一种抗骨质疏松药物组合物及其应用的制作方法

一种抗骨质疏松药物组合物及其应用
(一)技术领域
1.本发明涉及药学领域，具体涉及一种抗骨质疏松药物组合物及其制备方法与应用。
(二)

背景技术：

2.骨质疏松症(osteoporosis,op)是一种全身性骨骼疾病，其明显特征表现为骨密度降低和骨质量下降(微结构改变)，从而导致骨强度降低，使得人体的骨微结构易遭到破坏，骨骼脆性增加。骨质疏松已严重影响个体生活水平和质量。预计到2050年，我国骨质疏松性患者人数将超过599万，相应医疗支出高达1745 亿元，因此防治骨质疏松症是当下重要的健康课题。人骨骼长期处于一种动态平衡，这一生理过程主要包括由成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收，正常生理情况下骨形成与骨吸收处于动态平衡，当破骨细胞吸收和成骨细胞的骨形成之间的精确平衡被打破，即骨吸收增加，骨形成减少，骨完整性无法得以维持，从而引发骨质疏松。因此促成骨细胞功能和/或抑制破骨细胞功能的药物成为研究热点。
3.目前常用于治疗骨质疏松症的药物主要为骨吸收抑制剂、骨形成促进剂和骨矿化物等西药，但传统西药的治疗方法存在一定的局限性和不良反应，包括胃肠道不良反应、损伤肾功能、静脉血栓等，造成对op的治疗往往难以达到满意的效果。而中医理论强调治病求本，即从整体观上分析疾病的病因和病机，认为“肾主骨，生髓”、“肾藏精，精生髓，髓养骨”，若肾精亏虚不能生髓，髓枯则骨枯，日久发为本病。中医学认为op属于“骨蚀”、“骨萎”、“骨痹”范畴。“肾藏精，主骨生髓”是中医防治op的理论基础。“肾藏精”的科学内涵主要或部分体现为mscs及微环境的调和状态,且补肾中药能同时激活mscs和发挥微环境调节的作用，由此提出“肾虚”即表现为“肾藏精，精生髓”的功能低下，在细胞及分子层面体现在mscs增殖、分化等功能及其微环境稳态的变化。op的根本病机为“肾虚”，极有可能是肾虚导致mscs增殖能力下降及成骨异常分化，进而导致骨吸收加速，骨量减少，微观结构破坏，骨脆性升高。而补肾调髓中药之所以能有效干预pmop可能正是通过调控内源性mscs的增殖和成骨分化。目前治疗骨质疏松的药物主要分为3大类：
①
抑制破骨细胞活性的药物，主要有雌激素、降钙素、双膦酸盐、异丙氧黄酮、选择性雌激素受体调节剂等，
②
促进成骨细胞生成的药物，主要有氯化物、甲状旁腺激素、蛋白合成激素；
③
促进骨化的药物，主要有钙剂和维生素d及其衍生物等。
4.我们课题组在文献调研与实验研究的基础上公开了一种治疗骨质疏松症的中药组合物组成及采用醇水双提法制备药物的方法(专利号cn201110086501.2)，该提取物能够有效提高大鼠骨密度、骨强度，通过降低尿脱氧吡啶酚、尿脱氧吡啶酚/尿肌酐水平以及破骨细胞整合素αvβ3的表达抑制骨吸收，发挥治疗骨质疏松的药效。在此基础上课题组进一步公开了采用超临界流体萃取技术从上述中药组合物中抽提得到脂溶性成分的制备方法(专利号cn201310233904.4)，但由于该中药组合物药效物质基础不明确，无法准确控制提取物的质量，造成抗骨质疏松疗效不稳定，限制了其进一步的临床应用与开发。在上述发明
专利的基础上，课题组经过反复试验，发现了一系列新的中药有效成分组合配比，主要由反式肉桂醛、α-衣兰油烯、顺-菖蒲烯等挥发性物质，十六烷酸、顺-9-十八烯酸、亚油酸和亚麻酸等高级脂肪酸以及γ-谷甾醇按一定比例组合而成。体外实验证实该组合物有显著的成骨细胞增殖和诱导成骨分化活性，动物实验证明其(0.625g/kg小鼠体重)的抗骨质疏松症作用显著优于课题组前期已公开的提取物，且起效剂量仅为该提取物的十分之一。
5.虽然文献报道反式肉桂醛可通过提升去卵巢诱导的骨质疏松大鼠模型的骨密度和骨量起到抗骨质疏松的效果，但细胞学研究发现高浓度(128mg/ml)的肉皮醛对成骨细胞可产生抑制作用，提示单用肉桂醛作为药物治疗骨质疏松存在局限性。谷甾醇可通过提高sd大鼠成骨细胞opg/odf比值和刺激卵巢颗粒细胞分化e2，从而促进和加强成骨作用，但是起效剂量达到2.5g/kg动物体重，提示单用谷甾醇成药性较差。动物实验研究发现高级脂肪酸可以通过减少骨髓脂肪组织扩张和减少骨质流失发挥抗骨质疏松作用；细胞实验研究也表明成骨细胞需要分解代谢外源性不饱和脂肪酸获取生长必需的营养物质与能量，但是摄入过量不饱和脂肪酸易产生过氧化脂质，会增加动脉粥样硬化和恶性肿瘤的发生几率。综上上述任何一种有效成分都不能单独开发成为抗骨质疏松症的药物，目前尚未见按本专利所述化合物按一定比例组合用于治疗骨质疏松症的公开报道。本专利公开的有效成分组合配比明确，可确保药物质量稳定性和药效均一性，相比于传统中药提取物和单一化合物，更利于进一步开发成抗骨质疏松症的有效药物。
(三)

技术实现要素：

6.本发明目的是提供一种抗骨质疏松组合物及其制备方法与应用，该组合物具有显著的促进成骨细胞增殖和诱导成骨分化活性，能够有效治疗骨质疏松症，且明确了抗骨质疏松药物的化合物成分。
7.本发明采用的技术方案是：
8.本发明提供一种抗骨质疏松组合物，所述组合物由如下质量配比原料组成：反式肉桂醛1-60％、α-衣兰油烯1-10％、γ-谷甾醇1-40％、顺-菖蒲烯1-20％、十六烷酸1-20％、顺-9-十八烯酸1-30％、亚油酸5-30％、亚麻酸5-30％，总量100％。
9.进一步，所述组合物由如下质量配比的原料组成：反式肉桂醛20-55％、α
‑ꢀ
衣兰油烯4-10％、γ-谷甾醇8-40％、顺-菖蒲烯4-15％、十六烷酸4-15％、顺-9
‑ꢀ
十八烯酸5-30％、亚油酸5-25％、亚麻酸5-25％，总量100％。
10.更进一步，优选所述组合物由如下质量配比的原料组成：反式肉桂醛45-55％、α-衣兰油烯2-5％、γ-谷甾醇8-10％、顺-菖蒲烯5-8％、十六烷酸5-10％、顺-9
‑ꢀ
十八烯酸8-15％、亚油酸8-15％、亚麻酸5-10％，总量100％。
11.最优选，所述组合物由如下质量配比的原料组成：反式肉桂醛50％、α-衣兰油烯4％、γ-谷甾醇8％、顺-菖蒲烯5％、十六烷酸5％、顺-9-十八烯酸10％、亚油酸10％、亚麻酸8％，总量100％。
12.本发明还提供所述组合物在制备治疗骨质疏松症药物中的应用，所述药物能够促进成骨细胞增殖、诱导成骨分化，所述药物包含组合物和药学上可接受的载体；所述药学上可接受的载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、乳化剂、粘合剂、润滑剂、吸收促进剂、表面活性剂、崩解剂或抗氧化剂。
13.所述药学上可接受的载体还包括香味剂、甜味剂、防腐剂或着色剂。例如：山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、大豆磷脂、维生素c、维生素 e、edta二钠、一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、羟苯乙酯溶液、苯甲酸、山梨酸钾、醋酸氯己定、麦芽糖、葡萄糖、右旋糖苷、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙或硬脂酸镁等。
14.所述药物可以是口服固体制剂、口服液体制剂或注射剂；其中，口服固体制剂选自胶囊剂、片剂；口服液体制剂选自水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂；注射剂选自乳剂、冻干粉针剂和水针剂。
15.优选，所述每100ml口服乳剂由组合物100g、大豆磷脂或可供注射用大豆磷脂20～40g(优选30g)，油酸钠5～25g(优选10g)，蒸馏水加至100ml制成。
16.所述胶囊剂由药液和胶液组成，每1000粒胶囊剂中药液由组合物100g、抗氧化剂和/或乳化剂3～20g制成(优选10g)；所述抗氧化剂为维生素e，乳化剂为吐温80；胶液由重量比为1：0.7～3：1～7：1～10明胶、纯化水、甘油和防腐剂制成(优选1:2.5:1:5)；其中胶液是依次将甘油、纯化水、防腐剂加入化胶罐内，加热至75℃～85℃后，再加入明胶不断搅拌、抽真空，直至明胶完全溶解，将胶液过滤，滤液在57～65℃下存放。
17.所述每1000片片剂由组合物100g，液体石蜡5-15g，滑石粉20-40g，淀粉 20-50g，酒石酸20-50g制成；优选每1000片片剂由组合物100g、滑石粉25g，液体石蜡10g，淀粉30g，酒石酸25g制成。滑石粉是吸附有液状石蜡的滑石粉。
18.与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明所述组合物相较于中药提取物明确了活性化合物成分及配比；本发明所述组合物能够使成骨细胞增殖率达到125～205％，alp相对含量达到190～400％，钙化结节相对数量形成率达到110～700％，其中，优选的组合物能够使成骨细胞增殖达到145～200％，在抗骨质疏松质量方面具有积极效果。
(四)附图说明
19.图1为实施例6mtt法检测不同组合物对间充质干细胞c3h10t1/2(a)和前体成骨细胞mc3t3-e1细胞(b)增殖影响的柱形图。
20.图2为实施例6不同组合物作用mc3t3-e1细胞10天的alp染色(a)显微图(放大
×
100倍)和茜素红染色(b)显微图(放大
×
100倍)。
21.图3为实施例7不同组合物作用c3h10t1/2细胞10天alp染色结果(a 放大倍数：100)和碱性磷酸酶(alp)相对含量结果(b)。
22.图4为实施例7结晶紫染色法检测不同天数不同组合物促进c3h10t1/2成骨细胞集落形成的显微照片。
23.图5为实施例7结晶紫染色法检测不同组合物对间充质干细胞c3h10t1/2 细胞增殖率影响图。注：*p《0.01,与同天数的对照组相比较。
24.图6为实施例8不同组合物对mc3t3-e1成骨细胞内alp含量影响图；注： *p《0.05,**p《0.01,与同天数的对照组相比较。
25.图7为实施例9中不同时间的小鼠不同部位骨密度的dxa扫描图(a)、masson三色染
色图(b)。
26.图8为实施例9对照组与模型组给药前骨密度值(a)比较以及给药前后腰椎(b)、右股骨(c)、左股骨(d)测量点骨密度数据比较(与模型组(8周、12周)比较 *p《0.05,**p《0.01)。
(五)具体实施方式
27.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
28.实施例1、组合物a
29.1、组合物a质量配方：反式肉桂醛50％、α-衣兰油烯4％、γ-谷甾醇8％、顺-菖蒲烯5％、十六烷酸5％、顺-9-十八烯酸10％、亚油酸10％、亚麻酸8％。
30.组合物a的制备：按配方量，分别称取反式肉桂醛50g、α-衣兰油烯4g、γ
‑ꢀ
谷甾醇8g、顺-菖蒲烯5g、十六烷酸5g、顺-9-十八烯酸10g、亚油酸10g、亚麻酸8g，总量100g，混匀，即得组合物a。
31.实施例2、组合物b
32.组合物b质量配方：反式肉桂醛1％、α-衣兰油烯1％、γ-谷甾醇30％、顺
‑ꢀ
菖蒲烯12％、十六烷酸12％、顺-9-十八烯酸1％、亚油酸22％、亚麻酸21％。
33.组合物b制备：按配方量，分别称取反式肉桂醛1g、α-衣兰油烯1g、γ-谷甾醇30g、顺-菖蒲烯12g、十六烷酸12g、顺-9-十八烯酸1g、亚油酸22g、亚麻酸21g，总量100g，混匀，即得组合物b。
34.实施例3、组合物c
35.组合物c质量配方：反式肉桂醛40％、α-衣兰油烯1％、γ-谷甾醇16％、顺
‑ꢀ
菖蒲烯1％、十六烷酸15％、顺-9-十八烯酸6％、亚油酸6％、亚麻酸15％。
36.组合物c制备：反式肉桂醛40g、α-衣兰油烯1g、γ-谷甾醇16g、顺-菖蒲烯 1g、十六烷酸15g、顺-9-十八烯酸6g、亚油酸6g、亚麻酸15g，总量100g，混匀，即得组合物c。
37.实施例4、组合物d
38.组合物d质量配方：反式肉桂醛20％、α-衣兰油烯8％、γ-谷甾醇1％、顺
‑ꢀ
菖蒲烯15％、十六烷酸1％、顺-9-十八烯酸20％、亚油酸20％、亚麻酸15％。
39.组合物d制备：按配方量，分别称取反式肉桂醛20g、α-衣兰油烯8g、γ
‑ꢀ
谷甾醇1g、顺-菖蒲烯15g、十六烷酸1g、顺-9-十八烯酸20g、亚油酸20g、亚麻酸15g，混匀，即得组合物d。
40.实施例5、阳性对照药物提取物的制备
41.阳性对照药物配方：熟地黄90份，制附子60份，杜仲60份，山茱萸30 份，枸杞60份，山药60份，甘草30份，红花20份，肉桂20份，桃仁40份。
42.醇提：将配方量的桃仁(40g)和肉桂(20g)混合粉碎至10～24目，加600ml 体积浓度60％乙醇水溶液在25℃下浸泡1h后，70℃水浴回流提取3次，每次 1.5h，各提取液滤过(利用漏斗滤纸滤过)，合并三次滤液后用旋蒸仪减压真空浓缩至250ml，获得醇提液。
43.水提：将配方量的熟地黄90g，制附子60g，杜仲60g，山茱萸30g，枸杞 60g，山药60g，甘草30g，红花20g混合后粉碎至10～24目，加500ml蒸馏水， 25℃下浸泡1h，95℃水浴
回流提取3次，每次1.5h，将提取液减压真空浓缩达到1.05的相对密度，加入95％乙醇使提取液中乙醇的体积比调整为60％，4℃醇沉24h，滤过，回收乙醇至药液无醇味，再减压浓缩至250ml，获得水提液。再将醇提液和水提液混合均匀，最终得阳性对照药物提取物500ml，生药量为 0.94g/ml。
44.实施例6、体外测定不同配比组合物对间充质干细胞c3h10t1/2和成骨前体细胞mc3t3-e1细胞增殖和成骨分化作用
45.1.实验材料及配置
46.(1)细胞株：c3h10t1/2(小鼠间充质干细胞)和mc3t3-e1(成骨前体细胞)，由浙江中医药大学骨研所馈赠。
47.(2)细胞培养基：添加体积浓度10％胎牛血清(gibco)、体积浓度1％双抗penicillin-streptomycin(青霉素-链霉素，其中青霉素10000单位/ml，链霉素10,000μg/ml)的dmem培养基。
48.(3)0.25％胰蛋白酶溶液(trypsin)：购自杭州诺森德生物技术有限公司，-20℃保存。
49.(4)磷酸缓冲液(pbs):购自杭州诺森德生物技术有限公司，4℃保存。
50.(5)结晶紫：购自上海源叶生物技术有限公司。
51.(6)mtt，alp检测试剂盒：购自上海碧云天生物技术有限公司。
52.(7)tris和茜素红粉末：购自takara公司。
53.2.实验方法
54.(1)0.5％结晶紫染液配置：取适量结晶紫粉末，置于研钵研细，用万分之一电子天平精密称取100mg，转移至洗净烧杯后加入20ml ddh2o，30khz超声 5min至充分溶解，普通滤纸过滤，取续滤液即得0.5％结晶紫染液，室温备用。
55.(2)结晶紫染色法测定细胞增殖情况：将c3h10t1/2细胞接种至装有细胞培养基的细胞培养瓶，在细胞培养箱中37℃，5％co2培养24h至对数生长期，待培养瓶中细胞汇合度达到80-90％，从细胞培养箱中取出细胞培养瓶，用巴氏滴管吸出并弃去培养瓶中的培养基。往瓶中再加入1-2ml pbs，上下左右晃动轻洗细胞，用巴氏滴管吸除pbs，重复一次pbs操作。用1ml移液枪吸取2ml0.25％胰蛋白酶溶液，全部打入培养瓶中，轻晃培养瓶使胰蛋白酶充分覆盖贴壁细胞，将培养瓶移入细胞培养箱中37℃消化3min，取出加入3倍体积量的完全培养基终止消化，反复吹取将贴壁细胞吹下后转移至15ml离心管，900rpm离心3min。取离心管底部细胞团块加入2ml的细胞培养基反复吹打均匀制得均匀的细胞悬液，转移至普通无菌加样槽中，在96孔板每孔中加100μl，加好后置于超净台静置10min后移入的细胞培养箱(37℃，95％空气，5％co2)中培养过夜，使细胞贴壁，分成空白组、加药组和阳性对照组。空白组每孔加100μl细胞培养基；加药组每孔加100μl含药培养基，其中含药培养基是实施例1-3制备的组合物a、组合物b、组合物c，用细胞培养基制成0.0625、0.625、1.25、2.5、5、 10μg/ml浓度的含药培养基；阳性对照组每孔加入100μl阳性对照培养基，其中阳性对照培养基是将实施例5制备的阳性对照药物提取物用细胞培养基以生药量计算配制成0.0625、0.625、1.25、2.5、5、10μg/ml浓度的阳性对照培养基。各组继续培养24、48、72小时，每个浓度点重复三次。吸去培养基，用pbs洗去残留培养基后，每孔加0.1ml醋酸/甲醇(1:7，体积比)溶液固定细胞5min。弃去细胞固定液，每孔加50μl 0.5％结晶紫染液，置于室温染色1小
时。轻轻吸去染色液，用纯水洗涤96孔板各孔，直至各孔冲洗废液无紫色，室温风干后每孔加100μl甲醇(分析纯)，充分振荡后置于酶标仪570nm处测定吸光度(od值)。
56.同样条件下，将c3h10t1/2细胞替换为mc3t3-e1细胞。细胞增殖率＝(药物处理组od-空白组od)/空白组od
×
100％。按照上述公式计算相对空白对照增值率。
57.结果见图1，组合物c和组合物a促进细胞增殖优于阳性对照药物提取组和组合物b。
58.(3)碱性磷酸酶(alp)染色：将mc3t3-e1细胞接种至细胞培养基，在37℃培养24h至对数生长期，经0.25％胰蛋白酶消化后制成1
×
104个/ml细胞悬液。每孔500μl将细胞悬液接种于24孔细胞板中，置于细胞培养箱中37℃培养24h 后使细胞贴壁。弃去细胞培养基，分成空白组、给药组和阳性对照组，其中空白组每孔各加100μl的细胞培养基；给药组每孔加入100μl含药培养基，其中含药培养基是将实施例1-4中的组合物a、组合物b、组合物c和组合物d用细胞培养基配制的1.25μg/ml的含药培养基；阳性对照组加入100μl阳性对照培养基，其中阳性对照培养基是将实施例5方法制备的阳性对照药物提取物用细胞培养基配制的以生药含量计1.25μg/ml的阳性对照培养基。各组转移至细胞培养箱中继续培养10天后弃去培养液，每孔加入300μl pbs轻洗每孔残留培养基，再每孔加入400μl alp试剂盒内的1-steptmnbt/bcip染色液，将24孔板置于 37℃环境下染色1h。取出后轻轻吸去染色液，用纯水洗涤各孔。洗净后将细胞培养板倒扣于实验桌面上挥干多余水分，置于倒置显微镜下拍照。
59.结果见图2中a，不同配比组合物作用于mc3t3-e1细胞均能显著增强细胞内alp表达，其中组合物c和组合物a促进细胞内alp表达优于组合物b和组合物d，且不同组合物均优于阳性对照药物提取组。
60.(4)茜素红染色：精密称取tris粉末605.7mg，用双蒸水溶解制备得到0.05 m tris溶液。精密移取8.58ml浓盐酸至1000ml容量瓶中，用双蒸水定容至1000ml，即得0.1m hcl溶液。往0.05m tris溶液中逐滴滴入0.1mhcl溶液，至ph为8.3，即得ph8.3的tris-hcl溶液。取适量茜素红粉末，置于研钵研细，用万分之一电子天平精密称取500mg，加入到上述ph 8.3tris-hcl溶液，玻璃棒搅拌助溶，滤纸过滤，取续滤液即得0.5％茜素红染色液，室温备用。按照步骤(3)项下进行细胞铺板和给药处理。分别给药作用10天后，弃去培养液，每孔加入300μl pbs洗去孔中残留液体，再加入400μl过滤得到备用的0.5％茜素红染色液，将24孔板置于37℃环境下染色0.5h。取出后弃去染色液，用纯水洗涤各孔。洗净后将细胞培养板倒扣于实验桌面上挥干多余水分，置于倒置显微镜下拍照。
61.结果见图2中b，茜素红染色表明不同配比组合物作用于mc3t3-e1细胞均能显著增强细胞钙化结节形成，从而促进成骨分化；其中组合物c和组合物a 促进细胞成骨分化能力优于组合物b和组合物d，且不同组合物均优于阳性对照药物提取组。
62.3.实验结果
63.组合物a、组合物c作用于c3h10t1/2和mc3t3-e1细胞能够显著促进细胞增殖；组合物a、组合物c作用于mc3t3-e1显著增强细胞内alp含量，效果优于阳性对照药物提取组；组合物a、组合物b、组合物c和组合物d作用于mc3t3-e1细胞增加钙化结节含量效果显著优于阳性对照药物提取组。
64.实施例7、不同配比组合物促间充质干细胞c3h10t1/2增殖实验
65.(1)细胞培养：c3h10t1/2细胞常规贴壁生长，传代培养于细胞培养基(同实施例6)中，37℃、5％co2及饱和湿度的细胞培养箱中孵育，2d换液，3d传代1次，共传代2次。
66.(2)0.5％结晶紫染液配制，同实施例6。
67.(3)碱性磷酸酶(alp)染色：取对数生长期c3h10t1/2细胞，制备成8
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103 个/ml细胞悬液，将实施例1-4中的组合物a、组合物b、组合物c采用实施例 6步骤(3)项下进行铺板、贴壁、给药。作用10天后弃去培养液，每孔加入300μl 的pbs轻洗每孔残留培养基，再加入400μl事先混匀的1-steptmnbt/bcip染色液，将24孔板置于37℃环境下染色1h。取出后轻轻吸去染色液，用纯水洗涤各孔。洗净后将细胞培养板倒扣于实验桌面上挥干多余水分，置于倒置显微镜下拍照(结果见图3中a)。随后，向每孔加入1ml分析纯甲醇，于摇床上振荡 10min(室温)。每孔移取100μl置新的96孔细胞板中，利用酶标仪在波长为 570nm处测定od值，alp相对表达＝(药物处理组od-空白组od)/空白组 od。按照上述公式计算相对空白对照alp表达差异倍数结果见图3中b。
68.图3表明不同配比组合物作用于c3h10t1/2细胞均能显著增强细胞内alp 表达，其中组合物c和组合物a促进细胞内alp表达优于组合物b。
69.(4)细胞集落形成试验法：取对数生长期c3h10t1/2细胞，利用含有 0.25％edta的胰酶消化培养瓶内细胞并加入2ml细胞培养基，吹打，制备成单细胞混悬液，分别用细胞培养基调整为12*10^3个/ml(记为细胞浓度1)，4*10^3 个/ml(记为细胞浓度2)。各自接种于24孔培养板中(500μl/孔)，37℃，5％ co2培养至细胞贴壁。每个细胞浓度的24孔板设置空白组、给药组和阳性对照组，其中空白组加入100μl/孔的细胞培养基；给药组分别按100μl/孔加入细胞培养基配制的1.25μg/ml实施例1-3中的组合物a、组合物b、组合物c的培养液；阳性对照组按100μl/孔加入细胞培养基配制的以生药量计1.25μg/ml实施例5制备的阳性对照药物提取物的培养液。各组给药后转入培养箱中继续培养3 天、10天(每隔3天换一次液)。采用细胞集落形成试验法-结晶紫染色法，于规定时间吸取原培养液，pbs清洗3次，用4℃预冷4％多聚甲醛溶液固定15min，后弃去4％多聚甲醛溶液，再用pbs清洗1次，每孔加入0.5％结晶紫染液，浸没孔表面，染色30min，后用流动的自来水洗去多余结晶紫溶液，洗至无颜色为止。将培养板倒置于室温中，使之干燥。利用显微镜扫描仪扫描获取各孔细胞克隆形成图片(结果见图4)。随后，向每孔加入1ml分析纯甲醇，于摇床上振荡 10min(室温)，充分溶解后。每孔移取100μl置新的96孔细胞板中，利用酶标仪在波长为570nm处测定od值，细胞增殖率＝(药物处理组od-空白组od) /空白组od
×
100％按照上述公式计算间充干细胞增殖率(结果见图5)。
70.图4，图5表明不同配比组合物作用于c3h10t1/2细胞均能显著增强间充干细胞增殖，其中组合物c和组合物a促进间充干细胞增殖优于组合物b。
71.实验结果：图3、图4和图5，本发明中不同组合物作用于细胞后，均可促进间充干细胞增殖，组合物a和组合物c优于组合物b和阳性对照药物提取组，且具有统计学差异，p＜0.01。
72.实施例8、不同配比组合物增强小鼠成骨前体细胞mc3t3e1碱性磷酸酶活性实验
73.(1)实验方法：取对数生长期生长状态良好的mc3t3-e1细胞，利用胰酶消化制成细胞混悬液，分别用实施例6细胞培养基调整为12*10^3个/ml(记为细胞浓度1)，4*10^3个/ml(记为细胞浓度2)，分别按500μl/孔接种于24孔培养板中，常规培养至细胞贴壁。设置空白
组，给药组和阳性对照组，其中空白组加入100μl/孔的细胞培养基；给药组分别按100μl/孔加入细胞培养基配制的 1.25μg/ml实施例1-3中的组合物a、组合物b、组合物c的培养液；阳性对照组按100μl/孔加入细胞培养基配制的以生药量计1.25μg/ml实施例5制备的阳性对照药物提取物的培养液。各组转入培养箱中继续培养3天、10天(每隔3 天换一次液)。采用wako labassay
tm
alp alkaline phosphatase assay kit碱性磷酸酶定量检测盒测定细胞内alp含量，细胞培养后，除去培养基，用pbs冲洗，各孔添加150μl 0.05％的曲拉通x，进行冻结
→
融化
→
冻结
→
融化操作，温度设定4℃，以15,000rpm离心15分钟处理。将上清液移到新的辅助管，以此作为细胞内测定alp含量的样品。依据定量检测试剂盒说明书，向96孔微孔板内添加100μl底物缓冲液和20μl样品。在摇床上充分振荡1分钟后，37℃孵育15分钟。再添加80μl反应终止液，再在摇床上充分振荡1分钟，用酶标仪测量405nm处的吸光值。同样方法进行空白(蒸馏水)对照和碱性磷酸酶标准品的检测。alp相对含量＝(药物处理组od-空白组od)/(标准品od-空白组 od)
×
100％
74.(2)实验结果：由图6，本发明从第3天到第10天，各组别的alp活性均有明显统计学差异，alp活性增加，组合物a、组合物b、组合物c均优于阳性对照药物提取组。
75.实施例9、小鼠去卵巢致骨质疏松症模型构建方法和骨密度(bmd)的测定
76.(1)实验动物：icr小鼠60只，清洁级，雌性、体重约20
±
5g，购自浙江中医药大学动物实验中心，实验在浙江中医药大学动物实验中心进行，室温 20～23℃，相对湿度60％～70％，12小时交替光照。
77.(2)模型构建方法：将小鼠头部放在含有恒定流量异氟烷的管道中，通过在麻醉条件下，打开小鼠腹腔，手术切除小鼠卵巢并缝合腹腔，建立小鼠骨质疏松模型。
78.(3)给药方案与测量方案：所有模型动物按体重随机分为6组，每组10只，分别为：对照组，模型组，给药组1、给药组2、给药组3和阳性对照组。对照组灌胃生理盐水，模型组灌胃等体积生理盐水，给药组1、给药组2和给药组3 分别给予实施例1-3中组合物a、b、c的生理盐水溶液(0.625g/kg体重
·
天)，阳性对照组灌胃实施例5中阳性对照提取物的生理盐水溶液(按临床给药剂量折算为6.25g/kg体重
·
天)。每组灌胃给药，每天一次，持续12周。在给药第8 周和第12周，使用dexa设备(hologic qdr 4500w；美国)测量每只动物腰椎、右股骨和左股骨的骨矿物质密度(bmd)值，不同时间点骨密度测量部位结果见图 7中a，不同时间骨密度测量值结果见图8。实验结束后，在深度麻醉下处死所有动物，采集股骨进行组织学分析。
79.(4)masson染色：在第12周实验结束后，对采集的股骨，4℃下，将股骨在4％多聚甲醛中固定5天，随后置于甲酸溶液(80％)中14天进行脱钙，然后包埋在石蜡中。组织切片并贴在带正电的载玻片上。最后，使用masson三色染色试剂盒(solarbio，北京，中国)对股骨进行染色。使用徕卡dmi6000 b显微镜(德国徕卡)对每张切片进行组织学评估，结果见图7中b。
80.(5)实验结果：由图7中a和图8中a表明去卵巢致骨质疏松症模型成功构建，图7中b和图8表明组合物a、c相较于模型组和阳性提取物组具有显著延缓骨密度下降作用(p《0.05)。
81.实施例10、组合物口服乳剂
82.组合物质量配方：反式肉桂醛50％、α-衣兰油烯4％、γ-谷甾醇8％、顺-菖蒲烯
5％、十六烷酸5％、顺-9-十八烯酸10％、亚油酸10％、亚麻酸8％。
83.口服乳剂制备：(1)按配方量，分别称取反式反式肉桂醛50g、α-衣兰油烯 4g、γ-谷甾醇8g、顺-菖蒲烯5g、十六烷酸5g、顺-9-十八烯酸10g、亚油酸10g、亚麻酸8g，混合均匀。
84.称取10g油酸钠加入蒸馏水40ml，55℃磁力搅拌水浴锅中分散均匀，作为水相；将30g豆磷脂及组合物质量配方进行混合制备含药油脂，55℃磁力搅拌水浴锅中分散均匀作为油相；在高剪切分散乳化机(hy-fa30，中国)搅拌下将水相慢慢加至油相中，6 000r/min搅拌8min得初乳，用0.1mol/l氢氧化钠水溶液或盐酸水溶液调节ph至7.5，用蒸馏水定容至100ml，均质压力50mpa，循环6次，得100ml乳白色的终乳，充氮灌装，室温下放置。
85.实施例11、组合物胶囊剂：
86.组合物质量配方：反式肉桂醛50％、α-衣兰油烯4％、γ-谷甾醇8％、顺-菖蒲烯5％、十六烷酸5％、顺-9-十八烯酸10％、亚油酸10％、亚麻酸8％。
87.胶囊剂制备：
88.(1)胶液配制：称取纯化水50g、甘油20g和山梨酸钾100g，依次加入旋转模压机胶罐内，加热至75℃后，再加入明胶20g，不断搅拌，直至明胶完全溶解，过70μm滤膜过滤，滤液即为胶液，在57～65℃下存放，备用；
89.药液配制：将反式肉桂醛50g、α-衣兰油烯4g、γ-谷甾醇8g、顺-菖蒲烯5g、十六烷酸5g、顺-9-十八烯酸10g、亚油酸10g、亚麻酸8g、维生素e10g、10g 吐温80加入配料罐内，混合均匀，获得药液；
90.压胶囊：选择旋转模压机压丸模具，在25℃、相对湿度小于35％条件下进行压丸定型后干燥，约压丸1000粒，剔除大小不合格，用95％药用乙醇洗丸后，继续干燥至含水量小于12％，目检剔除不合格胶囊，包装即得。
91.实施例12、组合物片剂：
92.组合物质量配方：反式肉桂醛50％、α-衣兰油烯4％、γ-谷甾醇8％、顺-菖蒲烯5％、十六烷酸5％、顺-9-十八烯酸10％、亚油酸10％、亚麻酸8％。
93.组合物：反式肉桂醛50g、α-衣兰油烯4g、γ-谷甾醇8g、顺-菖蒲烯5g、十六烷酸5g、顺-9-十八烯酸10g、亚油酸10g、亚麻酸8g。
94.辅料：液状石蜡10g、滑石粉25g、淀粉30g、酒石酸25g。
95.片剂的制备：将组合物与1/3量的淀粉和酒石酸混匀，制软材，过14目尼龙筛制湿颗粒，于70℃干燥，干颗粒用12目尼龙筛整粒，加入剩余的淀粉(预先 100-105℃杠燥)及吸附含有10g液状石蜡的25g滑石粉共同混匀后再过12目尼龙筛，颗粒经含量测定合格后，用12mm冲压片，约冲压片1000片，即得组合物片剂。
96.以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。