调控植物花粉管与柱头识别的硫氧还蛋白及其制备方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种调控植物花粉管与柱头识别的硫氧还蛋白及其制备方法。


背景技术：

2.植物授粉过程包括花粉在柱头上的黏附、水合、萌发出花粉管、花粉管在花柱中极性生长、花粉管到达珠孔释放精细胞与卵细胞、中央细胞融合等，这个过程受到许多基因精细而复杂的调控。授粉过程中，花粉(管)与柱头细胞的识别决定花粉在柱头表面的水合和萌发以及花粉管在柱头表面的生长。
3.因此，怎样通过花粉(管)与柱头细胞的识别，以提升花粉在柱头表面的水合和萌发以及花粉管在柱头表面的生长，成为亟待解决的问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种调控植物花粉管与柱头识别的硫氧还蛋白及其制备方法，以提升花粉在柱头表面的水合和萌发以及花粉管在柱头表面的生长。
5.为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
6.根据本发明实施例的第一方面，提供一种调控植物花粉管与柱头识别的硫氧还蛋白，所述硫氧还蛋白的序列表如seq id no.1或seq id no.2所示。
7.进一步的，所述硫氧还蛋白为含有序列表seq id no.1或seq id no.2的真核重组表达质粒petrx转化大肠杆菌dh5α获得的重组蛋白。
8.进一步的，所述调控植物花粉管与柱头识别的硫氧还蛋白的制备方法，包括以下步骤：
9.①
用引物f1和r1进行pcr扩增cdna，pcr产物纯化后与载体pbs t连接，连接混合液转化大肠杆菌，得质粒pbstrx；
10.②
将质粒pbstrx和质粒pet259用限制性内切酶ecorv酶切，酶切片段用t4dna连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，得质粒petrx；
11.③
将质粒petrx转化bl21(de3)，所得转化子bl21(de3)/petrx纯化所得重组蛋白，制得氨基酸序列表如seq id no.1或seq id no.2所示的硫氧还蛋白。
12.进一步的，以拟南芥cdna为模板。
13.进一步的，制备seq id no.1所示硫氧还蛋白的插入突变体基因为gr1-1，制备seq id no.2所示硫氧还蛋白的插入突变体基因为nrta-1。
14.进一步的，gr1-1插入到gr1的第三个内含子序列中，ntra-1插入到ntra的第1个外显子序列中。
15.进一步的，gr1的基因序列表如seq id no.3所示；ntra的基因序列表如seq id no.4所示；
16.根据本发明实施例的第二方面，提供一种硫氧还蛋白于调控植物花粉管与柱头识
dna插入突变体(这两个突变体已经在laurent et al.,pnas,2009,106:9109-9114文章中使用过)，并分别命名为gr1-1和nrta-1。gr1-1插入到gr1的第三个内含子序列中，ntra-1插入到ntra的第1个外显子序列中。通过qrt-pcr分析发现gr1和ntra分别在gr1和ntra突变体中表达水平明显降低。
34.(2)gr1 ntra双突变的雄配子传递异常；
35.前人研究表明gr1和ntra单突变体没有表型，gr1 ntra ntrb导致不育，但是ntrb不在花粉中表达(laurent marty et al.,pnas,2009,106,9109-9114)。从拟南芥突变体库购买了文章中用过的相关突变体进行验证，利用基因特异引物和t-dna引物，通过pcr的方法鉴定发现：gr1/ 雄配子传递效率降低(回交后代野生型和杂合体比例为60:32，大于理论值1:1)(表1)，这可能是由于花粉数远大于胚珠数，使正常花粉完全可以使所有胚珠完成双受精，造成gr1/ 没有表型；ntra/ 雄配子传递效率正常(回交后代野生型和杂合体比例接近于1:1)(表1)；ntra/ ntrb/-和ntra/-ntrb/ 中雄配子传递效率也接近正常(回交后代野生型和杂合体的比例接近1:1)(表1)；而gr1/ ntra/-或gr1/-ntra/ 自交结果显示其后代植株中没有双纯合突变体，野生型与杂合体的分离比接近1:1(表1)，这表明gr1 ntra的配子体是有缺陷的；为了研究gr1/ ntra/-和gr1/-ntra/ 造成雄配子传递缺陷的原因，分别用这两种突变体与野生型进行了回交实验，发现当用杂合体做父本时gr1 ntra的传递效率为0，而杂合体做母本时其传递效率正常(表1)，这表明gr1 ntra双突变体的雄配子传递效率丧失。
36.(3)gr1和ntra突变不影响花粉形态、细胞核发育和花粉活力；
37.为了确定gr1 ntra突变体中雄配子的功能障碍是否是由于花粉发育异常造成的，首先对野生型和突变体的花粉进行了扫描电镜的观察，结果发现gr1/-、ntra/-、gr1/ ntra/-和gr1/-ntra/ 的花粉外形与野生型相比没有异常；dapi染色观察发现在gr1/-、ntra/-、gr1/ ntra/-和gr1/-ntra/ 的花粉与野生型一样都包含两个生殖核和一个营养核，即突变体的花粉发育正常；亚历山大染色发现，gr1/-、ntra/-、gr1/ ntra/-和gr1/-ntra/ 的花粉染色与野生型相似，表明突变体花粉活力正常。
38.(4)gr1 ntra花粉水合和体外萌发没有异常；
39.为了进一步确定突变的雄配子传递效率降低是否是由于花粉水合或者花粉萌发缺陷造成的，首先，用野生型的柱头，并利用限量授粉的方法进行了花粉水合实验，限量授粉5分钟后观察花粉水合情况发现gr1/-、ntra/-、gr1/ ntra/-和gr1/-ntra/ 的花粉水合能力与野生型花粉相比没有差异；然后，利用体外花粉萌发实验检测了gr1/-、ntra/-、gr1/ ntra/-和gr1/-ntra/ 花粉体外萌发(4小时)情况，发现突变体与野生型花粉管体外萌发率和花粉管形态上都是接近的。
40.(5)gr1 ntra的花粉不能完成受精；
41.为了进一步分析为什么突变的花粉配子传递效率为0，利用限量授粉的方法将wt、gr1/ ntra/-和gr1/-ntra/ 的花粉授到野生型的柱头上，授粉后48小时统计膨大的胚珠与柱头上花粉的比例，经统计后发现gr1/ ntra/-和gr1/-ntra/ 的花粉限量授到野生型的柱头上膨大的胚珠与柱头上相对应花粉的比例(分别是大约40％和48％)约是利用野生型花粉限量授粉到野生型的柱头上膨大的胚珠与柱头上花粉比例(约71％)的一半，这就证明gr1 ntra的花粉不能完成双受精。
42.(6)gr1 ntra花粉管在柱头表面停止生长；
43.为了探究gr1 ntra的花粉不能完成双受精的原因，利用限量授粉的方法观察了wt、gr1/-、ntra/-、gr1/ ntra/-和gr1/-ntra/ 的花粉授到wt柱头上花粉管在柱头上的生长情况。限量授粉4小时后，发现wt花粉管已经进入花柱生长(a和b)；gr1/-和ntra/-花粉管的生长情况与wt花粉管生长情况基本一致(c-f)，但经统计发现gr1/-花粉管比wt花粉管多出10％在柱头异常生长的花粉管(k)；但是，发现gr1/ ntra/-和gr1/-ntra/ 各比wt多出约50％的花粉管不能穿过柱头(g-k)。以上结果表明gr1 ntra花粉管在柱头表面停止生长，不能穿过柱头进入花柱等雌蕊组织。
44.(7)gr1 ntra花粉线粒体异常；
45.为了确定gr1 ntra花粉管在柱头表面停止生长，不能穿过柱头进入花柱的原因，又由于ntra和gr1分别编码nadph依赖的硫氧还蛋白还原酶和谷氧还蛋白还原酶，而氧化还原反应的场所一般是线粒体。因此，用mito-trackerdeep red对wt、gr1/-、ntra/-、gr1/ ntra/-和gr1/-ntra/ 花粉线粒体进行了染色分析。结果发现，花粉线粒体染色结果可分为线粒体正常、线粒体异常和线粒体显著异常三种情况。wt花粉正常线粒体约占总数的68％，异常线粒体占约12％，显著异常线粒体占约20％；gr1/-和ntra/-花粉正常线粒体约各占总数的15％和10％，异常线粒体各占约50％和55％，显著异常线粒体都约占35％；而gr1/ ntra/-和gr1/-ntra/ 花粉正常线粒体约各占总数的15％和5％，异常线粒体各占约20％和10％，显著异常线粒体都约占65％和85％。以上结果表明，gr1 ntra花粉线粒体出现严重异常。我们推测gr1 ntra花粉氧化还原状态及ros水平与野生型相比会出现很大变化，将进行验证。
46.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。