一种3的制作方法

技术特征：
1.一种3
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flag标签融合表达载体的制备方法，其特征在于，该方法为：s1、用kpni/xhoi双酶切pgl3 basic载体，在温度为37℃的条件下反应6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离后，切下4.8kb大小的条带，用dna凝胶回收试剂盒回收产物，得到kpni/xhoi双酶切pgl3 basic载体的回收产物；s2、以prgeb32bar-cas9质粒为模板，以特异性引物f1和特异性引物r1为引物进行pcr反应克隆2
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35s启动子，pcr扩增后，将pcr扩增产物用1％琼脂糖凝胶分离，切下677bp大小的条带，用dna凝胶回收试剂盒回收pcr产物，得到2
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35s启动子pcr回收产物；pcr反应体系为：2
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pfu master mix 10μl，特异性引物f11μl、特异性引物r11μl、prgeb32bar-cas9质粒1μl、灭菌超纯水补至20μl；pcr扩增的反应条件为：98℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火10s，68℃延伸40s，扩增40个循环；68℃延伸10min；所述特异性引物f1的核苷酸序列如seq id no:1所示；所述特异性引物r1核苷酸序列如seq id no:2所示；s3、利用同源重组方法将s2中得到的2
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35s启动子pcr回收产物中的2
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35s启动子连接至s1中得到的kpni/xhoi双酶切pgl3 basic载体的回收产物中pgl3 basic载体的kpni/xhoi位点之间，在温度为50℃的条件下连接反应25min，得到pgl-35s连接产物，将所述pgl-35s连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到中间载体pgl-35s；s4、将s3中得到的中间载体pgl-35s用xhoi/sali双酶切，在温度为37℃的条件下酶切反应6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离后，切下3.67kb大小的条带，用dna凝胶回收试剂盒回收产物，得到xhoi/sali双酶切中间载体pgl-35s的回收产物；s5、人工合成多克隆位点mcs正向引物和多克隆位点mcs反向引物，将所述多克隆位点mcs正向引物和所述多克隆位点mcs反向引物在95℃的条件下退火5min，得到mcs退火引物；所述多克隆位点mcs正向引物的核苷酸序列如seq id no:3所示；所述多克隆位点mcs反向引物的核苷酸序列如seq id no:4所示；s6、将s5中得到的mcs退火引物t4连接至s4中得到的xhoi/sali双酶切中间载体pgl-35s的回收产物中pgl-35s的xhoi/sali位点之间，在温度为22℃的条件下连接反应1h，得到pgl-35s-mcs连接产物；将所述pgl-35s-mcs连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到中间载体pgl-35s-mcs；s7、克隆nos ter序列：以pcambia1302质粒为模板，以特异性引物f2和特异性引物r2为引物进行pcr反应克隆nos ter序列，pcr扩增后，将pcr扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶分离，切下251bp大小的条带，用dna凝胶回收试剂盒回收pcr产物，得到nos ter序列pcr回收产物；pcr反应体系为：2
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pfu master mix 10μl，特异性引物f21μl、特异性引物r21μl、pcambia1302质粒1μl、灭菌超纯水补至20μl；pcr扩增的反应条件为：98℃预变性10min；98℃变性10s，55℃退火10s，68℃延伸20s，扩增40个循环；68℃延伸10min；所述特异性引物f2的核苷酸序列如seq id no:5所示；所述特异性引物r2核苷酸序列如seq id no:6所示；s8、将s6中得到的中间载体pgl-35s-mcs用ecori/sali双酶切，在温度为37℃的条件下酶切反应6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离后，切下3.72kb大小的条带，用dna凝胶回收试剂盒回收产物，得到ecori/sali双酶切中间载体pgl-35s-mcs的回收产物；s9、利用同源重组方法将s7中得到的nos ter序列pcr回收产物中的nos ter序列连接至s8中得到ecori/sali双酶切中间载体pgl-35s-mcs的回收产物中的pgl-35s-mcs的
ecori/sali位点之间，在温度为50℃的条件下连接反应25min，得到pgl-35s-mcs-nos连接产物，将所述pgl-35s-mcs-nos连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到中间载体pgl-35s-mcs-nos；s10、将s9中得到的中间载体pgl-35s-mcs-nos用bglii/bamhi双酶切，温度为37℃的条件下酶切反应6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离后，切下3.97kb大小的条带，用dna凝胶回收试剂盒回收产物，得到bglii/bamhi双酶切中间载体pgl-35s-mcs-nos的回收产物；s11、体外人工合成连接肽linker正向引物和连接肽linker反向引物，将所述连接肽linker正向引物和所述连接肽linker反向引物在温度为95℃的条件下退火5min，得到变性退火的连接肽linker引物；所述连接肽linker正向引物的核苷酸序列如seq id no:7所示；所述连接肽linker反向引物的核苷酸序列如seq id no:8所示；s12、将s11中得到的变性退火的连接肽linker引物t4连接至s10中得到的bglii/bamhi双酶切中间载体pgl-35s-mcs-nos的回收产物中pgl-35s-mcs-nos的bglii/bamhi位点之间，在温度为22℃的条件下连接反应1h，得到pgl-35s-mcs-linker-nos连接产物；将所述pgl-35s-mcs连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到中间载体pgl-35s-mcs-linker-nos；s13、将s12中得到的中间载体pgl-35s-mcs-linker-nos用bamhi/ecori双酶切，温度为37℃的条件下酶切反应6h后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶分离后，切下4.01kb大小的条带，用dna凝胶回收试剂盒回收产物，得到bamhi/ecori双酶切中间载体pgl-35s-mcs-linker-nos的回收产物；s14、合成3
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flag标签正向引物和3
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flag标签反向引物，将所述3
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flag标签正向引物和所述3
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flag标签反向引物在温度为95℃的条件下退火5min，得到3
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flag标签退火引物；所述3
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flag标签正向引物的核苷酸序列如seq id no:9所示；所述3
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flag标签反向引物的核苷酸序列如seq id no:10所示；s15、将s14中得到的3
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flag标签退火引物t4连接至s13中得到的bamhi/ecori双酶切中间载体pgl-35s-mcs-linker-nos的回收产物中pgl-35s-mcs-linker-nos的bamhi/ecori位点之间，在温度为22℃的条件下连接反应1h，得到pgl-35s-mcs-linker-nos连接产物；将所述pgl-35s-mcs连接产物转化到大肠杆菌中，扩增繁殖，用质粒提取试剂盒提取后，得到3
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flag标签融合表达载体，命名为3
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flag标签融合表达载体pproto-3
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flag；所述3
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flag标签融合表达载体pproto-3
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flag的核苷酸如seq id no:11所示。2.根据权利要求1所述的一种3
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flag标签融合表达载体的制备方法，其特征在于，s1中用kpni/xhoi双酶切pgl3 basic载体的酶切体系为：kpni酶1μl、xhoi酶1μl、cutsmart buffer 5μl、pgl3 basic载体10μl、灭菌超纯水补至50μl；s3中所述连接反应的反应体系为：2
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hieffclone enzyme premix 5μl、s1中得到的kpni/xhoi双酶切pgl3 basic载体的回收产物2μl、s2中得到的2
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35s启动子pcr回收产物1μl、灭菌超纯水补至10μl；s4中所述酶切反应的体系为：酶切体系为：sali酶1μl、xhoi酶1μl、cutsmart buffer 5μl、s3中得到的中间载体pgl-35s 10μl、灭菌超纯水补至50μl；s5中所述退火的反应体系为：所述多克隆位点mcs正向引物10μl、所述多克隆位点mcs反向引物10μl、灭菌超纯水补至100μl；
s6中所述连接反应的体系为：t4连接缓冲液1μl、t4连接酶1μl、s4中所述xhoi/sali双酶切中间载体pgl-35s的回收产物2μl、s5中所述mcs退火引物1μl、灭菌超纯水补至10μl；s8中所述酶切反应的体系为：ecori酶1μl、sali酶1μl、cutsmart buffer 5μl、s6中得到的中间载体pgl-35s-mcs 10μl、灭菌超纯水补至50μl；s9中所述连接反应的反应体系为：2
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hieffclone enzyme premix 5μl、s6中得到的ecori/sali双酶切中间载体pgl-35s-mcs的回收产物2μl、s7中得到的nos ter序列pcr回收产物1μl、灭菌超纯水补至10μl；s10中所述酶切反应的体系为：bglii酶1μl、bamhi酶1μl、cutsmart buffer 5μl、s9中得到的中间载体pgl-35s-mcs-nos 10μl、灭菌超纯水补至50μl；s11中所述退火的反应体系为：所述连接肽linker正向引物10μl、所述连接肽linker反向引物10μl、灭菌超纯水补至100μl；s12中所述连接反应的体系为：所述连接反应的体系为：t4连接缓冲液1μl、t4连接酶1μl、s10中所述bglii/bamhi双酶切中间载体pgl-35s-mcs-nos的回收产物2μl、s11中所述变性退火的连接肽linker引物1μl、灭菌超纯水补至10μl；s13中所述酶切反应的体系为：bamhi酶1μl、ecori酶1μl、cutsmart buffer 5μl、s12中得到的中间载体pgl-35s-mcs-linker-nos 10μl、灭菌超纯水补至50μl；s15所述连接反应的体系为：t4连接缓冲液1μl、t4连接酶1μl、s13中所述bamhi/ecori双酶切中间载体pgl-35s-mcs-linker-nos的回收产物2μl、s14中所述3
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flag标签退火引物1μl、灭菌超纯水补至10μl。3.一种如权利要求1或2制备的3
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flag标签融合表达载体的应用，其特征在于，所述3
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flag标签融合表达载体用于植物原生质体的转化。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述3
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flag标签融合表达载体用于目的蛋白在植物原生质体中的表达。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物原生质体包括拟南芥原生质体、玉米原生质体。

技术总结
本发明提供了一种3


技术研发人员：徐玉芳 姚文 李涛 张会勇 林楠 孙玉慧 连红梅 贾利华 李阳
受保护的技术使用者：河南农业大学
技术研发日：2021.12.02
技术公布日：2022/3/8