用于外源基因定点插入的基因编辑系统和方法与流程

技术特征：
1.一种用于外源基因定点插入的基因编辑系统，包括cas9、sgrna和ssdna，所述cas9和sgrna构成rnp复合物，所述sgrna为外源基因的插入位点，所述ssdna为外源基因的插入模板。2.根据权利要求1所述的用于外源基因定点插入的基因编辑系统，其特征在于，所述插入位点包括pd1、tigit、aavs1、ctla-4、tim3和lag3。3.根据权利要求2所述的用于外源基因定点插入的基因编辑系统，其特征在于，当所述插入位点为aavs1时，所述sgrna的核苷酸序列如seq id no:1所示或其同源序列；所述sgrna的同源序列与原序列的同源性为95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上。4.根据权利要求1所述的用于外源基因定点插入的基因编辑系统，其特征在于，所述外源基因为aapc1，所述ssdna包括aapc1和设于其两侧的同源臂，所述aapc1的结构为ef1a-cd19-cd86-cd64-polya，所述两侧的同源臂分别为lha和rha，所述lha与ef1a相连，所述rha与polya相连。5.根据权利要求4所述的用于外源基因定点插入的基因编辑系统，其特征在于，所述aapc1的核苷酸序列如seq id no:2所示或其同源序列；所述aapc1的同源序列与原序列的同源性均为95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上；和/或所述lha的核苷酸序列如seq id no:3所示或其同源序列；所述lha的同源序列与原序列的同源性为95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上；和/或所述rha的核苷酸序列如seq id no:4所示或其同源序列；所述rha的同源序列与原序列的同源性为95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上。6.一种用于外源基因定点插入的方法，包括以下步骤：1)根据要插入的外源基因，选择插入位点，再根据所述插入位点设计、合成sgrna和ssdna；2)然后将cas9和所述sgrna形成rnp复合物，然后再将所述rnp复合物与所述ssdna形成用于外源基因定点插入的基因编辑系统；3)培养k562细胞，再将所述外源基因通过步骤2)中形成的用于外源基因定点插入的基因编辑系统插入所述k562细胞中，得到定点插入外源基因的k562细胞，即得。7.根据权利要求6所述的用于外源基因定点插入的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述插入位点包括pd1、tigit、aavs1、ctla-4、tim3和lag3。8.根据权利要求6所述的用于外源基因定点插入的方法，其特征在于，当所述插入位点为aavs1时，所述sgrna的核苷酸序列如seq id no:1所示或其同源序列；所述sgrna的同源序列与原序列的同源性为95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、
99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上。9.根据权利要求6至8中任一项所述的用于外源基因定点插入的方法，其特征在于，在步骤3)中，将所述外源基因通过电转或脂质体转染插入所述k562细胞中。10.根据权利要求6至8中任一项所述的用于外源基因定点插入的方法，其特征在于，所述外源基因为aapc1，所述ssdna包括aapc1和设于其两侧的同源臂，所述aapc1的结构为ef1a-cd19-cd86-cd64-polya，所述两侧的同源臂分别为lha和rha，所述lha与ef1a相连，所述rha与polya相连；优选地，所述aapc1的同源序列与原序列的同源性为95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上；和/或所述lha的核苷酸序列如seq id no:3所示或其同源序列；所述lha的同源序列与原序列的同源性为95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上；和/或所述rha的核苷酸序列如seq id no:4所示或其同源序列；所述rha的同源序列与原序列的同源性为95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1％或以上、99.2％或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上。

技术总结
本发明实施例公开了一种用于外源基因定点插入的基因编辑系统和方法，所述基因编辑系统，包括Cas9、sgRNA和ssDNA，所述Cas9和sgRNA构成RNP复合物，所述sgRNA为外源基因的插入位点，所述ssDNA为外源基因的插入模板。本发明主要利用基因编辑技术，通过ssDNA利用作为外源基因的插入模板，在sgRNA的配合下，成功在AAVS1位点实现4.5kb(aAPC1：EF1a-CD19-CD86-CD64-PolyA)的定点敲入；AAVS1敲入外源基因片段具有稳定表达、不影响其他基因转录的优点；从而使改造后的细胞遗传背景更为简单和统一，排除插入位点和拷贝数对其它基因功能的影响。排除插入位点和拷贝数对其它基因功能的影响。排除插入位点和拷贝数对其它基因功能的影响。


技术研发人员：栗凤鹏 曹青 李华顺
受保护的技术使用者：阿思科力（苏州）生物科技有限公司
技术研发日：2020.08.27
技术公布日：2022/2/28