一种电化学分离、检测及释放外泌体的方法与流程

1.本发明涉及到生物技术领域，特别涉及应用电化学传感器分离、检测及释放外泌体的领域。


背景技术：

2.外泌体是新发现的一种新型肿瘤标志物，由于其体积小，数量多，并对肿瘤的早期诊断意义重大，因此备受关注。
3.外泌体的磷脂双分子层包含了典型的跨膜蛋白和受体，像跨膜蛋白pgrl；膜运输蛋白rabs；黏附分子icam-1，整合素；脂筏相关蛋白胆固醇，cd63和cd81。而且，外泌体的表面自组装了免疫调节分子，比如mhc-i/ii，cd80和cd86。在外泌体的内体，稳定保存了各种各样蛋白的信息，细胞骨架蛋白，网格蛋白以及微囊泡形成的蛋白。分布在体液中的外泌体携带了大量亲代细胞的分子信息，包括mirna，dna，碳水化合物，跨膜蛋白等。更重要的是：外泌体涉及到肿瘤抗原，抗肿瘤免疫反应，肿瘤诊断，这些和人类的健康密切相关，因此这些独一无二的特性使外泌体成为疾病诊断和治疗的生物标志物。
4.分离外泌体的技术普遍是基于其物理特性包括尺寸和密度。检测外泌体的方法很多包括流式细胞术，western blotting，酶联免疫吸附法，微流控平台，比色法，电化学法，荧光检测法，表面等离子共振等。但是如何快速、准确、灵敏、特异地捕获和检测外泌体，并能够方便、无损地释放外泌体仍然是研究工作者努力研究的科学问题。
5.基于以上所述，本发明拟应用电极表面功能化的电化学传感器捕获、检测和释放外泌体，能够灵敏、特异地识别外泌体并方便、快速、温和地释放外泌体，为外泌体的研究提供一种新的技术手段。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种应用电化学传感器分离、检测及释放外泌体的方法，该电化学传感器结合了电化学的高灵敏度特性以、特异性主客体识别及亲和识别生物分子，实现对细胞上清液及复杂体系中外泌体的捕获、检测及释放。
7.本发明的技术方案：一种应用电化学传感器分离、检测及释放外泌体的方法，包括以下步骤：
8.1)、电极传感器的构建：包括电极表面修饰及功能化。金电极首先用2ml的去离子水清洗，用氮气吹干。滴加葫芦脲水溶液在电极表面，反应结束后用去离子水冲洗，氮气吹干，然后加入适配体修饰的二茂铁溶液，实现电极表面的功能化。
9.2)、外泌体检测：包括外泌体的捕获及定量检测。将含有外泌体的pbs溶液滴加到功能化修饰后的电极表面，反应结束后用pbs清洗，氮气吹干后进行电化学信号检测。以外泌体浓度为横坐标，以外泌体加入体系前后的电流差值为纵坐标建立电化学传感器检测外泌体的标准曲线。
10.3)、外泌体的释放：在外泌体检测实验结束后，在电极表面滴加氨基二茂铁溶液，
使外泌体从电极表面脱离，收集反应后的溶液，对外泌体释放前后的电极做扫描电镜，观察电极表面的变化。
11.4)、复杂体系中外泌体的检测：电极表面修饰及功能化以后，将外泌体原液分别加入到不含外泌体的dmem细胞培养基、fbs溶液及羊血浆中，然后将添加了外泌体的复杂样品溶液滴加到功能化电极表面，测定电流信号。最后，加入氨基二茂铁释放外泌体。
12.所使用的电化学传感器为表面功能化修饰的金电极，在金电极表面修饰具有空腔结构的化合物(例如，葫芦脲)，通过葫芦脲与二茂铁的主客体识别修饰上能够识别外泌体的适配体达到特异性捕获外泌体的目的。
13.外泌体的捕获是通过适配体与外泌体的亲和识别实现的。
14.外泌体的释放是通过加入比二茂铁亲和力更强的其他试剂(例如氨基二茂铁)竞争葫芦脲上的空腔位点，达到释放外泌体的目的。
15.金电极表面修饰所使用的空腔结构的葫芦脲的浓度是1mm，体积为40μl。
16.金电极表面修饰所使用的空腔结构的葫芦脲的孵育条件为25℃孵育4h。
17.金电极表面修饰所使用的客体结构的二茂铁的浓度是500nm。
18.适配体与外泌体的孵育条件为4℃冰箱3h。
19.亲和力更强的客体氨基二茂铁的溶剂为乙醇∶水＝6∶4。
20.复杂样品溶液中外泌体的添加量为2000particles/μl。
21.复杂样品溶液中外泌体的检测与释放方法同pbs溶液中外泌体的检测和释放方法相同。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
23.1)本发明提供了一种用于集成外泌体分离、检测及释放的电化学传感器。该电化学传感器结合了电化学的高检测灵敏度、特异性主客体识别和亲和识别生物分子的优点，因此，本方法具有灵敏度高、特异性强的特点。
24.2)本发明还利用了主客体竞争结合的原理，利用结合常数更高的客体分子将外泌体简单、方便地从电极释放，对外泌体的释放具有简便、易得、快速、无损的特点。
25.3)本发明所涉及的电化学传感器还利用了亲和识别生物分子的原理，引入了具有亲和识别外泌体的识别对(例如：适配体)，该亲和识别对可以根据实验目的而更换，具有一定的通用性，具有广阔的应用前景。
附图说明
26.图1为电化学传感器捕获和释放外泌体的原理图
27.图2为所捕获外泌体的扫描电镜鉴定图
28.图3为检测外泌体的标准曲线
29.图4为释放外泌体前后的扫描电镜鉴定图
具体实施方式
30.下面就具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解这些实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本技术所附权利要求所限定的范围。为了理解本发明，下面对本发明
进行进一步的详细说明。
31.实施案例中未注明具体试验条件和试验方法的按照常规条件和方法或者制造商所建议的条件予以实施。
32.本发明中未特别说明的各种仪器和试剂均为本领域熟知的市售产品，可通过商业途径采购获得。
33.实施例1：电化学传感器检测外泌体的标准曲线，参照附图1-3。
34.请参阅图1-3，本发明的电化学传感器结合了电化学的高检测灵敏度、主客体特异性识别及亲和识别生物分子的方法，该电化学传感器检测外泌体的标准曲线，包括以下步骤：
35.1)用pbs(ph 7.4)稀释外泌体的原始溶液
36.2)将1)得到的外泌体pbs溶液设置6个浓度梯度：500、1000、2000、3000、4000和5000particles/μl。
37.3)将2)得到的不同浓度的外泌体溶液，滴加到电极上，4℃孵育。
38.4)将3)反应完成后的电极进行方波伏安法检测。
39.5)将4)所得到的检测结果对外泌体的浓度绘制标准曲线。检测结果如图3。
40.实施例2：电化学传感器对所捕获外泌体的释放，参照附图4。
41.1)在外泌体检测实验结束后，记录电极捕获外泌体后的电极的电流值。
42.2)在电极表面滴加氨基二茂铁溶液，溶液的溶剂为乙醇∶水＝6∶4，溶液体积为40μl。
43.3)待2)反应之后，收集释放了外泌体的反应溶液，可进行针对外泌体的后续试验。
44.4)将3)处理之后，测定电极的电流值，计算释放外泌体释放前后的电流变化。
45.5)将1)和4)的电极分别进行扫描电镜检测，观察电极释放外泌体前后电极表面的形貌变化。检测结果如图4。
46.实施例3：电化学传感器对复杂体系中外泌体的检测，参照表1。
47.1)电极表面修饰及功能化以后，将外泌体原液分别加入到不含外泌体的dmem细胞培养基、fbs溶液及羊血浆中。
48.2)将1)所涉及到的复杂样品中外泌体的添加浓度定为2000particles/μl。
49.3)将2)所得到的添加有外泌体的复杂样品溶液滴加到功能化电极表面。
50.4)将3)所得到的电极放置在4℃孵育3小时。
51.5)将4)所得到的捕获有外泌体的电极进行电流检测，确定捕获量，计算回收率，计算结果参照表1。
52.6)将5)检测完成后的电极用氨基二茂铁处理，处理方法与外泌体的释放方法相同。表1，电化学传感器检测外泌体在三种复杂样品中的回收率(n＝3)