苯磺酰胺化合物在制备预防和/或治疗衰老疾病的药物中的用途的制作方法

1.本发明涉及一种苯磺酰胺化合物的用途，尤其涉及一种苯磺酰胺化合物在制备预防和/或治疗衰老疾病的药物中的用途，属于医药技术领域。


背景技术：

[0002][0003]
衰老的机制十分复杂，尽管对于衰老的研究在多种模式生物中取得了突破的进展，然而考虑到物种生物学差异以及人类遗传异质性，衰老干预措施的临床试验和体系的广泛建立仍面临巨大的挑战。寻找可干预衰老进程以及延长健康寿命的药物一直是衰老研究的一个关键方面。开发预防或治疗衰老的药物，增强老年人的体质，减少衰老相关疾病的发生，无疑会大大提高老年人的生活质量和减轻社会负担。


技术实现要素：

[0004]
本发明的主要目的在于提供一种苯磺酰胺化合物或其药学上可接受的衍生物在制备预防和/ 或治疗衰老疾病的药物中的用途，以弥补现有治疗方法的不足。
[0005]
本发明的另一目的在于提供一种用于预防和/或治疗衰老疾病的药物。
[0006]
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
[0007]
本发明实施例提供了一种苯磺酰胺化合物或其药学上可接受的衍生物在制预防和/或治疗衰老疾病的药物中的用途，所述苯磺酰胺化合物具有如式(i)所示的结构：
[0008][0009]
其中，所述药学上可接受的衍生物选自药学上可接受的盐、多晶型体、共晶体、放射标记形式及其组合中的至少一种。
[0010]
在本发明中，苯磺酰胺化合物的化学名称为n，n
’‑
((4-((4-(2-氧代吡咯烷-1-基)苯基)磺酰胺基)-1，2-亚苯基)双(氧基))双(乙烷-2，1-二基))双酰胺。
[0011]
本发明实施例还提供了一种用于预防和/或治疗衰老疾病的药物，其包含式(i)所示的苯磺酰胺化合物或其药学上可接受的衍生物；
[0012][0013]
其中，所述药学上可接受的衍生物选自药学上可接受的盐、多晶型体、共晶体、放射标记形式及其组合中的至少一种。
[0014]
进一步地，所述药物还包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。
[0015]
较之现有技术，本发明的有益效果在于：
[0016]
本发明首次提出苯磺酰胺化合物或其药学上可接受的衍生物在预防和/或治疗衰老及衰老相关疾病的药物中的应用。实验显示，给予苯磺酰胺化合物可以显著延长阿霉素诱导的衰老模型小鼠的生存时间，提高小鼠的运动能力，减轻肝、肾等组织的损伤；同时苯磺酰胺化合物显著抑制mef细胞的衰老和衰老相关分泌表型基因的表达，使得细胞年轻化，以上实验说明苯磺酰胺化合物可以起到改善衰老的目的，对今后该类疾病的药物开发和预防治疗具有非常重要的意义。
附图说明
[0017]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0018]
图1是本发明一典型实施例中建立的阿霉素衰老小鼠给药组和对照组的生存曲线对比图；
[0019]
图2是本发明一典型实施例中建立的阿霉素衰老小鼠给药组和对照组运动能力对比图；
[0020]
图3是本发明一典型实施例中建立的阿霉素衰老小鼠给药组和对照组心、肝和肾组织的 h＆e染色结果对比图；
[0021]
图4是本发明一典型实施例中第5代小鼠mef细胞给药组和对照组的衰老标志物β-gal的染色对比图；
[0022]
图5是本发明一典型实施例中h2o2诱导的mef细胞给药组和对照组的衰老标志物β-gal 的染色对比图；
[0023]
图6是本发明一典型实施例中第6代mef细胞给药组和对照组的sasp基因的表达对比图。
具体实施方式
[0024]
鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，主要是提供一类苯磺酰胺化合物或其药学上可接受的衍生物在制备用于预防和/或治疗衰老疾病的药物中的用途。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
[0025]
本发明实施例的一个方面提供了一种苯磺酰胺化合物或其药学上可接受的衍生物在制备预防和/或治疗衰老疾病的药物中的用途，所述苯磺酰胺化合物具有如式(i)所示的结构：
[0026][0027]
其中，所述药学上可接受的衍生物选自药学上可接受的盐、多晶型体、共晶体、放射标记形式及其组合中的至少一种。
[0028]
进一步地，苯磺酰胺化合物的化学名称为n，n
’‑
((4-((4-(2-氧代吡咯烷-1-基)苯基)磺酰胺基)
‑ꢀ
1，2-亚苯基)双(氧基))双(乙烷-2，1-二基))双酰胺。
[0029]
本文所用的术语“药学上可接受的盐”用以指在可靠医学判断的范围内，适于与人类和低等动物的组织接触使用而没有过多毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，并且与合理的效益/风险比相称的那些盐。药学上可接受的盐是公知的现有技术。例如，sm berge等人在j.pharmaceutical sciences，第1977年，66，1-19，详细描述了药学上可接受的盐，纳入其内容作为参考。本发明的化合物的药学上可接受的盐包括从适合的无机酸和碱以及有机酸和碱衍生而来的那些盐。药学上可接受的无毒性酸加成盐的实例是氨基与无机酸如盐酸，氢溴酸，磷酸，硫酸和高氯酸，或者与有机酸如乙酸，草酸，马来酸、酒石酸，柠檬酸，琥珀酸或丙二酸形成的盐，或者通过使用诸如离子交换等本领域的其他方法形成的盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊丙酸盐、葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。
[0030]
从适当的碱衍生的盐包括碱金属、碱土金属、铵和n (c1-4烷基)4盐。代表性的碱或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等。其它药学可接受的盐包括使用诸如卤化物、氢氧化物、羧酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、低级烷基磺酸盐和芳基磺酸盐形成的合适的无毒的铵
盐，季铵盐和胺阳离子。
[0031]
如本文所用的，“药学上可接受的盐”是指公开的化合物的形式，其中母体化合物通过制备其酸盐或碱盐来进行改性。药学上可接受的盐的实例包括但不限于，例如胺等碱性残基的无机或有机酸盐；例如羧酸等酸性残基的碱金属或有机盐等。药学上可接受的盐包括例如由无毒无机酸或有机酸形成的母体化合物的常规的无毒盐或季铵盐。此类常规的无毒盐包括衍生自例如盐酸等无机酸的那些。
[0032]
本发明的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法由含有碱性或酸性部位的母体化合物合成。通常，此类盐可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量的适当的碱或酸，在水或有机溶剂或两者的混合物中反应来制备；通常，使用诸如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈等非水性介质。
[0033]
术语“药学上可接受的衍生物”包括任何药学上可接受的盐，水合物或前药，或其它任何化合物，在给予受试者时能提供(直接或间接)式(i)化合物或具有抗菌活性的代谢物或残余物。
[0034]
式(i)的化合物的盐是在药学上优选接受的，但非药学可接受盐也应落入本发明的范围之内也可接受，因为这些是制备药学上可接受盐的有用中间体。
[0035]
适合的药学上可接受的盐包括，但不限于，药学上可接受的无机酸如盐酸，硫酸，磷酸，硝酸，碳酸，硼酸，氨基磺酸和氢溴酸的酸，或其药学上可接受的有机酸如盐乙酸，丙酸，丁酸，酒石酸，马来酸，羟基酸，富马酸，苹果酸，柠檬酸，乳酸，粘酸，葡糖酸，苯甲酸，琥珀酸，草酸，苯乙酸，甲磺酸，甲苯磺酸，苯磺酸，水杨酸，对氨基，天冬氨酸，谷氨酸，依地酸，硬脂酸，棕榈酸，油酸，月桂酸，泛酸，鞣酸，抗坏血酸和戊酸。
[0036]
相应的碱盐包括，但不限于，那些与药学上可接受的阳离子形成的盐，如钠，钾，锂，钙，镁，锌，铵，烷基铵，例如由三乙胺，烷氧基胺形成的盐，如那些与乙醇胺形成的盐，和从乙二胺，胆碱或氨基酸如精氨酸，赖氨酸或组氨酸形成的盐。药学上可接受的盐及其形成和常规信息对本领域技术人员是公知的，如在一般教科书如“手册制药的盐”phstahl，cgwermuth，第1版，2002，威利-vch中所述。
[0037]
本文所提供的本公开内容的化合物也包括式(i)化合物的所有多晶型体和假多晶型体。“多晶型体”是本领域已知的(参见例如j.thermalanal.cal.64：37-60(2001))且被认为是其中式(i)化合物能够存在不同的结晶相。结晶相可以在晶格中具有不同的分子排列(“堆积多晶现象”(packingpolymorphism))和/或构象(“构象多晶现象”)。例如，在式(i)化合物的两种不同的多晶型体中，每种多晶型可具有以不同的基本晶体体系-三斜晶系、单斜晶系、斜方晶系、四方、三方、六方或立方排列的分子。如本文所用的术语“脱水物”是其中水分子是晶体的非聚会性部分的任何结晶形式之式(i)化合物。式(i)的化合物的脱水物可以通过例如从基本上不含水的溶剂结晶而制备。在一个实施方案中，式(i)化合物为脱水物，即作为游离碱，其中晶格基本上不含水分子且任何存在的水分子以“表面水”(例如，松散的键合到晶体的表面)存在，如那些本领域技术人员通过例如，热解重量分析(tga)和/或差示扫描量热法(dsc)而与成为晶体之整体部分的水分子(例如，水合物)可辨别且可区分。一个实施方式中，式(i)化合物的脱水物具有小于约0.2摩尔水，在另一个实施方式中少于约0.15摩尔，在另一个实施方式中水约0.12摩尔水，在另一个实施方案中少于约0.1摩尔水，在另一个实施方案中少于0.085摩尔水，在另一个实施方案中少于约 0.075摩尔水，在
另一个实施方案中少于约0.06摩尔水，在另一实施方案中少于约0.057摩尔水，在另一个实施方案中少于约0.05摩尔水，在另一个实施方案中少于约0.025摩尔水，在另一个实施方案中少于约0.02摩尔水，在另一实施方案中小于约0.01摩尔水，在另一实施方案中小于约0.005摩尔水，在另一实施方案中少于约0.03摩尔水，以及在另一个实施方案中少于约 0.001摩尔水，每个实施方案中考虑到表面水的存在且每个所述的实施方案是以每1摩尔式(i)的化合物计。
[0038]
本文提供的本公开内容的化合物也包括式(i)化合物的所有共晶体。“共晶体”是本领域已知的，共晶体被认为是结构均匀的结晶材料，其包含两个或更多个以明确的化学计量存在的中性建构单元，例如，式(i)化合物与共成型材料。mol.pharmaceutics4(3)：317-322(2007)。如本文所用的“共晶体”包括该共晶体的所有多晶型体，即该共晶体的所有不同的结晶相。溶剂化物和共晶体之间的主要区别在于分离的纯物质的物理状态。例如，对于二组分系统，如果一种组分在约25℃的温度是液体，则含有两个成分的晶体被指定为溶剂化物，如果两种组分在该温度是固体，则含有两种组分的晶体被指定为共晶体。sekhon
″
pharmaceutical co-crystals
‑ꢀ
areview，
″
ars.pharm.50(3)：99-117(2009)。此外，共晶体和盐在可能的多组分结构规模而言可被认为是“极端物”。盐是通过离子化形成的，例如，酸-碱反应或活性药物成分和酸性或碱性物质之间发生的质子给予。反之，当活性药物成分缺乏能形成盐的可离子化位置时，共晶体可以通过非离子化形成例如，氢键、π-π或组件之间的范德华相互作用。共晶体，盐和水合物之间在结构上的差异例证在crystal growth＆design9(6)：2950-2967(2009)的图1和图2中，通过引用并入本文。共晶的制备在本领域已知的，例如如在以上引用的参考文献和美国专利号 7452555b2和7935817b2中所述的。
[0039]
在一个实施方案中，具有式(i)化合物的晶体包括盐酸、酒石酸、苯磺酸、甲苯磺酸、琥珀酸、反丁烯二酸、柠檬酸、草酸、苯甲酸或其任意混合物。在另一个实施方案中，具有式(i)化合物的晶体包括盐酸、苯磺酸、甲苯磺酸、l-酒石酸，反丁烯二酸或其任意混合物。在另一个实施方案中，共晶体具有式(i)化合物和盐酸。在另一个实施方案中，共晶体具有式(i)化合物和苯磺酸。在另一个实施方案中，共晶体具有式(i)化合物和甲苯磺酸。在另一个实施方案中，共晶体具有式(i)化合物和l-酒石酸。在另一个实施方案中，共晶体具有式(i)化合物和反丁烯二酸。在另一个实施方案中，共晶体含有约1当量的式(i)化合物和约0.5当量的反丁烯二酸，例如，在一个实施方案中从约0.3至约0.7当量的反丁烯二酸，在另一个实施方案中从约0.4至约 0.6当量的反丁烯二酸，在另一个实施方案中从约0.44至约0.56当量的反丁烯二酸或在另一实施例中的从约0.47至约0.53当量的反丁烯二酸。在另一个实施方案中，共晶包含1当量的式(i) 化合物和0.5当量的反丁烯二酸。可以使用分析技术，例如红外光谱，单晶x-射线衍射 (xrd)、粉末x-射线衍射(pxrd)、熔点测定、dsc、差热分析(dta)、tga、固态 nmr(ssnmr)和x-射线光电子能谱(xps)来阐明共晶体的结构。在某些实施例中，使用xrd、 ssnmr和/或xps来确定是否有共晶体或其盐存在。在某些实施方案中，当不能生长足够大的单晶时，则使用ssnmr或xps来确定是否有共晶体或其盐存在。
[0040]
在一些优选实施方案中，所述药物至少能够延长阿霉素诱导的细胞衰老模型中的小鼠寿命。
[0041]
进一步地，所述细胞衰老模型中苯磺酰胺化合物的有效用量为1mg/kg。
[0042]
进一步地，所述细胞衰老模型中苯磺酰胺化合物的有效用量为10μm。
[0043]
在一些优选实施方案中，所述药物进行实验时使用的细胞衰老模型包括原代小鼠胚胎纤维母细胞的自然衰老模型和/或原代小鼠胚胎纤维母细胞过氧化氢诱导的加速衰老模型。
[0044]
进一步地，所述药物至少能够改善自然衰老模型中原代小鼠胚胎纤维母细胞的自然衰老。
[0045]
进一步地，所述药物至少能够改善加速衰老模型中原代小鼠胚胎纤维母细胞的衰老。
[0046]
在一些优选实施方案中，所述药物至少能够提高阿霉素诱导的衰老小鼠的运动能力。
[0047]
在一些优选实施方案中，所述药物至少能够改善阿霉素导致的衰老小鼠的肾脏、肝脏和心脏组织的损伤。
[0048]
在一些优选实施方案中，所述药物至少能够抑制原代小鼠胚胎纤维母细胞衰老时相关分泌表型sasp基因的表达。
[0049]
进一步地，所述sasp基因包括促炎因子、趋化因子或蛋白酶中的任意一种或两种以上的组合。sasp是促炎因子、趋化因子和蛋白酶等一系列细胞因子的总称，是衰老细胞的关键特征。
[0050]
在一些优选实施方案中，所述衰老疾病为阿霉素和/或过氧化氢诱导的衰老。
[0051]
本发明通过实验证明，给予苯磺酰胺化合物或其药学上可接受的衍生物可以显著延长阿霉素诱导的衰老模型小鼠的生存时间，提高小鼠的运动能力，减轻肝、肾等组织的损伤。同时，苯磺酰胺化合物或其药学上可接受的衍生物显著抑制mef细胞的衰老和衰老相关分泌表型基因的表达，使得细胞年轻化。以上实验说明苯磺酰胺化合物或其药学上可接受的衍生物可以起到改善衰老的目的，对今后该类疾病的药物开发和预防治疗具有非常重要的意义。
[0052]
本发明实施例的另一个方面还提供了一种用于预防和/或治疗衰老疾病的药物，其包含式 (i)所示的苯磺酰胺化合物或其药学上可接受的衍生物；
[0053][0054]
其中，所述药学上可接受的衍生物选自药学上可接受的盐、多晶型体、共晶体、放射标记形式及其组合中的至少一种。
[0055]
进一步地，所述药物还包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。该载体和/或赋形剂可以是对适于这种用途的本领域技术人员来说任何已知药学上可接受的载体和赋形剂。本说明书中所述的“药用载体”具有本领域人员熟知的含义，其可包括任何及所有的溶剂、
分散介质、涂层、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘结剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、类似物质及它们的组合。
[0056]
在一些优选实施方案中，所述药物还包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。
[0057]
在一些优选实施方案中，所述药物至少能够延长阿霉素诱导的衰老小鼠的寿命。
[0058]
在一些优选实施方案中，所述药物至少能够提高阿霉素诱导的衰老小鼠的运动能力。
[0059]
在一些优选实施方案中，所述药物至少能够改善阿霉素导致的衰老小鼠的肾脏、肝脏和心脏组织的损伤。
[0060]
在一些优选实施方案中，所述药物至少能够抑制原代小鼠胚胎纤维母细胞衰老时相关分泌表型sasp基因的表达。
[0061]
在一些优选实施方案中，所述衰老疾病为阿霉素和/或过氧化氢诱导的衰老。
[0062]
进一步地，所述药物的剂型包括注射剂、口服液、胶囊、片剂或颗粒剂。
[0063]
进一步地，本发明的药物可以是适于施用到患者的任何形式，例如所述药物的给药方式包括皮下给药、口服、肌肉内给药或腹腔内给药等，但不限于此。
[0064]
藉由上述技术方案，本发明提供的式(i)所示化合物苯磺酰胺化合物可以显著延长阿霉素诱导的衰老模型小鼠的生存时间，提高小鼠的运动能力，减轻肝、肾等组织的损伤。同时，苯磺酰胺化合物显著抑制mef细胞的衰老和衰老相关分泌表型基因的表达，使得细胞年轻化。以上实验说明苯磺酰胺化合物可以起到改善衰老的目的，对今后该类疾病的药物开发和预防治疗具有非常重要的意义。
[0065]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及若干较佳实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0066]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0067]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，例如：
[0068]
一、实验步骤
[0069]
实验动物：
[0070]
本实施例所用的雄性c57bl/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号 scxk(京)2007-0001。将小鼠置于湿度为50
±
10％，温度为23
±
2℃的标准条件下，昼夜各12h 适应生存。小鼠可自由饮水与进食。所有的动物管理与处理方案都经徐州医科大学动物伦理委员会批准。所有实验都是按照《管理和使用动物行为道德准则》的建议进行。
[0071]
试剂：
[0072]
阿霉素购自selleck公司，细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒购自cell signaling technology 公司。
[0073]
实施例1阿霉素诱导的小鼠衰老模型的构建
[0074]
选取24只8周龄的c57bl/6j小鼠分笼，分笼当天记为d0。分别为苯磺酰胺化合物给药组和生理盐水对照组；给药组小鼠腹腔注射1mg/kg的苯磺酰胺化合物，对照组小鼠给予
等剂量的生理盐水，每天一次，连续给药两周；于d7与d14腹腔注射10mg/kg的阿霉素，并同时继续给予苯磺酰胺化合物或生理盐水，每天称量并记录小鼠体重。d15进行转棒式疲劳仪适应， d17进行测量。
[0075]
实施例2rota-rod
[0076]
采用转棒疲劳仪评估小鼠运动协调能力。把小鼠放到转棒式疲劳仪的滚轴上，轻轻拉住其尾巴使其适应在转棒上，保持平衡运动。适应三天后，进行测试。转棒速度设置：30r/min，从 1r/min加速到30r/min，加速时间150s，测试时间5min。测试三轮，取平均值，每次测试间隔 10min。记录小鼠掉落时间。
[0077]
实施例3h＆e染色对肝、肾和心组织观察
[0078]
具体的实验方法包括：
[0079]
1、石蜡切片制备
[0080]
(1)组织标本的固定：取实施例1中的各组小鼠的心、肝和肾组织于4％多聚甲醛中室温固定24小时，纱布包裹，标记，流水冲洗过夜；
[0081]
(2)脱水与透明：将脱水盒放进脱水机内依次梯度酒精进行脱水，75％酒精4h，85％酒精 2h，90％酒精2h，95％酒精1h，无水乙醇i 30min，无水乙醇ii 30min，醇苯5-10min，二甲苯i 5-10min，二甲苯ii 5-10min；
[0082]
(3)浸蜡与包埋：65
°
融化石蜡i 1h，65
°
融化石蜡ii 1h，65
°
融化石蜡iii 1h。将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20
°
冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块；
[0083]
(4)切片及展片：切片机5μm厚度切片，50℃水浴展片，捞片贴片于清洁载玻片上，60℃烘箱烤片过夜。切片完成后做好标记，保存待用。
[0084]
2、h＆e染色
[0085]
(1)脱蜡和复水：切片二甲苯脱蜡两次(15分钟/次)，分别于100％、95％、90％、80％、 70％、50％酒精中各脱水5分钟，最后入蒸馏水中复水3分钟；
[0086]
(2)苏木素染色：切片置于苏木素染液中染色15分钟，自来水冲洗3分钟，盐酸酒精(70％酒精99ml 浓盐酸1ml)分色10秒；
[0087]
(3)返蓝及脱水：自来水冲洗10分钟使其变为蓝色。将切片依次置于50％、70％、80％、 90％酒精中各脱水5分钟；
[0088]
(4)伊红复染：1％伊红染液染色2分钟，95％酒精和100％酒精中分别3分钟脱水分色至界限清楚；
[0089]
(5)透明与封片：二甲苯透明3分钟后，中性树胶封片；
[0090]
(6)封片后放入50℃烘箱烘干，光镜下观察各组织结构的变化。
[0091]
实施例4mef细胞的分离和培养：
[0092]
取怀孕13.5天的母鼠，断颈处死，酒精消毒腹部，无菌打开腹腔子宫，置平皿(提前加入 pbs)，去除胎膜，取出胎儿(pbs洗3-4次，去除血细胞)
[0093]
用眼科剪去除鼠胚的四肢、头、尾及内脏等，pbs洗涤2-3次。冲洗后用眼科剪剪成1mm 的小组织块。
[0094]
细胞消化及培养加4ml 0.25％的胰蛋白酶-edta，置37℃消化10-15min，间隔5min
用枪反复吹打，直到看不见明显组织块。加等体积的dmem(10％fbs)终止消化。将细胞悬液移入离心管中，1000rpm，5min离心，去上清。dmem(10％fbs)1-2ml悬浮细胞。37℃， 5％co2，饱和湿度条件下培养。24h后换液，去除组织块和未贴壁的死细胞。2-3天传代一次。从分离第一代mef细胞开始，铺六孔板，1*106每孔，每两天进行一次传代，记录传代前细胞数量，共六次。
[0095]
实施例5β-半乳糖苷酶染色：
[0096]
细胞按照5*105/孔的密度接种于6孔板，代细胞生长到80％左右取出，吸去培养基，六孔板每孔加1mlpbs，洗涤3min。然后再用4％多聚甲醛固定15min，每孔1ml。pbs洗涤三遍，每次3min。吸去pbs，加工作液1ml(避光配置)。工作液配置比例，a液10μl，b液10μl，c 液930μl，x-gal 50μl配成ml体系。加入工作液后封口膜封边，锡纸包裹(避光)放在37℃孵育24h。
[0097]
实施例6rna提取
[0098]
细胞按照5*105/孔的密度接种于6孔板，待细胞生长到80％左右，吸去培养基，用pbs清洗两遍，加1ml trizol静置2min吹打，吸取打入提前准备的ep管中。每管加入200μl氯仿，室温放置10min，避免涡旋振荡。12000rpm离心15min，轻拿取取上清(dna)，吸取上层水相至另一离心管中。
[0099]
加入等体积异丙醇(约500μl)上下颠倒，轻轻混匀，室温放置10min，充分沉淀rna。 12000rpm离心15min，弃上清，底部沉淀即为rna。加入预冷的乙醇1ml，涡旋振荡洗涤，悬浮沉淀，12000rpm离心15min，弃去上清。室温干燥5-10min，加入20-50μl无核无核酶水溶解，轻轻振荡或用枪吹打。上机测定rna浓度。
[0100]
实施例7rt-qpcr
[0101]
cdna合成10μl体系中加入1μg rna根据rna浓度换算体积。逆转录工作液按比例配置，再加入无核酶水，总体积为10μl。扩增程序为37℃ 15min；85℃ 5s；4℃∞。
[0102]
rt-qpcr配置上机体系。无核酶水1ul；f primer 0.2μl；r primer 0.2μl；10
×
pcr buffer 5μl；无核酶水3.1μl；cdna 0.5μl.。96孔板加完样后，离心2500rpm，5min。上机。
[0103]
数据分析：
[0104]
所有数值均表示为平均值
±
标准误(sem)。使用两独立样本t检验或u检验进行统计分析。 p＜0.05被认为有统计学意义。
[0105]
二、实验结果
[0106]
1.苯磺酰胺化合物对阿霉素诱导的衰老小鼠寿命的影响
[0107]
取24只8周龄的c57bl/6j雄鼠随机分成两组，每组12只，给药组小鼠腹腔注射1mg/kg 的苯磺酰胺化合物，对照组小鼠给予等剂量的生理盐水，d7与d14给予10mg/kg的阿霉素，记录小鼠死亡时间。结果如图1所示，当小鼠注射阿霉素后，对照组小鼠很快出现死亡，而苯磺酰胺化合物给药组小鼠的死亡时间明显滞后于对照组小鼠，并具有显著的统计学差异 (*p＜0.05)，说明应用苯磺酰胺化合物后能显著延长阿霉素小鼠的寿命，表现出抗衰老作用。
[0108]
2.苯磺酰胺化合物对衰老模型小鼠运动能力的影响
[0109]
阿霉素诱导小鼠衰老后，d17应用转棒式疲劳仪测量小鼠运动能力，如图2所示，苯磺酰胺化合物给药组小鼠在滚轮上的停留时间相比对照组明显增加，具有显著性差异(*p
＜0.05)，说明应用苯磺酰胺化合物后可以改善小鼠的运动能力。
[0110]
3.苯磺酰胺化合物对衰老模型小鼠各组织器官损伤的影响
[0111]
对小鼠的各组织进行切片染色后，显微镜下观察各组织结构。如图3所示，对照组小鼠心肌细胞肥大明显、排列紊乱、纤维间质增多、炎症细胞浸润。而苯磺酰胺化合物给药组小鼠心肌细胞肥大程度减轻、排列较整齐、纤维间质无明显增多，表明应用苯磺酰胺化合物后改善并减缓了阿霉素对心肌细胞的损伤。同时，对照组小鼠肝组织细胞排列紊乱，有弥漫性肝细胞水肿，变性、坏死、气球样变，并伴有肝窦、肝静脉淤血。而苯磺酰胺化合物给药组小鼠肝组织细胞较对照组细胞空泡化、炎症等症状明显减轻，表明应用苯磺酰胺化合物后改善并减缓了阿霉素对肝组织的损伤。另外，对照组小鼠肾小管刷状缘丢失、管腔扩张等；而苯磺酰胺化合物给药组小鼠肾小管损伤明显减轻，表明应用苯磺酰胺化合物后改善并减缓了阿霉素对肾组织的损伤。以上结果提示苯磺酰胺化合物对于阿霉素引起的组织损伤具有很好的改善效果。
[0112]
4.苯磺酰胺化合物对mef细胞自然衰老的影响
[0113]
原代小鼠纤维母细胞是研究衰老最常用的细胞之一，其在正常培养条件下经过4-5次传代后会表现出明显的衰老症状。本发明选取了第5代的小鼠纤维母细胞，分别给予苯磺酰胺化合物和溶剂对照，培养24小时后采用β-gal染色对其衰老的状况进行评估，如图4所示，研究发现苯磺酰胺化合物能够明显抑制小鼠纤维母细胞的衰老，表现为β-gal阳性染色明显减少，提示苯磺酰胺化合物能够对抗衰老的症状。
[0114]
5.苯磺酰胺化合物对h2o2诱导的mef细胞加速衰老的影响
[0115]
氧自由基的增多和氧化应激的失衡是导致衰老的重要因素，h2o2可以通过增加氧自由基，促进氧化应激损伤加速衰老。本发明选用h2o2建立mef细胞衰老模型，分别给予苯磺酰胺化合物和溶剂对照，如图5所示，研究发现，苯磺酰胺化合物显著减少了h2o2诱导的衰老，表现为细胞β-gal的阳性染色明显少于对照组，提示苯磺酰胺化合物对氧化应激失衡导致的衰老也具有显著的对抗作用。
[0116]
6.苯磺酰胺化合物对mef细胞sasp基因表达的影响
[0117]
sasp是促炎因子、趋化因子和蛋白酶等一系列细胞因子的总称，是衰老细胞的关键特征。本发明选取了第6代的mef细胞，提取rna检测sasp相关因子的表达，如图6所示，发现mpges-2敲除后p16，cxcl1，cxcl2，cxcl10等促炎促衰老相关因子的表达下调，提示 mpges-2敲除通过抑制sasp基因的表达抑制衰老。
[0118]
尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。