参苓酒指纹图谱的检测方法与流程

参苓酒指纹图谱的检测方法
1.技术领域
2.本发明涉及一种中药配制酒的检测方法，具体涉及参苓酒指纹图谱的检测方法。


背景技术：

3.酒为百草之最，配以活血化瘀祛风散寒的食药材，酒助药性，药借酒力，扶正固本，人参大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津止渴，安神益智；大枣补中益气，养血安神；茯苓治脾虚失眠，利水渗湿；枸杞滋补肝肾，益精明目；甘草补脾益气，清热解毒，甘缓和中；橘皮理气健脾、燥湿化痰；山药益肾祛湿；莲子补脾止泻，益肾涩精，养心安神；益智仁芳香醒脾；麦芽行气消食，健脾开胃，回乳消胀；莱菔子消食除胀，健脾开胃；砂仁化湿开胃,温脾止泻；丁香温中降逆、行气止痛、温肾壮阳；白芷祛风除湿，活血化瘀，生肌止痛；山楂消食健胃，行气散瘀，化浊降脂。本发明配伍以上药味组成参苓酒，具有补气健脾，消食开胃的功效。
4.目前，关于参苓酒的质量检测方法较少。本发明采用高效液相色谱法建立参苓酒的指纹图谱检测方法，为参苓酒的成分鉴别、质量评价以及质量标准的制定具有重要的意义。


技术实现要素：

5.发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种参苓酒的指纹图谱检测方法，该检测方法可以客观、全面、准确的评价参苓酒的质量，对控制参苓酒的质量和保证临床疗效具有重要意义。
6.技术方案：为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种参苓酒指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，参苓酒供试品溶液的制备：分别精密称取不同批次的参苓酒样品，过0.22μm微孔滤膜，得供试品溶液；步骤2，混合对照品溶液的制备：精密称定绿原酸、甘草苷对照品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成混合对照品溶液；步骤3，分别精密吸取步骤1供试品溶液和步骤2对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；步骤4，将步骤3中获得的参苓酒供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012a；选择不同批次参苓酒的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成参苓酒的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；并根据混合对照品溶液色谱图的保留时间标注对照指纹图谱中峰的化学成分；步骤5，将步骤3中获得的参苓酒指纹图谱和混合标准品图谱进行比对，指认出参苓酒中2号峰为绿原酸、5号峰为甘草苷。
7.作为优选方案，以上所述的参苓酒指纹图谱的检测方法，步骤1参苓酒供试品溶液制备方法为：取8批次的参苓酒样品各10ml，过0.22μm微孔滤膜，即得供试品溶液。
8.作为优选方案，以上所述的参苓酒指纹图谱的检测方法，步骤2混合对照品溶液的制备：取精密称定绿原酸、甘草苷对照品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成含0.1019mg/ml绿原酸、0.1167mg/ml甘草苷组成的混合对照品溶液。
9.作为优选方案，以上所述的参苓酒指纹图谱的检测方法，步骤3中，液相色谱条件为：色谱柱：ymc-pack ods-a，流动相：乙腈和0.1%磷酸水，梯度洗脱，二极管阵列检测器，检测波长：280nm，柱温30℃，流速0.8ml/min，进样体积：10μl，梯度洗脱程序如下表：程序时间（min）乙腈体积（%）105210538530410055
10.作为优选方案，以上所述的参苓酒指纹图谱的检测方法，指纹谱图中共有峰8个，其保留时间分别为1号峰9.781min、2号峰35.683min、3号峰46.942min、4号峰54.133min、5号峰57.155min、6号峰63.151min、7号峰67.457min、8号峰99.47min，其中2号峰为绿原酸、5号峰为甘草苷。
11.作为优选方案，以上所述的参苓酒指纹图谱的检测方法，参苓酒的药味组成和配比为：人参、大枣、茯苓、枸杞、甘草、橘皮、山药、莲子、益智仁、麦芽、莱菔子、砂仁、丁香、白芷、山楂。
12.作为优选方案，以上所述的参苓酒指纹图谱的检测方法，参苓酒的药味组成和配比为：人参5~10份、大枣2~4份、茯苓5~10份、枸杞4~8份、甘草4~8份、橘皮3~6份、山药3~6份、莲子3~6份、益智仁2~40份、麦芽3~60份、莱菔子4~8份、砂仁3~6份、丁香4~8份、白芷3~6份、山楂4~8份。
13.更优选：人参5份、大枣2份、茯苓5份、枸杞4份、甘草4份、橘皮3份、山药3份、莲子3份、益智仁2份、麦芽3份、莱菔子4份、砂仁3份、丁香4份、白芷3份、山楂4份。
14.作为优选方案，以上所述的参苓酒指纹图谱的检测方法，参苓酒的制备方法为：取人参、大枣、茯苓、枸杞、甘草、橘皮、山药、莲子、益智仁、麦芽、莱菔子、砂仁、丁香、白芷、山楂，加入总药材50~100倍体积量的食用乙醇（体积浓度56%），浸泡72小时，过滤既得。
15.指纹图谱检测条件的优化：1、在样品溶液的制备优化方面本发明通过对不同制备方法（0.22μm微孔滤膜过滤、甲醇萃取、正丁醇萃取）进行实验比较，结果发现0.22μm微孔滤膜过滤所得的谱图差成分比较全面，方法简便，分离度良好，故采用滤膜过滤的方法。
16.2、在色谱条件进行优化方面本发明采用二极管阵列检测器对检测波长进行考察，提取205nm、230nm、254nm、280nm处的色谱图，发现检测波长为280nm时，色谱图所包含的信息量最全面且基线平稳，故选280nm为检测波长；
本发明对流速（1ml/min、0.9ml/min、0.8ml/min、0.6ml/min）进行筛选，因参苓酒中的成分中多存在皂苷类、黄酮类等同分异构体及其它极性极为相似的成分，高流速下无法将其分开，在低流速下分离效果较好，最终选择在流速为0.8ml/min梯度条件下将极性相似的物质分开。
17.本发明比较了甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.1%甲酸，乙腈和0.05%磷酸水，乙腈-0.1%磷酸水5个不同洗脱系统在不同梯度下的洗脱效果。结果发现以乙腈和0.1%磷酸水为流动相时，参苓酒中各成分分离效果较好，故最终选定以乙腈和0.1%磷酸水为流动相。
18.在确定最佳流动性组成后，本发明通过大量实验筛选最佳的梯度洗脱程序，实验发现，当采用0~10min 乙腈体积5%；10~85min 乙腈体积5%~30%；85~100min 乙腈体积30%~55%，可实现指纹图谱中各色谱峰的良好分离度。
19.有益效果：1、本发明根据参苓酒中所含的活性成分的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，梯度洗脱程序、流速，检测波长、色谱柱，柱温等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的参苓酒指纹图谱检测方法，可以全面、客观、准确的检测和评价参苓酒的质量，为保证临床参苓酒疗效具有重要意义。
20.2、用本发明所提供的方法所建立的参苓酒指纹图谱，能有效地表征参苓酒的质量，能客观体现各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既可避免因测定个别化学成分而判定参苓酒质量的片面性，又可减少为质量达标而人为处理的可能性。
21.3、本发明提供的参苓酒指纹图谱的检测方法，具有方法简便、稳定性好、精密度高、重现性好等优点。
附图说明
22.图1为本发明混合对照品的色谱图。
23.图2为本发明的参苓酒样品的对照指纹图谱。
24.图3为本发明参苓酒样品的8批次供试品指纹图谱。
具体实施方式
25.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
26.以下实施例用到的仪器与试剂如下：实验器材1.1仪器日本岛津公司全波段扫描（200-800nm）高液相色谱系统，包括全自动在线脱气系统，全自动进样系统prominence sil-20a，二极管阵列检测器spd-m20a和自动温控柱温箱cto-20a。
27.1.2药品与试剂参苓酒样品来自江苏海昇药业有限公司（制备方法为：取人参25g、大枣10g、茯苓
25g、枸杞20g、甘草20g、橘皮15g、山药15g、莲子15g、益智仁10g、麦芽15g、莱菔子20g、砂仁15g、丁香20g、白芷15g、山楂20g，加入总药材重量50倍量的食用乙醇（体积浓度56%），浸泡72小时，过滤既得）；绿原酸对照品（批号110753-201314）购自中国食品药品生物制品鉴定所；甘草苷对照品（批号111610-201607）购自中国药品生物制品检定所；甲醇（分析纯）；磷酸（分析纯）；乙腈（色谱纯）；水（超纯水）。
28.实施例1 一种参苓酒指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：步骤1，参苓酒供试品溶液的制备：取8批次的参苓酒样品（江苏海昇药业有限公司生产）10ml，过0.22μm微孔滤膜，得供试品溶液；步骤2，混合对照品溶液的制备：取精密称定绿原酸、甘草苷对照品，置于容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成含0.1019mg/ml绿原酸、0.1167mg/ml甘草苷组成的混合对照品溶液。
29.步骤3，分别精密吸取8批参苓酒供试品溶液和混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；液相色谱条件为：色谱柱：ymc-pack ods-a，流动相：乙腈和0.1%磷酸水，梯度洗脱，二极管阵列检测器，检测波长：280nm，柱温30℃，流速0.8ml/min，进样体积：10μl，梯度洗脱程序如下表：程序时间（min）乙腈体积（%）105210538530410055
30.步骤4，将步骤3中获得的8批参苓酒供试品溶液的指纹图谱导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012a；选择8批次参苓酒的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成1批次参苓酒的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积；结果1批生品参苓酒中有8个共有峰，对照指纹图谱见图2，8批次供试品的指纹图谱如图3所示。绿原酸保留时间为35.683min，甘草苷保留时间为57.155min。
31.步骤5，步骤3中获得的参苓酒指纹图谱和混合标准品图谱（图1）进行比对，指认主要成分，对比出参苓酒中2、5号色谱峰分别为：绿原酸（保留时间35.683min）、甘草苷（保留时间57.155min）。
32.同时本发明使用自动生成的对照hplc指纹图谱r来生成共有色谱峰模式，分析计算获得江苏海昇药业厂家的8批参苓酒中药共有色谱峰之间具有相对很好的相似性，说明该方法建立的参苓酒中药建立的指纹图谱能够很好的检测江苏海昇药业多批次参苓酒的质量，结果如表1。
33.表1各批次样品与共有模式间的相似度 s1s2s3s4s5s6s7s8rs110.8770.9010.9120.9320.9490.9050.9380.925s20.89710.8890.9080.9360.9510.9230.9380.921s30.9010.88910.9540.9410.9870.9400.9180.908
s40.9120.9080.95410.8650.9150.9880.9070.919s50.9320.9360.9410.86510.9570.9110.9990.949s60.9490.9510.9870.9150.95710.9880.9300.962s70.9050.9230.9400.9880.9010.98810.9390.917s80.9380.9380.9180.9070.9990.9300.93910.940r0.9250.9210.9080.9190.9490.9620.9170.941
34.实施例2指纹图谱检测的方法学研究：1、方法学考察1.1精密度考察 取参苓酒样品（江苏海昇药业有限公司）10ml，按照上述实施例1的供试品制备方法，制备得到供试品溶液，连续进样6次，每次进样量10μl，按上述实施例1色谱条件检测，测定其hplc色谱图，对色谱图中8个共有指纹峰进行考察，结果表明，共有指纹峰的保留时间rsd均小于0.3%，共有峰峰面积rsd均小于2.4%，说明仪器精密度较好。
35.1.2稳定性考察取参苓酒样品10ml，按照上述实施例1的供试品制备方法制备供试品溶液，按上述实施例1中的色谱条件分别于0，2，4，8，12，24h进样，记录色谱图，对色谱图中8个共有指纹峰进行考察，结果表明，共有指纹峰的保留时间rsd均小于0.6%，共有峰峰面积rsd均小于1.5%，说明供试品溶液在24h内稳定性较好。
36.1.3重复性考察取参苓酒样品6份，按照上述实施例1供试品制备方法制备供试品溶液，分别测定，记录色谱图，对色谱图中8个共有指纹峰进行考察，结果表明，共有指纹峰的保留时间rsd均小于0.9%，共有峰峰面积rsd均小于2.7%，说明该方法重复性良好。
37.以上实验结果表明，本发明提供的参苓酒指纹图谱检测方法，稳定性好，精密度高，重复性好，能全面客观评价参苓酒的质量，为保证临床疗效具有重要的意义。
38.以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。