淡豆豉的鉴别方法与流程

1.本发明涉及中药材检测技术领域，具体涉及一种淡豆豉的鉴别方法。


背景技术：

2.淡豆豉为豆科植物大豆glycine max(l.)merr.的干燥成熟种子(黑豆) 的发酵加工品，始载于《名医别录》。按照《中国药典》2020版一部淡豆豉项下的规定，淡豆豉的制备包括：取桑叶、青蒿各70g～100g，加水煎煮，滤过，煎液拌入净大豆1000g中，俟吸尽后，蒸透，取出，稍晾，再置容器内，用煎过的桑叶、青蒿渣覆盖，闷使发酵至黄衣上遍时，取出，除去药渣，洗净，置容器内再闷15天～20天，至充分发酵、香气溢出时，取出，略蒸，干燥，即得。淡豆豉呈椭圆形略扁，长0.6cm～lcm，直径0.5cm～ 0.7cm。表面黑色，皱缩不平，一侧有长椭圆形种脐。质稍柔软或脆，断面棕黑色。气香，味微甘。具有解表除烦，宣发郁热的功效。用于伤寒热病、寒热、头痛、烦躁和胸闷。然而，目前针对淡豆豉还缺乏有效的鉴别手段。


技术实现要素：

3.基于以上背景技术，本发明的主要目的是提供一种淡豆豉的鉴别方法，弥补淡豆豉鉴别技术领域的空缺，为淡豆豉的质量控制提供有效的技术手段，以便更好地把控产品的质量。
4.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
5.一种淡豆豉的鉴别方法，所述鉴别方法包括如下步骤：
6.用待测样品制备供试品溶液，提供含有维采宁ⅱ的阳性对照溶液，采用高效液相色谱质谱联用法对所述供试品溶液和所述阳性对照溶液进行检测。
7.在其中一个实施例中，所述高效液相色谱质谱联用法中，高效液相色谱的条件包括：
8.固定相：c18色谱柱，
9.流动相：流动相a为乙腈，流动相b为甲酸铵浓度为0.005mol/l～ 0.015mol/l的甲酸铵水溶液，洗脱方式采用梯度洗脱。
10.在其中一个示例中，梯度洗脱的条件包括：
11.0min～7min，所述流动相a的体积百分比由0％上升至6％，
12.7min～13min，所述流动相a的体积百分比由6％上升至9％，
13.13min～31min，所述流动相a的体积百分比由9％上升至39％，
14.31min～36min，所述流动相a的体积百分比由39％上升至70％，
15.36min～45min，所述流动相a的体积百分比由70％上升至90％，
16.45min～50min，所述流动相a的体积百分比为90％，
17.50min～51min，所述流动相a的体积百分比由90％下降至0％，
18.51min～55min，所述流动相a的体积百分比为0％。
19.在其中一个实施例中，所述高效液相色谱质谱联用法中，高效液相色谱的条件包
括：进样量为0.6μl～2μl。
20.在其中一个实施例中，所述高效液相色谱质谱联用法中，高效液相色谱的条件包括：柱温为25℃～40℃。
21.在其中一个实施例中，所述高效液相色谱质谱联用法中，高效液相色谱的条件包括：流速为0.2ml/min～0.4ml/min。
22.在其中一个实施例中，所述高效液相色谱质谱联用法中，质谱的条件包括：采用电喷雾负离子模式。
23.在其中一个实施例中，所述电喷雾负离子模式的设置条件包括：离子源模式为负离子模式。
24.在其中一个实施例中，所述电喷雾负离子模式的设置条件包括：离子源温度为340℃～360℃。
25.在其中一个实施例中，所述电喷雾负离子模式的设置条件包括：脱溶剂温度为340℃～360℃。
26.在其中一个实施例中，所述电喷雾负离子模式的设置条件包括：脱溶剂气流的流速为33l/min～37l/min。
27.在其中一个实施例中，所述电喷雾负离子模式的设置条件包括：毛细管电压为3.4kv～3.6kv。
28.在其中一个实施例中，所述供试品溶液的制备步骤包括：以甲醇水溶液为提取溶剂对所述待测样品进行提取，收集提取液。
29.在其中一个实施例中，所述含有维采宁ⅱ的阳性对照溶液选自青蒿对照药材溶液和维采宁ⅱ对照品溶液中的至少一种。
30.在其中一个实施例中，所述青蒿对照药材溶液的制备步骤包括：以甲醇水溶液为提取溶剂对青蒿对照药材进行提取，收集提取液。
31.在其中一个实施例中，所述鉴别方法还包括：取不含维采宁ⅱ的阴性样品，制备阴性对照溶液，并采用所述高效液相色谱质谱联用法对所述阴性对照溶液进行检测。
32.在其中一个实施例中，所述阴性样品选自桑叶对照药材和黑豆对照药材中的至少一种。
33.在其中一个实施例中，所述阴性对照溶液的制备步骤包括：以甲醇水溶液为提取溶剂对所述阴性样品进行提取，收集提取液。
34.与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：
35.本发明提供的鉴别方法，首次通过采用uplc-ms法鉴别待测淡豆豉样品中是否存在青蒿的化学成分
‑‑
维采宁ⅱ，从而实现淡豆豉的鉴别(特别是能将淡豆豉和食用豆豉区分开来)，弥补了淡豆豉鉴别技术领域的空缺，为淡豆豉的质量控制提供了有效的技术手段，以便更好地把控产品的质量。并且，本发明的鉴别方法，准确可靠。
附图说明
36.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前
提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
37.图1为淡豆豉药材-青蒿对照药材-桑叶对照药材-黑豆对照药材tic图 (负模式)扫描图；其中图1a为淡豆豉药材的扫描图、图1b为青蒿对照药材的扫描图、图1c为桑叶对照药材的扫描图、图1d为黑豆对照药材的扫描图；
38.图2为淡豆豉药材-青蒿对照药材-桑叶对照药材-黑豆对照药材tic图提取593.15离子轮廓图；其中图2a为淡豆豉药材的扫描图、图2b为青蒿对照药材的扫描图、图2c为桑叶对照药材的扫描图、图2d为黑豆对照药材的扫描图；
39.图3为维采宁ii对照品、淡豆豉药材、青蒿对照药材prm模式扫描图；其中图3a为维采宁ii对照品的扫描图、图3b淡豆豉药材的扫描图、图3c 为青蒿对照药材的扫描图；
40.图4为维采宁ii对照品、淡豆豉药材、青蒿对照药材在prm模式 593.15-353.07二级离子轮廓图，其中图4a为维采宁ii对照品的扫描图、图4b淡豆豉药材的扫描图、图4c为青蒿对照药材的扫描图；
41.图5为实施例2的检测结果图；
42.图6为实施例3的检测结果图。
具体实施方式
43.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更详细的描述。但是，应当理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式或实施例。相反地，提供这些实施方式或实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
44.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式或实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
45.本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
46.本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，则包括数值区间的两个端点。
47.本发明中涉及的百分比含量，如无特别说明，对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比，对于液相-液相混合指体积百分比。
48.本发明中涉及的百分比浓度，如无特别说明，均指终浓度。所述终浓度，指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
49.本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
50.药用的淡豆豉，是以青蒿、桑叶为辅料经过发酵炮制而成的，而日常食用的豆豉则不是以青蒿、桑叶为辅料炮制而成的。青蒿作为淡豆豉炮制过程中必不可少的辅料之一，影响淡豆豉发酵过程中的成分变化。在发酵过程中，青蒿中的有效成分是否转移到淡豆豉中，对淡豆豉的质量存在影响。目前还未有鉴别淡豆豉的技术方案，特别是通过鉴别青蒿成分实现淡豆豉的鉴别，尤其是区分淡豆豉和食用豆豉。基于此，本发明的主要目的是提供一种
淡豆豉的鉴别方法，该鉴别方法通过鉴别待测豆豉样品中是否存在青蒿的特征成分维采宁ⅱ从而实现淡豆豉的鉴别，将淡豆豉和食用豆豉区分开来。
51.本发明提供一种淡豆豉的鉴别方法，所述鉴别方法包括如下步骤：
52.用待测样品制备供试品溶液，提供含有维采宁ⅱ的阳性对照溶液，采用高效液相色谱质谱联用法对所述供试品溶液和所述阳性对照溶液进行检测。
53.采用本发明提供的上述鉴别方法，如果检测所得的供试品色谱图相对于对照色谱图的相应位置同时出现响应信号(即存在质荷比为593.15的离子碎片)，说明待测样品中含有青蒿成分
‑‑
维采宁ⅱ，即说明待测样品为淡豆豉。如果供试品色谱图相对于对照图谱的相应位置无响应信号，说明供试品溶液不含有维采宁ⅱ成分，即说明待测样品中不含有转移自青蒿的成分。
54.在其中一个示例中，所述高效液相色谱质谱联用法中，高效液相色谱的条件包括：
55.固定相：c18色谱柱，
56.流动相：流动相a为乙腈，流动相b为甲酸铵浓度为0.005mol/l～ 0.015mol/l的甲酸铵水溶液，洗脱方式采用梯度洗脱。
57.本发明的流动相b，例如流动相b为甲酸铵浓度为0.005mol/l的甲酸铵水溶液、甲酸铵浓度为0.01mol/l的甲酸铵水溶液、甲酸铵浓度为 0.015mol/l的甲酸铵水溶液。
58.在其中一个示例中，梯度洗脱的条件包括：
59.0min～7min，所述流动相a的体积百分比由0％上升至6％，
60.7min～13min，所述流动相a的体积百分比由6％上升至9％，
61.13min～31min，所述流动相a的体积百分比由9％上升至39％，
62.31min～36min，所述流动相a的体积百分比由39％上升至70％，
63.36min～45min，所述流动相a的体积百分比由70％上升至90％，
64.45min～50min，所述流动相a的体积百分比为90％，
65.50min～51min，所述流动相a的体积百分比由90％下降至0％，
66.51min～55min，所述流动相a的体积百分比为0％。
67.由于淡豆豉是由青蒿、桑叶作为辅料炮制而成，采用上述梯度洗脱条件能够检测出淡豆豉、青蒿中的化学成分，对青蒿辅料有较好的专属性鉴别。
68.优选地，所述高效液相色谱质谱联用法中，高效液相色谱的条件包括：
69.固定相：c18色谱柱，
70.流动相：流动相a为乙腈，流动相b为甲酸铵浓度为0.005mol/l～ 0.015mol/l的甲酸铵水溶液，洗脱方式采用梯度洗脱；梯度洗脱的条件包括：
71.0min～7min，所述流动相a的体积百分比由0％上升至6％，
72.7min～13min，所述流动相a的体积百分比由6％上升至9％，
73.13min～31min，所述流动相a的体积百分比由9％上升至39％，
74.31min～36min，所述流动相a的体积百分比由39％上升至70％，
75.36min～45min，所述流动相a的体积百分比由70％上升至90％，
76.45min～50min，所述流动相a的体积百分比为90％，
77.50min～51min，所述流动相a的体积百分比由90％下降至0％，
78.51min～55min，所述流动相a的体积百分比为0％。
79.在本发明上述液相色谱条件下能够实现对淡豆豉和青蒿成分的检测，避免除维采宁ⅱ外的其他化学成分的干扰，提供了检测的准确率。
80.在其中一个示例中，所述高效液相色谱质谱联用法中，高效液相色谱的条件包括：进样量为0.6μl～2μl。例如0.6μl、0.7μl、0.8μl、0.9μl、 1.0μl、1.1μl、1.2μl、2μl。
81.在其中一个示例中，所述高效液相色谱质谱联用法中，高效液相色谱的条件包括：柱温为25℃～40℃。例如25℃、27℃、29℃、32℃、33℃、 34℃、35℃、36℃、37℃、40℃。
82.在其中一个示例中，所述高效液相色谱质谱联用法中，高效液相色谱的条件包括：流速为0.2ml/min～0.4ml/min。例如0.2ml/min、0.3ml/min、 0.4ml/min。
83.在其中一个示例中，所述高效液相色谱质谱联用法中，质谱的条件包括：采用电喷雾负离子模式。
84.发明人还研究发现，采用质谱检测器，特别是电喷雾负离子模式的质谱检测器，可以提高对维采宁ⅱ相应信号的检测灵敏度。
85.在其中一个示例中，所述电喷雾负离子模式的设置条件包括：离子源模式为负离子模式。
86.在其中一个示例中，所述电喷雾负离子模式的设置条件包括：离子源温度为340℃～360℃。例如340℃、345℃、350℃、355℃、360℃。
87.在其中一个示例中，所述电喷雾负离子模式的设置条件包括：脱溶剂温度为340℃～360℃。例如340℃、345℃、350℃、355℃、360℃。
88.在其中一个示例中，所述电喷雾负离子模式的设置条件包括：脱溶剂气流的流速为33l/min～37l/min。例如33l/min、34l/min、35l/min、 36l/min、37l/min。
89.在其中一个示例中，所述电喷雾负离子模式的设置条件包括：毛细管电压为3.4kv～3.6kv。例如3.4kv、3.5kv、3.6kv。
90.在其中一个示例中，所述供试品溶液的制备步骤包括：以甲醇水溶液为提取溶剂对所述待测样品进行提取，收集提取液。
91.本发明在制备所述供试品溶液的过程中：提取溶剂可以选用甲醇含量为70％～90％(v/v)的甲醇水溶液。提取的方式可以采用超声提取，超声提取的条件包括：功率为200w～300w，频率为35khz～45khz，时长为 25min～35min，例如：在250w、40khz下超声30min，在200w、45khz 下超声25min，在300w、35khz下超声35min。收集提取液的方式包括但不限于过滤。每0.8g～1.2g所述待测样品对应所述提取溶剂的用量可以控制在20ml～40ml(例如20ml、25ml、30ml、35ml、40ml)。可以理解的是，如果提取过程中提取溶剂有减失，可以酌情在提取液中补加相应的提取溶剂。
92.在其中一个示例中，所述含有维采宁ⅱ的阳性对照溶液选自青蒿对照药材溶液和维采宁ⅱ对照品溶液中的至少一种。
93.在其中一个示例中，所述青蒿对照药材溶液的制备步骤包括：以甲醇水溶液为提取溶剂对青蒿对照药材进行提取，收集提取液。
94.本发明在制备所述青蒿对照药材溶液的过程中：提取溶剂可以选用甲醇含量为70％～90％(v/v)的甲醇水溶液。提取的方式可以采用超声提取，超声提取的条件包括：功率为200w～300w，频率为35khz～45khz，时长为25min～35min，例如：在250w、40khz下超声30min，在200w、45khz 下超声25min，在300w、35khz下超声35min。收集提取液的方式包括但
不限于过滤。每0.8g～1.2g所述青蒿对照药材对应所述提取溶剂的用量可以控制在20ml～40ml(例如20ml、25ml、30ml、35ml、40ml)。可以理解的是，如果提取过程中提取溶剂有减失，可以酌情在提取液中补加相应的提取溶剂。
95.在其中一个示例中，所述鉴别方法还包括：取不含维采宁ⅱ的阴性样品，制备阴性对照溶液，并采用所述高效液相色谱质谱联用法对所述阴性对照溶液进行检测。
96.在其中一个示例中，所述阴性样品选自桑叶对照药材和黑豆对照药材中的至少一种。
97.在其中一个示例中，所述阴性对照溶液的制备步骤包括：以甲醇水溶液为提取溶剂对所述阴性样品进行提取，收集提取液。
98.本发明在制备所述阴性对照溶液的过程中：提取溶剂可以选用甲醇含量为70％～90％(v/v)的甲醇水溶液。提取的方式可以采用超声提取，超声提取的条件包括：功率为200w～300w，频率为35khz～45khz，时长为 25min～35min，例如：在250w、40khz下超声30min，在200w、45khz 下超声25min，在300w、35khz下超声35min。收集提取液的方式包括但不限于过滤。每0.8g～1.2g所述阴性样品对应所述提取溶剂的用量可以控制在20ml～40ml(例如20ml、25ml、30ml、35ml、40ml)。可以理解的是，如果提取过程中提取溶剂有减失，可以酌情在提取液中补加相应的提取溶剂。
99.实施例1
100.本实施例提供一种淡豆豉的鉴别方法，包括如下步骤：
101.1材料
102.仪器：thermo液质联用仪(液相部分thermo vanquish flex、质谱部分 thermo fisher qe)。
103.试剂：乙腈(色谱纯，德国merck公司)；甲酸铵(色谱级，上海安谱科学实验有限公司)。
104.试药：维采宁ii(批号：cfn92031，含量≧98％，chem faces)。
105.2 方法
106.2.1 检测条件
107.2.1.1色谱条件
108.固定相：beh c18(1.7μm，1.5mm
×
100mm)；
109.进样量：1μl；
110.流速：0.3ml/min；
111.柱温：35℃；
112.监测模式：负离子模式(dd-ms2 discovery)；
113.洗脱梯度见下表1；
114.以乙腈为流动相a，以甲酸铵浓度为0.01mol/l的甲酸铵水溶液为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；
115.柱温为35℃；
116.流速为0.3ml/min。
117.表1
[0118][0119]
2.1.2质谱条件
[0120]
采用质谱检测器，电喷雾负离子模式下(esi-)，选择质荷比(m/z)593.15。
[0121]
esi参数设置参见下表：
[0122]
表2
[0123][0124]
2.2供试品溶液制备
[0125]
分别取淡豆豉药材、青蒿对照药材、桑叶对照药材和黑豆对照药材的粉末(过二号筛)，取约1.0g，精密称定，精密加80％甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用 80％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，相应获得供试品溶液、青蒿对照药材溶液、桑叶对照药材溶液和黑豆对照药材溶液。
[0126]
2.3对照品溶液制备
[0127]
取维采宁ii对照品适量，加甲醇分别制成每1ml含0.01mg的对照品溶液。
[0128]
2.4检测
[0129]
分别吸取淡豆豉药材供试品溶液1μl、青蒿对照药材溶液1μl、桑叶对照药材溶液1μl、黑豆对照药材溶液1μl和维采宁ii对照品溶液1μl，注入高效液相色谱-质谱联用仪，测定。
[0130]
以质荷比(m/z)593.15离子提供的淡豆豉药材供试品离子流色谱中，应同时呈现与青蒿对照药材溶液色谱保留时间一致的色谱峰。
[0131]
3结果
[0132]
分别吸取淡豆豉供试品溶液、青蒿对照药材溶液、桑叶对照药材溶液、黑豆对照药材溶液、维采宁ii对照品溶液按2.1所述的检测条件进行检测。结果见图1、图2、图3、图4所示。
[0133]
如图1所示的淡豆豉药材-青蒿对照药材-桑叶对照药材-黑豆对照药材 tic图(负模式)中，图1a淡豆豉药材的扫描图与图1b青蒿对照药材的扫描图中有相同的离子碎片(即在17.92分钟有一个峰的质荷比(m/z)为 593.15的离子碎片)，而图1c桑叶对照药材的扫描图与图1d黑豆对照药材的扫描图中均没有，经文献资料可能为维采宁ii(相对分子质量：594.52)，说明淡豆豉药材中含有青蒿药材中的特有成分。
[0134]
如图2所示的淡豆豉-青蒿-桑叶-黑豆tic图提取593.15离子轮廓图，图2a淡豆豉药材的扫描图与图2b青蒿对照药材的扫描图中在17.92分钟有色谱峰，而图2c桑叶对照药材的扫描图与图2d黑豆对照药材的扫描图中没有。
[0135]
如图3所示维采宁ii对照品(图3a)、淡豆豉药材(图3b)、青蒿对照药材(图3c)在prm模式，在18.21分钟均能提取一个质荷比(m/z)为 593.15的离子峰。
[0136]
如图4所示维采宁ii对照品、淡豆豉药材、青蒿对照药材在prm模式 593.15-353.07二级离子轮廓图，在18.21分钟均能提取一个质荷比(m/z)为 593.15的离子峰。
[0137]
实施例2
[0138]
本实施例提供一种淡豆豉的鉴别方法，包括如下步骤：
[0139]
(1)制备供试品溶液；
[0140]
取需要鉴别的药材的粉末(过二号筛)，取约1.0g，精密称定，精密加 80％甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用体积分数80％的甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品溶液。取青蒿对照药材，同法制备对照药材溶液。
[0141]
(2)将所述的供试品溶液和对照药材溶液注入到高效液相色谱仪中进行梯度洗脱；具体按实施例1中2.1项下的检测条件进行。
[0142]
(3)对梯度洗脱后的成分进行检测，检测图谱中若青蒿对照药材和需要鉴别的药材在18.21分钟同时出现离子峰，说明梯度洗脱后需要鉴别的药材中含有青蒿的特有成分维采宁ii，见图5。
[0143]
实施例3
[0144]
本实施例提供一种淡豆豉的鉴别方法，包括如下步骤：
[0145]
(1)制备供试品溶液；
[0146]
取需要鉴别的药材的粉末(过二号筛)，取约1.0g，精密称定，精密加 80％甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用体积分数80％的甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品溶液。取青蒿对照药材，同法制备对照药材溶液。
[0147]
(2)将所述的供试品溶液和所述的对照药材溶液注入到高效液相色谱仪中进行梯度洗脱；具体按实施例1中2.1项下所述的检测条件进行。
[0148]
(3)对梯度洗脱后的成分进行检测，检测图谱中若青蒿对照药材和需要鉴别的药材存在质荷比为593.15的离子碎片，说明梯度洗脱后淡豆豉中含有青蒿的特有成分维采宁ii，见图6。
[0149]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0150]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所述附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。