鹿血晶及其药物组合物和用途的制作方法

1.本发明涉及医药领域，具体涉及鹿血晶及其药物组合物和用途。


背景技术：

2.细胞凋亡一般是指机体细胞在发育过程中或在某些因素作用下，通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡(programmedcelldeath)。细胞凋亡已成为细胞生物学中一大研究热点。细胞凋亡之所以能引起人们关注，其根源在于它与人类众多疾病密切相关，并有望为某些疾病带来新的治疗方法，例如在肿瘤、心血管疾病、退行性病变、炎症、免疫系统疾病等中无不包含着细胞凋亡的现象，而目前许多正在研究中的药物也正是针对凋亡进行开发的。
3.中药或其有效成分能够调节细胞凋亡，但是其分子机制仍需要进一步的研究。例如，中国专利申请cn107496512a公开了一种治疗脑缺血的中药组合物，由如下重量份的原料药制成：红景天500份，延胡索500份，川芎300份，冰片7份。该中药组合物能够用于预防和治疗脑缺血疾病，降低大脑皮质细胞凋亡率。
4.再例如，中国专利申请cn104940326a公开了一种中药组合物在制备减少间质干细胞凋亡的药物中的应用，其由如下重量份的原料药制成：人参5-9、水蛭5-11、土鳖虫6-9、制乳香2-4、赤芍4-7、降香2-4、檀香2-4、全蝎3-7、蝉蜕6-10、蜈蚣1-3、冰片2-6、炒酸枣仁4-9。然而，目前仍亟需一种组成简单且能够有效抑制细胞凋亡的药物组合物以及其抑制细胞凋亡的方法。


技术实现要素：

5.为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明人通过深入研究发现，鹿血晶能够上调线粒体mtdna拷贝数，从而有效抑制邻苯二甲酸二丁酯介导的细胞凋亡。本发明包括以下内容。
6.本发明的第一方面，提供一种鹿血晶在制备抑制细胞凋亡的药物中的用途。
7.根据本发明所述的用途，优选地，所述鹿血晶包括以鹿科动物的干燥血块经加工制成的粉末状、颗粒状或片状产物。
8.根据本发明所述的用途，优选地，其能够调控bcl-2蛋白的表达。
9.根据本发明所述的用途，优选地，其能够上调线粒体mtdna拷贝数。
10.根据本发明所述的用途，优选地，所述细胞凋亡与邻苯二甲酸二丁酯介导的细胞凋亡相关。
11.根据本发明所述的用途，优选地，所述鹿血晶为2-200mg。
12.本发明的第二方面，提供一种抑制细胞凋亡的药物组合物，其包括治疗有效量的根据第一方面所述的鹿血晶。
13.本发明的第三方面，提供一种用于抑制细胞凋亡的方法，其包括使细胞与第二方面所述的药物组合物接触的步骤。
14.根据本发明所述的方法，进一步包括所述药物组合物与其他治疗剂联用的步骤，优选地，所述治疗剂包括细胞凋亡信号通路相关抑制剂。
附图说明
15.图1为鹿血晶改善邻苯二甲酸二丁酯导致的斑马鱼幼鱼眼部细胞凋亡结果示意图，其中a：ctrl，空白对照组；b：dbp，邻苯二甲酸模型对照组；c：阿胶0.5mg/ml；d～f：鹿血晶0.02,0.1,0.5mg/ml。
16.图2为鹿血晶对dbp诱导的斑马鱼衰老模型bcl-2蛋白表达电泳图其中，dbp：邻苯二甲酸模型对照组；ej:阿胶；lxj：鹿血晶。
17.图3为鹿血晶对dbp诱导的斑马鱼衰老模型抗凋亡因子bcl-2表达的影响其中与空白对照组相比，
###
p＜0.001；与模型组相比，
**
p＜0.01，
***
p＜0.001，ctrl：空白对照组；dbp：邻苯二甲酸模型对照组；ej:阿胶。
18.图4为鹿血晶对dbp诱导的斑马鱼衰老模型线粒体dna表达的影响其中，与空白对照组相比，
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p＜0.001；与模型组相比，
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p＜0.01，
***
p＜0.001。
具体实施方式
19.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
20.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
21.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
22.鹿血晶在制备抑制细胞凋亡的药物中的用途
23.本发明中，鹿血晶为已知产品或通过已知方法制备得到的含有有效成分的提取物。优选地，本发明的鹿血晶不含另外的任何添加剂。鹿血晶的已知产品的实例包括但不限于贵州广济堂健康药业有限公司生产的鹿血晶。通过已知方法制备的实例包括但不限于，例如通过鹿科动物的干燥血块经加工制成的粉末、颗粒或薄片。
24.本发明中，鹿血晶制备的工艺条件不特别限定，只要能够得到所需要的鹿血晶即可。
25.本发明中，鹿科动物包括马鹿cervuselaphuslinnaeus或梅花鹿
cervusnippontemminck。
26.本发明中，鹿血晶的量为2-200mg，优选5-200mg，还优选10-150mg。鹿血晶的浓度为0.01-5mg/ml，优选0.1-5mg/ml，还优选0.2-1mg/ml。
27.本发明人通过研究发现，鹿血晶在实验模型中能够以剂量依赖的方式显著缓解细胞凋亡，其可能通过调控bcl-2蛋白，从而抑制细胞凋亡。bcl-2蛋白的表达水平的测定方法是本领域已知的，例如可以采用westernblot、酶联免疫吸附技术(elisa)、免疫荧光染色、免疫组织化学染色等进行定性/定量分析。
28.本发明人还惊奇的发现，鹿血晶在实验模型中能够通过调控线粒体mtdna拷贝数，从而有效抑制细胞凋亡。优选地，鹿血晶调控线粒体mtdna拷贝数是指上调线粒体mtdna拷贝数。这可能是由于鹿血晶能够通过损伤的线粒体的保护作用，从而有效地抑制细胞凋亡。线粒体mtdna拷贝数的检测方法不特别限定，例如可以采用二代测序技术、荧光定量pcr等方法进行检测。
29.药物组合物
30.本发明进一步提供抑制细胞凋亡的药物组合物，其包括鹿血晶。可选地，本发明的药物组合物包括药学上可接受的载体或辅料。可以理解的是，本发明的药物组合物还可以包括鹿血晶与其他治疗剂联用的情况。优选地，所述治疗剂包括细胞凋亡信号通路相关抑制剂。
31.本发明中，药学上可接受的载体包括稀释剂或赋形剂或其他添加剂，其实例包括但不限于，例如润湿剂、崩解剂、润滑剂、粘结剂、表面活性剂等。其他添加剂的实例包括但不限于，例如紫胶、阿拉伯树胶、滑石、氧化钛、糖(例如，蔗糖)、明胶、水、多糖诸如乳糖或葡萄糖、石蜡(例如，石油馏分)、植物油(例如，花生油或芝麻油)、以及药学上可接受的有机溶剂如醇(例如，乙醇或甘油)、天然矿物粉末(例如，高岭土、粘土、滑石和白垩)、合成矿物粉末(例如，高度分散的硅酸和硅酸盐)、乳化剂(例如，木素、亚硫酸盐溶液、甲基纤维素、淀粉和聚乙烯基吡咯烷酮)、硬脂酸镁、硬脂酸、月桂基硫酸钠等。
32.本发明的药物组合物可制备为各种剂型，包括但不限于，例如适于口服给药的药物制剂，例如固体口服制剂包括片剂、包衣剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂、粉剂等，或液体口服制剂包括溶液剂、糖浆剂、混悬剂、乳液剂等；适于肠胃外给药的药物制剂，例如经直肠给药的栓剂或另外的局部给药的透皮贴剂形式。
33.用于抑制细胞凋亡的方法
34.本发明还提供一种用于抑制细胞凋亡的方法，该方法用于调控bcl-2蛋白的表达和/或线粒体mtdna拷贝数，其包括使细胞与药物组合物接触的步骤，其中药物组合物包括鹿血晶，或由鹿血晶组成。
35.优选地，细胞为体外细胞。通过将动物细胞在体外培养的环境下，将细胞暴露于鹿血晶，高度模拟鹿血晶在体内对bcl-2蛋白的表达和/或线粒体mtdna拷贝数的调控的作用进行蛋白表达水平和拷贝数变化的检测。培养条件不特别限定，只要能够实现体外细胞的正常生长、蛋白正常表达即可。
36.可以理解，本发明的用于抑制细胞凋亡的方法还包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明的药物组合物的步骤，其中，药物组合物包括鹿血晶，或由鹿血晶组成。
37.本文所用术语“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物可为例如任何哺乳动物，例如，
人、灵长类动物、鸟、小鼠、大鼠、家禽、狗、猫、牛、马、山羊、骆驼、绵羊或猪。优选哺乳动物为人。
38.本发明中，“治疗有效量”是指本发明的药物组合物的量足以明显抑制细胞凋亡，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有0.1-2000mg的鹿血晶，更佳地，含有0.1-200mg的鹿血晶。对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1-2000mg，优选20-500mg。当然，具体剂量方案还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都包括在熟练医师技能范围之内。
39.本领域技术人员应理解，只要能够实现本发明的目的，在本发明方法中，还可包含其他步骤或操作，例如进一步优化和/或改善本发明所述的方法。
40.实施例
41.本实施例为抗细胞凋亡药理实验，具体如下。
42.1、造模依据
43.邻苯二甲酸二丁酯(dbp)可通过呼吸道、消化道、静脉输液、皮肤接触或者动植物的生物富集进入食物链等途径进入动物或人体内，干扰血液中的激素水平，提高氧化应激水平或者影响体内物质代谢，导致生殖、发育和行为等方面出现异常。有研究表明，dbp可引起眼部细胞氧化应激损伤。
44.斑马鱼眼睛在结构、组织成分和生物信号方面与其他脊椎动物相似其实验周期短，头部眼球占比较大等特点，通过观察眼部细胞变化，可以直接观察药物的对损伤细胞的保护作用。
45.利用邻苯二甲酸二丁酯诱导斑马鱼眼部细胞凋亡，建立斑马鱼眼部细胞凋亡模型，观察鹿血晶对眼部细胞凋亡的影响。
46.2、实验材料
47.2.1实验动物：斑马鱼。
48.2.2试物
49.鹿血晶为鹿科动物马鹿cervuselaphuslinnaeus或梅花鹿cervus nippontemminck的干燥血块经加工制成粉末和薄片。
50.鹿血晶实验用样品为贵州广济堂健康药业有限公司生产提供。
51.2.3试剂：邻苯二甲酸二丁酯(dbp)
52.2.4仪器：m205fa荧光显微镜(leica公司)，spx-150生化培养箱(上海跃进医疗器械有限公司)
53.3、方法
54.3.1药物溶液的配制
55.3.1.1胚胎培养液：
56.量取纯水1000ml，加盐水调节电导率至550-580μs/cm，加入0.1g/l亚甲蓝溶液1ml，混合均匀，即得。
57.3.1.2dbp储备液：
58.精密称取21mgdbp，加胚胎培养液至7.54ml，即得10mmol/ldbp储备液，置于4℃冰箱备用，使用时，用胚胎培养液稀释成所需浓度。
59.3.1.3鹿血晶储备液：
60.精密称取20mg鹿血晶，加胚胎培养液至2.497ml，即得10mmol/l鹿血晶储备液，置于4℃冰箱备用，使用时，用胚胎培养液稀释成所需浓度。
61.3.1.4阿胶储备液：
62.精密称阿胶，加胚胎培养液，配置得到浓度为0.5mg/ml的阿胶储备液，置于4℃冰箱备用，使用时，用胚胎培养液稀释成所需浓度。
63.3.1.5链酶蛋白酶e溶液：
64.精密称取25mg链酶蛋白酶e粉末，置于50ml胚胎培养液中，待完全溶解，即为0.5g/l链酶蛋白酶e溶液。
65.3.1.6吖啶橙染色(ao)溶液：
66.取50μlao染色液(1g/l)，加9.95ml胚胎培养液稀释至5mg/l。
67.3.1.7麻醉剂：
68.精密称取三卡因粉末400mg，加入tris缓冲液(调至ph7)，再加入超纯水至100ml，混合均匀，得三卡因储存液，储存于4℃冰箱，用时量取三卡因储存液4.2ml，加入超纯水至100ml，混合均匀，即得。
69.4、dbp对斑马鱼存活率的影响
70.将挑选好的正常胚胎置于6孔板中，每孔20枚，并加入3ml胚胎培养基，从受精后30h(hpf)开始加入各浓度dbp(0.1、10、50、100μmol/l)，在正常环境下培养42h，于18h和42h观察死亡胚胎数目，上述实验平行重复3次，数据汇总后统计存活率。
71.5、dbp诱导眼部细胞凋亡模型
72.将挑选好的正常胚胎置于6孔板中，每孔12枚，并加入3ml胚胎培养基，从受精后30h或54h开始，吸尽胚胎培养基，分别加入各浓度dbp(0.1、1、5、10、50μmol/l)，在直射光(54-324lux)或非直射光条件下继续培养18h，上述实验平行重复3次。ao染色，并在体式显微镜下观察，眼部绿色荧光显示为凋亡细胞，采集图片并进行数据处理。
73.6、给药方式
74.将正常斑马鱼胚胎置于6孔板中，每孔12枚鱼卵，并给予3ml胚胎培养基饲养至30hpf，吸尽培养基；分组，空白对照组加入3ml胚胎培养基，模型组加入3ml10μmol/ldbp，6个给药组每孔除加入1.5ml20μmol/ldbp外，分别加入1.5ml鹿血晶储备液(0.2、2、10、100μmol/l)，共培养18h，上述实验平行重复3次。ao染色，并在体式显微镜下观察眼部凋亡细胞，采集图片并进行数据处理。
75.7、图片采集及数据处理
76.将胚胎放在有0.5g/l蛋白酶e溶液的培养皿中，在室温下放置8min；当胚胎有个别开始脱膜时，立即加入胚胎培养液稀释，终止脱膜，迅速将脱膜后的胚胎移入干净的培养皿中，漂洗2遍后，用5mg/lao溶液在暗室中染色1h，进而用胚胎培养液漂洗3次，每次5min，然后用2ml0.04g/l的ms-222麻醉5min，置载玻片上，于体式荧光显微镜下镜检拍照，采用imagej软件对斑马鱼眼部凋亡细胞数进行统计。
77.8、统计学分析
78.各组指标均以表示，采用graphpadprism5.0软件进行统计分析。采用one-wayanova法比较各组之间的差异，dunnett’st3检验进行组间比较。
79.9、结果
80.9.1如图1所示，与空白组相比较，模型组胚胎眼部出现大量细胞凋亡，斑马鱼眼部细胞凋亡明显，眼部凋亡模型造模成功(p＜0.0001)。与模型组相比，鹿血晶(0.02、0.1、0.5mg
·
ml-1
)组都能以剂量依赖的方式显著缓解眼部细胞的凋亡(p＜0.001)。实验表明：鹿血晶能够显著抑制dbp诱导的斑马鱼眼部细胞凋亡。
81.9.2如图2和图3所示，与空白组相比，模型组bcl-2蛋白的表达水平显著降低，表明造模成功。经中、高剂量组的鹿血晶处理后的斑马鱼胚胎，bcl-2蛋白表达显著升高(p＜0.01，p＜0.001)。实验结果表明：鹿血晶能够有效提高老化模型动物凋亡相关bcl-2蛋白的表达。这提示鹿血晶抗老化模型动物的细胞凋亡作用与增加bcl-2蛋白的表达有关。
82.9.3如图4所示，与空白组比较，模型组线粒体mtdna拷贝数出现了明显的下降(p＜0.05)；经给药处理后，线粒体mtdna拷贝数均呈上升趋势，其中0.5mg
·
ml-1
的鹿血晶尤其能够显著的上调线粒体mtdna拷贝数(p＜0.01，p＜0.001)。结果提示，细胞凋亡可以导致线粒体的损伤，同时鹿血晶对损伤的线粒体具有保护作用即抑制细胞凋亡。
83.因此，本发明的鹿血晶能观察到对老化模型动物细胞凋亡具有明显的保护作用。
84.尽管已经参考示例性实施方案对本发明进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对示例性实施方案做多种调整或变化。本发明的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。