用于治疗胰岛素缺乏病症的组合物的制作方法

用于治疗胰岛素缺乏病症的组合物
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年6月28日提交的序列号为19183317.7的欧洲专利申请的优先权权益，其内容通过引用全文纳入本文。
3.序列表
4.与本技术相关的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并在此通过引用并入说明书。包含序列表的文本文件的名称是pat7278pc00_st25.txt。
技术领域
5.本公开提供了用于在有需要的受试者中治疗胰岛素缺乏(id)病症或相关症状的组合物和方法，所述组合物包括s100钙结合蛋白a9(s100a9)、s100钙结合蛋白a9的变体或片段以及胰岛素、胰岛素的变体或片段。


背景技术：

6.数千万人患有1型糖尿病(t1d)；一种由自身免疫介导的胰腺β细胞攻击而导致全部(或几乎全部)β细胞丧失和胰岛素缺乏引起的病症1。如果不治疗，t1d是一种以高血糖症为特征的致命的分解代谢疾病。因此，t1d研究和药物开发的重点主要是在不引起危及生命的低血糖症的情况下改善策略以降低高血糖症
2,3
。然而，除了升高循环的葡萄糖水平外，β细胞丧失还会导致一些“其他缺陷”，其中一些(例如严重的高酮血症和酮症酸中毒)会危及生命
4-7
。因此，开发不仅可以改善高血糖，还可以挽救由胰岛素缺乏导致的“其他缺陷”(例如酮生成增加)的策略十分重要。例如，如下所示的结果强调了改善高血糖症和“其他缺陷”的重要性。事实上，我们的数据表明，尽管高血糖症略有改善，但高酮血症和高甘油三酯血症的正常化与β细胞丧失和胰岛素缺乏的小鼠寿命的显著延长相关。
7.未经治疗的t1d会迅速导致死亡4。然而，自从20世纪20年代初发现胰岛素以来
8,9
，就一直使用胰岛素疗法治疗t1d；一种将这种致命疾病转化为人类可以忍受的疾病的方法。胰岛素的显著成就(代表医学上最重要的发现之一)导致了没有胰岛素的生活是不可能的结论，尽管科学界不得不承认胰岛素治疗并不令人满意4。事实上，t1d受试者发生肾功能衰竭、失明、神经损伤、心脏病发作、中风和低血糖症的风险更高4。其中一些缺陷可能滋生于胰岛素治疗本身。例如，胰岛素刺激脂质和胆固醇的合成；因此，可能由于其已确立的脂肪生成作用
10
，慢性胰岛素治疗促进脂肪组织外的脂质沉积。这种效应可能导致在糖尿病受试者中观察到的冠状动脉疾病的极高发病率
5,6
。此外，胰岛素的脂肪生成作用会促进脂质诱导的胰岛素抵抗，因此可能是长期t1d护理中胰岛素需求增加的原因，至少是部分原因
11
。胰岛素也是一种有效的降血糖激素。由于这一作用，强化胰岛素治疗会导致低血糖症，这可能会导致残疾，并且有时甚至会导致死亡
12-14
。由于胰岛素治疗不能根除t1d的致残性副发病变(例如心脏病发作、中风、失明、肾衰竭、神经病变等)，因此t1d护理所需的成本巨大，并且与正常受试者的生活质量相比，t1d患者的生活质量降低15。由于目前治疗的缺陷，迫切需要旨在改善t1d治疗的研究。
8.主要方法旨在逐渐减少胰岛素剂量，从而降低与胰岛素治疗相关的风险，例如危及生命的低血糖症。然而，几乎所有预期的胰岛素辅助治疗都集中在改善高血糖症上。例如，胰淀素的合成类似物(普兰林肽)、肠促胰岛素模拟物(例如胰高血糖素样肽-1受体激动剂和二肽基-肽酶-4抑制剂)以及钠-葡萄糖转运体-1和钠-葡萄糖转运体-2(sglt1和sglt2)抑制剂均旨在降低高血糖症，并与低血糖症风险增加相关
2,3
。其中一些治疗还与酮症酸中毒风险增加相关
2,3
。
9.因此，仍然需要用于在有需要的受试者中治疗胰岛素缺乏(id)病症或相关症状的改进的治疗方法，以降低低血糖症和酮症酸中毒的风险。


技术实现要素：

10.本发明提供了一种用于在有需要的受试者中治疗胰岛素缺乏(id)病症或相关症状之用途的组合物，所述组合物包含：
11.i)s100钙结合蛋白a9(s100a9)、s100钙结合蛋白a9的变体或片段以及
12.ii)胰岛素、胰岛素的变体或片段。
13.本发明的另一方面涉及一种有需要的受试者的胰岛素缺乏(id)病症或相关症状的治疗方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的
14.i)s100钙结合蛋白a9(s100a9)、s100钙结合蛋白a9的变体或片段以及
15.ii)胰岛素、胰岛素的变体或片段。
16.本发明的另一方面涉及一种质粒或载体(vector)，所述质粒或载体包含一种或多种编码本发明的s100钙结合蛋白a9(s100a9)、s100钙结合蛋白a9的变体或片段以及胰岛素、胰岛素的变体或片段，和/或亲和标签的核酸。
17.本发明的另一方面涉及核酸，所述核酸编码：本发明的s100钙结合蛋白a9(s100a9)、s100钙结合蛋白a9变体或片段，以及胰岛素、胰岛素变体或片段和/或亲和标签。
18.本发明的另一方面涉及宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明的质粒或载体或核酸。
19.本发明的另一方面涉及药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的i)至iii)：i)本发明的组合物，或ii)本发明的质粒或载体，或iii)本发明的宿主细胞；以及至少一种药学上可接受的赋形剂、稀释剂、载剂(carrier)、盐和/或添加剂。
20.本发明的另一方面涉及有需要的受试者的胰岛素缺乏(id)病症或相关症状的治疗方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的
21.i)s100钙结合蛋白a9(s100a9)、s100钙结合蛋白a9的变体或片段以及
22.ii)胰岛素、胰岛素的变体或片段。
23.本发明的另一方面涉及本发明的组合物或药物组合物在制备用于治疗胰岛素缺乏(id)病症或相关症状的药物中的用途。
24.本发明的其他方面涉及一种包括本发明的药物组合物的递送装置以及一种试剂盒，所述试剂盒包含i)一个或多个包含本发明的药物组合物或递送装置的储存器。
附图说明
25.图1.鼠s100a9改善了dt诱导的id小鼠的代谢失衡。(a)dt处理的rip-dtr小鼠(水
动力尾静脉注射后第10天处死；htvi)及它们的年龄匹配的非糖尿病健康对照中的胰岛素原(proinsulin)mrna的含量。(b)dt-plive小鼠和dt-plive-s100a9小鼠(htvi后第10天)和年龄匹配的健康对照的血浆胰岛素含量。(c)血浆s100a9水平和循环(d)葡萄糖、循环(e)胰高血糖素和β-羟基丁酸，以及循环(f)甘油三酯。误差线表示sem。使用单因素方差分析(tukey’s post-hoc检验)进行统计分析。健康(n＝3-6)、dt-plive(n＝7-12)和dt-plive-s100a9(n＝7-12)。*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001，****p《0.0001。
26.图2.增强的鼠s100a9改善了胰岛素在降低id小鼠高血糖症的有效性。1.5u/小鼠的胰岛素剂量对dt-plive小鼠(水动力尾静脉注射后第14天；(htvi))的高血糖无影响，但其确实导致dt-plive-s100a9小鼠(htvi后第14天)的高血糖的快速下降。在胰岛素注射3小时后测量血糖。
27.图3.c端flag序列的存在不会影响鼠s100a9改善小鼠id症状的能力。(a)dt-plive小鼠、dt-plive-n-s100a9小鼠和dt-plive-s100a9-flag小鼠(htvi后第7天)和年龄匹配的健康对照(健康)(nd＝未检出的)中的血浆胰岛素含量。(b)血糖。(c)血浆β-羟基丁酸水平。对于每组，n＝4-9。误差线表示sem。使用单因素方差分析(tukey’s post-hoc检验)进行统计分析。每种情况所表示的统计结果均是相对于dt-plive组的。*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001。
28.图4.重组鼠s100a9与次优胰岛素治疗相结合可改善id小鼠的代谢失衡。(a)实验处理和分组。第一次stz注射后第13天的小鼠(及其健康对照)的(b)血浆胰岛素水平和(c)血糖。在实验第17天(颗粒植入后第3天)的小鼠(及其健康对照)的(d)血浆牛胰岛素(由linbit颗粒释放)和(e)血糖。(f)腹腔注射rs100a9或生理盐水后小鼠(及其健康对照)的血糖。在授时因子(zeitgeber，zt)2下进行rs100a9或生理盐水注射。(g)体重。(h)左图表示每日或平均每天的食物摄入量；右图表示生理盐水或rs100a9注射后3小时内的食物摄入量。在指定的实验时间的血浆值和血糖值来自自由进食(“进食”)或移除食物3小时后(“禁食3小时”)的小鼠。对于每组，n＝8或9。在胰岛素治疗组中，所有显示出血浆牛胰岛素水平低于25pg/ml的小鼠都被排除在研究之外。在c和e中，进食的值和禁食的值分别从在zt 2和zt 5采集的血浆中获得。误差线表示sem。使用单因素方差分析(tukey’s post-hoc检验)进行统计分析。每种情况所表示的统计结果均是相对于stz-假处理-生理盐水组的。*p《0.05；**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
具体实施方式
29.尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文所述的那些方法和材料相似或等效的方法和材料，但下文描述了合适的方法和材料。在本文中提及的所有公布、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用全部纳入本文。本文所讨论的公布和申请仅供在本技术提交日期之前披露之用。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权因在先发明而早于此类公布。此外，所述材料、方法和实施例仅是说明性的而不是限制性的。
30.在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。除非另有定义，本文使用的所有技术术语和科学术语与本文主题所属领域的技术人员通常理解的含义相同。如本文所用，提供以下定义以促进对本发明的理解。
31.术语“包括(comprise或comprising)”通常用于包括(include/including)的含
义，也就是说允许存在一个或多个特征或组分。术语“包括(comprise和comprising)”还分别涵盖更受限制的术语“由
……
组成(consist和consisting)”。
32.如说明书和权利要求书所用，单数形式“a”、“an”和“所述”包括复数形式，除非上下文另有明确说明。
33.如本文所用，“至少一个”意为“一个或多个”、“两个或更多个”、“三个或更多个”等。例如，至少一个亲和标签包括一个、两个或更多个、三个或更多个等
……
的亲和标签。
34.如本文所用，术语“受试者”、“有需要的受试者”或“患者”、“有需要的患者”在本领域中是众所周知的，并且在本文中可互换使用以指代哺乳动物，包括狗、猫、大鼠、小鼠、猴、牛、马、山羊、绵羊、猪、骆驼，以及最优选是人类。在一些情况下，所述受试者是需要治疗的受试者或患有疾病或病症的受试者。然而，在其他方面，所述受试者可以是健康受试者。该术语不表示具体的年龄或性别。因此，成人和新生儿受试者，无论是男性还是女性，都将被涵盖在内。优选地，所述受试者是人，最优选地，所述受试者是患有胰岛素缺乏(id)病症或相关症状的人。
35.如本文所用，术语“治疗(treating)”、“治疗(treated)”或“治疗(treatment)”包括预防性(例如预防疾病的(prophylactic))、姑息性和治疗性的用途或结果。
36.如本文所用，术语“胰岛素缺乏”是指产生胰岛素的胰腺β细胞的部分丧失或完全丧失。该术语还包括它们分泌胰岛素的能力降低，从而导致循环胰岛素水平降低。
37.如本文所用，术语“胰岛素缺乏相关症状”是指由胰岛素水平低或缺乏引起的不良反应。
38.胰岛素缺乏相关症状通常是指，并选自包括以下的组：高血糖症、高酮血症、酮症酸中毒、高甘油三酯血症、高血糖素血症、高钙卫蛋白血症、增加的或高循环(非酯化脂肪酸(nefa)水平、严重低瘦素血症、降低的体脂量或低体脂量、食欲过盛、烦渴及它们的任意组合。
39.胰岛素缺乏(id)病症通常是指1型糖尿病或2型糖尿病，以及2型糖尿病的亚型。
40.术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，指任何种类的脱氧核糖核苷酸(例如dna、cdna
……
)或核糖核苷酸(例如rna、mpvna
……
)聚合物或脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸(例如dna/rna)聚合物的组合，呈线性构象或环状构象，并以单链或双链形式存在。这些术语不应被解释为对聚合物长度的限制，并且可以包括天然核苷酸的已知类似物，以及在碱基、糖和/或磷酸盐部分(例如硫代磷酸酯骨架)被修饰的核苷酸。通常，具体核苷酸的类似物具有相同的碱基配对特异性；即，a的类似物将与t碱基配对。
41.如本文所用，术语“载体”是指病毒载体或核酸(dna或rna)分子，例如质粒或其他媒介物，所述载体包含一个或多个异源核酸序列(例如编码一种或多种编码肽(例如本发明的s100a9、胰岛素和/或亲和标签、它们的变体或片段)的核酸的核酸序列。术语“表达载体”、“基因递送载体”和“基因治疗载体”是指能有效地将一种或多种核酸并入细胞中并在细胞中表达一种或多种核酸的任何载体，优选在启动子(例如，如kallunki t,barisic m,m,liu b.how to choose the right inducible gene expression system for mammalian studies？cells.2019；8(8):796中所描述的诱导型启动子)的调控下。克隆载体或表达载体可以包括额外的元件，例如，除启动子之外的调控元件和/或转录后调控元件。
42.术语“约”具体指给定数量时，意在包括正负十(10)％(例如
±
10％)的偏差。例如，
约20个连续氨基酸还包括18个至22个连续氨基酸，约30个连续氨基酸还包括27个至33个连续氨基酸等
……
43.如本文所用，本发明的蛋白质、肽或多肽的“片段”是指在长度上比本发明的蛋白质、肽或多肽包含更少氨基酸的序列。只要这个序列表现出与其来源的天然序列相同的特性，即具有生物活性，就可以使用该序列。
44.术语“变体”是指具有在某种程度上与天然序列肽不同的氨基酸序列的蛋白质、肽或多肽，即通过氨基酸取代而与天然序列有所不同的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸被另一个具有相同特征和构象作用的氨基酸取代。氨基酸序列变体在天然氨基酸序列的氨基酸序列内的某些位置具有取代、缺失和/或插入。取代也可以是保守的，在这种情况下，所述保守氨基酸取代在本文中定义为以下五组之一内的交换：
45.i.小的脂肪族、非极性或微极性残基：ala、ser、thr、pro、gly
46.ii.极性、带正电荷的残基：his、arg、lys
47.iii.极性、带负电荷的残基：及其酰胺：asp、asn、glu、gin
48.iv.大的、芳香族残基：phe、tyr、tip
49.v.大的、脂肪族、非极性残基：met、leu、ile、val、cys。
50.本发明部分基于以下令人惊讶的发现：将s100钙结合蛋白a9(s100a9)连同其他次优的胰岛素剂量一起施用，极大地改善了胰岛素缺乏小鼠的代谢，而不会引起低血糖症。
51.s100a9属于ca2 -结合蛋白的ef-hand超家族，在单核细胞和中性粒细胞中高表达，并在炎症加重的情况下分泌，例如在类风湿性关节炎或败血症中分泌16,17。s100a9与其伙伴s100a8形成杂合物(s100a9/s100a8；也称为钙卫蛋白)，该复合物也在炎症状态下分泌18。钙卫蛋白是toll样受体4(tlr4)17和晚期糖基化终末产物受体(rage)19的内源性激活剂。钙卫蛋白已被证明会产生多种有害作用，包括潜在的败血症诱导的致死性
16,17,19-21
。然而，其他人已经表明，钙粒蛋白也可以存在于单体中以发挥抗炎作用20。值得注意的是，据报道s100a9同源二聚体直接影响tlr4信号传导22。总的来说，这些数据表明钙卫蛋白(s100a9/s100a8异二聚体)和s100a9(s100a9/s100a9同二聚体)调节炎症通路。尽管钙卫蛋白被认为会产生有害作用，但有鼠和人类证据表明s100a9是有益的。例如，增强的s100a9在t1d小鼠中带来显著的有益代谢作用(图1)。
52.本发明的一个方面涉及包括i)s100钙结合蛋白a9(s100a9)、s100钙结合蛋白a9的变体或片段以及ii)胰岛素、胰岛素的变体或片段的组合物。优选地，所述组合物是用于在有需要的受试者中治疗胰岛素缺乏(id)病症或相关症状之用途的组合物，其包括i)s100钙结合蛋白a9(s100a9)、s100钙结合蛋白a9的变体或片段以及ii)胰岛素、胰岛素的变体或片段。
53.所述治疗包括减轻高血糖症、减轻和/或降低低血糖症的风险、减轻血液中糖化血红蛋白水平的升高、减轻高血糖素血症、减轻和/或降低高酮血症和酮症酸中毒的风险、减轻高甘油三酯血症、减轻增加的肝脏脂肪酸氧化(fao)、增加肝脏的天然的或修饰的s100a9 mrna水平、增加肝脏的天然的或修饰的s100a9蛋白水平、增加血浆的天然的或修饰的s100a9蛋白水平、增加肝脏atp水平、延长寿命、降低循环的非酯化脂肪酸(nefa)水平、降低肝线粒体dna水平、降低循环的钙卫蛋白水平、降低脂肪酶活性或它们的任意组合。
54.在某些方面，与在不存在s100a9蛋白、s100a9蛋白的变体或片段的情况下施用胰
岛素相比，所述治疗包括将胰岛素剂量或胰岛素的变体或片段的剂量降低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或更多。
55.优选地，s100a9蛋白是具有如seq id no：1所示氨基酸序列的天然蛋白或重组蛋白、天然蛋白或重组蛋白的变体或片段。
56.s100a9蛋白片段优选为活性片段，所述活性片段包含如seq id no:1所示的氨基酸序列的至少约25个连续氨基酸、至少约30个连续氨基酸、至少约35个连续氨基酸、至少约40个连续氨基酸、至少约45个连续氨基酸、至少约50个连续氨基酸、至少约55个连续氨基酸、至少约60个连续氨基酸、至少约65个连续氨基酸、至少约70个连续氨基酸、至少约75个连续氨基酸、至少约80个连续氨基酸、至少约85个连续氨基酸、至少约90个连续氨基酸、至少约95个连续氨基酸、或至少约100个连续氨基酸、至少约105个连续氨基酸或至少约110个连续氨基酸。
57.s100a9片段的非限制性实例包括s100a9 n91(seq id no:2)、s100a9 c91(seq id no:3)、s100a9 n76(seq id no:4)和s100a9c76(seq id no:5)，以及其中一种或多种的组合。
58.s100a9蛋白的变体的氨基酸序列与seq id no:1所示的氨基酸序列或其活性片段之间在1个至约60个氨基酸不同、优选1个至约40个氨基酸、更优选1个至约20个氨基酸、甚至更优选1个至约10个氨基酸中不同。优选地，所述氨基酸序列变体是线性肽或环状肽，所述线性肽或环状肽在天然氨基酸序列或如上所述的seq id no.1的氨基酸序列内的n-末端和/或c-末端以及一个或多个内部结构域内具有取代、缺失，和/或在某些位置具有插入。
59.通常，此类变体的序列是功能性的，即生物学上的活性变体，并且与参考氨基酸序列具有高度的序列同源性，例如当两个序列进行比对时，序列同源性超过50％，通常超过60％，甚至更具体地80％或更多，例如至少90％或95％或更多。这种比对和百分比同源性或序列同一性可以使用本领域已知的软件程序来确定，例如在ausubel et al.eds.(2007)current protocols in molecular biology中描述的那些程序。优选地，使用默认参数用于比对。一种比对程序是blast，使用默认参数。特别地，程序是blastn和blastp，使用以下默认参数：遗传代码＝标准；过滤器＝无；链＝两者；中断＝60；期望＝10；矩阵＝blosum62；描述＝50个序列；排序方式＝高分；数据库＝非重复的，genbank embl ddbj pdb genbank cds翻译 swissprotein spupdate pir。生物学等效的多核苷酸是具有上述具体百分比同源性并编码具有相同或相似生物学活性的多肽的那些多核苷酸。
60.s100a9蛋白变体的非限制性实例选自包括以下的组：seq id no.49、seq id no.50、seq id no.51、seq id no.52和seq id no.53以及其中一种或多种的组合。这些序列对应于在其他动物物种中发现的s100a9蛋白(例如)哺乳动物中发现的s100a9蛋白，如下表1所示：
61.表1
62.氨基酸比对显示人类和其他哺乳动物物种之间的s100a9的同源性
[0063][0064]
s100a9蛋白的变体和片段均可包含源自s100a9蛋白的天然存在的氨基酸序列的合成的、非标准的和/或天然存在的氨基酸序列(包括d型异构体和/或逆反异构体)。举例来说，替代氨基酸可以是碱性非标准氨基酸(例如l-鸟氨酸，l-2-氨基-3-胍基丙酸，或赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸的d型异构体)。将非标准氨基酸引入蛋白质的方法是本领域已知的，包括使用大肠杆菌营养缺陷型表达宿主的重组蛋白质合成。
[0065]
非天然存在的氨基酸包括但不限于反式-3-甲基脯氨酸、2,4-甲烷-脯氨酸、顺式-4-羟基脯氨酸、反式-4-羟基-脯氨酸、n-甲基甘氨酸、别-苏氨酸、甲基-苏氨酸、羟乙基半胱氨酸、羟乙基高半胱氨酸(hydroxyethylhomo-cysteine)、硝基谷氨酰胺、高谷氨酰胺(homoglutamine)、六氢吡啶羧酸、叔亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。将非天然存在的氨基酸残基并入蛋白质中的几种方法是本领域已知的。
[0066]
s100a9变体的另一个实例包括具有如seq id no:6所示的氨基酸序列的s100a9 n69a-e78a变体。
[0067]
s100a9蛋白、其变体或片段也可与化学部分或酶部分偶联。这些部分通常用于增加溶解度、延长稳定性、降低免疫原性和/或能够与免疫球蛋白或免疫球蛋白的特定区域融合。这些部分的非限制性实例包括peg、马来酰亚胺-peg(n)-琥珀酰亚胺酯和生物素。
[0068]
或者，本发明还包括i)蛋白质或多肽，所述蛋白质或多包括具有如seq id no:1所示氨基酸序列的s100a9蛋白、s100a9蛋白的变体或片段或ii)以任意顺序在同一肽上的所述i)s100a9蛋白、s100a9蛋白的变体或片段、胰岛素、胰岛素的变体或片段，以及当存在时，iii)至少一个亲和标签。
[0069]
胰岛素选自天然胰岛素、重组胰岛素、胰岛素原、基础胰岛素、胰岛素类似物或速效胰岛素(bolus insulin)。胰岛素是一种蛋白质，其包含分别具有如seq id no：7和/或seq id no：8所示氨基酸序列的a链和/或b链、所述a链和/或b链的变体或片段。
[0070]
胰岛素蛋白片段是指胰岛素的a链和/或b链的片段。a链的胰岛素片段具有天然a
链氨基酸序列的至少约15个连续氨基酸、至少约16个连续氨基酸、至少约17个连续氨基酸、至少约18个连续氨基酸、至少约19个连续氨基酸、至少约20个连续氨基酸、至少约21个连续氨基酸、至少约22个连续氨基酸、至少约23个连续氨基酸、至少约24个连续氨基酸、至少约25个连续氨基酸、至少约26个连续氨基酸、至少约27个连续氨基酸、至少约28个连续氨基酸、至少约29个连续氨基酸、至少约30个连续氨基酸连续的氨基酸，至少约35个连续的氨基酸，或更多个连续氨基酸的a链长度。b链的胰岛素片段具有天然氨基酸b链序列的至少约25个连续氨基酸、至少约26个连续氨基酸、至少约27个连续氨基酸、至少约28个连续氨基酸、至少约29个连续氨基酸、至少约29个连续氨基酸、至少约30个连续氨基酸、至少约31个连续氨基酸、至少约32个连续氨基酸、至少约33个连续氨基酸、至少约34个连续氨基酸、至少约35个连续氨基酸、至少约36个连续氨基酸、至少约37个连续氨基酸、至少约38个连续氨基酸、至少约39个连续氨基酸-酸、至少约40个连续氨基酸、至少约41个连续氨基酸、至少约42个连续氨基酸、至少约42个连续氨基酸、至少约43个连续氨基酸、至少约44个连续氨基酸、至少约45个连续氨基酸、至少约50个连续氨基酸或更多个连续氨基酸的b链长度。
[0071]
胰岛素蛋白的变体是线性肽或环状肽，其与seq id no:7和/或seq id no:8所示的氨基酸序列或其活性片段之间在1个至约60个氨基酸、优选1个至约40个氨基酸、更优选1个至约20个氨基酸、甚至更优选1个至约10个氨基酸中不同。优选地，所述氨基酸序列变体具有在如上所述的氨基酸序列的氨基酸序列内的两条链中的至少一条的n-末端和/或c-末端以及在一个或多个内部结构域内的取代、缺失、和/或某些位置的插入。通常，此类变体的序列是功能性的，即生物学上的活性变体，并且与参考氨基酸序列具有高度的序列同源性，例如当两个序列进行比对时，序列同源性超过50％，通常超过60％，甚至更具体地80％或更多，例如至少90％或95％或更多。
[0072]
胰岛素变体的非限制性实例选自包括以下的组：赖脯胰岛素(seq id no.9和/或seq id no.10)、谷赖胰岛素(seq id no.11和/或seq id no.12)、门冬胰岛素(seq id no.13和/或seq id no.14)、甘精胰岛素(seq id no.15和/或seq id no.16)、地特胰岛素(seq id no.17和/或seq id no.18)和德谷(deglutec)胰岛素(seq id no.19和/或seq id no.20)，以及其中一种或多种的组合。
[0073]
胰岛素蛋白的变体和片段都可以包含合成的和/或天然存在的氨基酸序列(包括d型异构体和/或逆反异构体)，其源自如上所述的胰岛素蛋白的天然存在的氨基酸序列。
[0074]
胰岛素蛋白、其变体或片段也可与化学部分或酶部分偶联。这些部分通常用于增加溶解度、延长稳定性、降低免疫原性和/或能够与免疫球蛋白或免疫球蛋白的特定区域融合。这些部分的非限制性实例包括peg和生物素。实例可以在例如us 2010/0216690和wo 2007/104738(其全文并入本文)中找到。
[0075]
许多胰岛素类似物是本领域已知的。举例来说，胰岛素类似物包括例如在美国公布no.5597796、ep1193272、us 20090069216和wo2007/096332(其全文并入本文)中描述的那些胰岛素类似物。
[0076]
胰岛素原和胰岛素原衍生物也是本领域已知并且可以选择的，例如来自在us20190263881中描述的那些胰岛素原和胰岛素原衍生物。
[0077]
在本发明的某个方面，s100a9蛋白、其变体或片段还包含至少一个亲和标签。所述至少一个亲和标签附着于s100a9蛋白、s100a9蛋白变体或片段的c’末端和/或n’末端。
[0078]
亲和标签通常融合到重组蛋白的c’末端或n’末端，或融合到c’末端和n’末端，以便于亲和纯化和检测。这种方法可以实现高选择性捕获并避免了在r&d过程中限制产量的多步纯化过程。
[0079]
本发明的亲和标签可以是可用于研究和治疗的任何分子、肽或非肽，所述任何分子、肽或非肽可添加到s100a9蛋白、s100a9蛋白的变体或片段(kimple et al.,in curr protoc protein sci.；73:unit
–
9.9.,2013)和/或胰岛素、胰岛素的变体或片段。
[0080]
优选地，所述亲和标签选自包括以下的组：flag标签(seq id no：21)、几丁质结合蛋白(cbp)标签(seq id no：24)、麦芽糖结合蛋白(mbp)标签(seq id no：25)、链霉素标签ii(seq id no:31)、谷胱甘肽-s-转移酶(gst)标签(seq id no:32)、多聚(his)标签(seq id no:33)、c-myc(seq id no:26)、sbp(seq id no:27)、s(seq id no:28)、hat(seq id no:29)，以及其中一种或多种的组合。
[0081]
更优选地，所述亲和标签是flag标签，所述flag标签由如seq id no：21所示的氨基酸序列以及其一个或多个的组合所组成或包括如seq id no：21所示的氨基酸序列以及其一个或多个的组合。flag标签的组合或串联的实例包括2x flag(seq id no:22)、3x flag(seq id no:23)等
……
[0082]
或者，3x flag组合的最后一个标签可以编码如seq id no：23(dykdhd-g-dykdhd-i-dykddddk)所示的肠激酶切割位点。
[0083]
包括一个或多个flag标签的s100a9蛋白、s100a9蛋白的变体或片段的非限制性实例选自表2中所列的那些。
[0084]
在本发明的某个方面，所述i)s100a9蛋白、s100a9蛋白的变体或片段，ii)胰岛素、胰岛素的变体或片段，以及当存在时，iii)至少一个亲和标签是在同一肽上。可以涵盖任何组合，例如(从n端到c端)：s100a9-亲和标签-胰岛素、或s100a9-胰岛素、或胰岛素-s100a9、或胰岛素-亲和标签-s100a9、或亲和标签-胰岛素-s100a9、或胰岛素-s100a9-亲和标签、或亲和标签-s100a9-胰岛素，在同一肽上，由肽基接头或非肽基接头分开或不分开。表2中给出了肽基接头(seq id no.47)的一个实例。
[0085]
本发明的组合物还可包括钠-葡萄糖协同转运蛋白1(sglt1)抑制剂和/或钠-葡萄糖协同转运蛋白2(sglt2)抑制剂、胰淀素类似物、双胍(例如，二甲双胍)、肠促胰岛素模拟物(例如，胰高血糖素样肽受体激动剂、二肽基-肽酶-4抑制剂)。
[0086]
任选地与亲和标签偶联的所述i)本发明的s100a9蛋白、其变体或片段和/或ii)胰岛素、其变体或片段，可以通过本领域已知的多种方法和技术制备，例如如maniatis et al.1982,molecular cloning,a laboratory manual,cold spring harbor laboratory所述的化学合成或重组技术。
[0087]
如本文所述，任选地与亲和标签偶联的所述i)本发明的s100a9蛋白、其变体或片段和/或ii)胰岛素、其变体或片段，优选在细胞表达系统中重组产生。多种单细胞宿主细胞可用于表达编码本发明的肽(例如s100a9、胰岛素和/或亲和标签)、其变体或片段的核酸序列。这些宿主可以包括众所周知的真核宿主和原核宿主，例如大肠杆菌菌株(e.coli)、假单胞菌菌株(pseudomonas)、芽孢杆菌菌株(bacillus)、链霉菌菌株(streptomyces)、真菌菌株例如酵母(yeast)以及组织培养的动物细胞例如cho、yb/20、nso、sp2/0、r1.1、b-w和l-m细胞、非洲绿猴肾细胞(例如cos 1、cos 7、bsc1、bsc40和bmt10)、昆虫细胞(例如sf9)以及
人类细胞和植物细胞。
[0088]
本发明还涵盖了一种或多种编码本发明的肽(例如s100a9、胰岛素和/或亲和标签)、其变体或片段的核酸。
[0089]
本发明还涵盖了基因递送载体，优选为质粒或载体的形式，其包括一种或多种编码本发明的肽(例如s100a9、胰岛素和/或亲和标签)、其变体或片段的核酸。
[0090]
如本文所用，“载体”能够将核酸序列转移至靶细胞(例如，病毒载体、非病毒载体、微粒载剂和脂质体)。
[0091]
合适的载体包括sv40和已知细菌质粒的衍生物，例如，大肠杆菌质粒col el、pcrl、pbr322、plive、pmb9及它们的衍生物，质粒如rp4；噬菌体dna，例如，噬菌体x的众多衍生物(例如nm989)和其他噬菌体dna(例如ml 3和丝状单链噬菌体dna)；酵母质粒，如2μ质粒或其衍生物；用于真核细胞的载体，例如用于昆虫细胞或哺乳动物细胞的载体；源自质粒和噬菌体dna组合的载体，例如经过修饰以使用噬菌体dna或其他表达控制序列的质粒；以及之类的。各种病毒载体用于在体外或体内将核酸递送至细胞。非限制性实例是基于疱疹病毒、痘病毒、腺相关病毒、慢病毒等的载体。原则上，它们都适合递送包括可表达的核酸分子的表达盒，所述核酸分子编码一种或多种编码本发明的肽(例如s100a9、胰岛素和/或亲和标签)、其变体或片段的核酸。
[0092]
在一方面，所述病毒载体是适合于离体和体内基因递送的载体。更优选地，所述病毒载体选自包括腺相关病毒(aav)和慢病毒的组，例如第一代、第二代和第三代慢病毒，不排除其他病毒载体，如腺病毒载体、疱疹病毒载体等
……
其他递送方式或媒介物(例如酵母系统、微泡、微乳液、基因枪/将载体附着在金纳米颗粒的方式)是已知的并可提供的，在某些方面，一种或多种病毒或质粒载体，可以通过脂质体、微粒或纳米颗粒、外泌体、微泡或基因枪递送。
[0093]
在本发明的其他方面，本发明的药物组合物是缓释制剂，或使用缓释装置施用的制剂。此类装置在本领域中是众所周知的，并且包括例如透皮贴剂和微型可植入泵，它们可以随着时间的推移以连续、稳态的方式以不同剂量提供药物递送，以实现非缓释药物组合物的缓释效果。
[0094]
本发明还涵盖宿主细胞，所述宿主细胞包括本发明的基因递送载体，或一种或多种编码本发明的肽(例如s100a9、胰岛素和/或亲和标签)、其变体或片段的核酸，所述基因递送载体优选呈质粒或载体的形式。所述宿主细胞可以是任何原核细胞或真核细胞，优选所述宿主细胞是真核细胞，最优选所述宿主细胞是哺乳动物细胞。甚至更优选地，所述宿主细胞选自包括胰腺细胞(例如β细胞)、胰岛细胞和胰腺前体细胞的组。优选地，所述宿主细胞是人β细胞。
[0095]
本发明还涵盖了旨在增强本发明的肽(例如s100a9、胰岛素和/或亲和标签)、其变体或片段、其变体或片段的分泌的方法，所述方法通过植入i)野生型和/或基因工程化胰β细胞，ii)药物诱导的工程化胰β细胞或其他类型的细胞，ii)光诱导的工程化胰β细胞或其他类型的细胞，iii)电磁诱导的工程化胰β细胞或其他类型的细胞，以及iv)电诱导工程细胞来实现。
[0096]
本发明还涵盖了通过植入储库(reservoir)材料(例如皮下植入的固体小球和/或水凝胶)来提高胰岛素和/或s100a9、它们的变体或片段的含量的方法。
[0097]
本发明还涵盖了通过上述方法的组合来提高胰岛素和/或s100a9、它们的变体或片段的含量的方法。
[0098]
本发明还提供了药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的组合物，所述组合物包括i)s100钙结合蛋白a9(s100a9)、s100钙结合蛋白a9的变体或片段和胰岛素、胰岛素的变体或片段，或ii)本发明的质粒或载体，或iii)本发明的宿主细胞，和至少一种药学上可接受的赋形剂、稀释剂、载剂、盐和/或添加剂。
[0099]
通常，本发明的所述药物组合物用于在有需要的受试者中治疗胰岛素缺乏(id)病症或相关症状之用途。
[0100]
如本文所用，术语“治疗有效量”是指本发明的组合物或肽的量，所述量在合理的医学判断范围内足够高以显著积极地改善待治疗的症状和/或病症，但足够低以避免严重的副作用(以合理的风险/收益比)。
[0101]
根据多种因素选择本发明的组合物或肽的治疗有效量，包括患者的类型、物种、年龄、体重、性别和医疗状况；待治疗病症的严重程度；施用途径；患者的肝肾功能。本领域普通技术医师可以容易地确定和开出预防、对抗或阻止胰岛素缺乏(id)病症或相关症状的进展所需的药物有效量。
[0102]
尽管治疗有效量会因患者而异，但合适的每个患者的每日摄入量的范围为约0.1mg至约5000mg(例如，0.1mg、0.5mg、1mg、2mg、5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg、850mg、900mg、950mg、1000mg、1250mg、1500mg、1750mg、2000mg、2500mg、3000mg、3500mg、4000mg、4500mg、5000mg等，或其中的任何范围或值)，以单剂量或多剂量施用。可以连续施用或间歇施用(例如通过大剂量注射(bolus injection))。治疗有效量的剂量也由施用时间和施用频率决定。在口服或肠胃外施用的情况下，本发明的肽的剂量优选为每日约1mg至约2000mg不等(或者，如果使用，相应量的其药学上可接受的盐或前药)。在具体方面，本发明的肽以范围为约1mg至约2000mg的每日剂量施用于受试者。
[0103]
执业医师或其他技术人员将能够常规地确定最适合个体患者的治疗有效量。上述剂量是一般情况的示例；当然，在个别情况下，更高或更低的剂量范围是应当的，这也在本发明的范围内。
[0104]
在一些方面，将所述药物组合物作为注射用储库(depot)制剂施用。在其他方面，将所述药物组合物作为大剂量输注或静脉推注施用。
[0105]“药学上可接受的载剂或稀释剂”是指可用于制备通常安全、无毒且需要的药物组合物的载剂或稀释剂，并且包括人类药物使用可接受的载剂或稀释剂。
[0106]
这种药学上可接受的载剂可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。盐溶液和葡萄糖水溶液和甘油水溶液也可用作液体载剂，尤其是注射用溶液。
[0107]
药学上可接受的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇、苯酚、硫酸鱼精蛋白、氧化锌等。
[0108]
所述药物组合物还可包含一种或多种药学上可接受的盐，例如无机酸盐，例如盐
酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。此外，助剂，例如润湿剂或乳化剂、ph缓冲物质、凝胶或胶凝材料、调味剂、着色剂、微球、聚合物、悬浮剂等也可以存在于本文中。此外，还可以存在一种或多种其他常规药物成分，例如防腐剂、湿润剂、悬浮剂、表面活性剂、抗氧化剂、抗结剂、填充剂、螯合剂、包衣剂、化学稳定剂等，特别是如果剂型是一种可重构的形式。合适的示例性成分包括微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、聚山梨醇酯80、苯乙醇、氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香兰素、甘油、苯酚、对氯苯酚、明胶、白蛋白及它们的组合。remington's pharmaceutical sciences(mack pub.co.,n.j.1991)中对药学上可接受的赋形剂进行了详尽的讨论，该文献通过引用并入本文。
[0109]
本发明的所述药物组合物可通过不同途径施用于受试者，包括口服、肠胃外、舌下、经皮、直肠、经粘膜、局部、经吸入、经颊施用、胸膜内、静脉内、动脉内、腹腔、皮下、肌肉内、鼻内鞘内和关节内或它们的组合。对于人类使用，所述组合物可以根据正常的人类实践作为适当可接受的制剂施用。技术人员将容易确定最适合具体患者的给药方案和施用途径。本发明的所述组合物可以通过传统的注射器、泵、注射笔、微针贴片、留置导管、无针注射装置、“微弹轰击枪”或其他物理方法如电穿孔(“ep”)、“水动力学方法”，或超声波。
[0110]
本发明的药物组合物也可以通过以下几种技术递送给患者，包括编码本发明的肽(例如s100a9、胰岛素和/或亲和标签)的核酸的有活体电穿孔或无活体电穿孔的dna注射，脂质体介导的、纳米颗粒促进的重组载体，例如本文所述的重组慢病毒、重组腺病毒和重组腺病毒相关病毒。
[0111]
本发明还提供了几种旨在增强本发明的肽(例如s100a9、胰岛素和/或亲和标签)的分泌的技术，所述技术通过植入i)野生型和/或基因工程化宿主细胞，ii)药物诱导的工程化宿主细胞ii)光诱导的工程化宿主细胞，iii)电磁诱导的工程化宿主细胞，以及iv)电诱导工程化宿主细胞来实现(参见例如krawczyk k,xue s,buchmann p,et al.electrogenetic cellular insulin release for real-time glycemic control in type 1 diabetic mice.science.2020；368(6494):993-1001，通过引用并入本文)。
[0112]
还涵盖了几种旨在通过植入储库材料(例如皮下植入的固体小球和/或水凝胶)来提高本发明的肽(例如s100a9、胰岛素和/或亲和标签)的含量的技术。
[0113]
本文中公开的递送方法和技术的任何组合都被涵盖。
[0114]
本发明还提供了本发明的组合物和药物组合物在制备用于治疗胰岛素缺乏(id)病症或相关症状的药物中的用途。
[0115]
本发明的组合物或药物组合物同时施用、分开施用或交错施用。
[0116]
联合或同时施用可包括以单一药物制剂或使用分开的制剂共同施用，或以任一顺序但通常在一段时间内连续施用，使得所有活性剂可以同时发挥其生物活性。此类药剂的制备和给药方案可根据制造商的说明使用或由熟练的技术人员凭经验确定。
[0117]
本发明还提供了一种有需要的受试者的胰岛素缺乏(id)病症或相关症状的治疗方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的
[0118]
i)s100钙结合蛋白a9(s100a9)、s100钙结合蛋白a9的变体或片段以及
[0119]
ii)胰岛素、胰岛素的变体或片段。
[0120]
在某些方面，所述治疗包括增加肝脏中修饰的s100a9 mrna水平、增加肝脏的修饰
的s100a9蛋白水平、增加血浆的修饰的s100a9蛋白水平、减轻胰高血糖素血症、减轻酮血症、减轻甘油三酯血症、降低循环的非酯化脂肪酸(nefa)水平、减轻高酮血症，减轻肝脏脂肪酸氧化(fao)、增加肝脏atp水平、降低肝脏线粒体dna水平、延长寿命、降低钙卫蛋白水平、减轻高血糖症、减轻高甘油三酯血症、减轻高胰高血糖素血症、减轻高钙卫蛋白血症、减轻低瘦素血症、减少体脂量、减轻食欲亢进、减轻烦渴、或它们的任意组合。
[0121]
在某些方面，与在不存在s100a9蛋白、s100a9蛋白的变体或片段的情况下施用胰岛素相比，所述治疗包括将胰岛素剂量降低至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或更多。
[0122]
与不存在s100a9蛋白、其变体或片段的100％胰岛素剂量相比，上述降低的胰岛素剂量与s100a9蛋白、其变体或片段的组合能够实现相似的或更好的代谢控制。
[0123]
表2
[0124]
[0125]
[0126][0127]
本发明还涵盖了一种递送装置，所述递送装置包括本发明的组合物、使用的组合物或药物组合物。优选地，所述递送装置选自包括以下的组：包括本发明的组合物、使用的组合物或药物组合物的注射器、泵、笔、微针贴片、无针注射装置或留置导管。
[0128]
本发明还涵盖了一种试剂盒，所述试剂盒包含：
[0129]
i)包含本发明的组合物的第一储存器以及ii)包括药学上可接受的赋形剂、稀释剂、载剂、盐和/或添加剂的第二储存器，
[0130]
或者
[0131]
iii)包含本发明的药物组合物的一个或多个储存器，
[0132]
或
[0133]
iv)选自包括本发明的组合物或药物组合物的注射器、泵、笔、针或留置导管的组的递送装置。
[0134]
本发明的试剂盒还可包含位于储存器或容器上或与其相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器等。所述容器可以由多种材料形成，例如玻璃或塑料。所述容器容纳有能够有效治疗本发明病症的组合物并且可具有无菌入口。可选地或另外，所述试剂盒还可以包括第二(或第三)容器，其包含药学上可接受的缓冲液，例如抑菌注射用水(bwfi)、磷酸盐缓冲盐水、ringer's溶液和葡萄糖溶液。从商业和用户的角度来看，所述试剂盒还可以包含其他所需的材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射器。
[0135]
所述标签或包装插页可包括其使用说明书。所包括的说明书可以贴在包装材料上，也可以作为包装插页包含在内。虽然说明书通常是书面或印刷材料，但它们不限于此。本公开涵盖了能够存储此类说明书并将它们传达给最终用户的任何介质。
[0136]
虽然本文中已经说明和描述了本发明的某些特征，但是本领域普通技术人员现在将想到许多修改、替换、变化和等效物。因此，应当理解，所附权利要求旨在涵盖落入本发明
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实施例
[0169]
材料和方法
[0170]
动物和胰岛素缺乏的诱导。所有小鼠都饲养在光照和温度可控的环境中，自由供应标准饲料和水。研究中描述的所有实验都使用成年雄性小鼠。胰岛素缺乏动物模型的建立如下：将白喉毒素(dt，sigma aldrich)溶解在无菌的0.9％nacl中，并腹腔施用给rip-dtr动物(0.5ug/kg体重，在第0天、第1天、第4天施用)。
[0171]
mrna、蛋白质和底物含量的评估。处死小鼠，迅速取出它们的组织并速冻在液氮中，随后将组织储存在-80℃。使用trizol试剂(invitrogen)提取rna。通过superscript ii(invitrogen)生成互补dna，并将互补dna与sybr green pcr master mix(applied biosystem，foster city，ca，usa)一起用于实时定量pcr(q-rtpcr)分析。使mrna含量标准化至18s mrna水平。所有分析均使用applied biosystems5实时pcr系统进行。对于每个mrna的评估，至少重复3次q-rtpcr分析。通过在裂解缓中液(tris 20mm、edta 5mm、np401％(v/v)、蛋白酶抑制剂(p2714-1btl，来自sigma，st.louis，mo，usa)中均质化样品来提取蛋白质，然后通过sds-page分离并最后通过电印迹将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。使用以下抗体：calgranulinb-s100a9(目录号pb9678，boster)。
[0172]
循环的底物和激素水平。在下午2点到4点之间从自由进食的小鼠中采集尾静脉血。为避免随机餐后混杂效应，在采血前2小时移除食物。离心(3500xg，10分钟)后收集血清或血浆样本并储存在-80℃。使用市售试剂盒测量葡萄糖、非酯化脂肪酸、甘油三酯、酮体和胰高血糖素的水平。
[0173]
s100a9的过表达。进行水动力尾静脉注射(htvi)。通过使用允许在白蛋白启动子控制下表达给定基因的plive载体(myrus)实现s100a9的过表达。以下序列被克隆到plive的限制性位点bamh1和xho1之间：
[0174]
gctagcggatccgccgccaccatggccaacaaagcaccttctcagatggagcgcagcataaccaccat
catcgacaccttccatcaatactctaggaaggaaggacaccctgacaccctgagcaagaaggaattcagacaaatggtggaagcacagttggcaacctttatgaagaaagagaagagaaatgaagccctcataaatgacatcatggaggacctggacacaaaccaggacaatcagctgagctttgaggagtgtatgatgctgatggcaaagttgatctttgcctgtcatgagaagctgcatgagaacaacccacgtgggcatggccacagtcatggcaaaggctgtgggaaggactacaaagacgatgacgacaagtgactcgag(seq id no.45)。
[0175]
对plive-s100a9质粒dna进行测序以确认正确的序列和方向。每只小鼠接受50μg的plive-s100a9或plive；未接受任何操作的年龄匹配的小鼠被用作健康对照。图2中所示的数据收集自腹腔注射20微克重组s100a9的小鼠。
[0176]
统计分析。使用prism(graphpad,san diego,ca)分析数据集的统计显著性，当对两组进行比较时，进行双侧未配对student’s t检验，或当多于两组进行比较时，进行单因素或双因素anova(tukey’s事后检验)。
[0177]
实施例1
[0178]
结果
[0179]
增强的s100a9在t1d小鼠模型中的有益代谢作用
[0180]
发明人在胰岛素缺乏的小鼠中过表达s100a9。发明人在rip-dtr小鼠中进行了水动力尾静脉注射研究，该小鼠在克隆到x染色体hprt基因座的白喉毒素受体(dtr)序列上游带有大鼠胰岛素启动子(rip)。在连续三次腹腔dt施用后，rip-dtr小鼠几乎完全丧失胰腺β细胞27。事实上，在经历了plive(dt-plive)或plive-s100a9(dt-plive-s100a9)的htvi的dt注射的rip-dtr小鼠中，几乎所有胰腺β细胞都被消融(数据未显示)。与β细胞丧失一致，胰腺胰岛素原mrna水平几乎无法测量，并且这些缺陷导致在dt-plive小鼠和dt-plive-s100a9小鼠中几乎检测不到循环的胰岛素(图1a、图1b)。为了检测s100a9在dt-plive-s100a9小鼠中是否增加，我们评估了血浆s100a9水平，发现与dt-plive小鼠和健康对照相比，dt-plive-s100a9小鼠中的血浆s100a9水平增加了(图1c)。总的来说，这些数据表明dt-plive-s100a9小鼠是胰岛素缺乏的并且存在s100a9过表达。由于它们的id，dt-plive小鼠出现了高血糖症、高酮血症、高甘油三酯血症和高血糖素血症(图1d至图1f)。接下来，发明人评估了s100a9过表达对上述缺陷的影响。与dt-plive小鼠相比，dt-plive-s100a9小鼠的高血糖症略有改善(图1c)。值得注意的是，胰高血糖素、β-羟基丁酸和甘油三酯的循环水平都分别在dt-plive-s100a9小鼠与健康对照之间相似，在dt-plive-s100a9小鼠与和dt-plive对照之间显著降低(图1e至图1f)。
[0181]
s100a9与胰岛素联合治疗在t1d中的治疗价值
[0182]
图2所示的结果表明了增强的s100a9在t1d小鼠中的改善代谢和促存活作用。发明人开始检测增强的s100a9是否能够减少用于治疗t1d的胰岛素剂量。具体而言，发明人增加了在与次优胰岛素剂量的组合中的循环的s100a9水平(这是一种不能改善由β细胞丧失引起的高血糖症和高酮血症的胰岛素方案)。
[0183]
图2所示的结果还表明，虽然次优剂量的胰岛素不影响对照小鼠的高血糖症，但它显著降低了过表达s100a9的小鼠的高血糖症，而不会引起低血糖症。
[0184]
实施例2
[0185]
c端flag序列的存在不会干扰s100a9改善小鼠id症状的能力。
[0186]
为了确定在s100a9中添加flag标签序列是否会影响s100a9改善小鼠id症状的能
力，我们使用htvi递送在白蛋白启动子控制下过表达全长天然s100a9序列(带有或不带有c端flag标签)的质粒(plive-n-s100a9或plive-s100a9-flag)或对照空载体(plive)。经历了plive(dt-plive)或plive-n-s100a9(dt-plive-n-s100a9)或plive-s100a9-flag(dt-plive-s100a9-flag)的htvi的dt处理的rip-dtr小鼠
27
表现出了相似程度的低胰岛素血症(图3a)。虽然dt-plive小鼠表现出高血糖症和高酮血症，但dt-plive-n-s100a9小鼠和dt-plive-s100a9-flag小鼠在这些参数方面表现出相似的改善(图3b至图3c)。这些数据表明s100a9与flag标签序列的融合不会干扰s100a9的有益作用。此外，这些结果表明，除了flag序列之外，其他感兴趣的序列也可以与s100a9融合，而不会干扰s100a9改善id症状的能力。
[0187]
重组s100a9与次优胰岛素治疗相结合可改善id小鼠的代谢失衡。
[0188]
为了直接检测s100a9的治疗潜力，我们评估了在链脲佐菌素(stz)处理的小鼠中单独注射重组s100a9(rs100a9)或将重组s100a9(rs100a9)与次优剂量的胰岛素联合注射所带来的代谢结果。如图4a所示，8周大的雄性fvb小鼠腹腔(ip)注射stz(150mg/kg体重)两次，间隔一周(这种处理可产生已建立的id模型)
27，28，29
。第一次注射stz两周后，小鼠被随机分为三组：i)“stz-胰岛素-rs100a9”组通过手术植入皮下胰岛素颗粒(由linbit颗粒的一半组成，linshin-canada，预计以对血糖产生最小影响的剂量连续递送牛胰岛素)，并在手术三天后对这些小鼠进行腹腔注射rs100a9(1mg/千克体重)；ii)如上所示，“stz-胰岛素-生理盐水”组如上所述通过手术植入皮下胰岛素颗粒，并在手术三天后对这些小鼠进行腹腔注射生理盐水；iii)与前一组一样，对“stz-假处理-生理盐水”组进行手术处理，并在手术三天后对这些小鼠进行腹腔注射生理盐水。年龄匹配的未治疗小鼠作为健康对照(图4a)。正如预期的那样，stz处理导致严重的胰岛素减少(insulinopenia)和高血糖症(图4b-图4c)。手术三天后，stz-胰岛素-rs100a9小鼠和stz-胰岛素-生理盐水小鼠表现出可检测到的血浆牛胰岛素水平(图4d)，而牛胰岛素在stz-假处理-生理盐水小鼠和健康小鼠中预计是无法测量的(图4d)。与次优胰岛素剂量一致，手术三天后stz-胰岛素-rs100a9小鼠和stz-胰岛素-生理盐水小鼠表现出高血糖症，因为与stz-假处理-生理盐水组相比，它们在移除食物3小时后仅表现出适度的血糖降低(图4e)。接下来，我们监测了ip注射rs100a9的急性代谢作用。
[0189]
我们的数据显示注射三小时后，在stz-胰岛素-生理盐水小鼠和stz-假处理-胰岛素小鼠之间的高血糖症是类似的(图4f)。然而，与stz-假处理-胰岛素组相比，胰岛素和ip注射rs100a9的组合能够导致stz-胰岛素-rs100a9组的血糖出现小幅但显著的降低(图4f)。值得注意的是，这些数据是从体重相似的id小鼠中获得的。事实上，stz处理在所有三组中都引起了类似的体重减轻，而胰岛素或rs100a9治疗或两者的组合都没有影响体重(图4g)。此外，所有三个id组都显示出了食欲过盛，并且在用胰岛素治疗的小鼠中有食物摄入量减少的趋势(并且没有由rs100a9注射引起的额外影响)(图4h)。总体而言，这些数据表明，rs100a9(1mg/kg体重)与次优剂量的胰岛素相结合的腹腔注射，足以对id小鼠的血糖产生有益影响。