcd32(bdpharmingen)在37℃下与raji细胞孵育30分钟。然后，将2ꢀµg/ml抗体xg005和sars-cov-2假病毒的混合物加入经处理的raji细胞。将板在37℃下孵育60小时，然后如上所述测量萤光素酶活性。[0195]蛋白产生将sars-cov-2受体-结合结构域(rbd)(氨基酸333–530)连同avi-tag标签(glndifeaqkiewhe，seqidno:229)的密码子优化的野生型cdna合成(genewiz)，并克隆到pacgp67载体中，具有c-末端8×his标签用于纯化。使用bac-to-bac杆状病毒系统表达sars-cov-2rbd。然后使用cellfectiniireagent(invitrogen)将提取的杆粒dna转染到sf9细胞中。收获低效价病毒，然后扩增以产生高效价病毒贮液。感染后72小时收获含有分泌的未糖基化的rbd的上清液，并通过ni-nta树脂(gehealthcare)捕获rbd蛋白和纯化。sds-page分析揭示超过95%纯度的纯化重组蛋白。[0196]rbd-或s-ecd-结合记忆b细胞的单细胞分选从重组杆状病毒感染的昆虫sf9细胞表达和纯化的rbd蛋白(genscript)使用ez-link™ꢀsulfo-nhs-lc-biotin试剂盒(thermofisherscientific)按照制造商的指示进行化学生物素化。在杆状病毒感染的昆虫sf9细胞中表达的avi-tag标记的rbd和在哺乳动物hek293t细胞中表达的avi-tag标记的s-ecd(kactusbiosystems)使用birabiotin-proteinligase试剂盒(avidity)生物素化。过量的未结合生物素通过使用zebaspin脱盐柱(thermofisherscientific)除去。对于各样品，诱饵蛋白-pe和诱饵蛋白-apc通过分别孵育3μg的生物素化rbd或25μg的生物素化s-ecd蛋白与链霉亲和素-pe(ebioscience)或链霉亲和素-apc(bdbiosciences)制备。[0197]b细胞的纯化、诱饵蛋白-结合b细胞的双荧光染料标记和单细胞分选实验如之前所述进行(escolano等人,2019；robbiani等人,2017；wang,q.等人,2020)。简言之，将融化并用rpmi培养基洗涤的pbmc与cd19微珠(miltenyibiotec)一起孵育，用于b淋巴细胞的阳性选择。在4℃下用人fcblock(bdbiosciences)、诱饵蛋白-pe/apc(对于rbd为10μg/ml，对于s-ecd为60μg/ml)和抗-cd20-pecy7(bdbiosciences)连续孵育，接着使用kruskal-wallis多重比较)(图17b和17c)。基于三个抗体簇中rbd组iv抗体的频率的精确分布进行fisher精确检验以评价统计学显著性(图17d)。通过spearman秩相关方法评价相关性(图16d-16f)。elisa曲线下面积(elisaauc)(图3a-3e和8a-8d)、血清中和测定的半最大中和效价(nt50)(图3f-3h)、对于抗体中和能力计算的50%抑制浓度(ic50)值(图11a、11f和13c)、ade曲线下面积(adeauc)(图15c)和增强能力值(图16c)在prism软件中计算，如之前报道的(bardina等人,2017；robbiani等人,2019；wang,q.等人,2020)。[0201]实施例1：针对sars-cov-2的血清学应答从感染sars-cov-2但已恢复的16个供体和covid-19爆发之前招募的8个健康供体(图2)收集得到血清样品。与未暴露的健康供体相比，来自感染后恢复的供体血清显示与各个sars-cov-2s-蛋白结构域(rbd、s1、s2和s-ecd)具有显著更高的elisa结合效力(图3a-3d；图1)。在感染后，病毒体内的n-蛋白也引发强健的抗体应答(图3e)。为了确定恢复期血清中的中和活性，在huh-7细胞中通过表达萤光素酶的sars-cov-1或sars-cov-2假病毒测试了它们阻断病毒感染的能力(xia等人,2020a；xia等人,2020b)。然后在不同的稀释度的血清或纯化的igg抗体下，比较萤光素酶信号(感染的代替物)(图3f-3h)。尽管5例个体(供体#5、#6、#7、#8和#16)对于血清样品达到高于2000的半-最大中和效价(nt50)(图3f)，但仅1例个体(供体#16)对于纯化的igg部分显示出更为明显的中和作用(nt50:1.1μg/ml；图3h)。这种差异可能归因于在那些恢复期个体中igm或iga抗体的中和活性。恢复期个体的血清中和活性针对sars-cov-1假病毒明显更低，然而略微高于未感染供体(图3g)。因此，通过elisa，所有16个恢复期供体针对sars-cov-2s-蛋白产生较强的抗体应答反应，而5个供体显示高水平的血清中和活性，而其中仅1例个体(供体#16)的血清igg具有极其优异的中和活性，选择供体#16用于进一步研究。[0202]为了确定s-蛋白上的哪个结构域是在该选择的最优中和者(供体#16)中的中和igg应答的主要靶标，分别使用rbd、s1、s2和s-ecd蛋白来阻断其体外中和活性。如所示的，igg中和活性可分别被rbd、s1和s-ecd结构域部分地阻断，但不被s2结构域阻断(图3i)。这些结果表明，在该供体#16中的中和抗体应答主要针对s1结构域，并且更具体地，针对该蛋白内的rbd结构域。[0203]实施例2：针对sars-cov-2s-蛋白的人单克隆抗体为了表征在该选择的个体中负责有效的中和活性的igg抗体，使用双荧光染料标记策略鉴定了sars-cov-2rbd-或s-ecd-结合b细胞(图4)(wang,q.等人,2020)。未暴露的未感染对照显示背景水平的诱饵蛋白特异性b细胞，而具有高血清中和活性的供体#16显示不同群体的诱饵蛋白-结合b细胞。avi-tag标记的生物素化rbd、化学生物素化s-ecd和avi-tag标记的生物素化s-ecd诱饵蛋白分别以0.025%、0.12%和0.21%的频率染色b细胞，其为背景染色的约6至20倍(图5a-5c)。[0204]门控双阳性细胞(诱饵蛋白-pe 和诱饵蛋白-apc )经单细胞分选，并且免疫球蛋白重链(igh；igg同种型)和轻链(igl或igk)基因通过巢式pcr反应从分选的单细胞中进行扩增(robbiani等人,2017；scheid等人,2009b；wang,q.等人,2020)。总体上，从rbd-结合和s-ecd-结合igg 记忆b细胞获得了292个配对的重链和轻链可变区(图6)。序列分析表明宽范围的免疫球蛋白v基因，并鉴定了25个产生具有密切相关的cdr3序列的由相同的ig可变基因区段编码的抗体的扩展克隆(图6)。来自相同克隆的抗体在氨基酸水平上显示80%或更高的相似性(图7)。得出结论，该sars-cov-2中和者，类似于其它报道的供体(cao等人,2020；kreer等人,2020；robbiani等人,2020)，产生表达相关的ig重链和轻链的抗原-结合记忆b细胞的克隆。[0205]实施例3：抗体表位在称为xg001至xg048的总共48种抗体中，从25个扩展克隆中选择28种和从单独克隆中选择20种，用于表达和进一步表征(图6)。48种抗体中的45种(94%)显示与sars-cov-2s-ecd蛋白的反应性(图8a)，和48种抗体中的23种(48%)显示rbd结合能力(图8b)。所有这些rbd-结合抗体显示针对s1结构域的elisa结合，如所预期的(图8b和8c)。另外的11种没有rbd-结合的抗体(23%)也结合s1结构域(图8c)，暗示其对n-末端结构域(ntd)的反应性，如之前所报道的(chi等人,2020)。还发现48种抗体中的5种(10%)结合s2结构域(图8d)。此外，48种抗体中的6种(12%)与s1/s2/rbd蛋白没有结合或仅有弱结合，但显示了s-ecd结合亲和力(图8a-8d)，暗示着这些抗体识别在单独的结构域中不存在或改变的表位。总之，从该志愿者选择的48种抗体识别sars-cov-2s-蛋白上的不同表位，并且在它们中几乎一半结合rbd(图8e)。[0206]为了进一步确定rbd-结合抗体结合重叠还是不重叠的表位，进行竞争性elisa。具有弱水平的elisa结合的抗体(xg015、xg042、xg045、xg047)被排除。首先将包被的rbd蛋白与非生物素化的第一抗体预孵育，接着与生物素化的第二抗体孵育。如所预期的，所有测试的抗体与自身竞争，而对照抗体抗-hbsh004(wang,q.等人,2020)不能阻断任何识别rbd的第二抗体。在rbd(氨基酸330-530)中，通过竞争性elisa鉴定了4个互相排斥的抗体组(组i、ii、iii和iv)。其它2种抗体，xg009和xg043，跨越各组竞争，这可能通过它们跨越所有这些表位的结构或者通过由抗体结合而导致的抗原构象改变来解释。此外，在组iii中，尽管抗体xg017和xg022分别阻断xg008和xg038的结合，但抗体xg008和xg038非竞争性结合rbd。参见图8f。这些结果表明，对于组iii抗体，存在2个互相排斥的子表位。该发现进一步通过证明识别不同表位的4种抗体的组合不能阻断第5种抗体与rbd或s-ecd蛋白的结合得到证实(图9a和9b)。此外，每个rbd组中的抗体具有不同的ighv和igkv/iglv使用(图10)。得出结论，存在至少4组，其包含在sars-cov-2的rbd上的5个不重叠的抗体结合表位。[0207]实施例4：体外sars-cov-2中和活性为了确定选择的抗体是否体外阻断sars-cov-2感染，使用表达萤光素酶的sars-cov-2假病毒感染huh-7细胞进行中和作用测定(xia等人,2020a；xia等人,2020b)并计算它们的50%抑制浓度(ic50)(图11a和11b)。这些抗体的中和活性显著改变，范围从有效的中和抗体到几乎不具备中和活性。在48种测试的抗体中，几乎一半(23种抗体，其中17种为rbd结合抗体，5种为s1但非rbd结合抗体，1种为s2结合抗体)显示低于10μg/ml的ic50值的中和活性，而其中7种(其中6种为rbd结合抗体，1种为s1但非rbd结合抗体)是最有效的，ic50值低于0.1μg/ml(图11c)。最有效的抗体显示6-15ng/ml的ic50值，其中4种是rbd-结合的，xg005(ic50:6.1ng/ml)、xg014(ic50:14.4ng/ml)、xg016(ic50:9.1ng/ml)和xg038(ic50:12.7ng/ml)，以及其中1种是s1结合的，但不是rbd-结合的，xg027(ic50:15.7ng/ml)(图11a和11b)。[0208]然后选择几个单克隆抗体(xg005、xg008、xg013、xg014、xg016、xg017)使用sars-cov-2真病毒来证实它们中和活性(图11d-11f；图12)。通过抗-n-蛋白多克隆抗体使用免疫荧光(图11d；图12)以及培养基的定量反转录pcr定量感染性(图11e)。读出的结果在这2种方法中一致，并表明这些抗体是针对sars-cov-2真病毒的有效的中和抗体，ic50值低至单数位ng/ml，例如xg014(ic50:5.1ng/ml)(图11e和11f)。与sars-cov-2假病毒相比，一些单克隆抗体，例如xg017，显示针对sars-cov-2真病毒的显著更高的中和活性，而其它单克隆抗体，包括xg005和xg016，具有降低的效应(图11a和11f)。得出结论，几种分离的单克隆抗体，例如rbd-结合抗体xg014和xg017，可有效地体外中和sars-cov-2真病毒。[0209]为了确定单克隆抗体的中和活性和它们的结合表位之间的关系，使用来自中和作用测定(它们相应的表位被标记)的9个标准化的萤光素酶值，进行无监督分层聚类(图11g)。鉴定了具有不同水平的中和活性的抗体簇。与簇d中的非中和抗体相比，簇a和b中的抗体，其大部分针对rbd组ii、iii和iv表位，是有效的中和者，而簇c中的抗体是弱中和抗体(图11g)。在测定中靶向rbd组i表位的抗体几乎不能中和(图11g)。因此，有效的中和抗体主要靶向一些，但不是全部rbd表位。[0210]实施例5：针对天然存在的sars-cov-2rbd突变株和sars-cov-1的交叉中和活性流行性sars-cov-2病毒缓慢突变，并且已经报道了几种在rbd区中仅具有1个氨基酸突变的sars-cov-2毒株，例如v341i、f342l、v367f、r408i、a435s、g476s和v483a(ou等人,2020)。为了测试可能获得这些突变中的一些以赋予抗体抗性的可能性，挑出2个最有效的单克隆抗体，xg014和xg038，用于针对几种携带这些报道的rbd突变的sars-cov-2假病毒进行中和作用测定(图13a和13b)。抗体xg014仍保持对所测试的所有sars-cov-2突变株的敏感性(图13a)，而抗体xg038对7种病毒突变株中的2种显示出降低的中和作用(g476s和v483a；图13b)。因此，rbd结构域的单个氨基酸突变可赋予sars-cov-2对人单克隆抗体的抗性。[0211]为了确定克隆的单克隆抗体针对其它冠状病毒的范围，测量了它们针对sars-cov-1假病毒的体外中和活性。xg014和xg041可体外中和sars-cov-1假病毒，ic50值分别为23.7ng/ml和1140ng/ml(图13c和13d；图14)。在测定中没有其它抗体显示针对sars-cov-1假病毒的中和活性(图13c)。因此，sars-cov-2感染可诱导人体产生罕见的交叉中和抗体，例如xg014，其能有效地中和sars-cov-1和sars-cov-2以及sars-cov-2rbd突变株。[0212]实施例6：抗体依赖性增强(ade)效应尽管抗体可通过其与宿主免疫细胞上的fcγ受体结合来清除病毒或感染的细胞，但这些相互作用也可导致在冠状病毒感染期间的疾病增强(eroshenko等人,2020；iwasaki和yang,2020)。确定各抗体的ade效应是临床使用有效的中和抗体的关键步骤。raji细胞，最初源自伯基特淋巴瘤患者，已表明在抗-s-蛋白免疫血清的存在下促进sars-cov-1感染(jaume等人,2011)。因此，使用该携带fcγrii的人b成淋巴细胞细胞系来研究sars-cov-2的抗体依赖性病毒进入，并以此作为抗体ade效应的测量指标。[0213]未检测到sars-cov-2直接感染raji细胞(数据未显示)。然后测量在单克隆抗体存在的情况下sars-cov-2假病毒的抗体依赖性进入。48种抗体中的11种(23%)显著增强raji细胞中sars-cov-2病毒的感染，而其他的抗体并没有诱导病毒在raji细胞中的感染，其中包括2种有效的中和抗体xg014和xg038(图15a；图16a)。在这11种增强抗体中，9种是rbd-结合抗体，和2种抗体结合s1但不结合rbd(图15b)。没有s2-结合抗体诱导raji细胞感染。单克隆抗体诱导不同水平的感染。例如，xg006仅在高浓度条件时增强raji细胞的病毒感染，但当稀释时失去增强效应，而xg005在测试的所有稀释度下都诱导病毒感染(图15a；图16a)。ade曲线下面积(auc)和增强功效如之前所报道的计算(bardina等人,2017；robbiani等人,2019)(图15c；图16b和16c)，并且在这2个值之间观察到正相关(图16d)。然而，在中和抗体的计算ic50值与相应的adeauc和增强功效值之间没有显著相关性(图16e和16f)。[0214]抗体依赖性病毒进入被抗体fc受体-结合位点的grlr突变(g236r和l328r)完全消除(horton等人,2008)(图15d和15e)。通过用抗-fcγrii抗体孵育细胞也实现类似效应(图15f)，进一步证实了抗体依赖性sars-cov-2病毒进入需要fc受体结合。因此，一些sars-cov-2抗-rbd和抗-s1抗体在介导ade活性方面类似于sars-cov-1和登革病毒的抗体。[0215]实施例7：抗体性质和表位的关联为了基于功能特征的组合将抗体分开，使用分别来自抗体中和效力测定和ade效应测定的9个(共18个)标准化的萤光素酶值，进行无监督分层聚类。鉴定了三个主要的抗体簇(簇x、y和z)(图17a)。簇x抗体的特征为具有病毒中和活性与ade效应。簇y抗体显示有效的中和活性，但低水平的ade效应，而来自簇z的抗体是非中和的，并且不诱导病毒进入，即无ade效应(图17a)。使用adeauc和中和ic50进一步比较证实了簇x抗体在raji细胞中诱导更多抗体依赖性病毒进入(图17b)，以及来自簇x和y的抗体是更有效的中和抗体(图17c)。[0216]为了确定在抗体性质和它们的识别抗原表位之间是否存在关联，在构造的分簇树上标记它们的表位。在簇x中，9种抗体中的8种(89%)结合rbd结构域，并且所有这8种抗体，包括xg009和xg043，识别rbd组iv表位(图17a)。该百分比明显高于其它簇(p=0.001vs.簇y；p《0.001vs.簇z)(图17a和17d)。除了簇y中的1种组iv抗体xg014之外，所有其它rbd组iv抗体都处在簇x的分支中(图17a和17d)并在raji细胞中诱导统计学显著更高水平的抗体依赖性病毒进入(图17e)。仅使用ade值进一步进行无监督分层聚类，单独此数据则足以产生与rbd表位组iv显著相关的抗体簇(图18)。因此，揭示了在5个rbd抗体结合表位中的1个(组iv)与体外检测的抗体ade效应之间的显著关联。[0217]还注意到，一些rbd表位仅与中和活性，而不是ade效应有关联。簇y中的抗体具有中和活性，但在raji细胞中不诱导或诱导低水平的病毒进入(图17a和17d)。这些抗体针对许多不同的表位，包括rbd组ii和rbd组iii抗体结合表位。在其它簇中未发现这些类型的抗体，即仅识别组ii表位或仅识别组iii表位的抗体；而是仅在簇y中发现(图17a和17d)，表明针对这些表位的抗体与中和活性紧密相关，并且不诱导增强效应。[0218]因此，得出结论，靶向2个rbd表位(组ii和组iii)的抗体能中和sars-cov-2病毒，没有明显的ade效应，而rbd组iv抗体与体外sars-cov-2感染的增强(ade效应)紧密相关。[0219]讨论已从sars-cov-2或sars-cov-1恢复期个体鉴定了许多人单克隆抗体，并评价了它们用于预防和治疗的潜在被动抗体施用(andreano等人,2020；brouwer等人,2020；cao等人,2020；chen等人,2020；chi等人,2020；ju等人,2020；kreer等人,2020；liu,l.等人,2020；pinto等人,2020；robbiani等人,2020；rogers等人,2020；seydoux等人,2020；wan等人,2020；wec等人,2020；wu,y.等人,2020b；zost等人,2020a；zost等人,2020b)。相同的策略已用于鉴定针对hiv、zikv、hbv和其它病原体的有效的广泛中和抗体(mouquet等人,2012；robbiani等人,2017；scheid等人,2009a；wang,q.等人,2020)。在本研究中，筛选了恢复期个体以鉴定针对sars-cov-1和sars-cov-2病毒的有效的中和单克隆抗体，并且目的还在于理解抗体中和/增强效应和它们的抗原表位之间的关系。发现，类似于其它研究(premkumar等人,2020；rogers等人,2020)，从该个体克隆的大多数中和单克隆抗体主要靶向s-蛋白rbd结构域。更重要的是，rbd上的4组5个不重叠的抗体结合表位中的1个与抗体诱导的ade效应紧密关联，而3个其它表位与抗体中和活性相关。[0220]该结果与之前的研究(robbiani等人,2020；wu,f.等人,2020)一起，表明在恢复的个体中针对sars-cov-2的血清学中和活性有很大变化。然而，具有强健血清中和效应的个体不必然具有其纯化的igg抗体的有效中和活性。该现象与之前在hiv或hbv杰出中和者中的发现相反，在后者中纯化的血清igg与原始血清相比以类似程度中和病毒(scheid等人,2009a；wang,q.等人,2020)。对于sars-cov-2恢复的个体，这种差异可能归因于通过iga或igm部分的中和效应。在covid-19患者中，观察到早期强健的血清iga应答(cervia等人,2020；padoan等人,2020；yu等人,2020)，并且已通过体外结合和中和测定测试单克隆iga抗体有效(ejemel等人,2020)。因为分泌的iga在针对呼吸道病毒保护粘膜表面方面起重要作用，因此抗-sars-cov-2iga抗体可能在中和sars-cov-2方面起重要作用。[0221]在本研究和其它研究中抗-sars-cov-2抗体的ighv使用非常不同，并且最近的研究报道了ighv3-53是最频繁用于靶向rbd的ighv基因(yuan等人,2020)。然而，在本研究的供体#16中，鉴定了来自ighv1至ighv7的多个谱系，但仅1种ighv3-53抗体，表明ighv的使用在个体中显著不同。[0222]在本研究和之前的报道中鉴定的大多数中和抗体是针对rbd的，ic50值低至单数位ng/ml(图11a和11b)(robbiani等人,2020；rogers等人,2020)。在本研究的中和效力最强的几株单克隆抗体中，xg027是唯一不结合rbd，但很可能结合ntd的抗体，其可能类似于之前描述的称为4a8的ntd-结合抗体(chi等人,2020)。总体上，似乎组iii和iv的抗体比组ii的抗体更有效地中和；并且来自组i的抗体几乎不具备中和效力。这些发现类似于之前鉴定的rbd-a、-b和-c表位，或rbd-e、-f、-g和-h表位(liu,l.等人,2020；rogers等人,2020)，表明超过1个用于中和作用的表位存在于rbd的表面上。[0223]迄今为止，尚未评价大多数鉴定的中和抗体的交叉反应性。因为sars-cov-1属于与sars-cov-2相同的亚科，并共有相同的人受体ace2，免疫系统很可能偶然产生具有部分交叉反应性的抗体。存在这样的广谱sars-cov中和抗体已在选择的最近研究中得到证实。h014，一种从rbd-免疫小鼠中分离的噬菌体抗体，显示对于sars-cov-1和-2分别为150ng/ml和450ng/ml的ic50(lv等人,2020)。此外，从sars-cov-1感染的个体分离的抗体已表明对于sars-cov-2交叉中和；例如，抗体adi-55688(对于sars-cov-1和-2分别为4ng/ml和》100ng/ml的ic50)、adi-56046(对于sars-cov-1和-2分别为20ng/ml和50ng/ml的ic50)和s309(对于sars-cov-1和-2分别为120ng/ml和79ng/ml的ic50)。在本研究中，尽管48种抗体中的46种(96%)没有显示针对sars-cov-1的交叉中和活性，但一种抗体xg014显示针对sars-cov-1和-2二者的有效中和活性，对于sars-cov-1的ic50值为5.1ng/ml和对于sars-cov-2的ic50值为23.7ng/ml，同时并不诱导ade效应。[0224]sars-cov-2是缓慢突变的，因此监测单个氨基酸变化和理解它们的潜在表型相关性是关键的(korber等人,2020)。已经证实mers-cov和sars-cov-1中的点突变赋予对天然存在的中和抗体的抗性(sui等人,2008；tang等人,2014；termeulen等人,2006)。在本研究中，2种报告的病毒变体，v483a和g476s，显示有效抵抗一种单克隆抗体xg038的中和效力，具有分别为野生型毒株的20或80倍的ic50(图13b)。类似地，其它研究已报道了赋予对sars-cov-2中和抗体的抗性的突变，其中之一也是突变g476s，而另一种是不同的突变v367f(rogers等人,2020)。通过广泛的人-人传播，sars-cov-2病毒非常可能获得具有免疫抗性和适应性优势的突变。本发明人证实了几种在rbd区中仅具有1个氨基酸突变的sars-cov-2毒株，例如v341i、f342l、v367f、r408i、a435s、g476s和v483a，保持对xg014的敏感性，而7种病毒中的2种显示xg038的中和作用降低。[0225]具有严重疾病的sars-cov-2患者通常具有较强健的igg抗体应答。较高igg效价和较差后果之间的这种关联表明sars-cov-2的ade效应(cao,2020)。在本研究中，通过利用用于研究抗体依赖性病毒进入的基于raji细胞的模型，成功地鉴定和评价了sars-cov-2抗体的ade效应。对于sars-cov-1假病毒，在2种人伯基特淋巴瘤b细胞系raji和daudi细胞中和在人单核细胞系thp-1细胞中也观察到类似的ade效应，而对于sars-cov-1(jaume等人,2011)和sars-cov-2(数据未显示)(zang等人,2020)，在人红白血病细胞系k562和人巨噬细胞系u937中没有检测到增强的抗体依赖性病毒感染。[0226]关于ade效应与rbd上的5个不重叠的抗体结合表位中的1个之间的关联的发现是出人意料的。据所知，对于冠状病毒来说，尚未报道这样的抗体结合表位与ade效应的关系。虽然抗-sars-cov-2抗体的ade效应主要是通过结合rbd抗体结合表位(组iv)的抗体来诱导产生的，即组iv中的所有抗体(除xg014)均能诱导ade效应，然而并不诱导任何ade效应的中和效力最强的单克隆抗体xg014，也靶向该表位(rbd组iv)(图17a)。这可通过以下可能性解释：尽管与组iv表位重叠，但xg014的表位可能略微不同于其它抗体的表位。解决xg014或其它ade抗体与s-蛋白的复杂结构将有助于阐明ade和表位之间的相关性。[0227]针对sars-cov-2的许多不同类型的疫苗目前在开发中(callaway,2020)。为了评价它们的功效，测量来自接种者的血清的抗原结合和病毒中和活性。然而据所知，尚未在接种后测量血清ade效应。因此，表征来自接种个体的抗体的中和与增强效应将确保安全的疫苗开发。此外，因为数据提示ade效应与1个rbd表位密切相关，设计能够屏蔽该ade表位的rbd疫苗可能诱导产生具有较低ade效应的中和抗体，从而降低风险。[0228]关键资源表highlycustomizedandintegratedsystemforigandtrstandardizedv-jandv-d-jsequenceanalysis.nucleicacidsres.36(webserverissue),w503-508.doi:10.1093/nar/gkn316.brouwer,p.j.m.,caniels,t.g.,vanderstraten,k.,snitselaar,j.l.,aldon,y.,bangaru,s.,torres,j.l.,okba,n.m.a.,claireaux,m.,kerster,g.,etal.(2020).potentneutralizingantibodiesfromcovid-19patientsdefinemultipletargetsofvulnerability.science.doi:10.1126/science.abc5902.callaway,e.(2020).theraceforcoronavirusvaccines:agraphicalguide.nature.580(7805),576-577.doi:10.1038/d41586-020-01221-y.cao,x.(2020).covid-19:immunopathologyanditsimplicationsfortherapy.natrevimmunol.20(5),269-270.doi:10.1038/s41577-020-0308-3.cao,y.,su,b.,guo,x.,sun,w.,deng,y.,bao,l.,zhu,q.,zhang,x.,zheng,y.,geng,c.,etal.(2020).potentneutralizingantibodiesagainstsars-cov-2identifiedbyhigh-throughputsingle-cellsequencingofconvalescentpatients'bcells.cell.doi:10.1016/j.cell.2020.05.025.cervia,c.,nilsson,j.,zurbuchen,y.,valaperti,a.,schreiner,j.,wolfensberger,a.,raeber,m.e.,adamo,s.,emmenegger,m.,hasler,s.,etal.(2020).systemicandmucosalantibodysecretionspecifictosars-cov-2duringmildversusseverecovid-19.biorxiv.doi:10.1101/2020.05.21.108308.chen,x.,li,r.,pan,z.,qian,c.,yang,y.,you,r.,zhao,j.,liu,p.,gao,l.,li,z.,etal.(2020).humanmonoclonalantibodiesblockthebindingofsars-cov-2spikeproteintoangiotensinconvertingenzyme2receptor.cellmolimmunol.17(6),647-649.doi:10.1038/s41423-020-0426-7.chi,x.,yan,r.,zhang,j.,zhang,g.,zhang,y.,hao,m.,zhang,z.,fan,p.,dong,y.,yang,y.,etal.(2020).aneutralizinghumanantibodybindstothen-terminaldomainofthespikepro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技术领域：
：1.本发明涉及针对sars-cov-2新冠病毒的无ade效应的中和抗体及其抗原结合片段，以及制备和使用所述中和抗体及其抗原结合片段的方法。
背景技术：
：：2.2019年全球流行的冠状病毒疾病(covid-19)由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2；亦称为2019-ncov或hcov-19)引起(coronaviridaestudygroupoftheinternationalcommitteeontaxonomyof,2020；jiang等人,2020a；jiang等人,2020c)。冠状病毒有4个主要亚科，称为α、β、γ和δ。sars-cov-2，与2003年鉴定的sars-cov-1和2012年鉴定的中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)一起，属于β-cov属(zhou等人,2020；zhu等人,2020)。3.对于每个冠状病毒颗粒，病毒基因组被核衣壳(n)蛋白包装并且被含有结构蛋白的被膜包围。这些结构蛋白之一(刺突蛋白；s-蛋白)三聚化并介导病毒进入宿主细胞(li,2016)，并且是人中和抗体的主要靶标(jiang等人,2020b；premkumar等人,2020；wu,f.等人,2020)。其含有1273个氨基酸，包括大的胞外结构域(s-ecd)、一个跨膜螺旋和小的胞内c-末端。已经鉴定了s-ecd内的两个主要结构域为s1头区和s2茎区，并且关键的受体-结合结构域(rbd)位于s1部分。4.因为sars-cov-2rbd与其人受体血管紧张素转化酶-2(ace2)的结合是病毒进入靶细胞的关键起始步骤，用抗体阻断该相互作用可能是用于治疗和预防的有前景的方法。对于靶向不同冠状病毒中存在的保守表位的广泛中和抗体，特别如此，所述冠状病毒例如sars-cov-1和新出现的sars-cov-2，这二者来自相同的冠状病毒亚科并共有相同的人受体ace2。5.已通过各种方法，投入许多努力来获得针对rbd的人中和抗体，所述方法包括：噬菌体展示(liu,x.等人,2020；sun等人,2020；wu,y.等人,2020a)、人源化小鼠(hansen等人,2020)、从sars-cov-1-恢复个体的抗体筛选(pinto等人,2020；wec等人,2020)和从sars-cov-2恢复期供体的单个b细胞抗体克隆(andreano等人,2020；brouwer等人,2020；cao等人,2020；chen等人,2020；chi等人,2020；ju等人,2020；kreer等人,2020；liu,l.等人,2020；robbiani等人,2020；rogers等人,2020；seydoux等人,2020；wan等人,2020；wu,y.等人,2020b；zost等人,2020a；zost等人,2020b)。尽管一些报道的抗体显示交叉中和活性(lv等人,2020；pinto等人,2020；wec等人,2020)，但它们针对sars-cov-1和sars-cov-2的效力不同等高。此外，尚未评价这些抗体的抗体依赖性增强(ade)效应，并且尚未确定ade和不同的sars-cov-2s-蛋白表位之间的关系。6.在ade效应发生期间，通过病毒-抗体免疫复合物的fc受体介导的内化，病毒侵入宿主细胞。这种现象已对于登革病毒、冠状病毒和其它病毒得到证明(eroshenko等人,2020；iwasaki和yang,2020；katzelnick等人,2017；miner和diamond,2017；salje等人,2018)。在sars-cov-1感染中，结合s-蛋白的抗体促进ace2-非依赖性病毒内化到巨噬细胞、单核细胞和b细胞内(jaume等人,2011；wang等人,2014；yip等人,2014)。病毒颗粒通过ade途径的摄入可能导致促炎细胞因子的产生升高。在sars-cov-2感染期间，在病危患者中一致观察到显著升高的igg抗体应答(zhang等人,2020；zhao等人,2020)和显著增加的促炎细胞因子在血清中的水平(huang等人,2020；wang,j.等人,2020)。然而，仍然没有研究结果表明针对sars-cov-2新冠病毒的抗体是否能够诱发ade效应。7.在本发明中，发明人选择了具有高水平的针对sars-cov-2的血清igg中和活性的恢复期个体，并分离了表达具有相同的ig可变基因区段和高度类似的cdr3序列的密切相关抗体的记忆b细胞的许多扩展克隆。有近一半的分离抗体靶向于s-蛋白的rbd结构域上的5个不同抗体结合表位。这些抗体的中和与增强活性的表征鉴定了一系列抗体，其不仅能有效地中和sars-cov-2而且不诱发ade效应。特别引人注意的是，本发明的某些抗体对具有1个氨基酸突变的一系列sars-cov-2毒株保持敏感性。此外，发明人鉴定了rbd结构域结合抗体，其有效地广谱中和sars-cov-1和sars-cov-2二种病毒，且没有ade效应。技术实现要素：8.本发明提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段特异性地结合sars-cov-2的s蛋白，其特征在于所述分离的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区vh和轻链可变区vl，所述重链可变区vh包含互补决定区cdrh1、cdrh2和cdrh3，所述轻链可变区vl包含互补决定区cdrl1、cdrl2和cdrl3，其中cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3选自以下氨基酸序列：a)seqidno:1的cdrh1、seqidno:29的cdrh2、seqidno:57的cdrh3、seqidno:113的cdrl1、seqidno:141的cdrl2和seqidno:169的cdrl3；b)seqidno:2的cdrh1、seqidno:30的cdrh2、seqidno:58的cdrh3、seqidno:114的cdrl1、seqidno:142的cdrl2和seqidno:170的cdrl3；c)seqidno:3的cdrh1、seqidno:31的cdrh2、seqidno:59的cdrh3、seqidno:115的cdrl1、seqidno:143的cdrl2和seqidno:171的cdrl3；d)seqidno:4的cdrh1、seqidno:32的cdrh2、seqidno:60的cdrh3、seqidno:116的cdrl1、seqidno:144的cdrl2和seqidno:172的cdrl3；e)seqidno:5的cdrh1、seqidno:33的cdrh2、seqidno:61的cdrh3、seqidno:117的cdrl1、seqidno:145的cdrl2和seqidno:173的cdrl3；f)seqidno:6的cdrh1、seqidno:34的cdrh2、seqidno:62的cdrh3、seqidno:118的cdrl1、seqidno:146的cdrl2和seqidno:174的cdrl3；g)seqidno:7的cdrh1、seqidno:35的cdrh2、seqidno:63的cdrh3、seqidno:119的cdrl1、seqidno:147的cdrl2和seqidno:175的cdrl3；h)seqidno:8的cdrh1、seqidno:36的cdrh2、seqidno:64的cdrh3、seqidno:120的cdrl1、seqidno:148的cdrl2和seqidno:176的cdrl3；i)seqidno:9的cdrh1、seqidno:37的cdrh2、seqidno:65的cdrh3、seqidno:121的cdrl1、seqidno:149的cdrl2和seqidno:177的cdrl3；j)seqidno:10的cdrh1、seqidno:38的cdrh2、seqidno:66的cdrh3、seqidno:122的cdrl1、seqidno:150的cdrl2和seqidno:178的cdrl3；k)seqidno:11的cdrh1、seqidno:39的cdrh2、seqidno:67的cdrh3、seqidno:123的cdrl1、seqidno:151的cdrl2和seqidno:179的cdrl3；l)seqidno:12的cdrh1、seqidno:40的cdrh2、seqidno:68的cdrh3、seqidno:124的cdrl1、seqidno:152的cdrl2和seqidno:180的cdrl3；m)seqidno:13的cdrh1、seqidno:41的cdrh2、seqidno:69的cdrh3、seqidno:125的cdrl1、seqidno:153的cdrl2和seqidno:181的cdrl3；n)seqidno:14的cdrh1、seqidno:42的cdrh2、seqidno:70的cdrh3、seqidno:126的cdrl1、seqidno:154的cdrl2和seqidno:182的cdrl3；o)seqidno:15的cdrh1、seqidno:43的cdrh2、seqidno:71的cdrh3、seqidno:127的cdrl1、seqidno:155的cdrl2和seqidno:183的cdrl3；p)seqidno:16的cdrh1、seqidno:44的cdrh2、seqidno:72的cdrh3、seqidno:128的cdrl1、seqidno:156的cdrl2和seqidno:184的cdrl3；q)seqidno:17的cdrh1、seqidno:45的cdrh2、seqidno:73的cdrh3、seqidno:129的cdrl1、seqidno:157的cdrl2和seqidno:185的cdrl3；r)seqidno:18的cdrh1、seqidno:46的cdrh2、seqidno:74的cdrh3、seqidno:130的cdrl1、seqidno:158的cdrl2和seqidno:186的cdrl3；s)seqidno:19的cdrh1、seqidno:47的cdrh2、seqidno:75的cdrh3、seqidno:131的cdrl1、seqidno:159的cdrl2和seqidno:187的cdrl3；t)seqidno:20的cdrh1、seqidno:48的cdrh2、seqidno:76的cdrh3、seqidno:132的cdrl1、seqidno:160的cdrl2和seqidno:188的cdrl3；u)seqidno:21的cdrh1、seqidno:49的cdrh2、seqidno:77的cdrh3、seqidno:133的cdrl1、seqidno:161的cdrl2和seqidno:189的cdrl3；v)seqidno:22的cdrh1、seqidno:50的cdrh2、seqidno:78的cdrh3、seqidno:134的cdrl1、seqidno:162的cdrl2和seqidno:190的cdrl3；w)seqidno:23的cdrh1、seqidno:51的cdrh2、seqidno:79的cdrh3、seqidno:135的cdrl1、seqidno:163的cdrl2和seqidno:191的cdrl3；x)seqidno:24的cdrh1、seqidno:52的cdrh2、seqidno:80的cdrh3、seqidno:136的cdrl1、seqidno:164的cdrl2和seqidno:192的cdrl3；y)seqidno:25的cdrh1、seqidno:53的cdrh2、seqidno:81的cdrh3、seqidno:137的cdrl1、seqidno:165的cdrl2和seqidno:193的cdrl3；z)seqidno:26的cdrh1、seqidno:54的cdrh2、seqidno:82的cdrh3、seqidno:138的cdrl1、seqidno:166的cdrl2和seqidno:194的cdrl3；aa)seqidno:27的cdrh1、seqidno:55的cdrh2、seqidno:83的cdrh3、seqidno:139的cdrl1、seqidno:167的cdrl2和seqidno:195的cdrl3；和bb)seqidno:28的cdrh1、seqidno:56的cdrh2、seqidno:84的cdrh3、seqidno:140的cdrl1、seqidno:168的cdrl2和seqidno:196的cdrl3，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段中和sars-cov-2而没有ade效应。9.在一个实施方案中，所述重链可变区vh和轻链可变区vl选自以下氨基酸序列：a)seqidno:85的vh和seqidno:197的vl；b)seqidno:86的vh和seqidno:198的vl；c)seqidno:87的vh和seqidno:199的vl；d)seqidno:88的vh和seqidno:200的vl；e)seqidno:89的vh和seqidno:201的vl；f)seqidno:90的vh和seqidno:202的vl；g)seqidno:91的vh和seqidno:203的vl；h)seqidno:92的vh和seqidno:204的vl；i)seqidno:93的vh和seqidno:205的vl；j)seqidno:94的vh和seqidno:206的vl；k)seqidno:95的vh和seqidno:207的vl；l)seqidno:96的vh和seqidno:208的vl；m)seqidno:97的vh和seqidno:209的vl；n)seqidno:98的vh和seqidno:210的vl；o)seqidno:99的vh和seqidno:211的vl；p)seqidno:100的vh和seqidno:212的vl；q)seqidno:101的vh和seqidno:213的vl；r)seqidno:102的vh和seqidno:214的vl；s)seqidno:103的vh和seqidno:215的vl；t)seqidno:104的vh和seqidno:216的vl；u)seqidno:105的vh和seqidno:217的vl；v)seqidno:106的vh和seqidno:218的vl；w)seqidno:107的vh和seqidno:219的vl；x)seqidno:108的vh和seqidno:220的vl；y)seqidno:109的vh和seqidno:221的vl；z)seqidno:110的vh和seqidno:222的vl；aa)seqidno:111的vh和seqidno:223的vl；和bb)seqidno:112的vh和seqidno:224的vl。10.在一个实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合s蛋白的rbd结构域。11.在一个实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合s蛋白的s1结构域但非rbd结构域。12.在一个实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合s蛋白的s2结构域。13.本发明还提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段特异性地结合sars-cov-2s蛋白的rbd结构域，其特征在于所述分离的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区vh和轻链可变区vl，所述重链可变区vh包含互补决定区cdrh1、cdrh2和cdrh3，所述轻链可变区vl包含互补决定区cdrl1、cdrl2和cdrl3，其中cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3选自以下氨基酸序列：a)seqidno:26的cdrh1、seqidno:54的cdrh2、seqidno:82的cdrh3、seqidno:138的cdrl1、seqidno:166的cdrl2和seqidno:194的cdrl3；b)seqidno:27的cdrh1、seqidno:55的cdrh2、seqidno:83的cdrh3、seqidno:139的cdrl1、seqidno:167的cdrl2和seqidno:195的cdrl3；和c)seqidno:28的cdrh1、seqidno:56的cdrh2、seqidno:84的cdrh3、seqidno:140的cdrl1、seqidno:168的cdrl2和seqidno:196的cdrl3，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段中和sars-cov-2及其单氨基酸突变株而没有ade效应。14.在一个实施方案中，所述重链可变区vh和轻链可变区vl选自以下氨基酸序列：a)seqidno:110的vh和seqidno:222的vl；b)seqidno:111的vh和seqidno:223的vl；和c)seqidno:112的vh和seqidno:224的vl。15.在一个实施方案中，所述sars-cov-2的单氨基酸突变株包括rbd结构域中的v341i、f342l、v367f、r408i、a435s、g476s和v483a突变。16.在一个实施方案中，本文所述的分离的抗体或其抗原结合片段以小于10μg/ml的50%抑制浓度ic50值体外中和sars-cov-2及其单氨基酸突变株，如通过基于细胞的萤光素酶活性所测定。17.在一个实施方案中，本文所述的分离的抗体或其抗原结合片段以小于25ng/ml的50%抑制浓度ic50值体外中和sars-cov-2及其单氨基酸突变株。18.本发明还提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段特异性地结合sars-cov-2s蛋白的rbd结构域，其特征在于所述分离的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区vh和轻链可变区vl，所述重链可变区vh包含互补决定区cdrh1、cdrh2和cdrh3，所述轻链可变区vl包含互补决定区cdrl1、cdrl2和cdrl3，其中cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3选自以下氨基酸序列：a)seqidno:27的cdrh1、seqidno:55的cdrh2、seqidno:83的cdrh3、seqidno:139的cdrl1、seqidno:167的cdrl2和seqidno:195的cdrl3；和b)seqidno:28的cdrh1、seqidno:56的cdrh2、seqidno:84的cdrh3、seqidno:140的cdrl1、seqidno:168的cdrl2和seqidno:196的cdrl3，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段交叉中和sars-cov-2和sars-cov-1而没有ade效应。19.在一个实施方案中，所述重链可变区vh和轻链可变区vl选自以下氨基酸序列：a)seqidno:111的vh和seqidno:223的vl；和b)seqidno:112的vh和seqidno:224的vl。20.在一个实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段以小于25ng/ml的50%抑制浓度ic50值体外中和sars-cov-2，并且以小于10ng/ml的ic50值体外中和sars-cov-1，如通过基于细胞的萤光素酶活性所测定。21.在一个实施方案中，本文所述的分离的抗体或其抗原结合片段的fc受体-结合位点包括grlr突变g236r和l328r。22.在一个实施方案中，本文所述的分离的抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗体片段。23.在一个实施方案中，所述抗原结合片段为fab片段、fab'片段、f(ab')2片段、fv片段、双抗体或单链抗体分子。24.在一个实施方案中，本文所述的分离的抗体或其抗原结合片段为igg1型、igg2型、igg3型或igg4型。25.本发明还提供了一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码本文所述的分离的抗体或其抗原结合片段。26.本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体包含本文所述的多核苷酸。27.本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本文所述的表达载体。28.本发明还提供了一种产生本文所述的分离的抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于所述方法包括在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下培养本文所述的宿主细胞，以及回收由所述宿主细胞产生的抗体或其抗原结合片段。29.本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的分离的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载剂。30.本发明还提供了所述分离的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗或预防有需要的受试者的sars-cov-2感染的药物中的用途。31.本发明还提供了所述分离的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗或预防有需要的受试者的sars-cov-2及其单氨基酸突变株感染的药物中的用途。32.本发明还提供了所述分离的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗或预防有需要的受试者的sars-cov-2和/或sars-cov-1感染的药物中的用途。33.在某些方面，本发明提供了用于治疗或预防有需要的受试者的sars-cov-2感染的方法，所述方法包括给予受试者有效量的至少一种本文公开的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段不产生抗体依赖性增强(ade)效应。34.在某些方面，本发明提供了用于在有需要的受试者中有效中和sars-cov-2病毒而不产生抗体依赖性增强(ade)效应的方法，所述方法包括给予受试者有效量的至少一种本文公开的抗体或其抗原结合片段。35.在某些方面，本发明提供了用于治疗或预防有需要的受试者的sars-cov-2和/或sars-cov-1感染的方法，所述方法包括给予受试者有效量的至少一种本文公开的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段不产生抗体依赖性增强(ade)效应。36.在某些方面，本发明提供了本文公开的分离的抗体或其抗原结合片段，用于治疗或预防有需要的受试者的sars-cov-2感染，其中所述抗体或其抗原结合片段不产生抗体依赖性增强(ade)效应。37.在某些方面，本发明提供了本文公开的抗体或其抗原结合片段，用于在有需要的受试者中有效中和sars-cov-2病毒而不产生抗体依赖性增强(ade)效应。38.在某些方面，本发明提供了本文公开的抗体或其抗原结合片段，用于治疗或预防有需要的受试者的sars-cov-2和/或sars-cov-1感染，其中所述抗体或其抗原结合片段不产生抗体依赖性增强(ade)效应。39.在某些方面，本发明提供了针对sars-cov-2的中和抗体或其抗原结合片段，所述中和抗体或其抗原结合片段结合s-蛋白(seqidno:225)中的表位。在一个实施方案中，所述表位位于seqidno:225的rbd(aa319-541)、s1(aa14-685)、s2(aa686-1213)或s-ecd(aa14-1213)结构域中。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合具有与seqidno:225或其上述子序列至少90%同一性的氨基酸序列中的表位。附图说明40.结合附图，本发明将得到更好地理解。41.图1显示了sars-cov-2s-蛋白的不同结构域的示意图。42.图2显示了24名供体的年龄和性别柱状图。43.图3显示了在从sars-cov-2感染恢复的个体中的抗体应答。(a-e)血清样品的elisa。来自24名志愿者，包括16名sars-cov-2恢复期个体(供体#1~#16)和8名sars-cov-2-未暴露的未感染个体(供体#17~#24)的各种血清稀释度针对sars-cov-2rbd(a)、s1(b)、s2(c)、s-ecd(d)和n(e)蛋白通过elisa评价(上图)。elisa曲线下面积(elisaauc)值通过prism软件计算并作为柱状图呈现(下图)。在恢复期和未感染供体之间的统计学差异(p值)对于rbdelisa(a)通过studentt检验确定，或对于其它(b-e)通过wilcoxon秩和检验确定。显示了至少2次实验。(f-h)在不同稀释度的血清(上图，f和g)或不同浓度的纯化的igg抗体(上图，h)的存在下，针对sars-cov-1(g)或sars-cov-2假病毒(f和h)的萤光素酶报告子假病毒依赖性中和作用测定。导致半最大抑制作用的血清稀释度的倒数作为50%中和效价(nt50)报告并作为柱状图显示(下图，f和g)。显示了来自至少2次独立实验的纯化的igg抗体的半最大抑制浓度(ic50)值(下图，h)。阴影指示最有效的样品来自供体#16。缩写“b.d.”表示“低于检测限”。(i)通过不同的s-蛋白结构域阻断中和作用。不同量的指定蛋白(sars-cov-2s-蛋白的rbd、s1、s2和s-ecd)与纯化的多克隆igg(5μg/ml，来自供体#16)孵育，然后与sars-cov-2假病毒孵育用于体外感染。y轴显示标准化的萤光素酶读出值作为感染效率的指示物。44.图4显示了细胞分选的门控策略。双重阳性(诱饵蛋白-pe 和诱饵蛋白-apc )细胞经单细胞分选用于抗体克隆。45.图5显示了在未感染的对照供体(上图)和所选供体#16(下图)中识别sars-cov-2蛋白的b淋巴细胞的频率。代表性的流式细胞术绘图显示了结合生物素化avi-tag标记的rbd(a)、化学生物素化s-ecd(b)和生物素化avi-tag标记的s-ecd(c)的cd19 cd20 b细胞的百分比。所有诱饵蛋白用别藻蓝蛋白(apc)或藻红蛋白(pe)标记，用于双荧光-染料分选策略。实验重复至少2次。46.图6显示了供体#16的抗体饼图。总共克隆获得了292个测序的抗体具有天然配对的ig重链和轻链。具有igh和igl可变基因序列的相同组合和密切相关的cdr3的抗体一起分组并作为不同片层表示。鉴定了总共25个片层。单独克隆的抗体以一个浅灰色片层显示。对于扩展克隆的抗体和48种选择的抗体(xg001~xg048)显示了对于配对的igh和igl的vh、vl基因和cdr3氨基酸序列。47.图7显示了来自同一扩展克隆的代表性抗体的v(d)j氨基酸序列比对。xg001/xg002、xg003/xg004和xg020/xg044分别来自密切扩展b细胞克隆。共有的氨基酸残基以灰色盒显示。48.图8显示了在sars-cov-2s蛋白中的抗体表位。(a-d)人单克隆抗体与sars-cov-2s-蛋白的不同结构域的结合。显示了来自至少2次独立实验的使用s-ecd结构域(a)、rbd结构域(b)、s1结构域(c)和s2结构域(d)的elisa的代表性曲线下面积(auc)值。pbs用作阴性对照。(e)基于抗原-结合测定，将48种抗体分类为5个类型，rbd-结合抗体、s1但非rbd结合抗体、s2-结合抗体、s-ecd结合抗体、无结合抗体。(f)竞争性elisa定义了4组的rbd-结合抗体。第一抗体(x轴)是非生物素化的并用于阻断表位，而第二抗体(y轴)是生物素化的，用于通过链霉亲和素-hrp检测。竞争性elisa的结果作为与pbs-阻断的参考相比通过第二生物素化抗体的结合百分比显示，并通过颜色标出：黑色，0%–25%；深灰色，25%–50%；浅灰色，50%–75%；白色，》75%。所有测试的抗体阻断它们自身的生物素化形式的结合。xg008和xg038结合rbd组iii的2个互相排斥的子表位。抗-hbs抗体h004(wang,q.等人,2020)用作阴性对照。弱rbd结合剂(xg015、xg042、xg045、xg047)从该测定中排除。代表性的2次实验。49.图9显示了竞争性elisa和4个主要的rbd抗体组。(a-b)验证rbd上5个非竞争表位的竞争性elisa。代表性抗体选自每个抗体组，其中xg011选自rbd组i，xg025选自rbd组ii，xg008和xg038选自rbd组iii，和xg014选自组iv。xg008和xg038结合rbd组iii中的2个互相排斥的子表位。第一抗体是未标记的rbd-结合抗体并用于阻断包被的rbd(a)或包被的s-ecd蛋白(b)上的表位。第二抗体是生物素化rbd抗体用于链霉亲和素-hrp依赖性检测。pbs-阻断孔是标准化参考。50.图10显示了来自4个rbd组的抗体，标出了ighv和igkv/iglv。51.图11显示了体外中和活性。(a)使用基于萤光素酶的sars-cov-2假病毒，代表性的人单克隆抗体的中和效力。萤光素酶信号(感染的代替物)在各种浓度的所示单克隆抗体存在下测定并标准化至无抗体对照(虚线)。在测定中没有中和能力的测试抗体以灰色线显示。(b)针对sars-cov-2假病毒的体外中和测定。显示了对于各抗体的ic50值。所有实验重复最少2次。缩写“n.n.”表示“在测定中无中和”。(c)ic50低于10或0.1μg/ml的中和抗体的抗原表位以柱状图概述。(d)用于针对sars-cov-2真病毒的体外中和测定的sars-cov-2n-蛋白的免疫荧光染色。使用抗-n-蛋白多克隆抗体(gu等人,2020)的免疫荧光用于评价所选单克隆抗体的中和作用。(e和f)针对sars-cov-2真病毒的体外中和测定的定量反转录pcr结果(e)和相应的ic50值(f)。sars-cov-2n-蛋白rna拷贝数是基于n-蛋白dna样品的标准曲线所计算得到，而此标准曲线使用了包含10倍连续稀释的7个浓度的n-蛋白dna样品所绘制。进行至少2次独立实验。(g)聚类分析鉴定了与中和活性相关的抗体表位。在9个稀释度的45种单克隆抗体的存在下使用sars-cov-2假病毒中和数据进行无监督分层聚类。鉴定了簇a、b、c和d。针对测试的抗原没有elisa结合的抗体(xg021、xg034、xg039)被排除。具有s-蛋白或rbd上的不同表位的抗体分别用颜色编码或形状编码。52.图12显示了针对sars-cov-2真病毒的基于免疫荧光的体外中和测定。(a-g)在sars-cov-2真病毒感染后在不同的单克隆抗体xg005(a)、xg008(b)、xg013(c)、xg014(d)、xg016(e)、xg017(f)和xg020(g)的存在下sars-cov-2n-蛋白的免疫荧光染色。使用抗-n-蛋白多克隆抗体(gu等人,2020)的免疫荧光用于使感染的细胞可视化，其中dapi染色显示总细胞密度。53.图13显示了单克隆抗体的交叉中和活性。(a-b)xg014(a)和xg038(b)针对具有不同rbd突变的sars-cov-2假病毒的体外中和测定。测定萤光素酶活性，标准化并视为感染的代替物。用于标准化的参考没有加入抗体(虚线)。(c-d)针对sars-cov-1假病毒的体外中和实验(c)和对于各抗体的相应ic50值(d)。缩写“n.n.”表示“在测定中无中和”。在测定中没有中和能力的测试抗体在(c)中以浅灰色线显示。用所示的代表性抗体进行至少2次实验。54.图14显示了通过xg014和xg041抗体针对sars-cov-1假病毒的体外中和测定。(a-b)xg014(a)和xg038(b)针对sars-cov-1假病毒的体外中和测定。测定萤光素酶活性并使用未加入抗体的参考样品(虚线)的萤光素酶信号标准化。55.图15显示了通过单克隆抗体的体外抗体依赖性病毒进入。(a-b)在不同稀释度的抗体的存在下，使用表达萤光素酶的sars-cov-2假病毒的体外raji细胞测定抗体的ade效应。诱导高水平的萤光素酶信号的抗体显示于(a)，包括9种rbd-结合抗体和2种s1结合但非rbd-结合的抗体(b)。所有其它测试抗体的存在显示背景或低水平的萤光素酶信号。由2μg/ml的抗体xg003诱导的萤光素酶信号用作标准化参考，和其它表示为萤光素酶活性的倍数变化。(c)计算每种单克隆抗体的相应的曲线下面积(auc)值。进行至少2次独立实验。认为虚线上方的信号表现出ade。(d-e)使用grlr形式的xg005(d)和xg006(e)抗体的在体外raji细胞中测定抗体的ade效应。在同一个板上平行进行野生型人抗体和其fc受体变体grlr，实验重复至少2次。(f)用fc受体阻断的体外raji细胞后测定抗体的ade效应。在没有抗-人fcγrii抗体孵育的情况下用raji细胞进行阴性对照。实验重复2次。56.图16显示了在raji细胞中通过单克隆抗体的抗体依赖性增强(ade)效应。(a)使用表达萤光素酶的sars-cov-2的体外raji细胞依赖性测定，代表性单克隆抗体诱导ade效应。通过2μg/ml的抗体xg003诱导的萤光素酶信号用作标准化参考，和其它表示为萤光素酶活性的倍数变化。在许多不同的抗体浓度下，xg005和xg016诱导了高水平的萤光素酶信号，而抗体xg014和xg038不诱导ade。xg006仅在高浓度下诱导病毒进入，而对于xg029相反。(b)在测定中定义ade参数的草图：增强能力和ade的曲线下面积(auc)值。(c)各单克隆抗体的增强能力值。进行至少2次独立实验。虚线上方的信号被视为指示ade。(d-f)在增强能力和adeauc之间(d)、ic50和adeauc之间(e)以及ic50和增强能力之间(f)的相关性。图中每一个点表示一个单克隆抗体(对于d，n=48；对于e和f，n=24)。相关性的rs和p值用spearman秩相关方法确定。57.图17显示了聚类分析鉴定与抗体中和或增强效应相关的rbd表位。(a)使用sars-cov-2假病毒中和作用(neu)和raji细胞抗体依赖性增强(ade)效应数据进行无监督分层聚类。鉴定了簇x、y和z。针对测试的抗原没有elisa结合的抗体(xg021、xg034、xg039)被排除。该聚类分析使用其它组中和与ade值重复。(b-c)三个簇中抗体的adeauc(b)或ic50值(c)的小提琴图。统计学分析使用dunn'skruskal-wallis多重比较检验进行。(d)三个簇中具有不同结合表位的抗体数的柱状图。参考(a)中抗体表位的标记指导。统计学分析使用fisher精确检验进行。(e)具有不同表位组的rbd-结合抗体的adeauc值的小提琴图。统计学分析使用wilcoxon秩和检验进行。58.图18显示了聚类分析鉴定与ade效应相关的rbd组iv表位。使用sars-cov-2假病毒在raji细胞中的抗体依赖性增强(ade)效应数据进行无监督分层聚类。鉴定了簇m和n。具体实施方式59.本文公开了结合sars-cov-2s蛋白的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段结合s蛋白的rbd、s1、s2或s-ecd结构域中的表位。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段可阻止sars-cov-2病毒进入宿主细胞，从而治疗或预防受试者的sars-cov-2感染。在某些实施方案中，所述抗体为人单克隆抗体。60.如本领域技术人员所了解，根据本公开内容，本发明的结合s蛋白结构域的抗体或其抗原结合片段可中和受试者中的sars-cov-2，而没有产生抗体依赖性增强(ade)效应。因此，本发明的可用于各种方法和组合物中，所述方法和组合物用于治疗或预防受试者的sars-cov-2感染。61.为方便起见，以下章节概述了本文所用术语的各种含义，之后论述了关于抗体或其抗原结合片段的各个方面，接着通过具体实施例证明了抗体或其抗原结合片段的各种实施方案。62.一、定义应该理解，前述一般说明及以下详述仅为例示性和解释性，并非限制所要求保护的本发明。在本技术中，除非另外明确说明，否则单数的使用包括复数。在本技术中，除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括”以及其它形式例如“包含”的使用并非限制性的，并涵盖术语“由……组成”。63.本文所用章节标题仅用于组织目的，不能理解为限制所述的主题。为任何目的，本技术中所引用的所有文献或文献的部分(包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍及论文)都在此以其整体引作参考。64.术语“s-蛋白”亦称为刺突蛋白，是病毒结构蛋白之一，其介导病毒进入宿主细胞。s-蛋白含有1273个氨基酸(seqidno:225)，包括大的胞外结构域(s-ecd)、一个跨膜螺旋和小的胞内c-末端。已经鉴定了s-ecd内的两个主要结构域为s1头区和s2茎区，并且关键的受体-结合结构域(rbd)位于s1部分。参见图1。65.mfvflvllplvssqcvnlttrtqlppaytnsftrgvyypdkvfrssvlhstqdlflpffsnvtwfhaihvsgtngtkrfdnpvlpfndgvyfasteksniirgwifgttldsktqsllivnnatnvvikvcefqfcndpflgvyyhknnkswmesefrvyssannctfeyvsqpflmdlegkqgnfknlrefvfknidgyfkiyskhtpinlvrdlpqgfsaleplvdlpiginitrfqtllalhrsyltpgdsssgwtagaaayyvgylqprtfllkynengtitdavdcaldplsetkctlksftvekgiyqtsnfrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnfnfngltgtgvltesnkkflpfqqfgrdiadttdavrdpqtleilditpcsfggvsvitpgtntsnqvavlyqdvnctevpvaihadqltptwrvystgsnvfqtragcligaehvnnsyecdipigagicasyqtqtnsprrarsvasqsiiaytmslgaensvaysnnsiaiptnftisvtteilpvsmtktsvdctmyicgdstecsnlllqygsfctqlnraltgiaveqdkntqevfaqvkqiyktppikdfggfnfsqilpdpskpskrsfiedllfnkvtladagfikqygdclgdiaardlicaqkfngltvlpplltdemiaqytsallagtitsgwtfgagaalqipfamqmayrfngigvtqnvlyenqklianqfnsaigkiqdslsstasalgklqdvvnqnaqalntlvkqlssnfgaissvlndilsrldkveaevqidrlitgrlqslqtyvtqqliraaeirasanlaatkmsecvlgqskrvdfcgkgyhlmsfpqsaphgvvflhvtyvpaqeknfttapaichdgkahfpregvfvsngthwfvtqrnfyepqiittdntfvsgncdvvigivnntvydplqpeldsfkeeldkyfknhtspdvdlgdisginasvvniqkeidrlnevaknlneslidlqelgkyeqyikwpwyiwlgfiagliaivmvtimlccmtsccsclkgccscgscckfdeddsepvlkgvklhyt(seqidno:225)术语“多核苷酸”或“核酸”包括单链和双链核苷酸聚合体二者。包含多核苷酸的核苷酸可为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或经修饰形式的任一种类型核苷酸。所述修饰包括：碱基修饰，例如溴尿苷和肌苷衍生物；核糖修饰，例如2’,3’-二脱氧核糖；和核苷酸间连接修饰，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯和氨基磷酸酯等。术语“寡核苷酸”意指包含200个或更少核苷酸的多核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸长10-60个碱基。在其它实施方案中，寡核苷酸长度为12、13、14、15、16、17、18、19或20-40个核苷酸。寡核苷酸可为单链或双链，例如用于构建突变基因的单链或双链。寡核苷酸可为有义或反义寡核苷酸。寡核苷酸可包括用于检测测定的标记，包括放射性标记、荧光标记、半抗原或抗原标记。寡核苷酸可用作例如pcr引物、克隆引物或杂交探针。66.术语“载体”意指用于将蛋白编码信息转移到宿主细胞的任何分子或实体(例如核酸、质粒、噬菌体或病毒)。67.术语“表达载体”或“表达构建体”是指适于转化宿主细胞并含有指导和/或调控一个或多个可操作地与其连接的异源编码区的表达的核酸序列的载体。表达构建体可包括但不限于：影响或调控转录、翻译的序列；和若存在内含子，则影响可操作地与其连接的编码区的rna剪接的序列。68.本文所用“可操作地连接”意指使用该术语的组分处于允许所述组分在合适的条件下实行其固有的功能的关系中。例如，让“可操作地连接”到蛋白编码序列的载体中的调控序列与蛋白编码序列连接，以便在与调控序列的转录活性兼容的条件下完成所述蛋白编码序列的表达。69.术语“宿主细胞”意指业已被或能够被核酸序列转化并藉此表达目的基因的细胞。不管后代在形态上或在遗传构成上与原始母细胞是否相同，只要后代存在目的基因，该术语就包括所述母细胞的后代。70.术语“转染”意指细胞吸收外来或外源dna，当将所述外源dna引入到细胞膜内时所述细胞就被“转染”了。多种转染技术在本领域众所周知并公开于本文中。参见例如graham等，1973,virology52:456；sambrook等，2001,molecularcloning:alaboratorymanual，见上述；davis等，1986,basicmethodsinmolecularbiology,elsevier；chu等，1981,gene13:197。所述技术可用于将一种或多种外源dna部分引入到合适的宿主细胞中。71.术语“转化”是指细胞中遗传特性的改变，当细胞被修饰成含有新dna或rna时，所述细胞就被转化了。例如，当通过经由转染、转导或其它技术引入新遗传物质来对细胞天然状态进行遗传修饰时，细胞被转化了。转染或转导后，转化的dna可通过在物理上整合到细胞染色体而与细胞dna重组，或可作为染色体外元件不被复制而短暂保留，或可作为质粒独立复制。当转化的dna随着细胞分裂复制时，认为细胞已经被“稳定地转化”了。72.术语“氨基酸”包括其在本领域中的一般含义。本文使用常规的单字母氨基酸代码和三字母氨基酸代码，如表1中所示。73.表1(devereux等，1984,nucl.acidres.12:387；geneticscomputergroup,universityofwisconsin,madison,wi)。将计算机算法gap用于比对待测定序列同一性百分比的两个多肽或多核苷酸。根据其各自的氨基酸或核苷酸的最佳匹配对序列进行比对(由算法来确定“匹配跨度”)。结合所述方法使用空位开放罚分(计算为3x平均对角线，其中所述“平均对角线”为所用比较矩阵的对角线的平均值；所述“对角线”为通过特定比较矩阵分配给每一完美的氨基酸匹配的分值或数值)和空位延伸罚分(其通常为空位开放罚分的1/10倍)以及比较矩阵例如pam250或blosum62。在某些实施方案中，所述算法也使用标准比较矩阵(对于pam250比较矩阵，参见dayhoff等，1978,atlasofproteinsequenceandstructure，5:345-352；对于blosum62比较矩阵，参见henikoff等，1992,proc.natl.acad.sci.u.s.a.89:10915-10919)。77.在用gap程序测定多肽或核苷酸序列的同一性百分率中可采用的参数实例如下：算法：needleman等，1970,j.mol.biol.48:443-453；比较矩阵：来自henikoff等，1992，上述的blosum62；空位罚分：12(但对末端空位不罚分)；空位长度罚分：4；相似性阀值：0。78.用于比对两个氨基酸序列的某些比对设计可导致仅两个序列的短区域匹配，即使在两个全长序列间没有显著的关系，这种小比对区也可具有极高的序列同一性。因此，如果需要产生跨越靶标多肽的至少50个或其它数目的邻接氨基酸的比对，则可调整所选择的比对方法(gap程序)。79.术语“衍生物”是指包括除氨基酸(或核酸)的插入、缺失或取代外的化学修饰的分子。在某些实施方案中，衍生物包括共价修饰，其包括但不限于与聚合物、脂类或其它有机或无机部分化学键合。在某些实施方案中，化学修饰的抗原结合蛋白可比未进行化学修饰的抗原结合蛋白具有更长的循环半衰期。在某些实施方案中，化学修饰的抗原结合蛋白可改进靶向所期需细胞、组织和/或器官的能力。在某些实施方案中，对衍生的抗原结合蛋白进行共价修饰以使其包含一种或多种水溶性聚合连接物，其包括但不限于聚乙二醇、聚氧乙二醇或聚丙二醇。在某些实施方案中，衍生的抗原结合蛋白包含一种或多种聚合物，其包括但不限于单甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、纤维素或基于其它基于糖类的聚合物、聚-(n-乙烯吡咯烷酮)-聚乙二醇、丙二醇同聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化的多元醇(例如乙二醇)和聚乙烯醇以及所述聚合物的混合物。80.在某些实施方案中，用聚乙二醇(peg)亚单位共价修饰衍生物。在某些实施方案中，在一个或多个特定位置(例如在衍生物的氨基末端)键合一种或多种水溶性聚合物体。在某些实施方案中，将一种或多种水溶性聚合物随机连接到衍生物的一个或多个侧链上。在某些实施方案中，将peg用于改进抗体或其抗原结合片段的治疗能力。在某些实施方案中，将peg用于改进人源化抗体的治疗能力。某些所述方法于例如美国专利第6,133,426号中论述，其为任何目的在此引作参考。81.术语“抗体”是指任何同种型的完整免疫球蛋白或其可与完整抗体竞争特异性结合靶抗原的片段，并且包括例如嵌合抗体、人源化抗体、人全抗体和双特异性抗体。“抗体”是一类抗原结合蛋白。完整抗体通常将包含至少两条全长重链和两条全长轻链，但在某些情况下可包括较少的链，例如骆驼中天然存在的抗体可仅包含重链。抗体可仅来源于单一来源，或可为“嵌合”的，也即抗体的不同部分可来源于两种不同的抗体。可在杂交瘤中；通过重组dna技术或通过酶学或化学裂解完整抗体，来产生抗原结合蛋白、抗体或结合片段。除非另外指出，否则术语“抗体”除包括包含两条全长重链和两条全长轻链的抗体外，还包括其衍生物、变体和片段。此外，除非明确将其排除在外，否则抗体分别包括单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、双特异性抗体、结构域抗体、合成抗体(本文有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体融合体(本文有时称为“抗体缀合物”)及其片段。82.天然存在的抗体结构单元通常包含四聚体。每一四聚体通常由两个同样的多肽链对组成，每一对具有一条全长“轻链”(在某些实施方案中，约25kda)和一条全长“重链”(在某些实施方案中，约50-70kda)。每条链的氨基末端部分通常包含约100-110个或更多个氨基酸的可变区，所述可变区通常负责抗原识别。每条链的羧基末端部分通常定义为可负责效应功能的恒定区。人轻链通常分为κ和λ轻链。重链通常分为μ、δ、γ、α或ε链，并且抗体的同种型分别定义为igm、igd、igg、iga和ige。igg有若干亚类，包括但不限于igg1、igg2、igg3和igg4。igm具有亚类，包括但不限于igm1和igm2。iga同样被再分为亚类，包括但不限于iga1和iga2。在全长轻链和重链内，通常可变区和恒定区由约12个或更多个氨基酸的“j”区连接，且重链还包括约10个以上氨基酸的“d”区。参见例如fundamentalimmunology,ch.7(paul,w.编辑，第二版，ravenpress,n.y.(1989))(其为所有目的以其整体在此引作参考)。每一轻链/重链对的可变区通常形成抗原结合位点。83.在某些实施方案中，即使是在同一物种的抗体之间，不同的抗体可变区在氨基酸序列上广泛变化。抗体可变区通常决定特定抗体针对其靶标的特异性。84.可变区通常表现出由三个高变区连接的相对保守的构架区(fr)的相同一般结构，所述高变区也被称为互补决定区或cdr。通常通过构架区定位来自每对两条链的cdr，所述cdr使得可结合特异性表位。两条轻链和重链可变区从n-末端到c-末端通常包含结构域fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4。向每一结构域的氨基酸分配通常与如下定义一致：kabatsequencesofproteinsofimmunologicalinterest(nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1987和1991))或chothia&lesk,j.mol.biol.,196:901-917(1987)；chothia等，nature,342:878-883(1989)。国际免疫遗传学(imgt)数据库(http://www.imgt.org)提供了抗原结合位点的标准化编号和定义。cdr与imgt划分之间的对应性在lefrancetal.,devcomparatimmunol27:55-77,2003中有所描述。85.按惯例，重链中的cdr区通常被称为h1、h2和h3，并且从氨基末端到羧基末端的方向按顺序编号。轻链中的cdr区通常被称为l1、l2和l3，并且从氨基末端到羧基末端的方向按顺序编号。86.术语“轻链”包括全长轻链及其具有足以赋予结合特异性的可变区序列的片段。全长轻链包含可变区结构域vl和恒定区结构域cl。轻链的可变区结构域位于多肽的氨基末端。轻链包括κ链和λ链。87.术语“重链”包括全长重链及其具有足以赋予结合特异性的可变区序列的片段。全长重链包含可变区结构域vh和三个恒定区结构域ch1、ch2和ch3。vh结构域位于多肽的氨基末端，而ch结构域位于羧基末端，且ch3最接近多肽的羧基末端。重链可为任何同种型，包括igg(包括igg1、igg2、igg3和igg4亚型)、iga(包括iga1和iga2亚型)、igm和ige。88.术语“抗原结合片段”包括但不限于fab片段、fab'片段、f(ab')2片段、fv片段、双抗体以及单链抗体分子。[0089]“fc”区包含两个含抗体ch1和ch2结构域的重链片段。所述两个重链片段通过两个或多个二硫键并通过ch3结构域的疏水作用保持在一起。[0090]“fab片段”包含一条轻链和一条重链的ch1及可变区。fab分子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。[0091]“fab’片段”包含一条轻链和含有vh结构域及ch1结构域还有ch1和ch2结构域之间的区域的一条重链的部分，因此在两个fab’片段的两条重链间可形成链间二硫键以形成f(ab’)2分子。[0092]“f(ab’)2片段”含有两条轻链和含有ch1和ch2结构域之间的恒定区的部分的两条重链，由此在两条重链之间形成链间二硫键。因此f(ab’)2片段由通过两条重链之间的二硫键保持在一起的两个fab’片段组成。[0093]“fv片段”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺乏恒定区。[0094]“单链抗体”为fv分子，其中重链和轻链可变区由弹性接头连接在一起以形成单多肽链，从而形成抗原结合区。单链抗体详述于国际专利申请公开号wo88/01649和美国专利第4,946,778号及第5,260,203号中，它们的内容在此引作参考。[0095]“单克隆抗体”是指具有单一分子组成的同质抗体群。单克隆抗体可以是非特异性的，也可以是多特异性的。[0096]“结构域抗体”为只含有重链可变区或轻链可变区的具免疫学功能的免疫球蛋白片段。在某些情况下，两个或多个vh区与肽接头共价连接以形成二价结构域抗体。二价结构域抗体的这两个vh区可靶向相同或不同的抗原。[0097]“多特异性抗体”为靶向不止一种抗原或表位的抗体。“双特异性”、“双重特异性”或“双功能”抗体分别为具有两个不同的抗原结合位点的杂合抗体。双特异性抗体的两个结合位点将结合两种不同的表位，所述表位可位于相同或不同的蛋白靶标上。[0098]当抗体结合一个靶标比其结合第二个靶标更紧密时，其为“选择性”抗体。[0099]“重组抗体”为用重组技术制备的抗体。用于制备重组抗体的方法和技术在本领域众所周知。[0100]双特异性或双功能抗体通常为人工杂合抗体，其具有两个不同的重链/轻链对和两个不同的结合位点。可通过多种方法(包括但不限于融合杂交瘤或连接fab’片段)来制备双特异性抗体。参见例如songsivilai等，clin.exp.immunol.,79:315-321(1990)；kostelny等，j.immunol.,148:1547-1553(1992)。[0101]每个单独的免疫球蛋白链通常由若干个“免疫球蛋白结构域”组成，每个免疫球蛋白结构域由大约90-110个氨基酸组成并具有特有的折叠方式。这些结构域为组成抗体多肽的基本单元。在人中，iga和igd同种型含有四条重链和四条轻链；igg和ige同种型含有两条重链和两条轻链；而igm同种型含有五条重链和五条轻链。重链c区通常包含一个或多个可负责效应功能的结构域。重链恒定区结构域的数目将视同种型而定。例如，igg重链含有三个称为ch1、ch2和ch3的c区结构域。提供的抗体可具有任何这些同种型和亚型。[0102]术语“中和”指结合配体并防止或降低配体的生物学作用。这可例如通过直接封阻配体上的结合位点或通过结合配体并通过间接方式(例如配体的结构或能量改变)改变配体的结合能力来实现。在评估抗体或其抗原结合片段的结合情况和/或特异性中，当过量的抗体降低结合到配体的结合配偶体的量至少约1-20、20-30%、30-40%、40-50%、50-60%、60-70%、70-80%、80-85%、85-90%、90-95%、95-97%、97-98%、98-99%或更多(根据体外竞争性结合测定所测量)时，抗体或片段可基本上抑制配体与其结合配偶体的结合。在某些实施方案中，在本发明的情况下，所述中和抗体可降低rbd与其受体ace2的结合。在某些实施方案中，经由竞争测定来表征和/或描述中和能力。在某些实施方案中，中和能力以50%抑制浓度(ic50)值来描述。[0103]术语“抗体依赖性增强(ade)效应”指某些病毒特异性抗体与病毒结合后，与病毒结合的抗体可通过其fc区与表面表达fcr的细胞结合从而介导病毒进入这些细胞，导致增强了病毒的感染性过程。[0104]人体感染冠状病毒后，免疫系统能够产生各种各样的针对病毒颗粒及其组分的特异性抗体。在这些抗体中，只有针对病毒表面s蛋白的抗体能够结合病毒颗粒；而那些针对病毒其他元件和组分的抗体并不能与病毒颗粒发生结合，这是因为这些组分被包裹在病毒内部，抗体无法与其接触。这些结合病毒表面s蛋白的抗体各式各样，在s蛋白上分别具有不同的结合位点。其中有一部分抗体，其结合位点恰恰与病毒表面s蛋白上细胞受体的结合部位重合。这类抗体不仅能结合病毒颗粒，还能够与细胞表面受体竞争性地结合病毒颗粒。若抗体的结合力够强，这类抗体就能阻止病毒表面蛋白与细胞受体的结合，从而抑制病毒感染，这类抗体称为中和抗体。而另外大部分能结合病毒颗粒却不具备体外中和效力的抗体，在人体内也能通过其恒定区的fc区域起到非常重要的作用。抗体的fc区域可以结合效应细胞上的fc受体，从而招募各类效应细胞：招募自然杀伤细胞，引发抗体依赖性细胞毒性作用(adcc)；招募结合血清中的补体分子，引发补体依赖性细胞毒性作用(cdc)；招募巨噬细胞，引发抗体依赖细胞介导的吞噬作用(adcp)。[0105]然而，ade效应使疫苗开发复杂化。登革病毒有4类血清型，而人体在感染某个血清型的登革病毒后，机体产生针对该血清型的具有终身保护效力的抗体(guzmanmg,2007)。但是，登革病毒导致威胁生命的登革出血热症状并非发生在第一次感染的时段(screatong,2015)，而往往发生在第二次感染不同血清类型病毒之后（氨基酸序列差异为30%～35%）。这是因为第一次感染后诱导产生的针对某一血清型登革病毒的抗体，其浓度或亲和力不足以中和第二次感染中另一血清型的病毒，相反促进病毒感染增强。这种现象被称为ade效应。[0106]在ade效应发生时，结合病毒颗粒的抗体，通过其fc区域使病毒颗粒被拥有fc受体或补体受体的细胞吞噬，反而促进其对这类细胞的侵染。某些种类的病毒感染细胞时，病毒颗粒通过内吞作用进入宿主细胞体内，在溶酶体中完成病毒膜与宿主膜的融合过程。而依赖于抗体的内吞作用反而促进了病毒颗粒被宿主细胞所吞噬，加重病毒感染。因此，抗体是否抑制或促进病毒感染，是其中和效力与ade效应共同平衡的结果；而血清对病毒的影响则是其中所包含的所有抗体分子（中和效力与ade效应）的综合表现。[0107]术语“靶标”是指能够被抗体或其抗原结合片段结合的分子或分子部分。在某些实施方案中，靶标可具有一个或多个表位。在某些实施方案中，靶标为抗原。在短语“抗原结合片段”中“抗原”的使用仅表示包含可被抗体结合的抗原的蛋白序列。在该情况下，所述蛋白不一定是外源的或不一定能够诱导免疫反应。[0108]当术语“竞争”用于竞争相同表位的中和抗体的情况中时，意指在抗体之间竞争，其通过以下测定法来测定：在所述测定法中，待检测的抗体或其抗原结合片段防止或抑制(例如降低)参考抗体与共同抗原(例如s蛋白或其结构域)的特异性结合。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗体是否与另一种竞争，这些测定例如：固相直接或间接放射免疫测定(ria)、固相直接或间接酶免疫测定(eia)、夹心竞争测定(参见例如stahli等，1983,methodsinenzymology9:242-253)；固相直接生物素-亲和素eia(参见例如kirkland等，1986,j.immunol.137:3614-3619)、固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见例如harlow和lane,1988,antibodies,alaboratorymanual(抗体，实验室手册),coldspringharborpress)；用i-125标记物的固相直接标记ria(参见例如morel等，1988,molec.immunol.25:7-15)；固相直接生物素-亲和素eia(参见例如cheung,等，1990,virology176:546-552)；和直接标记的ria(moldenhauer等，1990,scand.j.immunol.32:77-82)。通常所述测定法涉及使用结合荷有未标记的检测抗体及标记的参考抗体任一种的固态表面或细胞的纯化抗原。通过测量在所测抗体存在下结合固态表面或细胞的标记量来测量竞争性抑制。通常所测抗体过量存在。通常当竞争的抗体过量存在时，其将抑制(例如降低)至少40-45%、45-50%、50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%或75%或更多参考抗体与共同抗原的特异性结合。在某些情况下，结合被抑制至少80-85%、85-90%、90-95%、95-97%或97%或更多。[0109]术语“抗原”是指能够被选择性结合剂例如抗体或其免疫学功能片段结合的分子或分子部分。在某些实施方案中，能够将抗原用于动物以产生能够结合该抗原的抗体。抗原可拥有能够与不同的抗体作用的一个或多个表位。[0110]术语“表位”包括能够被抗体结合的任何决定簇。表位为抗原区域，其被靶向该抗原的抗体结合。当抗原为蛋白时，其包含直接与抗体接触的特定氨基酸。大部分情况下，表位位于蛋白上，但在某些情况下，可位于其它种类的分子上，例如核酸。表位决定簇可包括分子的化学活性表面簇，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并可具有特定的三维结构特点和/或特定的电荷特点。[0111]术语“扩展克隆”又称b细胞扩展克隆或扩展克隆抗体，是指初始b细胞结合抗原后进入到淋巴结的生发中心，在生发中心，b细胞在t细胞的帮助下不断扩增，同时抗体的可变区进一步突变，最终生成结合力非常强的抗体。通常认为同一扩展克隆产生的抗体在功能和性质方面具有极大相似性，例如cdr序列类似，结合相同的表位，实现相同的生物学作用等。[0112]术语“单独克隆”又称单独克隆抗体，在实验中没有发现与其具有极为相似的cdr序列的抗体。很有可能的是，实验样本有限而没有发现扩展克隆抗体，因此将该抗体称为单独克隆。[0113]术语“治疗有效量”是指确定在哺乳动物中产生治疗反应的本发明的抗体或其抗原结合片段的量。所述治疗有效量易于由本领域一般技术人员确定。[0114]术语“患者”和“受试者”可互换使用，包括人和非人动物受试者以及患有正式确诊的疾病的对象、患未被正式确定的疾病的对象、接受医学治疗的对象、有发展疾病风险的对象等。[0115]术语“治疗”包括治疗性治疗、预防性治疗及在降低受试者发展疾病的风险或其它风险因素中的应用。治疗不需要完全治愈疾病，而是包括在其中减轻症状或减轻潜在风险因素的实施方案。[0116]术语“预防”不需要100%消除事件的可能性。更准确地说，它表示在所述抗体或方法存在下事件发生的可能性得到降低。[0117]可将标准技术用于重组dna、寡核苷酸合成和组织培养及转化(例如电穿孔、脂质转染)。可按照厂商说明书来实施酶学反应及纯化技术，或根据本领域通用的方法来完成或如本文所述进行。通常可按照本领域众所周知的常规方法，以及阐述于在本说明书中各处引用并讨论的各种一般性及更特定的参考文献，来实施前述技术和方法。参见例如sambrook等，molecularcloning:alaboratorymanual(第2版，coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.(1989))，其为任何目的在此引作参考。除非提供明确定义，否则所使用的与本文所述的分析化学、合成有机化学及医药和制药化学相关的术语及实验方法和技术为本领域众所周知并在本领域常常使用。可将标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制及递送和治疗患者。[0118]二、抗体及其制备方法本公开内容提供了能够结合sars-cov-2并中和其活性的有效抗体或其抗原结合片段(以下统称为“抗体”)，所述抗体不产生ade效应。本发明至少部分地基于sars-cov-2rbd与其人受体血管紧张素转化酶-2(ace2)的结合是病毒进入靶细胞的关键起始步骤的理解，用抗体阻断该相互作用可能是用于治疗和预防sars-cov-2感染的有前景的方法。本发明人还鉴定了增强与中和活性和sars-cov-2s蛋白结构域的抗体表位之间的关系。本发明人出人意料地发现了能够中和sars-cov-2而无ade效应的一系列抗体，并特别发现了能够交叉中和sars-cov-2和sars-cov-1而无ade效应的一系列抗体。本发明人还发现一系列sars-cov-2突变株显示对本发明的某些抗体保持敏感性。[0119]在一些实施方案中，本文所述的抗体以小于10μg/ml的50%抑制浓度(ic50)值体外中和sars-cov-2。在一些实施方案中，本文所述的抗体以小于0.1μg/ml的50%抑制浓度(ic50)值体外中和sars-cov-2。在一些实施方案中，本文所述的抗体以小于50ng/ml的50%抑制浓度(ic50)值体外中和sars-cov-2。在一些实施方案中，本文所述的抗体以小于25ng/ml的50%抑制浓度(ic50)值体外中和sars-cov-2。在一些实施方案中，本文所述的抗体以约1-20ng/ml的50%抑制浓度(ic50)值体外中和sars-cov-2。如实施例中基于细胞的体外中和测定所述，通过萤光素酶活性测量本文所述的抗体的ic50值。[0120]在一些实施方案中，本文所述的抗体以小于10μg/ml的50%抑制浓度(ic50)值体外中和sars-cov-1。在一些实施方案中，本文所述的抗体以小于0.1μg/ml的50%抑制浓度(ic50)值体外中和sars-cov-1。在一些实施方案中，本文所述的抗体以小于50ng/ml的50%抑制浓度(ic50)值体外中和sars-cov-1。在一些实施方案中，本文所述的抗体以小于25ng/ml的50%抑制浓度(ic50)值体外中和sars-cov-1。在一些实施方案中，本文所述的抗体以小于10ng/ml的50%抑制浓度(ic50)值体外中和sars-cov-1。在一些实施方案中，本文所述的抗体以小于6ng/ml的50%抑制浓度(ic50)值体外中和sars-cov-1。在一些实施方案中，本文所述的抗体以约1-6ng/ml的50%抑制浓度(ic50)值体外中和sars-cov-1。如实施例中基于细胞的体外中和测定所述，通过萤光素酶活性测量本文所述的抗体的ic50值。[0121]在一些实施方案中，本文所述的抗体没有产生ade效应，如实施例中基于细胞的体外增强测定所述，通过ade曲线下面积(auc)和增强功效所测量。[0122]本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明涉及结合sars-cov-2s蛋白的分离的抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，本发明涉及结合s-ecd的分离的抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，本发明涉及结合s1结构域的分离的抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，本发明涉及结合s2结构域的分离的抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，本发明涉及结合rbd的分离的抗体或其抗原结合片段。[0123]在一个方面，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：a)选自以下的一个或多个重链互补决定区(cdrh)：(i)选自以下氨基酸序列的cdrh1：seqidno:1-28；(ii)选自以下氨基酸序列的cdrh2：seqidno:29-56；(iii)选自以下氨基酸序列的cdrh3：seqidno:57-84；和(iv)在一处或多处含有不超过2个氨基酸的取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的cdrh；b)选自以下的一个或多个轻链互补决定区(cdrl)：(i)选自以下氨基酸序列的cdrl1：seqidno:113-140；(ii)选自以下氨基酸序列的cdrl2：seqidno:141-168；(iii)选自以下氨基酸的序列的cdrl3：seqidno:169-196；和(iv)在一处或多处含有不超过2个氨基酸的取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的cdrl；或c)一个或多个a)的cdrh和一个或多个b)的cdrl，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2而无ade效应。[0124]在某些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含至少一个a)的cdrh和至少一个b)的cdrl。在某些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含至少两个a)的cdrh和至少两个b)的cdrl。在某些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含所述cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3。[0125]在一个方面，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：a)一个或多个选自以下氨基酸序列的重链可变区(vh)：seqidno:85-112，或与seqidno:85-112中任一序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列；和/或b)一个或多个选自以下氨基酸序列的轻链可变区(vl)：seqidno:197-224，或与seqidno:197-224中任一序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2而无ade效应。[0126]在某些实施方案中，所述重链可变区(vh)的氨基酸序列与seqidno:85-112中任一序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。在某些实施方案中，所述轻链可变区(vl)的氨基酸序列与seqidno:197-224中任一序列具有85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。[0127]在一个实施方案中，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：a)选自以下的一个或多个cdrh：(i)选自seqidno:7、8、11-21、24-28的氨基酸序列的cdrh1；(ii)选自seqidno:35、36、39-49、52-56的氨基酸序列的cdrh2；(iii)选自seqidno:63、64、67-77、80-84的氨基酸序列的cdrh3；和(iv)在一处或多处含有不超过2个氨基酸的取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的cdrh；b)选自以下的一个或多个cdrl：(i)选自seqidno:119、120、123-133、136-140的氨基酸序列的cdrl1；(ii)选自seqidno:147、148、151-161、164-168的氨基酸序列的cdrl2；(iii)选自seqidno:175、176、179-189、192-196的氨基酸序列的cdrl3；和(iv)在一处或多处含有不超过2个氨基酸的取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的cdrl；或c)一个或多个a)的cdrh和一个或多个b)的cdrl，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合s蛋白的rbd结构域，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2而无ade效应。[0128]在另一个实施方案中，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：a)一个或多个选自以下氨基酸序列的重链可变区(vh)：seqidno:91、92、95-105、108-112，或与seqidno:91、92、95-105、108-112中任一序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列；和/或b)一个或多个选自以下氨基酸序列的轻链可变区(vl)：seqidno:203、204、207-217、220-224，或与seqidno:203、204、207-217、220-224中任一序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合s蛋白的rbd结构域，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2而无ade效应。[0129]在某些实施方案中，所述重链可变区(vh)的氨基酸序列与seqidno:91、92、95-105、108-112中任一序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。在某些实施方案中，所述轻链可变区(vl)的氨基酸序列与seqidno:203、204、207-217、220-224中任一序列具有85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。[0130]在一个实施方案中，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：a)选自以下的一个或多个cdrh：(i)选自seqidno:1-6、22、23的氨基酸序列的cdrh1；(ii)选自seqidno:29-34、50、51的氨基酸序列的cdrh2；(iii)选自seqidno:57-62、78、79的氨基酸序列的cdrh3；和(iv)在一处或多处含有不超过2个氨基酸的取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的cdrh；b)选自以下的一个或多个cdrl：(i)选自seqidno:113-118、134、135的氨基酸序列的cdrl1；(ii)选自seqidno:141-146、162、163的氨基酸序列的cdrl2；(iii)选自seqidno:169-174、190、191的氨基酸序列的cdrl3；和(iv)在一处或多处含有不超过2个氨基酸的取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的cdrl；或c)一个或多个a)的cdrh和一个或多个b)的cdrl，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合s蛋白的s1但非rbd结构域，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2而无ade效应。[0131]在另一个实施方案中，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：a)一个或多个选自以下氨基酸序列的重链可变区(vh)：seqidno:85-90、106、107，或与seqidno:85-90、106、107中任一序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列；和/或b)一个或多个选自以下氨基酸序列的轻链可变区(vl)：seqidno:197-202、218、219，或与seqidno:197-202、218、219中任一序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合s蛋白的s1但非rbd结构域，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2而无ade效应。[0132]在某些实施方案中，所述重链可变区(vh)的氨基酸序列与seqidno:85-90、106、107中任一序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。在某些实施方案中，所述轻链可变区(vl)的氨基酸序列与seqidno:197-202、218、219中任一序列具有85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。[0133]在一个实施方案中，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：a)选自以下的一个或多个cdrh：(i)选自seqidno:9、10的氨基酸序列的cdrh1；(ii)选自seqidno:37、38的氨基酸序列的cdrh2；(iii)选自seqidno:65、66的氨基酸序列的cdrh3；和(iv)在一处或多处含有不超过2个氨基酸的取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的cdrh；b)选自以下的一个或多个cdrl：(i)选自seqidno:121、122的氨基酸序列的cdrl1；(ii)选自seqidno:149、150的氨基酸序列的cdrl2；(iii)选自seqidno:177、178的氨基酸序列的cdrl3；和(iv)在一处或多处含有不超过2个氨基酸的取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的cdrl；或c)一个或多个a)的cdrh和一个或多个b)的cdrl，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合s蛋白的s2结构域，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2而无ade效应。[0134]在另一个实施方案中，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：a)一个或多个选自以下氨基酸序列的重链可变区(vh)：seqidno:93、94，或与seqidno:93、94中任一序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列；和/或b)一个或多个选自以下氨基酸序列的轻链可变区(vl)：seqidno:205、206，或与seqidno:205、206中任一序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合s蛋白的s2结构域，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2而无ade效应。[0135]在某些实施方案中，所述重链可变区(vh)的氨基酸序列与seqidno:93、94中任一序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。在某些实施方案中，所述轻链可变区(vl)的氨基酸序列与seqidno:205、206中任一序列具有85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。[0136]在一个方面，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体选自以下表2中所示的抗体：表2：抗体及相应的cdr氨基酸序列抗体名称cdrh1seqidnocdrh2seqidnocdrh3seqidnocdrl1seqidnocdrl2seqidnocdrl3seqidnoꢀ12957113141169xg02823058114142170xg03033159115143171ꢀ43260116144172ꢀ53361117145173xg03563462118146174ꢀ73563119147175xg01183664120148176xg01293765121149177ꢀ103866122150178xg017113967123151179ꢀ124068124152180ꢀ134169125153181xg036144270126154182xg025154371127155183ꢀ164472128156184xg041174573129157185xg010184674130158186ꢀ194775131159187xg008204876132160188ꢀ214977133161189ꢀ225078134162190xg027235179135163191ꢀ245280136164192xg022255381137165193xg038265482138166194xg014275583139167195ꢀ285684140168196其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2而无ade效应。[0137]本领域技术人员将理解，本发明的分离的抗体或其抗原结合片段还包括在一处或多处含有不超过2个氨基酸的取代、缺失或插入的表2中所示的相应cdr序列。[0138]在一个方面，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体选自以下表3中所示的抗体：表3：抗体及相应的vh和vl氨基酸序列抗体名称vhseqidnovlseqidnoꢀ85197xg02886198xg03087199ꢀ88200ꢀ89201xg03590202ꢀ91203xg01192204xg01293205ꢀ94206xg01795207ꢀ96208ꢀ97209xg03698210xg02599211ꢀ100212xg041101213xg010102214ꢀ103215xg008104216ꢀ105217ꢀ106218xg027107219ꢀ108220xg022109221xg038110222xg014111223ꢀ112224其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2而无ade效应。[0139]在某些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：具有与表3中所示的氨基酸序列至少80%序列同一性的重链可变区(vh)；和/或具有与表3中所示的氨基酸序列至少80%序列同一性的轻链可变区(vl)。在某些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：具有与表3中所示的氨基酸序列至少90%序列同一性的重链可变区(vh)；和/或具有与表3中所示的氨基酸序列至少90%序列同一性的轻链可变区(vl)。[0140]在一个方面，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体选自以下表4中所示的抗体：表4：抗体及相应的cdr氨基酸序列抗体名称cdrh1seqidnocdrh2seqidnocdrh3seqidnocdrl1seqidnocdrl2seqidnocdrl3seqidnoꢀ73563119147175xg01183664120148176xg017113967123151179ꢀ124068124152180ꢀ134169125153181xg036144270126154182xg025154371127155183ꢀ164472128156184xg041174573129157185xg010184674130158186ꢀ194775131159187xg008204876132160188ꢀ214977133161189ꢀ245280136164192xg022255381137165193xg038265482138166194xg014275583139167195ꢀ285684140168196其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合s蛋白的rbd结构域，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2而无ade效应。[0141]在一个方面，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体选自以下表5中所示的抗体：表5：抗体及相应的vh和vl氨基酸序列抗体名称vhseqidnovlseqidnoꢀ91203xg01192204xg01795207ꢀ96208ꢀ97209xg03698210xg02599211ꢀ100212xg041101213xg010102214ꢀ103215xg008104216ꢀ105217ꢀ108220xg022109221xg038110222xg014111223ꢀ112224其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合s蛋白的rbd结构域，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2而无ade效应。[0142]在一个方面，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体选自以下表6中所示的抗体：表6：抗体及相应的cdr氨基酸序列抗体名称cdrh1seqidnocdrh2seqidnocdrh3seqidnocdrl1seqidnocdrl2seqidnocdrl3seqidnoꢀ12957113141169xg02823058114142170xg03033159115143171ꢀ43260116144172ꢀ53361117145173xg03563462118146174ꢀ225078134162190xg027235179135163191其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合s蛋白的s1但非rbd结构域，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2而无ade效应。[0143]在一个方面，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体选自以下表7中所示的抗体：表7：抗体及相应的vh和vl氨基酸序列抗体名称vhseqidnovlseqidnoꢀ85197xg02886198xg03087199ꢀ88200ꢀ89201xg03590202ꢀ106218xg027107219其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合s蛋白的s1但非rbd结构域，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2而无ade效应。[0144]在一个方面，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体选自以下表8中所示的抗体：表8：抗体及相应的cdr氨基酸序列抗体名称cdrh1seqidnocdrh2seqidnocdrh3seqidnocdrl1seqidnocdrl2seqidnocdrl3seqidnoxg01293765121149177ꢀ103866122150178其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合s蛋白的s2结构域，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2而无ade效应。[0145]在一个方面，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体选自以下表9中所示的抗体：表9：抗体及相应的vh和vl氨基酸序列抗体名称vhseqidnovlseqidnoxg01293205ꢀ94206其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合s蛋白的s2结构域，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2而无ade效应。[0146]在一个方面，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体选自以下表10中所示的抗体：表10：抗体及相应的cdr氨基酸序列抗体名称cdrh1seqidnocdrh2seqidnocdrh3seqidnocdrl1seqidnocdrl2seqidnocdrl3seqidnoxg038265482138166194xg014275583139167195ꢀ285684140168196其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2及其单氨基酸突变株而无ade效应。[0147]在一个实施方案中，所述sars-cov-2的单氨基酸突变株包括rbd中的v341i、f342l、v367f、r408i、a435s、g476s和v483a突变。在一个优选的实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段为包含seqidno:27的cdrh1、seqidno:55的cdrh2、seqidno:83的cdrh3、seqidno:139的cdrl1、seqidno:167的cdrl2、seqidno:195的cdrl3的抗体或其抗原结合片段。在另一个优选的实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段为包含seqidno:28的cdrh1、seqidno:56的cdrh2、seqidno:84的cdrh3、seqidno:140的cdrl1、seqidno:168的cdrl2、seqidno:196的cdrl3的抗体或其抗原结合片段。[0148]在一个方面，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体选自以下表11中所示的抗体：表11：抗体及相应的vh和vl氨基酸序列抗体名称vhseqidnovlseqidnoxg038110222xg014111223ꢀ112224其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效中和sars-cov-2及其单氨基酸突变株而无ade效应。[0149]在一个实施方案中，所述sars-cov-2的单氨基酸突变株包括rbd中的v341i、f342l、v367f、r408i、a435s、g476s和v483a突变。在一个优选的实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段为包含seqidno:111的vh和seqidno:223的vl的抗体或其抗原结合片段。在另一个优选的实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合片段为包含seqidno:112的vh和seqidno:224的vl的抗体或其抗原结合片段。[0150]在一个方面，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段选自：包含seqidno:27的cdrh1、seqidno:55的cdrh2、seqidno:83的cdrh3、seqidno:139的cdrl1、seqidno:167的cdrl2、seqidno:195的cdrl3的抗体或其抗原结合片段，以及包含seqidno:28的cdrh1、seqidno:56的cdrh2、seqidno:84的cdrh3、seqidno:140的cdrl1、seqidno:168的cdrl2、seqidno:196的cdrl3的抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效交叉中和sars-cov-2和sars-cov-1而无ade效应。[0151]在一个方面，本发明涉及针对sars-cov-2的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段选自：包含seqidno:111的vh和seqidno:223的vl的抗体或其抗原结合片段，以及包含seqidno:112的vh和seqidno:224的vl的抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够有效交叉中和sars-cov-2和sars-cov-1而无ade效应。[0152]本发明的抗体识别的表位如下：抗体名称识别的表位位置xg028s1但非rbdxg030s1但非rbdxg035s1但非rbdxg011rbdxg012s2xg017rbdxg036rbdxg025rbdxg041rbdxg010rbdxg008rbdxg027s1但非rbdxg022rbdxg038rbdxg014rbd本发明的抗体的序列表信息如下：包含上文所述的vh或vl氨基酸序列的本发明抗体的变体在本发明的范围之内。例如，变体可在vh和/或vl中包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个不会对抗体特性产生不利影响的immunol28:489-499,1991)、特异性决定残基表面重塑（美国专利公布号20100261620）、人改型（或人框架改型）（美国专利公布号us2009/0118127）、超人源化（美国专利号7,709,226）和定向选择（osbournetal(2005)methods36:61-68,2005；美国专利号5,565,332）。[0157]可采用诸如国际专利公布号wo90/007861和国际专利公布号wo92/22653中所述的那些公开的技术，通过引入修改的框架支持残基来保持结合亲和力（回复突变），来进一步优化人源化抗体以改善其对所需抗原的选择性或亲和力。[0158]可使用基因组中携带人免疫球蛋白(ig)基因座的转基因小鼠来产生抗目标蛋白质的人抗体，这描述于例如国际专利公布号wo90/04036、美国专利号6150584、国际专利公布号wo99/45962、国际专利公布号wo02/066630、国际专利公布号wo02/43478；lonbergetal(1994)nature368:856-9；greenetal(1994)naturegenet.7:13-21；green&jakobovits(1998)exp.med.188:483-95；lonbergandhuszar(1995)int.rev.immunol.13:65-93；bruggemannetal(1991)eur.j.immunol.21:1323-ꢀ1326；fishwildetal(1996)nat.biotechnol.14:845-851；mendezetal(1997)nat.genet.15:146-156；green(1999)j.immunol.methods231:11-23；yangetal(1999)cancerres.59:1236-1243；brüggemannandtaussig(1997)curr.opin.biotechnol.8:455-458；国际专利公布号wo02/043478）。可破坏此类鼠中的内源性免疫球蛋白基因座或使该基因座缺失，并且可使用转染色体或微小基因，通过同源或非同源重组将至少一种完整或部分的人免疫球蛋白基因座插入小鼠基因组中。[0159]人抗体可选自噬菌体展示文库，其中噬菌体经工程改造以表达人免疫球蛋白或其部分，诸如fab、单链抗体(scfv)或者未配对或配对抗体可变区（knappiketal(2000)j.mol.biol.296:57-86；krebsetal(2001)j.immunol.meth.254:67-84；vaughanetal(1996)naturebiotechnology14:309-314；sheetsetal(1998)pitas(usa)95:6157-6162；hoogenboomandwinter,(1991)j.mol.biol.227:381；marksetal(1991)j.mol.biol.222:581）。本发明的抗体可分离自例如噬菌体展示文库，所述噬菌体展示文库将抗体的重链可变区和轻链可变区表达为具有噬菌体pix外壳蛋白的融合蛋白，如shietal(2010)j.mol.biol.397:385-96和国际专利公布no.wo09/085462中所述。可筛选文库中结合至s蛋白的噬菌体，并可进一步表征获得的阳性克隆，从克隆裂解物分离fab，将其表达为全长igg。此类用于分离人抗体的噬菌体展示方法描述于例如：授予ladner等人的美国专利号5,223,409、5,403,484和5,571,698；授予dower等人的美国专利号5,427,908和5,580,717；授予mccafferty等人的美国专利号5,969,108和6,172,197；以及授予griffiths等人的美国专利号5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915和6,593,081。[0160]免疫原性抗原的制备以及单克隆抗体的产生可用任何合适的技术诸如重组蛋白产生来执行。免疫原性抗原可按纯化蛋白质或蛋白质混合物（包括全细胞、细胞提取物或组织提取物）的形式施用于动物，或者抗原可在动物体内由编码所述抗原或其部分的核酸从头形成。[0161]本发明的另一个实施方案是一种分离的多核苷酸，其编码本发明的任一个抗体重链可变区和/或抗体轻链可变区。鉴于在给定表达系统中的遗传密码简并性或密码子优先性而编码本发明的同一抗体的多种多核苷酸也在本发明的范围内。编码本发明抗体的vh或vl或它们的片段的多核苷酸序列可有效连接至一个或多个调控元件，诸如启动子或增强子，所述调控元件允许核苷酸序列在预期宿主细胞中表达。多核苷酸可为cdna。[0162]本发明的另一个实施方案是一种包含本发明的多核苷酸的载体。此类载体可以是质粒载体、病毒载体、用于杆状病毒表达的载体、基于转座子的载体或任何其他适于通过任何手段将本发明的合成多核苷酸引入给定生物体或遗传背景的载体。例如，将任选地连接至恒定区并且编码本发明抗体的轻链可变区和/或重链可变区的多核苷酸插入表达载体中。可将轻链和/或重链克隆到相同或不同的表达载体中。可将编码免疫球蛋白链的dna片段有效连接至一个或多个表达载体中确保免疫球蛋白多肽表达的对照序列。此类对照序列包括信号序列、启动子（例如，天然相关联的或异源的启动子）、增强子元件和转录终止子序列，对此类对照序列进行选择，以使其与选择用于表达抗体的宿主细胞相容。一旦载体被结合到适当的宿主中，该载体将宿主保持在适于高水平表达蛋白质的条件下，所述蛋白质由结合的多核苷酸编码。[0163]合适的表达载体通常可以在宿主生物体中作为游离基因或宿主染色体dna的一部分进行复制。通常，表达载体包含选择标记，诸如氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性、卡那霉素抗性或新霉素抗性，以便对那些转化了所需dna序列的细胞进行检测。[0164]合适的启动子和增强子元件是本领域已知的。对于在细菌细胞中的表达，示例性启动子包括lacl、lacz、t3、t7、gpt、λp和trc。对于真核细胞中的表达，示例性启动子包括轻链和/或重链免疫球蛋白基因启动子和增强子元件；细胞巨化病毒极早期启动子；单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；早期和晚期sv40启动子；存在于逆转录酶病毒长末端重复序列中的启动子；小鼠金属硫蛋白-i启动子；以及各种本领域已知的组织特异性启动子。对于酵母细胞中的表达，示例性启动子是组成型启动子，诸如adh1启动子、pgk1启动子、eno启动子、pyk1启动子等等；或调控型启动子，诸如gal1启动子、gal10启动子、adh2启动子、ph05启动子、cup1启动子、gal7启动子、met25启动子、met3启动子、cyc1启动子、his3启动子、adh1启动子、pgk启动子、gapdh启动子、adc1启动子、trp1启动子、ura3启动子、leu2启动子、eno启动子、tp1启动子和aox1（例如，用于毕赤酵母(pichia)）。对合适的载体和启动子的选择在本领域普通技术人员的能力范围内。[0165]大量合适的载体和启动子都是本领域的技术人员已知的；许多可商购获得用于生成受试者重组构建体。以下载体以举例的方式提供。细菌载体：pbs、phagescript、psix174、pbluescriptsk、pbsks、pnh8a、pnh16a、pnh18a、pnh46a(stratagene,lajolla,calif.,usa)；ptrc99a、pkk223-3、pkk233-3、pdr540和prit5(pharmacia,uppsala,sweden)。真核载体：pwlneo、psv2cat、pog44、pxr1、psg(stratagene)，psvk3、pbpv、pmsg和psvl(pharmacia)。[0166]本发明的另一个实施方案是一种包含一个或多个本发明的载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”是指其中已引入载体的细胞。应当理解，术语“宿主细胞”不仅旨在指特定的受试细胞，还指这种细胞的子代，而且也指由特定受试细胞产生的稳定细胞系。由于突变或者由于环境影响，在后代中可能出现某些修饰，因此这种子代可能与亲本细胞不同，但仍包含在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。此类宿主细胞可以是真核细胞、原核细胞、植物细胞或古菌细胞。[0167]大肠杆菌(escherichiacoli)、杆菌属(bacilli)（诸如枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)）和其他肠杆菌科(enterobacteriaceae)（诸如沙门氏菌(salmonella)、沙雷氏菌(serratia)）以及各种假单胞菌属(pseudomonas)物种是原核宿主细胞的示例。其他微生物诸如酵母也可用于表达。酵母属(saccharomyces)（例如，酿酒酵母(s.cerevisiae)）和毕赤酵母属(pichia)是合适的酵母宿主细胞的示例。示例性的真核细胞可以来自哺乳动物、昆虫、鸟类或其他动物来源。哺乳动物真核细胞包括无限增殖化细胞系，诸如杂交瘤或骨髓瘤细胞系，诸如sp2/0（美国典型培养物保藏中心(atcc)，manassas,va,crl-1581）、ns0（欧洲细胞培养物保藏中心(ecacc)，salisbury,wiltshire,uk，ecaccno.85110503）、fo(atcccrl-1646)和ag653(atcccrl-1580)鼠细胞系。一种示例性人骨髓瘤细胞系是u266(attccrl-tib-196)。其他可用的细胞系包括来源于中国仓鼠卵巢(cho)细胞的那些细胞系，诸如cho-k1sv(lonzabiologics,walkersville,md)、cho-k1(atcccrl-61)或dg44。[0168]本发明的另一个实施方案是一种制备本发明的抗体的方法，该方法包括在使该抗体表达的条件下培养本发明的宿主细胞，然后回收由该宿主细胞产生的抗体。制备抗体并将其纯化的方法是本领域所熟知的。全部抗体、其二聚体、各条轻链和/或重链、或者其他抗体片段（诸如vh和/或vl）一旦被合成（以化学方式或重组方式），就可根据标准程序进行纯化，所述标准程序包括硫酸铵沉淀、亲和色谱柱、柱层析法、高效液相色谱(hplc)纯化、凝胶电泳等等（参见generallyscopes,proteinpurification(springer-ꢀverlag,n.y.,(1982)）。抗体可以基本上是纯净的，例如，至少约80%至85%纯净、至少约85%至90%纯净、至少约90%至95%纯净、或至少约98%至99%纯净，或者更加纯净，例如不含污染物（诸如细胞碎片、除受试抗体之外的大分子等）。[0169]本发明的另一个实施方案是一种用于制备本发明的抗体的方法，该方法包括：将编码抗体vh的第一多核苷酸和编码抗体vl的第二多核苷酸结合到表达载体中；用该表达载体转化宿主细胞；在使vl和vh表达以及形成所述抗体的条件下，在培养基中培养宿主细胞；然后从宿主细胞或培养基回收抗体。[0170]使用标准分子生物方法将编码本发明的特定vh或vi序列的多核苷酸结合到载体中。使用熟知的方法完成宿主细胞转化、培养、抗体表达和纯化。[0171]三、组合物和给药方法本发明提供了药物组合物，这些药物组合物包含本文所述的抗体，以及药学上可接受的载剂。出于治疗用途，本发明的抗体可被制备成药物组合物，这些药物组合物包含有效量的抗体，作为药学上可接受的载体中的活性成分。术语“载剂”是指据以施用所述活性化合物的稀释剂、辅助剂、赋形剂或媒介物。此类媒介物可以是液体，诸如水和油，包括那些来源于石油、动物、植物的油或合成的油，诸如花生油、大豆油、矿物油和芝麻油等。例如，可使用0.4%的盐水和0.3%的甘氨酸。这些溶液是无菌的，并且通常不含颗粒物。它们可通过熟知的常规灭菌技术（例如，过滤）进行灭菌。所述组合物可根据需要含有药学上可接受的辅助物质，以接近生理条件，所述辅助物质诸如ph调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。此类药物制剂中的本发明抗体的浓度可在很大范围内变化，即，从小于约0.5重量%，通常到至少约1重量%至多达15重量%、20重量%、25重量%、30重量%、35重量%、40重量%、45重量%或50重量%，并且将根据所选择的具体施用方式，主要基于所需的剂量、流体体积、粘度等进行选择。合适的媒介物及制剂（包含其他人蛋白例如人血清白蛋白在内）描述于例如remington:thescienceandpracticeofpharmacy，第21版，troy，d.b.编辑，lipincottwilliamsandwilkins,philadelphia,pa2006，第5部分，pharmaceuticalmanufacturing，第691-1092页，特别参见第958-989页。[0172]本文所述的本发明方法中的施用本发明的抗体的方式可为任何合适的途径，诸如胃肠外施用，例如真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下、肺、粘膜（口腔、鼻内、阴道内、直肠）或技术人员了解的其他方式，这是本领域众所周知的。[0173]本文所述的本发明方法中的抗体可通过任何合适的途径施用至患者，例如通过静脉内(i.v.)输注或推注进行肠胃外施用，肌肉内施用、皮下施用或腹膜内施用。可在例如15、30、60、90、120、180或240分钟内，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时内给予静脉内输注。[0174]在一个实施方案中，本文所述的本发明方法中将治疗有效量的本发明的抗体施用于受试者。抗体的“治疗有效量”可通过标准研究技术确定。例如，可采用体外测定法来帮助鉴定最佳剂量范围。任选地，本发明抗体的治疗有效量可通过将抗体施用至本领域熟知的相关动物模型来确定。对具体的有效剂量的选择可由本领域的技术人员基于对若干种因素的考量（例如，经由临床试验）来确定。此类因素包括待治疗或预防的疾病、所涉及的症状、患者体重、患者免疫状态以及技术人员已知的其他因素。在制剂中待使用的精确剂量也将取决于给药途径以及疾病的严重程度，并且应该根据医生的判断和每位患者的情况来决定。有效剂量可通过来自体外或动物模型测试体系的剂量响应曲线来推导。可以使用本文所述模型中的任何一个来测试本发明抗体的功效和有效剂量。[0175]本发明的方法中的抗体可在一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、一个月、五周、六周、七周、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或更长时间之后重复施用。也可以重复治疗疗程，按照慢性施用一样。重复施用可为相同剂量或不同剂量。[0176]本发明的方法中的抗体也可被预防性地施用，以降低受试者感染sars-cov-2/sars-cov-1的风险，延迟sars-cov-2/sars-cov-1感染的发作，和/或降低处于缓解状态的sars-cov-2/sars-cov-1感染复发的风险。[0177]本文所述的本发明方法中的抗体可冻干储存，并在使用之前在合适的载体中复原。此项技术已被证实对常规的蛋白制剂有效，并且可采用熟知的冻干和复原技术。[0178]现结合以下具体的非限制性实施例描述本发明，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。[0179]材料与方法人受试者根据舟山医院研究伦理委员会批准的方案(2020-003)，在舟山医院进行志愿者招募和血液收集。根据机构伦理委员会批准的方案(2020-c007)在复旦大学基础医学院进行涉及所有人样品的实验。研究参与者，16名感染已通过pcr证实的恢复期供体，和8名未暴露的未感染供体。所有供体年龄范围为7-67岁，平均值为37岁，和女性:男性比率为14:10(图2)。[0180]细胞系人胚肾293t(hek293t)细胞、人肝细胞瘤huh-7细胞和非洲绿猴肾vero-e6细胞(xia等人,2020a)在补充有10%热灭活的胎牛血清(fbs)、100u/ml青霉素和100mg/ml链霉素的dulbecco氏改良的eagle培养基(dmem)中维持。raji细胞(人伯基特淋巴瘤b成淋巴细胞)(jaume等人,2011)在补充有10�s、100u/ml青霉素和100mg/ml链霉素的rpmi1640中维持。所有细胞系在37℃下在5%co2中培养。人胚肾hek293f悬浮细胞使用hek293无血清opm-293-cd05培养基(opmbiosciences)在37℃下在5%co2中培养，同时以100rpm摇动。[0181]病毒本研究中使用的sars-cov-2真病毒ncov-sh01(genbank:mt121215.1)在复旦大学上海医学院的生物安全水平3(bsl-3)实验室从感染的患者中分离(wu,y.等人,2020a)。sars-cov-2病毒在vero-e6细胞中繁殖。将浓缩的病毒贮液分装后储存在液氮中。一个等份的细胞系传代的sars-cov-2真病毒，最初来自患者血清并在-80℃下储存，经融化用于体外细胞感染实验。[0182]细菌大肠杆菌trans5α(transgenbiotech)在37℃下培养，同时以230rpm摇动。[0183]收集人样品在浙江省舟山医院从sars-cov-2患者收集外周血样品。血清样品在56℃下热灭活60分钟，通过离心凝固的全血分离，并分装储存于-80℃。在从供体#16抽取400ml血液后，人外周血单核细胞(pbmc)使用带有玻璃料屏障的细胞分离管分离。将分离的pbmc重悬于补充有10%二甲基亚砜(dmso)的90%热灭活fbs中并在液氮中冷冻保存。[0184]抗体所有克隆的人单克隆抗体和它们的grlr形式通过瞬时转染哺乳动物hek293f细胞制备，如之前报道的(wang,q.等人,2020)。[0185]elisa测量血清样品或来自血清样品的纯化的igg抗体部分或针对sars-cov-2蛋白(包括s-ecd-、rbd-、s1-、s2-和n-蛋白)的重组igg抗体(见关键资源表的细节)的elisa结合，如之前报道的(wang,q.等人,2020)。简言之，elisa板首先用在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中的10μg/ml的抗原在4℃下包被过夜，然后用在pbs中的2%牛血清白蛋白(bsa)封闭。血清或第一抗体按1:3在pbs中连续稀释(最大浓度，对于血清样本为1:10，对于单克隆抗体样本为10μg/ml)，总共8个稀释度，并加入以在室温下孵育1小时。用hrp缀合的山羊抗-人igg(thermofisherscientific)或hrp缀合的小鼠抗-人iggfab(genscript)可视化。通过使用prism软件分析对于各抗体计算曲线下面积(auc)以评价抗原-结合能力。[0186]竞争性elisa竞争性elisa如之前所述进行(wang,q.等人,2020)。简言之，板用2μg/mlsars-cov-2rbd或2μg/mlsars-cov-2s-ecd包被并用15μg/ml第一阻断抗体孵育2小时。在室温下直接加入生物素化第二抗体(0.25μg/ml)，持续30分钟。用链霉亲和素-hrp(bdbiosciences)进行检测。pbs缓冲液代替第一阻断抗体用作标准化参考，而抗-hbs抗体h004(wang,q.等人,2020)，其不能阻断第二抗体的结合，用作阴性对照。[0187]制备sars-cov-2和sars-cov-1假型病毒如之前所报道的，产生假型病毒(xia等人,2020a)。简言之，使用转染试剂vigofect(vigorousbiotechnology,beijing)将质粒pnl4-3.luc.re(表达萤光素酶报告子的cttctcctgctagaat，seqidno:226)、sars-cov-2-n-r(5’-cagacattttgctctcaagctg，seqidno:227)和sars-cov-2-n-探针(5’-fam-ttgctgctgcttgacagatt-tamra-3’，seqidno:228)。将通过sars-cov-2-n-f和sars-cov-2-n-r引物的pcr扩增子插入puc57质粒中用于标准曲线产生。定量反转录pcr的程序使用mastercyclereprealplexreal-timepcrsystem(eppendorf)如下进行：95℃5分钟；95℃10秒、50℃30秒、72℃30秒的40个循环。[0193]检测抗体依赖性病毒进入的体外测定如之前所报道的(jaume等人,2011)，使用raji细胞进行体外sars-cov-2假病毒ade测定。简言之，将3×104个raji细胞接种到用0.01%聚l-赖氨酸/pbs包被的96孔板的每个孔中，并培养24小时。将抗体按1:2(最大浓度，100μg/ml)在rpmi1640中连续稀释，总共9个稀释度，并与sars-cov-2假病毒孵育30分钟。将混合物施加到raji细胞中，并培养60小时。如上所述使用萤火虫萤光素酶测定试剂盒(promega)进行萤光素酶活性的测量。将萤光素酶信号标准化至存在于同一板上的用2μg/ml的抗体xg003(参考对照)获得的信号，并表示为萤光素酶活性的倍数变化。[0194]对于阻断抗体依赖性病毒进入的实验，将不同浓度的抗-hcd32(bdpharmingen)在37℃下与raji细胞孵育30分钟。然后，将2ꢀµg/ml抗体xg005和sars-cov-2假病毒的混合物加入经处理的raji细胞。将板在37℃下孵育60小时，然后如上所述测量萤光素酶活性。[0195]蛋白产生将sars-cov-2受体-结合结构域(rbd)(氨基酸333–530)连同avi-tag标签(glndifeaqkiewhe，seqidno:229)的密码子优化的野生型cdna合成(genewiz)，并克隆到pacgp67载体中，具有c-末端8×his标签用于纯化。使用bac-to-bac杆状病毒系统表达sars-cov-2rbd。然后使用cellfectiniireagent(invitrogen)将提取的杆粒dna转染到sf9细胞中。收获低效价病毒，然后扩增以产生高效价病毒贮液。感染后72小时收获含有分泌的未糖基化的rbd的上清液，并通过ni-nta树脂(gehealthcare)捕获rbd蛋白和纯化。sds-page分析揭示超过95%纯度的纯化重组蛋白。[0196]rbd-或s-ecd-结合记忆b细胞的单细胞分选从重组杆状病毒感染的昆虫sf9细胞表达和纯化的rbd蛋白(genscript)使用ez-link™ꢀsulfo-nhs-lc-biotin试剂盒(thermofisherscientific)按照制造商的指示进行化学生物素化。在杆状病毒感染的昆虫sf9细胞中表达的avi-tag标记的rbd和在哺乳动物hek293t细胞中表达的avi-tag标记的s-ecd(kactusbiosystems)使用birabiotin-proteinligase试剂盒(avidity)生物素化。过量的未结合生物素通过使用zebaspin脱盐柱(thermofisherscientific)除去。对于各样品，诱饵蛋白-pe和诱饵蛋白-apc通过分别孵育3μg的生物素化rbd或25μg的生物素化s-ecd蛋白与链霉亲和素-pe(ebioscience)或链霉亲和素-apc(bdbiosciences)制备。[0197]b细胞的纯化、诱饵蛋白-结合b细胞的双荧光染料标记和单细胞分选实验如之前所述进行(escolano等人,2019；robbiani等人,2017；wang,q.等人,2020)。简言之，将融化并用rpmi培养基洗涤的pbmc与cd19微珠(miltenyibiotec)一起孵育，用于b淋巴细胞的阳性选择。在4℃下用人fcblock(bdbiosciences)、诱饵蛋白-pe/apc(对于rbd为10μg/ml，对于s-ecd为60μg/ml)和抗-cd20-pecy7(bdbiosciences)连续孵育，接着使用kruskal-wallis多重比较)(图17b和17c)。基于三个抗体簇中rbd组iv抗体的频率的精确分布进行fisher精确检验以评价统计学显著性(图17d)。通过spearman秩相关方法评价相关性(图16d-16f)。elisa曲线下面积(elisaauc)(图3a-3e和8a-8d)、血清中和测定的半最大中和效价(nt50)(图3f-3h)、对于抗体中和能力计算的50%抑制浓度(ic50)值(图11a、11f和13c)、ade曲线下面积(adeauc)(图15c)和增强能力值(图16c)在prism软件中计算，如之前报道的(bardina等人,2017；robbiani等人,2019；wang,q.等人,2020)。[0201]实施例1：针对sars-cov-2的血清学应答从感染sars-cov-2但已恢复的16个供体和covid-19爆发之前招募的8个健康供体(图2)收集得到血清样品。与未暴露的健康供体相比，来自感染后恢复的供体血清显示与各个sars-cov-2s-蛋白结构域(rbd、s1、s2和s-ecd)具有显著更高的elisa结合效力(图3a-3d；图1)。在感染后，病毒体内的n-蛋白也引发强健的抗体应答(图3e)。为了确定恢复期血清中的中和活性，在huh-7细胞中通过表达萤光素酶的sars-cov-1或sars-cov-2假病毒测试了它们阻断病毒感染的能力(xia等人,2020a；xia等人,2020b)。然后在不同的稀释度的血清或纯化的igg抗体下，比较萤光素酶信号(感染的代替物)(图3f-3h)。尽管5例个体(供体#5、#6、#7、#8和#16)对于血清样品达到高于2000的半-最大中和效价(nt50)(图3f)，但仅1例个体(供体#16)对于纯化的igg部分显示出更为明显的中和作用(nt50:1.1μg/ml；图3h)。这种差异可能归因于在那些恢复期个体中igm或iga抗体的中和活性。恢复期个体的血清中和活性针对sars-cov-1假病毒明显更低，然而略微高于未感染供体(图3g)。因此，通过elisa，所有16个恢复期供体针对sars-cov-2s-蛋白产生较强的抗体应答反应，而5个供体显示高水平的血清中和活性，而其中仅1例个体(供体#16)的血清igg具有极其优异的中和活性，选择供体#16用于进一步研究。[0202]为了确定s-蛋白上的哪个结构域是在该选择的最优中和者(供体#16)中的中和igg应答的主要靶标，分别使用rbd、s1、s2和s-ecd蛋白来阻断其体外中和活性。如所示的，igg中和活性可分别被rbd、s1和s-ecd结构域部分地阻断，但不被s2结构域阻断(图3i)。这些结果表明，在该供体#16中的中和抗体应答主要针对s1结构域，并且更具体地，针对该蛋白内的rbd结构域。[0203]实施例2：针对sars-cov-2s-蛋白的人单克隆抗体为了表征在该选择的个体中负责有效的中和活性的igg抗体，使用双荧光染料标记策略鉴定了sars-cov-2rbd-或s-ecd-结合b细胞(图4)(wang,q.等人,2020)。未暴露的未感染对照显示背景水平的诱饵蛋白特异性b细胞，而具有高血清中和活性的供体#16显示不同群体的诱饵蛋白-结合b细胞。avi-tag标记的生物素化rbd、化学生物素化s-ecd和avi-tag标记的生物素化s-ecd诱饵蛋白分别以0.025%、0.12%和0.21%的频率染色b细胞，其为背景染色的约6至20倍(图5a-5c)。[0204]门控双阳性细胞(诱饵蛋白-pe 和诱饵蛋白-apc )经单细胞分选，并且免疫球蛋白重链(igh；igg同种型)和轻链(igl或igk)基因通过巢式pcr反应从分选的单细胞中进行扩增(robbiani等人,2017；scheid等人,2009b；wang,q.等人,2020)。总体上，从rbd-结合和s-ecd-结合igg 记忆b细胞获得了292个配对的重链和轻链可变区(图6)。序列分析表明宽范围的免疫球蛋白v基因，并鉴定了25个产生具有密切相关的cdr3序列的由相同的ig可变基因区段编码的抗体的扩展克隆(图6)。来自相同克隆的抗体在氨基酸水平上显示80%或更高的相似性(图7)。得出结论，该sars-cov-2中和者，类似于其它报道的供体(cao等人,2020；kreer等人,2020；robbiani等人,2020)，产生表达相关的ig重链和轻链的抗原-结合记忆b细胞的克隆。[0205]实施例3：抗体表位在称为xg001至xg048的总共48种抗体中，从25个扩展克隆中选择28种和从单独克隆中选择20种，用于表达和进一步表征(图6)。48种抗体中的45种(94%)显示与sars-cov-2s-ecd蛋白的反应性(图8a)，和48种抗体中的23种(48%)显示rbd结合能力(图8b)。所有这些rbd-结合抗体显示针对s1结构域的elisa结合，如所预期的(图8b和8c)。另外的11种没有rbd-结合的抗体(23%)也结合s1结构域(图8c)，暗示其对n-末端结构域(ntd)的反应性，如之前所报道的(chi等人,2020)。还发现48种抗体中的5种(10%)结合s2结构域(图8d)。此外，48种抗体中的6种(12%)与s1/s2/rbd蛋白没有结合或仅有弱结合，但显示了s-ecd结合亲和力(图8a-8d)，暗示着这些抗体识别在单独的结构域中不存在或改变的表位。总之，从该志愿者选择的48种抗体识别sars-cov-2s-蛋白上的不同表位，并且在它们中几乎一半结合rbd(图8e)。[0206]为了进一步确定rbd-结合抗体结合重叠还是不重叠的表位，进行竞争性elisa。具有弱水平的elisa结合的抗体(xg015、xg042、xg045、xg047)被排除。首先将包被的rbd蛋白与非生物素化的第一抗体预孵育，接着与生物素化的第二抗体孵育。如所预期的，所有测试的抗体与自身竞争，而对照抗体抗-hbsh004(wang,q.等人,2020)不能阻断任何识别rbd的第二抗体。在rbd(氨基酸330-530)中，通过竞争性elisa鉴定了4个互相排斥的抗体组(组i、ii、iii和iv)。其它2种抗体，xg009和xg043，跨越各组竞争，这可能通过它们跨越所有这些表位的结构或者通过由抗体结合而导致的抗原构象改变来解释。此外，在组iii中，尽管抗体xg017和xg022分别阻断xg008和xg038的结合，但抗体xg008和xg038非竞争性结合rbd。参见图8f。这些结果表明，对于组iii抗体，存在2个互相排斥的子表位。该发现进一步通过证明识别不同表位的4种抗体的组合不能阻断第5种抗体与rbd或s-ecd蛋白的结合得到证实(图9a和9b)。此外，每个rbd组中的抗体具有不同的ighv和igkv/iglv使用(图10)。得出结论，存在至少4组，其包含在sars-cov-2的rbd上的5个不重叠的抗体结合表位。[0207]实施例4：体外sars-cov-2中和活性为了确定选择的抗体是否体外阻断sars-cov-2感染，使用表达萤光素酶的sars-cov-2假病毒感染huh-7细胞进行中和作用测定(xia等人,2020a；xia等人,2020b)并计算它们的50%抑制浓度(ic50)(图11a和11b)。这些抗体的中和活性显著改变，范围从有效的中和抗体到几乎不具备中和活性。在48种测试的抗体中，几乎一半(23种抗体，其中17种为rbd结合抗体，5种为s1但非rbd结合抗体，1种为s2结合抗体)显示低于10μg/ml的ic50值的中和活性，而其中7种(其中6种为rbd结合抗体，1种为s1但非rbd结合抗体)是最有效的，ic50值低于0.1μg/ml(图11c)。最有效的抗体显示6-15ng/ml的ic50值，其中4种是rbd-结合的，xg005(ic50:6.1ng/ml)、xg014(ic50:14.4ng/ml)、xg016(ic50:9.1ng/ml)和xg038(ic50:12.7ng/ml)，以及其中1种是s1结合的，但不是rbd-结合的，xg027(ic50:15.7ng/ml)(图11a和11b)。[0208]然后选择几个单克隆抗体(xg005、xg008、xg013、xg014、xg016、xg017)使用sars-cov-2真病毒来证实它们中和活性(图11d-11f；图12)。通过抗-n-蛋白多克隆抗体使用免疫荧光(图11d；图12)以及培养基的定量反转录pcr定量感染性(图11e)。读出的结果在这2种方法中一致，并表明这些抗体是针对sars-cov-2真病毒的有效的中和抗体，ic50值低至单数位ng/ml，例如xg014(ic50:5.1ng/ml)(图11e和11f)。与sars-cov-2假病毒相比，一些单克隆抗体，例如xg017，显示针对sars-cov-2真病毒的显著更高的中和活性，而其它单克隆抗体，包括xg005和xg016，具有降低的效应(图11a和11f)。得出结论，几种分离的单克隆抗体，例如rbd-结合抗体xg014和xg017，可有效地体外中和sars-cov-2真病毒。[0209]为了确定单克隆抗体的中和活性和它们的结合表位之间的关系，使用来自中和作用测定(它们相应的表位被标记)的9个标准化的萤光素酶值，进行无监督分层聚类(图11g)。鉴定了具有不同水平的中和活性的抗体簇。与簇d中的非中和抗体相比，簇a和b中的抗体，其大部分针对rbd组ii、iii和iv表位，是有效的中和者，而簇c中的抗体是弱中和抗体(图11g)。在测定中靶向rbd组i表位的抗体几乎不能中和(图11g)。因此，有效的中和抗体主要靶向一些，但不是全部rbd表位。[0210]实施例5：针对天然存在的sars-cov-2rbd突变株和sars-cov-1的交叉中和活性流行性sars-cov-2病毒缓慢突变，并且已经报道了几种在rbd区中仅具有1个氨基酸突变的sars-cov-2毒株，例如v341i、f342l、v367f、r408i、a435s、g476s和v483a(ou等人,2020)。为了测试可能获得这些突变中的一些以赋予抗体抗性的可能性，挑出2个最有效的单克隆抗体，xg014和xg038，用于针对几种携带这些报道的rbd突变的sars-cov-2假病毒进行中和作用测定(图13a和13b)。抗体xg014仍保持对所测试的所有sars-cov-2突变株的敏感性(图13a)，而抗体xg038对7种病毒突变株中的2种显示出降低的中和作用(g476s和v483a；图13b)。因此，rbd结构域的单个氨基酸突变可赋予sars-cov-2对人单克隆抗体的抗性。[0211]为了确定克隆的单克隆抗体针对其它冠状病毒的范围，测量了它们针对sars-cov-1假病毒的体外中和活性。xg014和xg041可体外中和sars-cov-1假病毒，ic50值分别为23.7ng/ml和1140ng/ml(图13c和13d；图14)。在测定中没有其它抗体显示针对sars-cov-1假病毒的中和活性(图13c)。因此，sars-cov-2感染可诱导人体产生罕见的交叉中和抗体，例如xg014，其能有效地中和sars-cov-1和sars-cov-2以及sars-cov-2rbd突变株。[0212]实施例6：抗体依赖性增强(ade)效应尽管抗体可通过其与宿主免疫细胞上的fcγ受体结合来清除病毒或感染的细胞，但这些相互作用也可导致在冠状病毒感染期间的疾病增强(eroshenko等人,2020；iwasaki和yang,2020)。确定各抗体的ade效应是临床使用有效的中和抗体的关键步骤。raji细胞，最初源自伯基特淋巴瘤患者，已表明在抗-s-蛋白免疫血清的存在下促进sars-cov-1感染(jaume等人,2011)。因此，使用该携带fcγrii的人b成淋巴细胞细胞系来研究sars-cov-2的抗体依赖性病毒进入，并以此作为抗体ade效应的测量指标。[0213]未检测到sars-cov-2直接感染raji细胞(数据未显示)。然后测量在单克隆抗体存在的情况下sars-cov-2假病毒的抗体依赖性进入。48种抗体中的11种(23%)显著增强raji细胞中sars-cov-2病毒的感染，而其他的抗体并没有诱导病毒在raji细胞中的感染，其中包括2种有效的中和抗体xg014和xg038(图15a；图16a)。在这11种增强抗体中，9种是rbd-结合抗体，和2种抗体结合s1但不结合rbd(图15b)。没有s2-结合抗体诱导raji细胞感染。单克隆抗体诱导不同水平的感染。例如，xg006仅在高浓度条件时增强raji细胞的病毒感染，但当稀释时失去增强效应，而xg005在测试的所有稀释度下都诱导病毒感染(图15a；图16a)。ade曲线下面积(auc)和增强功效如之前所报道的计算(bardina等人,2017；robbiani等人,2019)(图15c；图16b和16c)，并且在这2个值之间观察到正相关(图16d)。然而，在中和抗体的计算ic50值与相应的adeauc和增强功效值之间没有显著相关性(图16e和16f)。[0214]抗体依赖性病毒进入被抗体fc受体-结合位点的grlr突变(g236r和l328r)完全消除(horton等人,2008)(图15d和15e)。通过用抗-fcγrii抗体孵育细胞也实现类似效应(图15f)，进一步证实了抗体依赖性sars-cov-2病毒进入需要fc受体结合。因此，一些sars-cov-2抗-rbd和抗-s1抗体在介导ade活性方面类似于sars-cov-1和登革病毒的抗体。[0215]实施例7：抗体性质和表位的关联为了基于功能特征的组合将抗体分开，使用分别来自抗体中和效力测定和ade效应测定的9个(共18个)标准化的萤光素酶值，进行无监督分层聚类。鉴定了三个主要的抗体簇(簇x、y和z)(图17a)。簇x抗体的特征为具有病毒中和活性与ade效应。簇y抗体显示有效的中和活性，但低水平的ade效应，而来自簇z的抗体是非中和的，并且不诱导病毒进入，即无ade效应(图17a)。使用adeauc和中和ic50进一步比较证实了簇x抗体在raji细胞中诱导更多抗体依赖性病毒进入(图17b)，以及来自簇x和y的抗体是更有效的中和抗体(图17c)。[0216]为了确定在抗体性质和它们的识别抗原表位之间是否存在关联，在构造的分簇树上标记它们的表位。在簇x中，9种抗体中的8种(89%)结合rbd结构域，并且所有这8种抗体，包括xg009和xg043，识别rbd组iv表位(图17a)。该百分比明显高于其它簇(p=0.001vs.簇y；p《0.001vs.簇z)(图17a和17d)。除了簇y中的1种组iv抗体xg014之外，所有其它rbd组iv抗体都处在簇x的分支中(图17a和17d)并在raji细胞中诱导统计学显著更高水平的抗体依赖性病毒进入(图17e)。仅使用ade值进一步进行无监督分层聚类，单独此数据则足以产生与rbd表位组iv显著相关的抗体簇(图18)。因此，揭示了在5个rbd抗体结合表位中的1个(组iv)与体外检测的抗体ade效应之间的显著关联。[0217]还注意到，一些rbd表位仅与中和活性，而不是ade效应有关联。簇y中的抗体具有中和活性，但在raji细胞中不诱导或诱导低水平的病毒进入(图17a和17d)。这些抗体针对许多不同的表位，包括rbd组ii和rbd组iii抗体结合表位。在其它簇中未发现这些类型的抗体，即仅识别组ii表位或仅识别组iii表位的抗体；而是仅在簇y中发现(图17a和17d)，表明针对这些表位的抗体与中和活性紧密相关，并且不诱导增强效应。[0218]因此，得出结论，靶向2个rbd表位(组ii和组iii)的抗体能中和sars-cov-2病毒，没有明显的ade效应，而rbd组iv抗体与体外sars-cov-2感染的增强(ade效应)紧密相关。[0219]讨论已从sars-cov-2或sars-cov-1恢复期个体鉴定了许多人单克隆抗体，并评价了它们用于预防和治疗的潜在被动抗体施用(andreano等人,2020；brouwer等人,2020；cao等人,2020；chen等人,2020；chi等人,2020；ju等人,2020；kreer等人,2020；liu,l.等人,2020；pinto等人,2020；robbiani等人,2020；rogers等人,2020；seydoux等人,2020；wan等人,2020；wec等人,2020；wu,y.等人,2020b；zost等人,2020a；zost等人,2020b)。相同的策略已用于鉴定针对hiv、zikv、hbv和其它病原体的有效的广泛中和抗体(mouquet等人,2012；robbiani等人,2017；scheid等人,2009a；wang,q.等人,2020)。在本研究中，筛选了恢复期个体以鉴定针对sars-cov-1和sars-cov-2病毒的有效的中和单克隆抗体，并且目的还在于理解抗体中和/增强效应和它们的抗原表位之间的关系。发现，类似于其它研究(premkumar等人,2020；rogers等人,2020)，从该个体克隆的大多数中和单克隆抗体主要靶向s-蛋白rbd结构域。更重要的是，rbd上的4组5个不重叠的抗体结合表位中的1个与抗体诱导的ade效应紧密关联，而3个其它表位与抗体中和活性相关。[0220]该结果与之前的研究(robbiani等人,2020；wu,f.等人,2020)一起，表明在恢复的个体中针对sars-cov-2的血清学中和活性有很大变化。然而，具有强健血清中和效应的个体不必然具有其纯化的igg抗体的有效中和活性。该现象与之前在hiv或hbv杰出中和者中的发现相反，在后者中纯化的血清igg与原始血清相比以类似程度中和病毒(scheid等人,2009a；wang,q.等人,2020)。对于sars-cov-2恢复的个体，这种差异可能归因于通过iga或igm部分的中和效应。在covid-19患者中，观察到早期强健的血清iga应答(cervia等人,2020；padoan等人,2020；yu等人,2020)，并且已通过体外结合和中和测定测试单克隆iga抗体有效(ejemel等人,2020)。因为分泌的iga在针对呼吸道病毒保护粘膜表面方面起重要作用，因此抗-sars-cov-2iga抗体可能在中和sars-cov-2方面起重要作用。[0221]在本研究和其它研究中抗-sars-cov-2抗体的ighv使用非常不同，并且最近的研究报道了ighv3-53是最频繁用于靶向rbd的ighv基因(yuan等人,2020)。然而，在本研究的供体#16中，鉴定了来自ighv1至ighv7的多个谱系，但仅1种ighv3-53抗体，表明ighv的使用在个体中显著不同。[0222]在本研究和之前的报道中鉴定的大多数中和抗体是针对rbd的，ic50值低至单数位ng/ml(图11a和11b)(robbiani等人,2020；rogers等人,2020)。在本研究的中和效力最强的几株单克隆抗体中，xg027是唯一不结合rbd，但很可能结合ntd的抗体，其可能类似于之前描述的称为4a8的ntd-结合抗体(chi等人,2020)。总体上，似乎组iii和iv的抗体比组ii的抗体更有效地中和；并且来自组i的抗体几乎不具备中和效力。这些发现类似于之前鉴定的rbd-a、-b和-c表位，或rbd-e、-f、-g和-h表位(liu,l.等人,2020；rogers等人,2020)，表明超过1个用于中和作用的表位存在于rbd的表面上。[0223]迄今为止，尚未评价大多数鉴定的中和抗体的交叉反应性。因为sars-cov-1属于与sars-cov-2相同的亚科，并共有相同的人受体ace2，免疫系统很可能偶然产生具有部分交叉反应性的抗体。存在这样的广谱sars-cov中和抗体已在选择的最近研究中得到证实。h014，一种从rbd-免疫小鼠中分离的噬菌体抗体，显示对于sars-cov-1和-2分别为150ng/ml和450ng/ml的ic50(lv等人,2020)。此外，从sars-cov-1感染的个体分离的抗体已表明对于sars-cov-2交叉中和；例如，抗体adi-55688(对于sars-cov-1和-2分别为4ng/ml和》100ng/ml的ic50)、adi-56046(对于sars-cov-1和-2分别为20ng/ml和50ng/ml的ic50)和s309(对于sars-cov-1和-2分别为120ng/ml和79ng/ml的ic50)。在本研究中，尽管48种抗体中的46种(96%)没有显示针对sars-cov-1的交叉中和活性，但一种抗体xg014显示针对sars-cov-1和-2二者的有效中和活性，对于sars-cov-1的ic50值为5.1ng/ml和对于sars-cov-2的ic50值为23.7ng/ml，同时并不诱导ade效应。[0224]sars-cov-2是缓慢突变的，因此监测单个氨基酸变化和理解它们的潜在表型相关性是关键的(korber等人,2020)。已经证实mers-cov和sars-cov-1中的点突变赋予对天然存在的中和抗体的抗性(sui等人,2008；tang等人,2014；termeulen等人,2006)。在本研究中，2种报告的病毒变体，v483a和g476s，显示有效抵抗一种单克隆抗体xg038的中和效力，具有分别为野生型毒株的20或80倍的ic50(图13b)。类似地，其它研究已报道了赋予对sars-cov-2中和抗体的抗性的突变，其中之一也是突变g476s，而另一种是不同的突变v367f(rogers等人,2020)。通过广泛的人-人传播，sars-cov-2病毒非常可能获得具有免疫抗性和适应性优势的突变。本发明人证实了几种在rbd区中仅具有1个氨基酸突变的sars-cov-2毒株，例如v341i、f342l、v367f、r408i、a435s、g476s和v483a，保持对xg014的敏感性，而7种病毒中的2种显示xg038的中和作用降低。[0225]具有严重疾病的sars-cov-2患者通常具有较强健的igg抗体应答。较高igg效价和较差后果之间的这种关联表明sars-cov-2的ade效应(cao,2020)。在本研究中，通过利用用于研究抗体依赖性病毒进入的基于raji细胞的模型，成功地鉴定和评价了sars-cov-2抗体的ade效应。对于sars-cov-1假病毒，在2种人伯基特淋巴瘤b细胞系raji和daudi细胞中和在人单核细胞系thp-1细胞中也观察到类似的ade效应，而对于sars-cov-1(jaume等人,2011)和sars-cov-2(数据未显示)(zang等人,2020)，在人红白血病细胞系k562和人巨噬细胞系u937中没有检测到增强的抗体依赖性病毒感染。[0226]关于ade效应与rbd上的5个不重叠的抗体结合表位中的1个之间的关联的发现是出人意料的。据所知，对于冠状病毒来说，尚未报道这样的抗体结合表位与ade效应的关系。虽然抗-sars-cov-2抗体的ade效应主要是通过结合rbd抗体结合表位(组iv)的抗体来诱导产生的，即组iv中的所有抗体(除xg014)均能诱导ade效应，然而并不诱导任何ade效应的中和效力最强的单克隆抗体xg014，也靶向该表位(rbd组iv)(图17a)。这可通过以下可能性解释：尽管与组iv表位重叠，但xg014的表位可能略微不同于其它抗体的表位。解决xg014或其它ade抗体与s-蛋白的复杂结构将有助于阐明ade和表位之间的相关性。[0227]针对sars-cov-2的许多不同类型的疫苗目前在开发中(callaway,2020)。为了评价它们的功效，测量来自接种者的血清的抗原结合和病毒中和活性。然而据所知，尚未在接种后测量血清ade效应。因此，表征来自接种个体的抗体的中和与增强效应将确保安全的疫苗开发。此外，因为数据提示ade效应与1个rbd表位密切相关，设计能够屏蔽该ade表位的rbd疫苗可能诱导产生具有较低ade效应的中和抗体，从而降低风险。[0228]关键资源表highlycustomizedandintegratedsystemforigandtrstandardizedv-jandv-d-jsequenceanalysis.nucleicacidsres.36(webserverissue),w503-508.doi:10.1093/nar/gkn316.brouwer,p.j.m.,caniels,t.g.,vanderstraten,k.,snitselaar,j.l.,aldon,y.,bangaru,s.,torres,j.l.,okba,n.m.a.,claireaux,m.,kerster,g.,etal.(2020).potentneutralizingantibodiesfromcovid-19patientsdefinemultipletargetsofvulnerability.science.doi:10.1126/science.abc5902.callaway,e.(2020).theraceforcoronavirusvaccines:agraphicalguide.nature.580(7805),576-577.doi:10.1038/d41586-020-01221-y.cao,x.(2020).covid-19:immunopathologyanditsimplicationsfortherapy.natrevimmunol.20(5),269-270.doi:10.1038/s41577-020-0308-3.cao,y.,su,b.,guo,x.,sun,w.,deng,y.,bao,l.,zhu,q.,zhang,x.,zheng,y.,geng,c.,etal.(2020).potentneutralizingantibodiesagainstsars-cov-2identifiedbyhigh-throughputsingle-cellsequencingofconvalescentpatients'bcells.cell.doi:10.1016/j.cell.2020.05.025.cervia,c.,nilsson,j.,zurbuchen,y.,valaperti,a.,schreiner,j.,wolfensberger,a.,raeber,m.e.,adamo,s.,emmenegger,m.,hasler,s.,etal.(2020).systemicandmucosalantibodysecretionspecifictosars-cov-2duringmildversusseverecovid-19.biorxiv.doi:10.1101/2020.05.21.108308.chen,x.,li,r.,pan,z.,qian,c.,yang,y.,you,r.,zhao,j.,liu,p.,gao,l.,li,z.,etal.(2020).humanmonoclonalantibodiesblockthebindingofsars-cov-2spikeproteintoangiotensinconvertingenzyme2receptor.cellmolimmunol.17(6),647-649.doi:10.1038/s41423-020-0426-7.chi,x.,yan,r.,zhang,j.,zhang,g.,zhang,y.,hao,m.,zhang,z.,fan,p.,dong,y.,yang,y.,etal.(2020).aneutralizinghumanantibodybindstothen-terminaldomainofthespikepro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