副干酪乳杆菌与母乳低聚糖组合物在婴幼儿配方粉中的应用的制作方法

cultures)，保藏编号dsm27447；另外，副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei subsp.paracasei)k56菌株也已于2017年12月29日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(china general microbiological culture collection center,cgmcc)，保藏编号cgmcc no.15139；副干酪乳杆菌k56是已在cn 107916236 a中公布的生物材料，是公众可以得到的。
19.保藏编号cgmcc no.15077的副干酪乳杆菌在本发明中亦命名为副干酪乳杆菌et-22。该菌株已2017年12月18日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名：副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)；保藏编号cgmcc no.15077。副干酪乳杆菌et-22菌株是已在cn110964653a中公布的生物材料，是公众可以得到的。
20.根据本发明的具体实施方案，本发明的应用于制备婴幼儿配方粉的副干酪乳杆菌与母乳低聚糖的组合物中，所述母乳低聚糖包括2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
’‑
岩藻糖基乳糖、乳糖-n-四糖、3
’‑
唾液酸基乳糖、6
’‑
唾液酸基乳糖中的一种或多种。
[0021]2’‑
岩藻糖基乳糖(2
’‑
fucosyllactose，2
’‑
fl)，为岩藻糖与乳糖形成的三糖结构，是岩藻糖基类低聚糖的代表性物质。市售该物质通常为经微生物发酵法制备，与人乳中发现的2
’‑
岩藻糖基乳糖具有相同结构。
[0022]
3-岩藻糖基乳糖(3-fucosyllactose，3-fl)，为岩藻糖与乳糖形成的三糖结构，与2
’‑
岩藻糖基乳糖互为同分异构体，是岩藻糖基类低聚糖的代表性物质。市售该物质通常为经微生物发酵法制备，与人乳中发现的3-岩藻糖基乳糖具有相同结构。
[0023]
乳糖-n-四糖(lacto-n-tetraose，lnt)，为乳糖与四糖形成的六糖结构，是以核心糖链为基础结构且不含岩藻糖基或唾液酸基的低聚糖的代表性物质，市售该物质通常为经微生物发酵法制备，且与人乳中发现的乳糖-n-四糖具有相同结构。
[0024]3’‑
唾液酸基乳糖(3
’‑
sialyllactose，3
’‑
sl)，为唾液酸与乳糖形成的三糖结构，与6
’‑
唾液酸基乳糖互为同分异构体，是唾液酸基类低聚糖的代表性物质。市售该物质通常为经微生物发酵法制备，与人乳中发现的3
’‑
唾液酸基乳糖具有相同结构。
[0025]6’‑
唾液酸基乳糖(6
’‑
sialyllactose，6
’‑
sl)，为唾液酸与乳糖形成的三糖结构，与3
’‑
唾液酸基乳糖互为同分异构体，是唾液酸基类低聚糖的代表性物质。市售该物质通常为经微生物发酵法制备，与人乳中发现的6
’‑
唾液酸基乳糖具有相同结构。
[0026]
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用于制备婴幼儿配方粉的副干酪乳杆菌与母乳低聚糖的组合物中，2
’‑
岩藻糖基乳糖在所述母乳低聚糖中的含量为0％-73％，优选为0％-63％，进一步优选为0％-58％，更进一步优选为2％-55％，例如可以为3％-8％、25％-35％或51％-56％，更具体可以为5％、30％或53％。本发明中，除特别注明外，各母乳低聚糖的含量是以母乳低聚糖中的2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
’‑
岩藻糖基乳糖、乳糖-n-四糖、3
’‑
唾液酸基乳糖、6
’‑
唾液酸基乳糖的总重量之和为100％计。
[0027]
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用于制备婴幼儿配方粉的副干酪乳杆菌与母乳低聚糖的组合物中，3
’‑
岩藻糖基乳糖在所述母乳低聚糖中的含量为0％-61％，优选为11％-51％，进一步优选为16％-46％，更进一步优选为20％-44％，例如可以为18％-23％、25％-35％或40％-45％，更具体可以为21％、30％或41％。
[0028]
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用于制备婴幼儿配方粉的副干酪乳杆菌
与母乳低聚糖的组合物中，乳糖-n-四糖在所述母乳低聚糖中的含量为0％-52％，优选为6％-42％，进一步优选为11-37％，更进一步优选为13％-35％，例如可以为13％-18％、22％-27％或30％-35％，更具体可以为16％、25％或32％。
[0029]
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用于制备婴幼儿配方粉的副干酪乳杆菌与母乳低聚糖的组合物中，3
’‑
唾液酸基乳糖在所述母乳低聚糖中的含量为0％-42％，优选为0％-32％，进一步优选为0％-27％，更进一步优选为2％-25％，例如可以为2％-7％、10％-15％或20％-25％，更具体可以为5％、12％或22％。
[0030]
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用于制备婴幼儿配方粉的副干酪乳杆菌与母乳低聚糖的组合物中，6
’‑
唾液酸基乳糖在所述母乳低聚糖中的含量为0％-25％，优选为0％-15％，进一步优选为0％-10％，更进一步优选为0％-8％，例如可以为3％-8％，更具体可以为3％或5％。
[0031]
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用于制备婴幼儿配方粉的副干酪乳杆菌与母乳低聚糖的组合物中，所述母乳低聚糖是由2
’‑
岩藻糖基乳糖(2
’‑
fl)、3-岩藻糖基乳糖(3-fl)、乳糖-n-四糖(lnt)、3
’‑
唾液酸基乳糖(3
’‑
sl)和6
’‑
唾液酸基乳糖(6
’‑
sl)中的至少二种、至少三种或至少四种组成的组合。
[0032]
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用于制备婴幼儿配方粉的副干酪乳杆菌与母乳低聚糖的组合物中，所述母乳低聚糖包括重量比例(0％-73％):(0％-61％):(0％-52％):(0％-42％):(0％-25％)的2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
’‑
岩藻糖基乳糖、乳糖-n-四糖、3
’‑
唾液酸基乳糖、6
’‑
唾液酸基乳糖中的至少三种或四种。
[0033]
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用于制备婴幼儿配方粉的副干酪乳杆菌与母乳低聚糖的组合物中，所述母乳低聚糖包括重量比例(0％-63％):(11％-51％):(6％-42％):(0％-32％):(0％-15％)的2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
’‑
岩藻糖基乳糖、乳糖-n-四糖、3
’‑
唾液酸基乳糖、6
’‑
唾液酸基乳糖中的至少三种或四种。
[0034]
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用于制备婴幼儿配方粉的副干酪乳杆菌与母乳低聚糖的组合物中，所述母乳低聚糖包括重量比例(0～63％):(11～51％):(6～42％):(0～22％):(0～8％)的2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
’‑
岩藻糖基乳糖、乳糖-n-四糖、3
’‑
唾液酸基乳糖、6
’‑
唾液酸基乳糖。
[0035]
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用于制备婴幼儿配方粉的副干酪乳杆菌与母乳低聚糖的组合物中，所述母乳低聚糖包括重量比例(0％-58％):(16％-46％):(11％-37％):(0％-27％):(0％-10％)的2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
’‑
岩藻糖基乳糖、乳糖-n-四糖、3
’‑
唾液酸基乳糖、6
’‑
唾液酸基乳糖中的至少三种或四种。
[0036]
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用于制备婴幼儿配方粉的副干酪乳杆菌与母乳低聚糖的组合物中，所述母乳低聚糖包括重量比例(0％-55％):(20％-44％):(13％-35％):(2％-25％):(0％-8％)的2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
’‑
岩藻糖基乳糖、乳糖-n-四糖、3
’‑
唾液酸基乳糖、6
’‑
唾液酸基乳糖。
[0037]
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用于制备婴幼儿配方粉的副干酪乳杆菌与母乳低聚糖的组合物中，所述母乳低聚糖包括重量比例(0～53％):(21～41％):(16～32％):(5～22％):(0～5％)，优选为(5～53％):(21～41％):(16～32％):(5～22％):(0～5％)，更优选为(5～53％):(21～41％):(16～32％):(5～22％):(3～5％)的2
’‑
岩藻糖基
乳糖、3
’‑
岩藻糖基乳糖、乳糖-n-四糖、3
’‑
唾液酸基乳糖、6
’‑
唾液酸基乳糖。
[0038]
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用于制备婴幼儿配方粉的副干酪乳杆菌与母乳低聚糖的组合物中，所述母乳低聚糖包括重量比例(30％-53％):(21％-30％):(16％-25％):(5％-12％):(3％-5％)的2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
’‑
岩藻糖基乳糖、乳糖-n-四糖、3
’‑
唾液酸基乳糖、6
’‑
唾液酸基乳糖。
[0039]
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用于制备婴幼儿配方粉的副干酪乳杆菌与母乳低聚糖的组合物中，所述母乳低聚糖包括重量比例(33％-73％):(1％-41％):(0％-36％):(0％-25％):(0％-25％)，优选为(43％-63％):(11％-31％):(6％-26％):(0％-15％):(0％-15％)，更优选为(48％-58％):(16％-26％):(11％-21％):(0％-10％):(0％-10％)，最优选为(51％-56％):(18％-23％):(13％-18％):(2％-7％):(3％-8％)的2
’‑
岩藻糖基乳糖、3
’‑
岩藻糖基乳糖、乳糖-n-四糖、3
’‑
唾液酸基乳糖、6
’‑
唾液酸基乳糖。
[0040]
根据本发明的具体实施方案，本发明的应用于制备婴幼儿配方粉的副干酪乳杆菌与母乳低聚糖的组合物中，所述副干酪乳杆菌与母乳低聚糖的比例为1
×
103cfu～1
×
10
12
cfu：0.1g～10g，优选为1
×
106cfu～1
×
10
10
cfu：1g～10g。在本发明的一些更具体实施方案中，所述副干酪乳杆菌与母乳低聚糖的比例为1
×
108cfu：0.08g～0.3g。所述副干酪乳杆菌与母乳低聚糖的比例是以二者在同一组合物中的用量计。
[0041]
根据本发明的具体实施方案，本发明的组合物的应用中，所述提升生物体对金黄色葡萄球菌感染抵御能力包括：提升个体预防金黄色葡萄球菌感染的能力，降低金黄色葡萄球菌感染个体的能力，和/或缓解金黄色葡萄球菌感染引起的各种症状例如食物中毒(包括恶心、呕吐、头晕等)、肠炎、肺炎、皮肤感染、伤口溃烂或脑膜炎等。
[0042]
根据本发明的具体实施方案，本发明的组合物的应用中，所述生物体包括动物或人。
[0043]
本发明的婴幼儿配方粉，因包括所述的副干酪乳杆菌与母乳低聚糖的组合物而具有可有效提升生物体对金黄色葡萄球菌感染的抵御能力和/或可提高生物体先天免疫抗衰老功效。
[0044]
另一方面，本发明还提供了一种制备所述婴幼儿配方粉的方法，该方法采用湿法或干法或干湿复合生产工艺，将副干酪乳杆菌和母乳低聚糖组合物与配方中的其他原料混合，制备所述母乳化婴幼儿配方粉。其制备的工艺流程主要包括：配料、均质、浓缩杀菌、喷雾干燥、干混得到成品。本发明中，副干酪乳杆菌可以在配料时一起混料(在婴儿配方粉中以灭活形式存在)，优选在后混料过程中添加(在婴儿配方粉中以活菌形式存在)。本发明中，母乳低聚糖可以在配料时一起混料，也可以在后混料过程中添加。
[0045]
综上所述，本发明发现包括副干酪乳杆菌和母乳低聚糖的所述组合物具有可抗衰老、提高生物体先天免疫、可有效提升生物体对金黄色葡萄球菌感染的抵御能力，将其应用于婴幼儿配方粉中可抗感染、提高免疫力，具有广泛的应用前景。
附图说明
[0046]
图1显示10mg/ml的母乳低聚糖组合物a与副干酪乳杆菌et-22的组合物对秀丽隐杆线虫受到金黄色葡萄球菌感染时存活率的影响。图中各组别在感染阶段添加的干预物(益生菌和/或hmo)情况分别与培养阶段相同。
[0047]
图2显示30mg/ml的母乳低聚糖组合物a与副干酪乳杆菌et-22的组合物对秀丽隐杆线虫受到金黄色葡萄球菌感染时存活率的影响。图中各组别在感染阶段添加的干预物(益生菌和/或hmo)情况分别与培养阶段相同。
[0048]
图3显示10mg/ml的母乳低聚糖组合物a与副干酪乳杆菌k56的组合物对秀丽隐杆线虫受到金黄色葡萄球菌感染时存活率的影响。图中各组别在感染阶段添加的干预物(益生菌和/或hmo)情况分别与培养阶段相同。
[0049]
图4显示30mg/ml的母乳低聚糖组合物a与副干酪乳杆菌k56的组合物对秀丽隐杆线虫受到金黄色葡萄球菌感染时存活率的影响。图中各组别在感染阶段添加的干预物(益生菌和/或hmo)情况分别与培养阶段相同。
[0050]
图5为母乳低聚糖组合物a与副干酪乳杆菌et-22菌株或k56菌株的组合物对秀丽隐杆线虫受到金黄色葡萄球菌感染时第三天的存活率的影响。图中各组别在感染阶段添加的干预物(益生菌和/或hmo)情况分别与培养阶段相同。
[0051]
图6为母乳低聚糖组合物a与副干酪乳杆菌et-22菌株或k56菌株的组合物对秀丽隐杆线虫受到金黄色葡萄球菌感染时第五天的存活率的影响。图中各组别在感染阶段添加的干预物(益生菌和/或hmo)情况分别与培养阶段相同。
[0052]
图7为庆大霉素圆片扩散抑菌圈实验结果图。
[0053]
图8a-图8b为副干酪乳杆菌圆片扩散抑菌圈实验结果图；其中，图8a为副干酪乳杆菌et-22菌株圆片扩散抑菌圈实验结果图，图8b为副干酪乳杆菌k56菌株圆片扩散抑菌圈实验结果图。
[0054]
图9显示hmo组合物a(8mg/ml)与副干酪乳杆菌k56(1
×
108cfu)单独及形成组合物后对于金葡菌感染情况下线虫存活率的影响。
[0055]
图10显示hmo组合物g(8mg/ml)与副干酪乳杆菌k56(1
×
108cfu)单独及形成组合物后对于金葡菌感染情况下线虫存活率的影响。
[0056]
图11显示hmo组合物h(8mg/ml)与副干酪乳杆菌k56(1
×
108cfu)单独及形成组合物后对于金葡菌感染情况下线虫存活率的影响。
[0057]
图12显示hmo组合物j(8mg/ml)与副干酪乳杆菌k56(1
×
108cfu)单独及形成组合物后对于金葡菌感染情况下线虫存活率的影响。
[0058]
图13显示hmo组合物g(10mg/ml)与副干酪乳杆菌k56(1
×
108cfu)单独及形成组合物后对于金葡菌感染情况下线虫存活率的影响。
[0059]
图中：*代表p《0.05,**代表p《0.01,***代表p《0.001,****代表p《0.0001，ns代表没有显著性差异(not significant)。
具体实施方式
[0060]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0061]
除非另外专门定义，本文使用的所有技术和科学术语都与相关领域普通技术人员的通常理解具有相同的含义。实施例中所用副干酪乳杆菌为保藏编号为cgmcc no.15077的
副干酪乳杆菌和/或保藏编号为cgmcc no.15139或dsm27447的副干酪乳杆菌。实施例中未详细注明的操作条件，按照所属领域的常规操作进行。
[0062]
实施例1
[0063]
本实施例提供一种0～6月龄的婴儿配方奶粉，该粉状配方食品中总蛋白质含量为10.3g/100g粉，脂肪含量为27.8g/100g粉；碳水化合物含量为53.9g/100g粉；母乳低聚糖组合物含量2.8g/100g粉。副干酪乳杆菌含量2.7
×
109cfu/100g。hmos组合物的组成及比例如下，2
’‑
岩藻糖基乳糖(2
’‑
fl)：3
’‑
岩藻糖基乳糖(3
’‑
fl)：乳糖-n-四糖(lnt)：3
’‑
唾液酸基乳糖(3
’‑
sl)：6
’‑
唾液酸基乳糖(6
’‑
sl)＝53：21：16：5：5。
[0064]
本实施例由以下重量份的原料复配实现，其原料组成包括(制备1000份重量)：
[0065]
生牛乳1700份，脱盐乳清粉450份，乳糖80份，混合植物油100份，opo结构油脂110份，母乳低聚糖组合物30份，副干酪乳杆菌0.18份，复配维生素3份，复配矿物质18份。
[0066]
本实施例的婴儿配方粉采用干湿复合生产工艺制备而成，主要包括：配料，预热，均质，浓缩杀菌，喷雾干燥，干混添加hmo与乳双歧杆菌，得到成品。
[0067]
实施例2
[0068]
本实施例提供一种6～12月龄的较大婴儿配方羊奶粉，该粉状配方食品中总蛋白质含量为12.5g/100g粉，脂肪含量为22.9g/100g粉；碳水化合物含量为57.9g/100g粉；母乳低聚糖(3-岩藻糖基乳糖)含量1.9g/100g粉。副干酪乳杆菌含量1.5
×
109cfu/100g。hmos组合物的组成及比例如下，2
’‑
岩藻糖基乳糖(2
’‑
fl)：3
’‑
岩藻糖基乳糖(3
’‑
fl)：乳糖-n-四糖(lnt)：3
’‑
唾液酸基乳糖(3
’‑
sl)＝5：41：32：22。
[0069]
本实施例由以下重量份的原料复配实现，其原料组成包括(制备1000份重量)：
[0070]
脱盐乳清粉(羊)275份，全脂羊奶粉225份，乳糖275份，混合植物油份150份(含opo结构脂)，乳清蛋白粉(羊)40份，母乳低聚糖组合物20份，副干酪乳杆菌k56 0.1份，复配维生素3.5份，复配矿物质17份。
[0071]
本实施例的婴儿配方粉采用干湿复合生产工艺制备而成，主要包括：配料，预热，均质，浓缩杀菌，喷雾干燥，干混添加hmo与乳双歧杆菌，得到成品。
[0072]
实施例3
[0073]
本实施例提供一种12～36月龄的幼儿配方奶粉，该粉状配方食品中总蛋白质含量为13.3g/100g粉，脂肪含量为29.4g/100g粉；碳水化合物含量为48.5g/100g粉；母乳低聚糖(3-岩藻糖基乳糖)含量0.9g/100g粉。副干酪乳杆菌含量7.5
×
108cfu/100g。hmos组合物的组成及比例如下，2
’‑
岩藻糖基乳糖(2
’‑
fl)：3
’‑
岩藻糖基乳糖(3
’‑
fl)：乳糖-n-四糖(lnt)：3
’‑
唾液酸基乳糖(3
’‑
sl)：6
’‑
唾液酸基乳糖(6
’‑
sl)＝30：30：25：12：3。
[0074]
本实施例由以下重量份的原料复配实现，其原料组成包括(制备1000份重量)：
[0075]
生牛乳3100份，脱盐乳清粉100份，乳糖270份，混合植物油份180份(含opo结构脂)，乳清蛋白粉45份，低聚半乳糖20份，低聚果糖5份，母乳低聚糖组合物10份，副干酪乳杆菌k56 0.05份，复配维生素3.5份，复配矿物质17份。
[0076]
本实施例的幼儿配方粉采用干湿复合生产工艺制备而成，主要包括：配料，预热，均质，浓缩杀菌，喷雾干燥，干混添加hmo与副干酪乳杆菌，得到成品。
[0077]
副干酪乳杆菌与母乳低聚糖组合物功效实验
[0078]
1受试母乳低聚糖样品
[0079]
表1
[0080][0081][0082]
hmo的组合物a、g、h、j的各组分及含量比例如表2：
[0083]
表2
[0084][0085]
用蒸馏水配置母乳低聚糖溶液，并在含有不同终浓度(分别是1、10、30mg/ml)的线虫生长培养基的培养皿中进行培养。
[0086]
用补充了1％半胱氨酸的mrs培养基来培养受试的益生菌，并在37℃厌氧环境中孵育过夜。收获细胞并用生理盐水溶液冲洗，调整细菌浓度将其接种在含有线虫生长培养基的平皿中，终浓度为1
×
108cfu。
[0087]
2线虫感染模型
[0088]
获取了年龄一致的线虫并将其培养在含线虫琼脂培养基(ngm培养基，且线虫培养基中含有大肠杆菌op50为食物)的培养皿中，添加了不同剂量的hmo组合(8mg/ml，10mg/ml，30mg/ml)与益生菌(1
×
108cfu)组合物进行共培养(每个线虫培养皿中加入的液体总体积是10ml。对于浓度为10mg/ml的hmo受试组，每个培养皿中hmo的最终量是100mg；对于浓度分别为8mg/ml和30mg/ml的hmo受试组，每个培养皿中hmo的最终量分别是80mg和300mg。因此每个培养皿平板中，益生菌与hmo的添加量比例为：1
×
108cfu：80mg-300mg)。在线虫成年后，它们被转移到接种了金黄色葡萄球菌atcc25923的培养皿中，添加量为108～109cfu/ml，来模拟受到金黄色葡萄球菌感染的情况。各组别在感染阶段添加的干预物(益生菌和/或hmo)情况分别与培养阶段相同。使用了两个对照，分别是没有致病菌的条件(线虫培养皿中含有大肠杆菌op50)，以及有致病菌金黄色葡萄球菌感染但没有任何干预物的(只含有金黄色葡萄球菌的培养皿)。另设置培养阶段添加干预物而感染阶段没有任何干预物的组别、以及培养阶段未添加干预物而感染阶段添加干预物的组别。
[0089]
将线虫培养几天后，对它们的存活率进行每日计数。如果线虫对铂丝没有反应，则可被认为是死亡。每种条件均进行了两次独立测定。
[0090]
对存活曲线进行了统计学的比较分析，用graphpad prism 4或graphpad prism 9统计学软件包进行了log rank survival显著性分析。关于对线虫存活率的影响各组间在每一天体现的差异，先用two-way anova进行分析，再用tukey’s post hoc test进行各组间的比较，对于hmo组合物单独或益生菌单独组同益生元益生菌混合组的区别，在图上用星号标出。用one-way anova与dunnett’s post hoc test分析感染第三天或第五天各组存活率的显著性差异。
[0091]
3圆片扩散抑菌圈实验
[0092]
为确定受试物质是否本身具有抗菌效果，进行了圆片扩散的抑菌圈实验。用无菌的滤纸制成圆片，并接入受试的hmo物质(10mg/ml，30mg/ml)或益生菌(1
×
108cfu)，并将圆片在无菌条件下干燥过夜。将金黄色葡萄球菌atcc25923(1.0
×
106cfu/ml)均匀涂抹在ngm琼脂平板表面，随后再将圆片放置于接种的琼脂平板培养皿表面。庆大霉素(200μg/ml)作为阳性对照。所有培养皿在37摄氏度下培养18小时。通过观察在圆片周围是否形成透明的环状圈来确认受试物质是否能直接抑制细菌生长或者具有抗菌活性。
[0093]
4实验结果
[0094]
(1)母乳低聚糖组合物a与副干酪乳杆菌et-22组合物对秀丽隐杆线虫受到金黄色葡萄球菌感染时存活率的影响
[0095]
实验前准备步骤以及具体实验方法请见前述段落。
[0096]
副干酪乳杆菌et-22与两种不同剂量的五种hmo组合物对秀丽隐杆线虫受到金葡菌感染存活率的影响如图1和图2所示。在整个实验周期，hmo组合物在10mg/ml时，益生元益生菌组合物比hmo组合物单独或益生菌单独的效果均显著的好(p《0.0001)。而hmo组合物在30mg/ml时，在整个实验周期，hmo与益生菌组合物并未体现优势(图2)。
[0097]
如图1所示，在hmo组合物为10mg/ml时，益生元hmo和益生菌et-22的组合物在第4、5天效果显著好于益生菌单独的组(第4天：p《0.05；第5天：p《0.0001)，在第3、4天显著好于hmo组合物单独的组(p《0.05)。在观察是否有协同效应时，将hmo与益生菌组合物的存活率数值与单独hmo组合或单独益生菌作比较，发现hmo与益生菌组合物存活率在第4天显著高于单独hmo组合与单独益生菌存活率数值的加和，体现了hmo与益生菌组合物的协同效应(表3)。
[0098]
表3
[0099][0100]
图5和图6显示了在感染第三天和第五天，hmo组合物与益生菌形成的组合物对秀丽隐杆线虫存活率影响的比较。在感染第三天，益生元与益生菌et-22或k56各自形成的组
合物效果较好，与其他组别相比有显著差异(p《0.001)。
[0101]
此外，本发明的实验显示，培养阶段添加了hmo和et-22的组合干预物而感染阶段没有添加任何干预物的组别的秀丽隐杆线虫存活率，显著高于培养阶段及感染阶段均未添加干预物的组别。
[0102]
为了研究在此前测试中所出现的，hmo与益生菌组合物对于应对金黄色葡萄球菌感染起到的保护作用，是否来源于直接的杀菌或者抑菌功能，进行了受试物质和菌群一起培养并观察是否有抑菌圈形成的测试。如图8a所示，et-22未在接种点周围形成透明的环状抑菌圈。而阳性对照庆大霉素(gentamicin)则显示出了抑菌效果(图7)，以透明环状抑菌圈的产生作为标志。此外，各hmo单体在两个不同浓度下(10mg/ml，30mg/ml)的抑菌圈实验也有类似结果，各母乳低聚糖单体并不能直接抑制金葡菌生长。可见，本研究中体现的母乳低聚糖组合物和益生菌et-22的组合物对于线虫受到金黄色葡萄球菌感染的保护作用并非源于物质可以直接杀菌。
[0103]
(2)母乳低聚糖组合物a与副干酪乳杆菌k56组合物对秀丽隐杆线虫受到金黄色葡萄球菌感染时存活率的影响
[0104]
实验前准备步骤以及具体实验方法请见前述段落。
[0105]
副干酪乳杆菌k56与两种不同剂量的五个hmo组合物对秀丽隐杆线虫受到金葡菌感染存活率的影响如图3和图4所示。在整个实验周期，hmo组合物在10mg/ml时，益生元益生菌组合物比hmo组合物单独或益生菌单独的效果均显著的好(p《0.0001)。而hmo组合物在30mg/ml时，在整个实验周期，hmo与益生菌组合物并未体现优势。
[0106]
如图3所示，在hmo组合物为10mg/ml时，益生元hmo和益生菌k56的组合物在第3、4、5天效果显著好于hmo组合物单独的组(第4、5天：p《0.05；第3天：p《0.0001)。在观察是否有协同效应时，将hmo与益生菌组合物的存活率数值与单独hmo组合或单独益生菌作比较，发现hmo与益生菌组合物存活率在第4天和第5天均显著高于单独hmo组合与单独益生菌存活率数值的加和，体现了hmo与益生菌组合物的协同效应(表4)。
[0107]
表4
[0108][0109]
图5和图6显示了在感染第三天和第五天，hmo组合物与四种益生菌形成的组合物对秀丽隐杆线虫存活率影响的比较。在感染第三天，益生元与益生菌hn001、et-22或k56各自形成的组合物效果较好，与其他组别相比有显著差异(p《0.001)。在感染第五天，益生元与hn019或k56形成的组合物相比于其他受试组，效果较好。
[0110]
此外，本发明的实验显示，培养阶段添加了hmo和k56的组合干预物而感染阶段没有添加任何干预物的组别的秀丽隐杆线虫存活率，显著高于培养阶段及感染阶段均未添加干预物的组别。
[0111]
为了研究在此前测试中所出现的，hmo与益生菌组合物对于应对金黄色葡萄球菌感染起到的保护作用，是否来源于直接的杀菌或者抑菌功能，进行了受试物质和菌群一起培养并观察是否有抑菌圈形成的测试。如图8b所示，k56未在接种点周围形成透明的环状抑菌圈。而阳性对照庆大霉素(gentamicin)则显示出了抑菌效果(图7)，以透明环状抑菌圈的产生作为标志。此外，各hmo单体在两个不同浓度下(10mg/ml，30mg/ml)的抑菌圈实验也有类似结果，各母乳低聚糖单体并不能直接抑制金葡菌生长。可见，本研究中体现的母乳低聚糖组合物和益生菌k56的组合物对于线虫受到金黄色葡萄球菌感染的保护作用并非源于物质可以直接杀菌。
[0112]
(3)hmo组合物a(8mg/ml)与副干酪乳杆菌k56单独及形成组合物后对于金葡菌感染情况下线虫存活率的影响
[0113]
结果参见图9。可以看出，在培养后第一天到第五天，8mg/ml的hmo组合物a与单独的益生菌k56(108cfu)均可显著提升线虫在金葡菌感染条件下的存活率，且当二者形成组合物之后，提升效果更显著(p《0.0001)。体现了益生菌k56与hmo组合物a的较好的协同效应。
[0114]
(4)hmo组合物g(8mg/ml)与副干酪乳杆菌k56单独及形成组合物后对于金葡菌感染情况下线虫存活率的影响
[0115]
结果参见图10。可以看出，在培养后第一天到第五天，8mg/ml的hmo组合物g与单独的益生菌k56(108cfu)均可显著提升线虫在金葡菌感染条件下的存活率，当二者形成组合物之后，提升效果更显著(p《0.0001)。体现了益生菌k56与hmo组合物g的较好的协同效应。
[0116]
(5)hmo组合物h(8mg/ml)与副干酪乳杆菌k56单独及形成组合物后对于金葡菌感染情况下线虫存活率的影响
[0117]
结果参见图11。可以看出，在培养后第一天到第五天，8mg/ml的hmo组合物h与单独的益生菌k56(108cfu)均可显著提升线虫在金葡菌感染条件下的存活率，当二者形成组合物之后，提升效果更显著(p《0.0001)。体现了益生菌k56与hmo组合物h的较好的协同效应。
[0118]
(6)hmo组合物j(8mg/ml)与副干酪乳杆菌k56单独及形成组合物后对于金葡菌感染情况下线虫存活率的影响
[0119]
结果参见图12。可以看出，在培养后第一天到第五天，单独的益生菌k56(108cfu)可显著提升线虫在金葡菌感染条件下的存活率，当益生菌与hmo组合物j形成组合物之后，提升效果没有进一步明显改善的趋势。
[0120]
(7)hmo组合物g(10mg/ml)与副干酪乳杆菌k56单独及形成组合物后对于金葡菌感染情况下线虫存活率的影响
[0121]
结果参见图13。可以看出，在培养后第一天到第五天，10mg/ml的hmo组合物g与单独的益生菌k56(108cfu)均可显著提升线虫在金葡菌感染条件下的存活率，当二者形成组合物之后，提升效果更显著(p《0.01)。体现了益生菌k56与hmo组合物g的较好的协同效应。