一种基因VII型遗传拯救的新城疫病毒疫苗株的制作方法

一种基因vii型遗传拯救的新城疫病毒疫苗株
技术领域
1.本发明属于兽用疫苗株技术领域，具体涉及一种基因vii型遗传拯救的新城疫病毒疫苗株。
技术背景
2.新城疫是由新城疫病毒引起的禽类的急性高度接触性传染病，可引起鸡、鸽子、鹅、野鸟等多种动物的发病。新城疫自1926年首次发现于印度尼西亚以来，在世界许多国家和地区迅速传播并流行，对养禽业危害巨大，是世界动物卫生组织要求的必须报告的a类疫病，我国农业部将其列为一类动物疫病。
3.刘华雷等通过对新城疫流行毒株的持续监测，发现我国目前流行的新城疫病毒以基因ⅶ型和ⅵ型为主，其中基因ⅶ型主要存在于鸡群和鹅群中，基因ⅵ型主要存在于鸽群中。刘秀梵等对江浙地区分离的新城疫病毒进行分析显示，多数分离株属于基因ⅶ型。国外的研究表明，东南亚等地区的鸡群中新城疫的流行基因型也以ⅶ型为主。
4.我国目前防控基因ⅶ型新城疫病毒主要用灭活疫苗，市场上没有针对基因ⅶ型新城疫病毒的活疫苗；而用于鸽子新城疫病毒的防控主要使用lasota等传统的基因ⅱ型的毒株，与鸽子流行的基因ⅵ型的新城疫病毒毒株不匹配，免疫保护效果较差。
5.对ndv活疫苗的研制，主要是通过反向遗传的方法，将基因组中与毒力相关的基因进行改造，拯救出毒力减弱的毒株。国内外研究发现，与ndv毒力相关的基因包括f基因、hn基因、p基因和l基因等。直接对基因ⅶ型或基因ⅵ型强毒株的若干基因进行改造发现，病毒的毒力并不能完全致弱，免疫后仍会引起一定的副反应，有很大的安全风险。因此，能从健康鸡上分离到一株自然弱毒株就显得很有意义。
6.但是分离的自然弱毒株在使用的过程中往往会暴露出各种问题，包括免疫后的应激反应大，毒力有残存，免疫持续期短，免疫原性受母源抗体的影响或免疫原性弱等。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种基因ⅶ型新城疫病毒疫苗株，以及该疫苗株的遗传拯救方法，所提供的弱毒株用于制备疫苗。
8.本发明首先提供一株基因ⅶ型新城疫病毒弱毒株ndv
-ⅶ
b株，其是将保藏编号为cctcc no:v201968的新城疫病毒株的hn蛋白的340位、342位、347位和353位氨基酸分别突变为组氨酸(h)、天冬酰胺(n)、赖氨酸(k)和精氨酸(r)；再通过遗传拯救构建的；
9.所述的基因vii型弱毒株ndv-vii株，于2019年10月15日保藏在位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为cctcc no:v201968。
10.所述的基因ⅶ型新城疫病毒弱毒株ndv
-ⅶ
b株，其遗传拯救构建方法如下：
11.1)分别将基因ⅶ型新城疫病毒的np蛋白、p蛋白和l蛋白基因分别连接到载体构建辅助质粒；
12.所述的载体，一种实施例的具体记载为pci-neo载体；
13.2)构建携带有基因ⅶ型新城疫病毒的全基因组的重组载体，且hn蛋白的340位、342位、347位和353位氨基酸分别突变为h、n、k和r；
14.3)分别将全基因组载体与3个辅助质粒共转染宿主细胞，拯救获得新城疫病毒基因ⅶ型弱毒株。
15.所述的宿主细胞为bsr细胞；
16.本发明提供的基因ⅶ型新城疫ndv
-ⅶ
b株用于制备疫苗；
17.本发明再提供一种基因ⅶ型新城疫病毒疫苗，所用的抗原为上述的新城疫病毒基因ⅶ型弱毒株。
18.本发明所提供的新城疫病毒基因ⅶ型弱毒株的免疫效果显著优于亲本株，可以对当前流行的基因ⅶ型新城疫病毒提供良好的保护作用。
附图说明
19.图1：辅助质粒的pcr鉴定图；
20.图2：spf鸡抗体效价测定图。
具体实施方式
21.发明人所在的实验室前期分离到一株基因ⅶ型新城疫病毒弱毒株ndv
-ⅶ
株(于2019年10月15日保藏在位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为cctcc no:v201968)，免疫spf鸡后可提供100％的保护，但是用于商品肉鸡免疫还不能完全克服母源抗体的干扰。
22.为了解决这一问题，对ndv
-ⅶ
株的基因序列分析后，选择将ndv
-ⅶ
株的hn基因(其序列为seq id no:5)进行定点突变并构建全基因组载体，与辅助质粒共转染，获得改造后的基因ⅶ型新城疫病毒重组毒株，筛选能够在鸡胚上繁殖效价高，毒力较弱的毒株。最终获得了本发明的基因ⅶ型新城疫病毒疫苗株，使用该疫苗株免疫鸡后，与亲本株相比免疫原性有显著的提高。
23.下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
24.实施例1基因ⅶ型新城疫病毒弱毒株的构建
25.通过反向遗传学技术，分别构建了以ndv
-ⅶ
株为亲本毒株的4个重组毒，其中hn蛋白基因进行了不同组合的点突变，包括e347k q353r y304h d342n、e347k、e347k q353r以及y304h d342n。根据上述基因重组毒株的免疫效果，构建了1株基因ⅵ型的新城疫病毒重组毒株。
26.下面就具体的步骤进行描述。
27.(1)新城疫病毒cdna感染性克隆的构建
28.根据保藏编号为cctcc no:v201968ndv
-ⅶ
株的全基因组序列(基因组的核苷酸序列为seq id no:1)设计引物，将全基因组分成5段，应用red/et同源重组技术一步克隆至载体pbrt。其中pbrt载体是以质粒pbr322为基础，连接上t7启动子、具有dna剪切作用的丁肝病毒核酶序列以及t7终止子序列，ndv全基因组插入t7启动子之后、丁肝病毒核酶序列之前；片段ndv-3事先通过over-lap pcr技术进行点突变后，克隆至pmd 19-t载体进行测序，分别将用引物ndv f3/t-r1/t-f1/ndv r3、ndv f3/t-r2/t-f2/ndv r3、ndv f3/t-r3/t-f3/
ndv r3和ndv f3/t-r4/t-f4/ndv r3扩增获得的克隆命名为ndv-3-t1、ndv-3-t2、ndv-3-t3和ndv-3-t4。所用引物见下表1。
29.表1：感染性克隆的构建引物表
[0030][0031][0032]
注：斜体序列为设计的同源臂序列；下划线序列为设计的点突变序列；小写字母为酶切位点。
[0033]
提取ndvⅶ株rna并反转录成cdna，以cdna为模板，分别用引物ndv f1/ndv r1、ndv f2/ndv r2、ndv f4/ndv r4和ndv f5/ndv r5扩增并获得片段ndv-1、ndv-2、ndv-4和ndv-5；
分别以ndv-3-t1、ndv-3-t2、ndv-3-t3和ndv-3-t4为模板，用引物ndv f3/ndv r3扩增获得片段ndv3-t1、ndv3-t2、ndv3-t3和ndv3-t4；以pbrt载体为模板，用引物ndv-v-f/ndv-v-r扩增获得载体片段ndv vector。
[0034]
扩增获得的条带进行纯化后，测定dna浓度。取ndv vector 200ng、ndv-1 400ng、ndv-2 400ng、ndv-4 400ng和ndv-5 400ng混合后，分别添加ndv3-t1 400ng、ndv3-t2 400ng、ndv3-t3 400ng或ndv3-t4 400ng，混匀后电转到用l-阿拉伯糖诱导表达了red/et重组酶的gbdir大肠杆菌中，电压1250v，时间4-6ms，电转后迅速加入1ml的无抗lb培养基，复苏1h，涂在氨苄平板上，37℃过夜培养。
[0035]
分别挑取单菌落，用氨苄lb培养基摇菌培养后进行pcr鉴定(图2)，全基因组载体的鉴定引物为ndv f1/ndv r1、ndv f2/ndv r2、ndv f3/ndv r3、ndv f4/ndv r4和ndv f5/ndv r5。鉴定正确的克隆送上海生工生物工程有限公司进行测序。构建的4个质粒分别命名为pbrt
-ⅶ
b、pbrt
-ⅶ
c、pbrt
-ⅶ
d和pbrt
-ⅶ
e。
[0036]
以质粒pkd3为模板，用引物cm-f/cm-r扩增氯霉素抗性片段cat基因，并引入pac i酶切位点；dna片段纯化后测定浓度。取cat基因400ng与200ng的质粒pbrt
-ⅶ
b混合，电转到诱导表达redα/β重组酶的大肠杆菌gb-red。电转后迅速加入1ml的无抗lb培养基，复苏1h，涂在氨苄/氯霉素双抗平板上，37℃过夜培养。挑取单菌落，摇菌后进行pcr鉴定，测序鉴定，构建的质粒命名为pbrt-ndv-cat。
[0037]
(2)辅助质粒的构建
[0038]
设计引物，分别在ndv
-ⅶ
株np(编码基因的序列为seq id no:2)、p(编码基因的序列为seq id no:3)和l基因(编码基因的序列为seq id no:4)的上下游引入酶切位点，分别克隆至经相同核酸内切酶处理的pci-neo载体。其中l基因片段较长，分成3段进行扩增，扩增的每一段dna片段在首尾均有30bp左右的重叠，用neb公司生产的高保真dna组装预混液进行一步法组装。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见下表2。
[0039]
表2：ndv辅助质粒构建用引物表
[0040][0041]
构建的3个辅助质粒分别用引物np-f/np-r、p-f/p-r、l-1/l-6进行pcr鉴定后测序并保存(图1)，分别命名为pci-np、pci-p、pci-l。
[0042]
(3)病毒拯救
[0043]
bsr细胞接种于6孔细胞培养板中，待细胞生长至60％-80％时进行转染。分别取5ug感染性克隆质粒pbrt
-ⅶ
b、pbrt
-ⅶ
c、pbrt
-ⅶ
d、pbrt
-ⅶ
e、，与3个辅助质粒(pci-np 2.5ug、pci-p 1.25ug、pci-l 1.25ug)混合后进行共转染，按照磷酸钙转染试剂盒说明书进行操作。转染后3天，取培养液上清接种10日龄spf鸡胚，培养96h后收取鸡胚尿囊液，测定ha效价。ha效价阳性样品进行冻存。将拯救获得的基因ⅶ型的ndv毒株分别命名为ndv
-ⅶ
b(e347k q353r y304h d342n)、ndv
-ⅶ
c(e347k)、ndv
-ⅶ
d(e347k q353r)和ndv
-ⅶ
e(y304h d342n)；
[0044]
接胚后96h收取的鸡胚尿囊液，ha效价为2
4-26。尿囊液稀释后继续接种鸡胚，ha效价稳定在2
9-2
10
。继续传代至20代，每隔5代取一次病毒尿囊液样品，提取rna并反转录成cdna。分别对ndv
-ⅶ
b株、ndv
-ⅶ
c株、ndv
-ⅶ
d株、ndv
-ⅶ
e株的hn突变位点进行测序，改造的位点没有发生任何插入、缺失等突变。表明拯救的毒株可以稳定遗传。
[0045]
实施例2鸡胚平均致死时间(mdt)、脑内致病指数(icpi)和静脉致病指数(ivpi)的测定
[0046]
新城疫病毒毒力致病性的判定，可以根据mdt、icpi和ivpi的测定结果进行划分。按照oie的标准，分别对未改造的亲本毒株ndv
-ⅶ
株、和改造毒株ndv
-ⅶ
b株、ndv
-ⅶ
c株、ndv
-ⅶ
d株、ndv
-ⅶ
e株进行上述3个指数的测定。结果见下表3所示。
[0047]
表3：致病指数的测定表
[0048][0049][0050]
结果表明，除yb17
-ⅵ
株表现为中等毒力的特征外，其余毒株均为弱毒株，说明对hn基因进行突变改造或替换后，没有影响毒株致病力。
[0051]
实施例3基因ⅶ型ndv活疫苗的制备及安全性试验
[0052]
分别将ndv
-ⅶ
株、ndv
-ⅶ
b株、ndv
-ⅶ
c株、ndv
-ⅶ
d株和ndv
-ⅶ
e株制备成活疫苗并进行安全性试验。用5％蔗糖脱脂乳1:1加入至稀释的尿囊液中，定量稀释后的病毒含量为10
8.0
eid50/0.1ml，充分混匀后冻干制备活疫苗。制备的活疫苗按2010年版《中国兽药典》附录进行无菌检验，结果符合标准，无细菌污染。
[0053]
用1日龄spf鸡进行安全性试验。每个毒株用20只雏鸡，每10只一组，分别免疫10
7.0
eid50和10
8.0
eid50剂量的病毒液，pbs对照组5只，免疫方式为滴鼻点眼，在相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验鸡采食、饮水及临床表现。结果显示，免疫后鸡只没有出现精神沉郁、食欲不振、嗜睡麻痹及全身不良反应，鸡只健康，证明制备的5株ndv活疫苗对雏鸡安全。
[0054]
表4：基因ⅶ型ndv活疫苗对spf雏鸡的安全性试验
[0055][0056][0057]
实施例4：基因ⅶ型ndv活疫苗免疫效果评价
[0058]
分别将制备的基因ⅶ型ndv活疫苗免疫spf鸡和肉鸡，评价5株ndv毒株的免疫效果。其中spf鸡免疫组观察至42天，每7天采血并分离血清，测定hi抗体水平；肉鸡免疫后采血至21天后攻毒:评价免疫效果。
[0059]
下面就具体的步骤进行描述。
[0060]
(1)spf鸡抗体持续性试验
[0061]
19日龄spf鸡随机分成5组，每组10只，分别免疫10
7.0
eid50剂量的基因ⅶ型活疫苗，另设1组pbs阴性对照组5只，滴鼻点眼，0.1ml/只。分别在免疫后7天、14天、21天、28天、35天和42天测定hi抗体，评价疫苗免疫效果。结果见下表5所示。
[0062]
表5：spf鸡抗体持续时间表
[0063][0064]
结果显示，免疫后ndv
-ⅶ
b的免疫效果最好，具体表现在，在相同的采血时间内诱导的抗体水平更高。因此，确定hn蛋白基因的e347k q353r y304h d342n突变后所遗传拯救的基因ⅶ型新城疫病毒弱毒株与亲本毒株和hn基因其它位点突变的毒株相比，免疫动物后抗体效价更高，持续时间更长，具有最好的免疫效果。
[0065]
(2)肉鸡攻毒保护试验
[0066]
1日龄商品肉鸡随机分成5组，每组10只，分别免疫10
7.0
eid50剂量的基因ⅶ型活疫苗；另设一组lasota对照组10只鸡，免疫相同剂量的lasota活疫苗；一组pbs对照组5只；每只鸡进行编号。免疫途径为滴鼻点眼。免疫后14天和21天采血测定hi抗体。21天采血后，所有鸡进行攻毒，攻毒毒株为实验室保存的基因ⅶ型ndv强毒株js 02/06株，攻毒剂量10
4.0
eld50/只，攻毒方式为肌肉注射，连续观察14日。攻毒后5日，分别采集每只鸡的喉头和泄殖腔拭子，经处理后，每个样品尿囊腔内接种10-11日龄非免疫鸡胚5枚，每胚0.2ml，孵育观察5日，无论死胚、活胚均应测定鸡胚液红细胞凝集价，每个拭子样品接种的5枚鸡胚中，只要有1枚鸡胚液的凝集价不低于1:16(微量法)，即可判为病毒分离阳性，对病毒分离阴性的样品，盲传一次后再进行判定。保护率＝(动物总数-死亡动物数-未死亡但排毒动物数)/动物总数。具体结果见下表所示：
[0067]
表7肉鸡攻毒保护性试验
[0068]
[0069][0070]
综上所述，本发明所拯救的ndv
-ⅶ
b株免疫效果最好，诱导动物机体产生的抗体水平较高，持续时间更长，最重要的是可以克服母源抗体的干扰，对商品肉鸡可以达到100％的保护水平。