参芎葡萄糖注射液在激活细胞ERK通路方面的应用的制作方法

参芎葡萄糖注射液在激活细胞erk通路方面的应用
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，具体是参芎葡萄糖注射液在激活细胞erk通路方面的应用。


背景技术：

2.参芎葡萄糖注射液(sgi)是由丹参水提取物和盐酸川芎嗪组成的注射液。临床上主要用于治疗冠心病、心绞痛等心血管疾病，已成为我国防治心血管疾病的主要药物之一。我们实验室前期研究证实，sgi具有较强的抗氧化应激和抗凋亡作用，但目前关于sgi抗氧化损伤作用的机制研究很少。
3.细胞凋亡是一个通过高度精密的调控并有序地向死亡进程发展的过程，具有多基因、多通路调控的特点。中药存在多组分、多靶点和多途径的特点，利用传统单靶点单通路的研究方法难以阐明中药的抗凋亡机制。也无法寻找到参芎葡萄糖注射液(sgi)对具体的通路、靶蛋白的作用效果，无法得到参芎葡萄糖注射液(sgi)在具体的蛋白作用及激活通路方面的应用，此时无法对细胞中具体的通路和靶蛋白进行精确作用及调控。
4.erk信号通路是mapk信号转导系统的经典通路，参与细胞生长、发育、增殖等多种生理过程，激活erk通路可以改善心肌缺血再灌注损伤。erk的底物在细胞核、细胞质和细胞器中均有分布，但大多数为核蛋白。在静息时，erk主要存在胞浆中，没有活性，只有磷酸化的erk具有活性，当erk被激活后，erk迅速进入细胞核，调节160多种蛋白的活性，从而调节细胞的正常代谢和功能，是细胞膜表面受体转导至细胞核的关键。当erk磷酸化被抑制时，蛋白bcl-2的抗凋亡作用降低，蛋白bax的促凋亡作用增加，破坏线粒体功能，从而产生caspase级联反应，破坏机体细胞的凋亡和生存平衡，最终导致细胞凋亡。
5.因此，寻找并探究参芎葡萄糖注射液(sgi)对具体的通路、靶蛋白的作用效果进行研究及探索，是目前急需解决的问题，可以为参芎葡萄糖注射液进一步开发提供理论和实验基础并且完善基于靶蛋白的中药药效物质基础研究平台。


技术实现要素：

6.为了解决上述问题，本发明提供了参芎葡萄糖注射液在激活细胞erk通路方面的应用。
7.进一步的，所述参芎葡萄糖注射液，是由丹参水提取物和盐酸川芎嗪组成的注射液。
8.进一步的，所述在激活细胞erk通路方面，是制备激活细胞erk通路的药物方面。进一步的，所述激活细胞erk通路的药物，是激活细胞erk通路，并且减少细胞氧化损伤或减少细胞氧化损伤后凋亡的药物。
9.进一步的，所述细胞，是心肌细胞。
10.进一步的，所述激活细胞erk通路，是激活细胞erk通路并减少ros产生。
11.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述激活细胞erk通路，是促进蛋白erk
磷酸化水平上调。
12.氧化应激是导致心血管系统结构、功能异常的重要原因之一。氧化应激引起的心肌细胞凋亡或坏死被认为在心血管疾病的发生发展中起着关键作用。因此，抗凋亡对心血管疾病的防治具有重要作用。h2o2是一种强氧化剂，可氧化细胞膜上的蛋白质和脂肪，通过自由扩散的形式穿过细胞膜与细胞内化合物反应生成-oh等自由基，再与细胞膜中不饱和脂肪酸发生脂质过氧反应破坏细胞内自由基平衡，ros大量增多，激活线粒体凋亡通路，导致细胞凋亡。因此，h2o2常被用于模拟细胞氧化损伤模型，在探索心血管疾病机制的研究中被广泛使用。
13.本技术利用蛋白与参芎葡萄糖注射液相互作用，筛选和验证注射液抗氧化损伤靶蛋白的方法。首先预先给予不同体积分数的参芎葡萄糖注射液处理h9c2细胞，再给予h2o2诱导氧化损伤。在模拟体外生理条件下，进行注射液活性成分筛选，同时进行空白对照。利用高效液相色谱(hplc)进行肽段分级，超高效液相色谱-质谱联用技术检测h9c2细胞的蛋白表达，高分辨质谱定量分析筛选差异修饰蛋白，并对其进行生物信息学分析筛选靶蛋白，蛋白免疫印迹法验证筛选的靶蛋白。最终确定了参芎葡萄糖注射液在激活细胞erk通路方面的应用。
14.参芎葡萄糖注射液(sgi)可通过激活erk信号通路，增加bcl-2蛋白表达水平，降低bax和cleaved-caspase 3蛋白表达水平，增加h2o2诱导h9c2细胞存活率，降低细胞凋亡率。此外，我们还研究了erk通路抑制剂pd98059对sgi抗凋亡作用的影响，发现pd98059可以显著抑制sgi对蛋白bcl-2、bax和cleaved caspase-3的调节，以及显著抑制sgi对h9c2细胞凋亡率和细胞存活率的影响。这表明sgi可激活erk通路产生抗凋亡作用。
15.与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：
16.本发明公开了参芎葡萄糖注射液在激活细胞erk通路方面的应用，参芎葡萄糖注射液可以通过激活细胞erk通路来达到减少ros产生，减少细胞氧化损伤以及减少细胞氧化损伤后凋亡等效果，并且可以通过激活细胞erk通路来达到其他对细胞进行精准调控的效果。并且为参芎葡萄糖注射液进一步开发提供理论和实验基础并且完善基于靶蛋白的中药药效物质基础研究平台。
附图说明
17.图1是sgi促进h2o2诱导h9c2细胞的细胞生存能力结果图，其中(a)细胞用不同浓度的h2o2处理30min，通过mts测定检测细胞活力；(b)h9c2细胞用不同浓度(2，4，8，12％(v/v))的sgi预处理24h，然后用h2o2处理30min，用mts法检测细胞活力，
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p《0.05，
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p《0.01，
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p《0.001vs control；
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p《0.5，
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p《0.01vs model；
18.图2是sgi保护h9c2细胞免受h2o2诱导的细胞形态变化结果图，具体是使用倒置显微镜观察细胞形态(x100)，其中(a)空白组，未用sgi和h2o2处理；(b)模型组，h2o2诱导处理24h；(c-e)用4，8，12％(v/v)的sgi处理24h后h2o2处理30min；
19.图3是sgi治疗可减少h2o2诱导的ros产生结果图，是用浓度为4，8，12％的sgi预处理24h，再用h2o2处理30min，用ros试剂盒检测细胞内ros水平，
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20.图4是sgi保护h9c2细胞免受h2o2诱发凋亡结果图，具体是浓度为4，8，12％的sgi预
处理24h，再用h2o2处理30min；(a)annexinv-fitc细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率；(b)蛋白质印迹分析检测bcl-2，bax和cleaved caspase-3蛋白的表达，
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21.图5是sgi处理后蛋白组学的变化，其中(a)差异表达蛋白(红色代表上调蛋白，蓝色代表下调蛋白)；(b)差异表达蛋白的go富集分析(红色代表上调蛋白，蓝色代表下调蛋白)；(c)差异表达蛋白的kegg富集分析；(d)focal adhesion kegg通路图(红色蛋白被上调，绿色蛋白被下调)；
22.图6是通过westernblot对磷酸化水平上调蛋白erk，磷酸化水平下调蛋白c-jun进行定量分析，以确认磷酸化蛋白组学分析中发现的差异表达蛋白；
23.图7是sgi通过激活erk通路减少h2o2诱导的细胞凋亡结果图，其中pd98059处理h9c2细胞，然后用浓度为12％的sgi预处理，再用h2o2处理；(a)蛋白质印迹分析检测p-erk,erk,bcl-2，bax和cleaved caspase-3蛋白的表达；(b)细胞凋亡率，
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p《0.5versus sgi。
具体实施方式
24.下面结合具体的实施方式对本发明的技术方案做进一步的解释，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
25.1、细胞培养和sgi治疗
26.h9c2大鼠心肌细胞置于含有10％fbs、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem培养基，于37℃，5％co2的培养箱中培养。待细胞生长至80％左右时。然后将细胞用胰蛋白酶消化并传代培养。取对数生长期中生长良好的细胞用于后续实验。用不同浓度的sgi处理24h，然后加入含300μmol/l h2o2处理30min。空白组始终在完全培养基中培养。
27.2、细胞内ros的检测
28.dcfh-da探针测量细胞内ros水平。将已消化的h9c2细胞悬浮液与dcfh-da孵育20min，用磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤3次以除去残留的探针，然后重悬于500μlpbs中。使用酶标仪(bio-rad,hercules,ca,usa)和共聚焦显微镜(zeiss,germany)检测细胞荧光强度，激发和发射波长分别设定在488nm和525nm。
29.3、凋亡检测
30.用胰蛋白酶消化收集h9c2细胞，用冷pbs洗涤两次，用1x binding buffer调整细胞密度为1x 106个/ml。将100μl的细胞重悬液转移至5ml离心管中。将细胞与5μlannexinv在室温黑暗中孵育5分钟，然后与5μlpi在室温下孵育5分钟，然后加入400μl1 x binding buffer。使用c6 plus流式细胞仪(bd biosciences，美国)分析荧光。
31.4、蛋白提取
32.样品在冰上使用高强度超声波处理器(scientz)在裂解缓冲器中对样品进行了三次声波处理。其余碎片在4℃下以12，000x g离心10min。最后，用bca试剂盒测定蛋白质浓度。
33.5、磷酸化蛋白组学
34.混合物首先与imac微球悬浮与振动在加载缓冲(50％丙酮酸/6％三氟乙酸)孵育。通过离心收集富含磷肽的imac微球，并去除超高分子。为了去除非特异性吸附肽，imac微球
按顺序用50％丙酮酸/6％三氟乙酸和30％乙酮酸/0.1％三氟乙酸清洗。为了从imac微球中分离出富集的磷肽，添加了含有10％nh4oh的椭芽缓冲器，并增加了富集磷肽的振动。含有磷肽的超高肽被收集并受冻，用于lc-ms/ms分析
35.6、lc-ms/ms分析
36.试剂肽溶解在0.1％的甲酸(溶剂a)，直接加载到自制的倒相分析柱。梯度包括从6％增加到23％溶剂b(0.1％的甲基甲酸在98％乙酰酸)，23％到35％、80％，然后在80％保持3min，所有在easy-nlc 1，000uplc系统的恒定流量为400nl/min。
37.肽受nsi源的约束，随后在q exactivetm plus(热)中采用串联质谱(ms/ms)，并在线耦合到uplc。施加的电喷雾电压为2.0千伏。m/z扫描范围为350到1800进行全扫描，在orbitrap中检测到完整的肽，分辨率为70，000。然后，使用nce设置选择多肽为ms/ms，分辨率为28，在轨道疗法中检测到碎片，分辨率为17，500。数据依赖程序，在一次ms扫描之间交替，然后进行20次ms/ms扫描，并排除15.0s动态。自动增益控制(agc)设置为5e4。固定第一质量设置为100m/z。
38.7、western blot
39.根据报道进行免疫印迹分析。简而言之，h9c2细胞用ripa缓冲液裂解，bca法对蛋白质进行定量。高温使蛋白变性10min。各组等量上样，利用sds-page电泳分离蛋白后转移至pvdf膜，用5％的bsa封闭3h，用tbst稀释相应一抗至规定浓度，p-erk，erk，c-jun，p-c-jun，bcl-2，bax和cleaved caspase-3，4℃过夜。tbst洗膜5次，5min/次，加入二抗(1:2,000)，室温孵育2h。tbst洗膜5次，5min/次，ecl试剂盒曝光显色，凝胶成像系统拍照。并分别分析每个泳道中靶蛋白与β-肌动蛋白的灰度比，以计算相对蛋白表达水平。
40.实验结果
41.1、sgi促进h2o2诱导h9c2细胞的细胞生存能力。h2o2浓度为300μmol/l能使h9c2细胞的存活率降低至50％左右，因此，后续选用300μmol/l的h2o2作为实验造模浓度。用浓度为2-12％(v/v)的sgi预处理后，可浓度依赖性地提高细胞存活率(p《0.05，p《0.01)。具体结果见图1。
42.2、sgi保护h9c2细胞免受h2o2引起的细胞形态变化。正常细胞h9c2呈完整的椭圆形，形态规则饱满，在经过h2o2处理后，细胞明显皱缩、体积减小且有细胞碎片，即出现明显细胞损伤。sgi预处理能明显减少细胞皱缩和细胞碎片，改善细胞损伤状态，具体结果见图2。
43.3、sgi治疗可减少h2o2诱导的ros产生。结果表明，与comtrol组相比，h2o2处理后细胞内ros显著升高(p《0.01)，而sgi预处理后细胞内ros水平明显降低(p《0.05，p《0.01)。具体结果见图3。
44.4、sgi保护h9c2细胞免受h2o2诱发凋亡。细胞凋亡率结果显示h2o2处理后细胞凋亡率明显高于对照组(41.21％
±
2.69％；p《0.001)。4％、8％和12％的sgi预处理后，凋亡细胞百分率分别降至33.70
±
2.68％、29.53
±
1.06％和27.72
±
1.80％(p《0.05，p《0.01)。western blot分析显示，与control相比，h2o2可显著降低bcl-2/bax的表达水平，增加cleaved caspase-3的表达水平。与model组比较，sgi预处理后bcl-2/bax表达水平明显增加，cleaved caspase-3表达水平显著降低(p《0.05，p《0.01)，提示sgi可改善h2o2诱导的h9c2细胞凋亡。具体结果见图4。
45.5、sgi处理后磷酸化蛋白组学的变化。通过谱图解析我们一共鉴定到4038个蛋白，其中3369个蛋白被定量。与model组比较，sgi组有78个蛋白磷酸化上调，104个蛋白磷酸化下调。上调的蛋白质在细胞核、蛋白质转运和细胞器组织的调节等方面高度富集，而下调的蛋白质与血浆组织、细胞骨架的调节和基因表达有关。kegg富集分析表明，差异磷酸化蛋白主要富集在12个通路中，其中与细胞凋亡相关的黏着斑通路被高度富集，且富集于下游信号通路erk和jnk通路。具体结果见图5。
46.6、靶蛋白的验证。western blot结果显示，与model组比较，sgi预处理的h9c2细胞p-erk水平显著升高(p《0.001，p《0.01)，p-c-jun水平显著降低(p《0.001)，与磷酸化蛋白质组学分析结果一致。具体结果见图6。
47.7、sgi通过激活erk通路减少h2o2诱导的细胞凋亡。western blot结果显示，h2o2可显著降低p-erk和bcl-2/bax的表达水平(p《0.001)，显著增加cleaved caspase-3的表达水平(p《0.001)，而sgi预处理则显著增加p-erk和bcl-2/bax的表达水平(p《0.001)，显著降低cleaved caspase-3的表达水平(p《0.05)。而在给于erk通路抑制剂pd98059后，给药组细胞的p-erk、bcl-2/bax和cleaved caspase-3表达水平，细胞存活率，细胞凋亡率均被显著抑制。具体结果见图7。
48.由上结果可知，参芎葡萄糖注射液(sgi)可通过激活erk信号通路，增加bcl-2蛋白表达水平，降低bax和cleaved-caspase 3蛋白表达水平，增加h2o2诱导h9c2细胞存活率，降低细胞凋亡率。此外，我们还研究了erk通路抑制剂pd98059对sgi抗凋亡作用的影响，发现pd98059可以显著抑制sgi对蛋白bcl-2、bax和cleaved caspase-3的调节，以及显著抑制sgi对h9c2细胞凋亡率和细胞存活率的影响。这表明sgi可激活erk通路产生抗凋亡作用。
49.最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。