一种达比加群酯原料药或制剂中对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯的检测方法与流程

1.本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种达比加群酯原料药或制剂中基因毒性杂质对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯的检测方法。


背景技术：

2.甲磺酸达比加群酯化学名为β-丙氨酸,n-[[2-[[[4-[[[(己氧基)羰基]氨基]亚氨基甲基]苯基] 氨基]甲基]-1-甲基-1h-苯并咪唑-5-基]羰基]-n-2-嘧啶-,乙酯,甲磺酸盐，其化学结构如式i所示，是由勃林格殷格翰公司开发的口服直接凝血酶抑制剂，主要用于：(1)非瓣膜性房颤患者中风的预防；(2)已经过5-10天注射用抗凝药治疗的患者深静脉血栓(dvt)和肺栓塞(pe) 预防；(3)已经治疗的患者降低dvt和pe复发的风险；(4)髋关节置换术后dvt和pe的预防。
[0003]
达比加群酯是新一代口服抗凝药物直接凝血酶抑制剂(dtis)，可提供有效的、可预测的、稳定的抗凝效果，同时较少发生药物相互作用，无药物食物相互作用，无需常规进行凝血功能监测或剂量调整，具有非常广泛的临床应用。
[0004][0005]
在达比加群酯原料药的合成过程中，使用到甲苯磺酸、乙醇、异丙醇等，会发生反应产生副产物对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯，其化学结构如式ii、式iii所示，该副产物可进一步转移存在于达比加群酯原料药及终产品达比加群酯制剂中。根据欧洲药品管理局颁布的《基因毒性杂质限度指南》，磺酸酯是具有基因毒性的警示性结构，能直接或间接损害dna，在浓度很低时即可造成人体遗传物质的损伤，具有致突变性和致癌性，在用药过程中严重威胁到人类的健康。对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯属于潜在基因毒性杂质，针对这两种潜在基因毒性杂质开发灵敏、高效、专属性强的检测方法，严格控制其含量是药物质量控制的关键一环。
[0006][0007]
然而，关于达比加群酯原料药或制剂中对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯含量测定的方法目前在国内外还没有报道。因此，应制定检测方法，严格控制达比加群酯原料药或制剂中的对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯的含量，以保障临床用药安全。


技术实现要素：

[0008]
本发明的目的是提供一种达比加群酯原料药或制剂中对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯的检测方法，采用超高效液相色谱(uplc)与质谱联用的方法，对其在系统适用性、专属性、精密度、检测限、定量限、准确度和耐用性等方面进行验证，使其完全符合中国药典方法验证的指导原则，并且可用于达比加群酯原料药或制剂的质量控制。
[0009]
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0010]
一种达比加群酯原料药或制剂中基因毒性杂质对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯的检测方法，采用超高效液相色谱(uplc)与质谱联用，包括以下步骤：
[0011]
步骤(1)配制供试品溶液和对照品溶液：以乙腈水溶液为溶剂，溶解待测样品，配制得到供试品溶液；以乙腈和/或乙腈水溶液为溶剂，溶解对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯的标准品，配制得到对照品溶液；
[0012]
步骤(2)取供试品溶液和对照品溶液分别进样，用超高效液相色谱-质谱仪进行检测，记录色谱图；
[0013]
其中，所述的超高效液相色谱条件为：色谱柱：超高效液相苯基色谱柱，2.1mm
×
50mm (直径
×
长度)，1.7μm(粒径)；流速：0.4
±
0.05ml/min；柱温：30
±
5℃；流动相a：浓度为 0.05％-0.5％的甲酸铵水溶液；流动相b：甲醇；梯度洗脱条件如下：
[0014]
时间(min)流动相a(％)流动相b(％)068-7228-321.568-7228-3212.548-5248-5218.28-1288-9222.08-1288-9222.168-7228-3225.068-7228-32
[0015]
梯度洗脱条件优选：
[0016]
时间(min)流动相a(％)流动相b(％)070301.5703012.55050
18.2109022.0109022.1703025.07030
[0017]
所述的质谱条件为：质谱仪：三重四级杆质谱仪；质谱方法模式：多反应检测扫描(mrm)；电离模式(ionization mode)：正离子谱(es )；
[0018][0019]
按照外标法计算对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯的含量。
[0020]
进一步的，
[0021]
所述的步骤(1)中，乙腈水溶液为体积比为40％-60％的乙腈水溶液；优选体积比50％的乙腈水溶液。
[0022]
所述的步骤(1)中，流动相a为浓度为0.05％-0.2％的甲酸铵水溶液，优选0.08％-0.12％的甲酸铵水溶液，更优选浓度为0.1％的甲酸铵水溶液。
[0023]
所述的步骤(1)中，所述的待测样品为达比加群酯原料药或达比加群酯制剂，达比加群酯制剂优选达比加群酯胶囊。
[0024]
所述的步骤(1)中，可分别配制对甲苯磺酸乙酯或对甲苯磺酸异丙酯的对照品溶液，也可以将这两种杂质的标准品混合配制在同一对照品溶液中。具体配制步骤包括：取对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯标准品加乙腈溶解成各自浓度为0.1-1mg/ml的溶液，再用乙腈水溶液稀释成分别含对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯0.1-100ng/ml的对照品溶液。对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯在对照品溶液中各自的浓度优选1-20ng/ml，更优选2-10ng/ml。在一些实施例中，所述的对照品溶液含对甲苯磺酸乙酯4ng/ml、对甲苯磺酸异丙酯4ng/ml。
[0025]
所述的步骤(1)中，供试品溶液含有达比加群酯0.25-100mg/ml，优选0.5-50mg/ml，更优选10mg/ml。本发明所述的达比加群酯包含达比加群酯及其药学上可接受的盐，其在供试品溶液中的浓度均以达比加群酯计。
[0026]
所述的步骤(1)中，待测样品为达比加群酯胶囊时，供试品溶液的配制方法为：称取达比加群酯胶囊内容物适量，加乙腈水溶液溶解，滤膜过滤，得到供试品溶液。
[0027]
所述的步骤(2)中，进样体积为5-10μl。
[0028]
所述的步骤(2)中，超高效液相苯基色谱柱优选acquity beh phenyl；所述的质谱仪优选waters xevo tq-s。
[0029]
所述的步骤(2)中，质谱条件进一步包括：毛细管电压(voltages capillary)为3kv，所述的脱溶剂气流量(gas flow desolvation)为1000l/小时，所述的脱溶剂温度(desolvationtemperatures)为500℃。
[0030]
对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯出峰时间分别为6.2min、8.1min左右，供试品溶液在 6min之前及11min之后改为waster模式(不进质谱)。
[0031]
采用外标法计算，所述对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯的含量不得超过5ppm，优选不得超过2ppm；更优选不超过1ppm，更优选不超过0.4ppm。
[0032]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0033]
(1)本发明提供的达比加群酯原料药或制剂中基因毒性杂质对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯的检测方法，属于本领域首次开发的方法。
[0034]
(2)根据ich m7对基因毒性杂质限度的指导原则，限度值设定为1.5μg/d(天)，意味着当每人每天所摄入的基因毒性杂质的量小于1.5μg时，人一生中(按寿命为70年计算)患癌症的风险将小于十万分之一，达比加群酯日服用最大剂量为300mg，计算得出对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯的限度值为5ppm。本发明提供的液质联用法，样品处理过程操作简单，灵敏度高(对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯的检测限分别为0.08ppm、0.02ppm)，检测结果准确(回收率达到85％以上)，稳定性好，可检测到达比加群酯原料药或制剂中含有的微量对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯，因此本发明提供的方法完全满足了中国药典有关检测方法验证的指导原则的要求，可用于达比加群酯原料药或制剂中基因毒性杂质的质量控制。
附图说明：
[0035]
图1：实施例2中对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯对照品溶液中对甲苯磺酸乙酯专属性色谱图
[0036]
图2：实施例2中对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯对照品溶液中对甲苯磺酸异丙酯专属性色谱图
[0037]
图3：实施例2中空白溶液在对甲苯磺酸乙酯处的专属性色谱图
[0038]
图4：实施例2中空白溶液在对甲苯磺酸异丙酯处的专属性色谱图
[0039]
图5：实施例2中空白辅料在对甲苯磺酸乙酯处的专属性色谱图
[0040]
图6：实施例2中空白辅料在对甲苯磺酸异丙酯处的专属性色谱图
[0041]
图7：实施例2中达比加群酯对照品溶液专属性色谱图
[0042]
图8：实施例4中方法精密度2试验中，供试品溶液中对甲苯磺酸异丙酯色谱图
[0043]
图9：实施例7中对甲苯磺酸乙酯检测限色谱图
[0044]
图10：实施例7中对甲苯磺酸异丙酯检测限色谱图
[0045]
图11：实施例7中对甲苯磺酸乙酯定量限色谱图
[0046]
图12：实施例7中对甲苯磺酸异丙酯定量限色谱图
[0047]
图13：对比例1对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯对照品溶液专属性色谱图
[0048]
图14：对比例2不同定量离子对下对甲苯磺酸乙酯的峰面积色谱图
[0049]
图15：对比例3不同流动相b下对甲苯磺酸乙酯的峰面积色谱图
具体实施方式
[0050]
本发明公开了一种达比加群酯原料药或制剂中对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯的检测方法，本领域技术人员可以借鉴本发明的内容，结合药物分析的相关原理，适当改进工艺参数来实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明范围内。
[0051]
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本技术中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
[0052]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0053]
检测仪器：waters xevo tq-s超高效液相质谱仪
[0054]
超高效液相色谱条件：
[0055]
色谱柱：超高效液相苯基色谱柱acquity beh phenyl，2.1mm
×
50mm,1.7μm；
[0056]
流速：0.4ml/min；柱温：30℃；进样体积：8μl；
[0057]
流动相a：精密量取甲酸铵0.5g溶于500ml超纯水中，超声脱气；
[0058]
流动相b：甲醇，超声脱气；
[0059]
梯度洗脱表：
[0060]
时间(min)流动相a(％)流动相b(％)070301.5703012.5505018.2109022.0109022.1703025.07030
[0061]
质谱条件如下：
[0062]
质谱方法：mrm(多反应检测扫描)；ionization mode(电离模式)：es (正离子谱)；span： 0.2
[0063][0064]
调谐方法：
[0065]
voltages capillary(毛细管电压)：3.00kv；
[0066]
desolvation temperatures(脱溶剂温度)：500℃；
[0067]
gas flow desolvation(脱溶剂气流量)：1000l/hr(小时)
[0068]
空白辅料溶液的制备：取达比加群酯胶囊中的辅料阿拉伯树胶、羟丙甲纤维素、羟丙基纤维素、滑石粉和酒石酸，按照达比加群酯胶囊处方的用量比例混合，加50％乙腈水溶液溶解，摇匀，经0.22μm滤膜过滤，取滤液为空白辅料溶液。
[0069]
对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯对照品溶液的配制:精密称取对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯标准品各约10mg，置已有10ml乙腈的25ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀；再精密量取1ml置100ml量瓶中，加50％乙腈水溶液稀释至刻度，摇匀；再精密量取
25μl 置25ml量瓶中，加50％乙腈水溶液稀释至刻度，摇匀，得到分别含对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯浓度为4ng/ml的溶液，为对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯对照品溶液。
[0070]
达比加群酯对照品溶液的配制：精密称达比加群酯标准品约10mg置10ml量瓶中，加50％乙腈水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，得到浓度为1mg/ml的溶液，为达比加群酯对照品标准溶液。
[0071]
供试品(达比加群酯原料药)溶液1的制备：精密称达比加群酯原料药约100mg置10ml 量瓶中，加50％乙腈水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，得到浓度为10mg/ml的供试品溶液1。
[0072]
供试品(达比加群酯胶囊)溶液2的制备：精密称达比加群酯胶囊内容物适量(约含达比加群酯100mg)置10ml量瓶中，加50％乙腈水溶液超声溶解并稀释至刻度，摇匀，经0.22μm 滤膜过滤，得到浓度为10mg/ml的供试品溶液2。
[0073]
实施例1：系统适用性
[0074]
(1)试验方法：
[0075]
取对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯对照品溶液连续进样6针，记录对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯的峰面积。
[0076]
(2)试验结果：
[0077]
如表1所示，对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯对照品溶液连续进样6针rsd分别为 7.4％、4.0％(标准规定：6针峰面积的rsd≤10.0％)，表明本色谱系统进样精密度良好，系统适用性符合要求。
[0078]
表1：实施例1系统适用性试验结果
[0079][0080][0081]
实施例2：专属性
[0082]
(1)试验方法：
[0083]
分别进样空白溶液(50％乙腈水溶液)、(达比加群酯胶囊)空白辅料溶液、对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯对照品溶液、达比加群酯对照品溶液。
[0084]
其中达比加群酯对照品溶液的检测方法为高效液相色谱法，色谱柱、流速、柱温、进样体积、流动相a、流动相b、梯度洗脱方法同前；检测波长226nm。
[0085]
(2)试验结果：
[0086]
如表2所示，空白溶液、空白辅料溶液、达比加群酯对对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯的测定无干扰。见附图1-7。
[0087]
表2：实施例2专属性试验结果
[0088][0089]
实施例3：方法精密度1(达比加群酯原料)
[0090]
(1)试验方法：
[0091]
同一批达比加群酯原料药，平行制备6份供试品溶液1，测定对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯的含量。
[0092]
平行制备6份含对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯为规定限度(0.4ppm)的100％对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯对照品 样品的测试溶液(6份“样 标”溶液)，用对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯对照品溶液按外标法计算溶液中含有的浓度，以此浓度扣除供试品含有的量后得到实际测得浓度，再与理论加入浓度比较，计算6份样品中基因毒性杂质对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯的平均回收率和相对标准偏差。
[0093]
(2)试验结果：
[0094]
如表3、表4所示，6份供试品溶液中对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯含量均低于定量限，其中供试品溶液1中未检出对甲苯磺酸乙酯，对甲苯磺酸异丙酯的含量为0.03-0.04ppm (低于定量限0.08ppm)(标准规定：当含量低于定量限时，可以不计算rsd)；6份“样 标”溶液中对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯的平均回收率分别为99.9％、89.6％(标准规定：平均回收率80.0％-120.0％)，rsd分别为8.8％、3.8％(标准规定：rsd≤10.0％)，说明本方法测定达比加群酯原料药中的对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯含量方法精密度符合要求。
[0095]
表3：实施例3方法精密度1试验结果-6份供试品溶液测定结果
[0096][0097]
表4：实施例3方法精密度1试验结果-6份“样 标”溶液回收率结果
[0098][0099][0100]
实施例4：方法精密度2(达比加群酯胶囊)
[0101]
(1)试验方法：
[0102]
同一批达比加群酯胶囊，平行制备6份供试品溶液2，测定对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯的含量。
[0103]
平行制备6份含对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯为规定限度(0.4ppm)的100％对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯对照品 样品的测试溶液(6份“样 标”溶液)，用对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯对照品溶液按外标法计算溶液中含有的浓度，以此浓度扣除供试品含有的量后得到实际测得浓度，再与理论加入浓度比较，计算6份样品中基因毒性杂质对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯的平均回收率和相对标准偏差。
[0104]
(2)试验结果：
[0105]
如表5、表6所示，6份供试品溶液2中对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯含量均低于定量限，其中供试品溶液2中未检出对甲苯磺酸乙酯，对甲苯磺酸异丙酯的含量为0.04ppm (低于定量限0.08ppm)(标准规定：当含量低于定量限时，可以不计算rsd)；6份“样
标”溶液中对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯的平均回收率分别为91.0％、88.6％(标准规定：平均回收率80.0％-120.0％)，rsd分别为6.1％、4.9％(标准规定：rsd≤10.0％)，说明本方法测定达比加群酯胶囊中的对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯含量方法精密度符合要求。供试品溶液2中对甲苯磺酸异丙酯含量结果见附图8。
[0106]
表5：实施例4方法精密度2试验结果-6份供试品溶液2测定结果
[0107][0108][0109]
表6：实施例4方法精密度2试验结果-6份“样 标”溶液回收率结果
[0110][0111]
实施例5：中间精密度1(达比加群酯原料药)
[0112]
(1)试验方法：
[0113]
两位化验员，在不同日期用两根相同型号的色谱柱分别检测同批达比加群酯原料药中对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯的含量，平行制备6份供试品(达比加群酯原料药)溶液 1样品；并平行制备6份含对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯为规定限度的100％对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯对照品 样品的测试溶液，考察两人测得对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯含量及平均回收率的相对平均偏差。
[0114]
(2)试验结果：
[0115]
如表7所示，两位化验员测得的对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯平均回收率的rd 分别为1.9％、1.7％(标准规定：rd≤10.0％)，中间精密度符合要求。
[0116]
表7：实施例5中间精密度1试验结果对比
[0117][0118][0119]
实施例6：中间精密度2(达比加群酯胶囊)
[0120]
(1)试验方法：
[0121]
两位化验员，在不同日期用两根相同型号的色谱柱分别检测同批达比加群酯胶囊中对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯的含量，平行制备6份供试品(达比加群酯胶囊)溶液2样品；并平行制备6份含对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯为规定限度的100％对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯对照品 样品的测试溶液，考察两人测得对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯含量及平均回收率的相对平均偏差。
[0122]
(2)试验结果：
[0123]
如表8所示，两位化验员测得的对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯平均回收率的rd 分别为1.0％、0.7％(标准规定：rd≤10.0％)，中间精密度符合要求。
[0124]
表8：实施例6中间精密度2试验结果对比
[0125][0126]
实施例7：检测限与定量限
[0127]
(1)检测限试验方法：
[0128]
将对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯对照品溶液稀释，进行测定，记录色谱图，测定对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯的s/n(信噪比)来确定；当s/n为3-10时的浓度为待测物质的最小检测浓度，此浓度/供试品溶液浓度得到检测限(lod，ppm)；
[0129]
(2)定量限试验方法：
[0130]
将对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯对照品溶液稀释，进行测定，记录色谱图，测定对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯的s/n来确定；当s/n≥10时的浓度为待测物质的最小定量浓度，此浓度/供试品溶液浓度得到定量限(loq，ppm)；
[0131]
定量限精密度：loq溶液连续进样6针，记录峰面积，计算峰面积的相对标准偏差。
[0132]
定量限准确度：平行制备6份loq溶液，测定对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯平均回收率及相对标准偏差。平行制备6份“loq 辅料”溶液，测定对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯平均回收率及相对标准偏差。
[0133]
(3)检测限试验结果：
[0134]
检测限试验结果表9所示，对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯的检测限分别为0.08ppm、 0.02ppm，检测限见附图9-10。
[0135]
表9：实施例7检测限结果
[0136]
名称s/n对应浓度(ng/ml)以ppm计对甲苯磺酸乙酯50.794250.08对甲苯磺酸异丙酯30.204400.02
[0137]
(4)定量限试验结果：
[0138]
定量限试验结果如下表10、表11、表12、表13所示。对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯的定量限分别为0.2ppm、0.08ppm。对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯定量限精密度的rsd为2.2％、5.6％(标准规定：rsd≤10.0％)，定量限精密度符合要求。6份“loq 辅料”溶液中对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯的回收率分别为99.2％、102.2％(标准规定：平均回收率80.0％-120.0％)，rsd分别为3.7％、2.3％(标准规定：rsd≤10.0％)，定量限准确度符合要求。定量限见附图11-12。
[0139]
表10：实施例7定量限结果
[0140]
名称s/n对应浓度(ng/ml)以ppm计对甲苯磺酸乙酯181.98560.2对甲苯磺酸异丙酯140.817600.08
[0141]
表11：实施例7定量限精密度结果
[0142][0143]
[0144]
表12：实施例7定量限准确度试验-6份loq溶液回收率结果
[0145] 对甲苯磺酸乙酯回收率(％)对甲苯磺酸异丙酯回收率(％)1100.497.72100.296.23102.594.94100.397.15104.7100.06101.999.5平均101.797.6rsd(％)1.82.0
[0146]
表13：实施例7定量限准确度试验-6份“loq 辅料”溶液回收率结果
[0147] 对甲苯磺酸乙酯回收率(％)对甲苯磺酸异丙酯回收率(％)199.7103293.8104.33103.2101.3496.1102.55102.1104.66100.398.4平均99.2102.4rsd(％)3.72.3
[0148]
实施例8：溶液稳定性
[0149]
(1)试验方法：
[0150]
对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯对照品溶液、供试品溶液1、供试品溶液2在冰箱 (2-8℃)密闭放置至少12小时后，按外标法计算对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯对照品回收率和供试品溶液中对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯的含量。
[0151]
(2)试验结果：
[0152]
溶液稳定性结果如表14、表15、表16所示。对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯对照品溶液在室温和冰箱(2-8℃)密闭放置33小时回收率分别为101.8％，104.5％(标准规定：回收率为80.0％-120.0％，则溶液稳定)，说明对照品溶液稳定，符合验证要求。供试品溶液1 室温和冰箱(2-8℃)密闭放置23小时，对甲苯磺酸乙酯放置前与放置后均为未检出，对甲苯磺酸异丙酯放置后与放置前含量的比值为100％；供试品溶液2在室温和冰箱(2-8℃)密闭放置29小时，对甲苯磺酸乙酯放置前与放置后均为未检出，对甲苯磺酸异丙酯放置后与放置前含量的比值为107.9％，说明供试品溶液1、供试品溶液2稳定，符合验证要求(标准规定：放置后含量与放置前含量的比值在80.0％-120.0％之间，则溶液稳定)。
[0153]
表14：实施例8溶液稳定性试验-对照品溶液回收率结果
[0154][0155]
表15：实施例8溶液稳定性试验-供试品溶液1结果
[0156][0157]
表16：实施例8溶液稳定性试验-供试品溶液2结果
[0158][0159]
实施例9：耐用性
[0160]
(1)耐用性试验方法：
[0161]
改变柱温
±
5℃，对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯对照品溶液连续进样6次，计算对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯峰面积的rsd。
[0162]
(2)耐用性试验结果：
[0163]
耐用性结果如表17、表18所示，柱温变化
±
5℃，对甲苯磺酸乙酯峰面积的rsd分别为 1.9％、1.3％(标准规定：rsd≤10.0％)；对甲苯磺酸异丙酯峰面积的rsd分别为1.1％、1.1％(标准规定：rsd≤10.0％)；系统适用性符合要求。
[0164]
表17：实施例9耐用性-柱温25℃-系统适用性结果
[0165] 对甲苯磺酸乙酯峰面积对甲苯磺酸异丙酯峰面积第1针864529001第2针835629219第3针849728568第4针838528493第5针873928504第6针838428545平均值850128722rsd(％)1.91.1
[0166]
表18：实施例9耐用性-柱温35℃-系统适用性结果
[0167] 对甲苯磺酸乙酯峰面积对甲苯磺酸异丙酯峰面积第1针896329471第2针891129695
第3针872329489第4针863929029第5针880629233第6针882528851平均值881129295rsd(％)1.31.1
[0168]
对比例1：使用液相色谱法检测
[0169]
1、色谱条件：
[0170]
使用液相色谱法，色谱柱：acquity beh phenyl，2.1mm
×
50mm,1.7μm；流速：0.4ml/min；柱温：30℃；进样体积：8μl；流动相a：精密量取甲酸铵0.5g溶于500ml超纯水中，超声脱气；流动相b：甲醇，超声脱气；检测波长：226nm
[0171]
梯度洗脱表：
[0172]
时间(min)流动相a(％)流动相b(％)070301.5703012.5505018.2109022.0109022.1703025.07030
[0173]
2、专属性试验：
[0174]
取对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯对照品溶液注入液相色谱仪中，图谱如附图13所示。
[0175]
3、定量限试验：
[0176]
试验方法同实施例7，结果显示，对甲苯磺酸乙酯定量限为1.5ppm，对甲苯磺酸异丙酯定量限为1.2ppm。
[0177]
4、结论：
[0178]
该方法灵敏度低，不能用于对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯的检测。
[0179]
对比例2：对甲苯磺酸乙酯离子对的选择对检测结果的影响试验
[0180]
1、色谱条件：
[0181]
对甲苯磺酸乙酯的离子对如下表所示，其他检测条件如前所述。
[0182][0183]
2、溶液配制:
[0184]
对甲苯磺酸乙酯对照品溶液1的配制:精密称取对甲苯磺酸乙酯标准品约8mg，置已有 10ml乙腈的25ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀；再精密量取1ml置100ml量瓶中，加
50％乙腈水溶液稀释至刻度，摇匀；再精密量取100μl置25ml量瓶中，加50％乙腈水溶液稀释至刻度，摇匀，得到分别含对甲苯磺酸乙酯浓度为20ng/ml的溶液，为对甲苯磺酸乙酯对照品溶液1。
[0185]
3、试验方法：
[0186]
取对甲苯磺酸乙酯对照品溶液1分别进样，记录不同定量离子对下对甲苯磺酸乙酯的峰面积，结果如图14所示。
[0187][0188]
4、定量限：
[0189]
将对甲苯磺酸乙酯对照品溶液1稀释，进行测定，记录色谱图，测定对甲苯磺酸乙酯s/n 来确定；当s/n≥10时的浓度为待测物质的最小定量浓度，此浓度/供试品溶液浓度得到定量限(loq，ppm)。
[0190][0191]
5、结论：
[0192]
在相同的条件下，对甲苯磺酸乙酯定量离子对为201/173时的峰面积(38641)是定量离子对为218/173时峰面积(7093)的5.4倍，其定量限也相差5倍，因此对甲苯磺酸乙酯的定量离子对为201/173时，方法更灵敏。
[0193]
对比例3：流动相b的选择对检测结果的影响试验
[0194]
1、色谱条件：
[0195]
流动相b为乙腈，其他检测条件如前所述。
[0196]
2、溶液配制:
[0197]
对甲苯磺酸乙酯对照品溶液2的配制:精密称取对甲苯磺酸乙酯标准品约10mg，置已有 10ml乙腈的25ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀；再精密量取1ml置100ml量瓶中，加 50％乙腈水溶液稀释至刻度，摇匀；再精密量取50μl置25ml量瓶中，加50％乙腈水溶液稀释至刻度，摇匀，得到分别含对甲苯磺酸乙酯浓度为8ng/ml的溶液，为对甲苯磺酸乙酯对照品溶液2。
[0198]
3、试验方法：
[0199]
取对甲苯磺酸乙酯对照品溶液2分别进样，记录不同流动相b下对甲苯磺酸乙酯的峰面积，结果如图15所示。
[0200]
流动相b峰面积乙腈5502
甲醇16198
[0201]
4、结论：
[0202]
在相同的条件下，流动相b为甲醇的峰面积(16198)是流动相b为乙腈峰面积(5502) 的2.94倍，因此流动相b为甲醇，方法更灵敏。
[0203]
对比例4：梯度洗脱方法对检测结果的影响试验2
[0204]
1、色谱条件：
[0205]
梯度洗脱方法如下，其他检测条件如前所述。
[0206]
梯度洗脱方法为：
[0207]
时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0703052080620806.1703077030
[0208]
2、精密度试验：
[0209]
精密度考察方法同实施例4。
[0210]
对甲苯磺酸乙酯出峰时间为2.5min，对甲苯磺酸异丙酯的出峰时间为2.87min。
[0211]
方法精密度考察结果如表20所示：6份“样 标”溶液中对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯的平均回收率分别为61.6％、72.4％(标准规定：平均回收率80.0％-120.0％)，rsd分别为15.5％、9.5％(标准规定：rsd≤10.0％)；不符合精密度实验的控制要求。
[0212]
表20：对比例4方法精密度2试验结果-6份“样 标”溶液回收率结果
[0213][0214][0215]
3、结论：
[0216]
该方法精密度较差，不能用于对甲苯磺酸乙酯、对甲苯磺酸异丙酯的检测。