一种复合益生菌制剂在抗炎产品中的新应用的制作方法

1.本发明涉及益生菌技术领域，尤其涉及一种复合益生菌制剂在抗炎产品中的新应用。


背景技术：

2.炎症就是平时人们所说的“发炎”，是机体对于刺激的一种防御反应，表现为红、肿、热、痛和功能障碍。细菌、病毒、立克次体、支原体、真菌、螺旋体和寄生虫等为引发炎症最常见的原因。由生物病原体引起的炎症又称感染。还有部分炎症为非感染性的炎症，例如长期的睡眠剥夺和睡眠障碍，会引起机体发生炎症及免疫功能的紊乱。很多研究认为，由睡眠剥夺和睡眠障碍引发的炎症反应，是导致众多慢性疾病的独立危险因素。
3.在炎症过程中，以血管系统为中心的一系列局部反应局限并消除损伤因子，同时也促进受损组织的愈合。液体的渗出可稀释毒素，吞噬搬运坏死组织以利于再生和修复，使致病因子局限在炎症部位而不蔓延全身。因此，炎症是以防御为主的天然的局部反应，一般而论，是对机体有利的。但是在有些情况下，炎症又是潜在有害的。炎症反应是一些疾病的发病基础，如严重的超敏反应炎症过于剧烈时可以威胁病人的生命。此外，特殊部位或器官所发生的炎症可造成严重后果，如脑或脑的炎症可压迫生命中枢，声带炎症阻塞喉部导致窒息，严重的心肌炎可以影响心脏功能，此时，多需要使用抗炎症药物抑制炎症反应，以及使用抗生素等来抑制和杀死病菌。而抗生素和抗炎药物的长期和大量使用，会对基体产生一系列的毒副作用，并且容易使病菌产生抗性。对于婴幼儿、老年人和免疫力低下的中青年人群，抗生素和抗炎药物的大量使用还容易导致免疫功能紊乱等一些列副作用。


技术实现要素：

4.针对现有炎症药物存在的上述问题，本发明提供一种复合益生菌制剂在抗炎产品中的新应用，复合益生菌制剂可促进巨噬细胞分泌抗炎因子tnf-α和il-10的分泌，减少慢性炎症对机体细胞的损伤。
5.为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
6.一种复合益生菌制剂在制备抗炎产品中的应用，所述复合益生菌制剂包括以下活菌：嗜热链球菌s709、副干酪乳杆菌l578和瑞士乳杆菌l551；
7.所述嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)s709保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.18028。
8.所述副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)l578，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.15603，保藏日期为2018年4月11日。
9.所述瑞士乳杆菌(lactobacillushelveticus)l551，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.15604，保藏日期为2018年4月11日。
10.上述三种菌种均为公开菌种，具体在公开号为cn111778192a，发明名称为“具有降压活性的那曲4580益生菌及其制剂和应用”的专利公开文本中公开。
11.相对于现有技术，本发明提供了由嗜热链球菌s709、副干酪乳杆菌l578和瑞士乳杆菌l551组成的复合益生菌制剂在制备抗炎产品中的新应用。该复合益生菌制剂对巨噬细胞分泌的tnf-α和il-10细胞因子具有调节作用，可激活正常的巨噬细胞分泌tnf-α，产生生理性炎症反应，提高机体的免疫力。同时，当巨噬细胞处于炎症时，可增加抑炎因子il-10的分泌。即在炎症状态下，该益生菌制剂可通过调节促炎因子和抑炎因子的平衡，减少炎症对细胞和组织的损伤，改善机体的炎症保护机制。
12.优选的，所述抗炎产品为促进巨噬细胞分泌细胞因子的产品。
13.优选的，所述细胞因子为tnf-α和il-10。
14.优选的，所述抗炎产品为药品、食品和保健品中的一种。
15.优选的，所述产品的剂型为粉剂、颗粒剂、乳剂、晶球、胶囊、块状、棒状、片剂和口服液中的一种。
16.优选的，所述复合益生菌制剂的制备方法包括：
17.a、按10-30g/l的量向培养基中加入谷氨酸钠，搅拌10-15min，升温至55-60℃，进行灭菌，得到灭菌培养基；
18.b、将嗜热链球菌s709、副干酪乳杆菌l578和瑞士乳杆菌l551的活化菌种分别按照5-15％的体积比接种至所述灭菌培养基中进行发酵，控制所述发酵的温度为37-45℃，发酵28-48h得到发酵液，所述发酵液经高温灭菌或不经过高温灭菌，浓缩、干燥得到所述复合益生菌制剂。
19.优选的，每升所述培养基的配方为：脱脂奶粉70-90g、全脂奶粉18-22g、葡萄糖18-22g、蛋白胨8-12g、酵母浸粉4-6g、无水乙酸钠1.5-2.5g、硫酸镁0.55-0.60g和硫酸锰0.2-0.3g，加水定容至1l，ph值调为6.5-7.0。
附图说明
20.图1是本发明实施例2中正常状态下复合益生菌制剂对巨噬细胞分泌tnf-α和il-10细胞因子影响的统计图；
21.图2是本发明实施例2中防御状态下复合益生菌制剂对巨噬细胞分泌tnf-α和il-10细胞因子影响的统计图；
22.图3是本发明实施例2中炎症状态下复合益生菌制剂对巨噬细胞分泌tnf-α和il-10细胞因子影响的统计图。
具体实施方式
23.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
24.实施例1
25.复合益生菌制剂的制备
26.复合益生菌制剂的制备方法包括：
27.a、按20g/l的量向培养基中加入谷氨酸钠，搅拌10min，升温至55℃，进行灭菌，得到灭菌培养基；其中，培养基的配方为：脱脂奶粉80g、全脂奶粉2g、葡萄糖2g、蛋白胨10g、酵
母浸粉5g、无水乙酸钠2g、硫酸镁0.58g和硫酸锰0.25g，加水定容至1l，ph值调为6.6；
28.b、将嗜热链球菌s709、副干酪乳杆菌l578和瑞士乳杆菌l551活化菌种分别按照10％的体积比接种至所述灭菌培养基中进行发酵，控制所述发酵的温度为42℃，发酵30h得到发酵液，所述发酵液经高温灭菌，浓缩、干燥得到复合益生菌制剂。
29.实施例2
30.复合益生菌制剂在制备抗炎产品中的应用
31.1、材料及设备
32.1.1、复合益生菌制剂(实施例1中制得)。
33.1.2、试剂：dmem高糖培养液，美国invitrogen公司；胎牛血清、pbs缓冲液、青链霉素混合液、0.4％台盼蓝染色液、细胞刮，上海生工生物工程有限公司；快速细胞冻存液(无血清)，上海雅酶生物医药科技有限公司；脂多糖(lps)，美国sigma公司；mouse tnf-αelisakit、mouseil-10elisakit，北京四正柏生物科技有限公司。
34.1.3、试验设备
35.酶标仪(赛默飞multiskan sky 1530)、细胞培养箱(thermo)、离心机(tdz5-ws，长沙湘锐离心机有限公司)、生物安全柜(bsc-160411a2，苏净安泰)、水浴锅(hws-24型，上海一恒科学仪器有限公司)、显微镜(model ckx41sf)、自动细胞计数仪(nexcelom bioscience llc)。
36.2、试验方法
37.2.1、样品前处理
38.将复合益生菌制剂用pbs稀释成5mg/g、2.5mg/g、1.25mg/g，得到复合益生菌制剂稀释液，用于体外细胞实验。
39.2.2、复合益生菌制剂对炎症相关细胞因子的分泌作用的影响
40.2.2.1、正常情况下的影响
41.将小鼠单核巨噬细胞raw264.7细胞、含10％胎牛血清(fbs)的dmem高糖培养基，置于75cm2无菌培养皿中。raw264.7细胞在37℃恒温、5％co2以及饱和湿度的无菌培养箱中培养。细胞进行贴壁生长，当细胞长至接近培养皿80％满时，在超净台中用0.25％胰酶消化约2min，显微镜下观察细胞形态。轻轻吸去胰酶，加入含10％胎牛血清(fbs)的dmem高糖培养基吹打均匀，得到raw264.7细胞培养液。
42.调整培养液中raw264.7细胞的浓度，均匀接种24孔板(每孔2ml培养液，细胞浓度1.5
×
105个/ml)，培养12h贴壁后，加入复合益生菌制剂稀释液(5mg/g、2.5mg/g、1.25mg/g)，对照组加入等体积的dmem溶液，模型组加入2μl的lps造细胞炎症模型，再加入等体积的dmem溶液，培养24h。收集细胞培养液，1000rad离心10min，取上清液。测定上清液中tnf-α和il-10细胞因子的含量。
43.测定结果如图1所示，不同浓度的复合益生菌制剂稀释液与raw264.7共孵育24h后，tnf-α的分泌量相比于正常对照组来说都显著升高(p《0.0001)，说明复合益生菌制剂在正常情况下可激活巨噬细胞上调tnf-α，产生生理性炎症反应，提高机体的免疫力。当巨噬细胞被激活后，促炎性细胞因子增加可增强宿主的防御能力。
44.2.2.2、防御作用影响
45.调整培养液中raw264.7细胞的浓度，均匀种24孔板(每孔2ml培养液，细胞浓度1.5
×
105个/ml)，培养12h贴壁后，加入复合益生菌制剂稀释液，对照组加入等体积dmem溶液，孵育20h后，加入lps 2μl介导细胞炎症(其中对照组不加lps，对照组加入lps后为模型组)，再孵育培养4h。收集细胞培养液，1000rad离心10min，取上清液。测定上清液中tnf-α、il-10细胞因子的含量。
46.测定结果如图2所示，复合益生菌制剂与raw264.7共孵育20h后，再用lps介导炎症，复合益生菌制剂组和模型组比正常对照组均有显著上升(p《0.0001)，其中，不同浓度的复合益生菌制剂稀释液对il-10的分泌量相比于模型组来说都有显著升高(p《0.0001)，说明复合益生菌制剂与细胞共孵育后，在发生炎症的情况下，可以增加抑炎因子il-10的分泌，从而促进促炎和抑炎因子的平衡，减少对细胞的损伤。
47.2.2.3、抗炎作用影响
48.调整培养液中raw264.7细胞浓度，均匀种24孔板(每孔2ml培养液，细胞浓度1.5
×
105个/ml)，培养12h贴壁后，加入lps 2μl介导细胞炎症4h后(对照组除外)，加入复合益生菌制品稀释液(模型组用等体积的pbs代替复合益生菌制品稀释液)，共孵育20h。收集细胞培养液，1000rad离心10min，取上清液。测定上清液中tnf-α、il-10细胞因子的含量。
49.测定结果如图3所示，在lps介导细胞炎症后，再与复合益生菌制剂共孵育，5mg/g和2.5mg/g的复合益生菌制剂稀释液相比于模型组来说il-10都显著升高(p《0.0001)。说明发生炎症后，复合益生菌制剂可以增加抑炎因子il-10的分泌，从而调节炎症反应，避免组织损伤。
50.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。