乌司他丁前体用于检测炎症的应用的制作方法

1.本发明涉及乌司他丁前体用于检测炎症反应的应用，尤其是特异性结合乌司他丁前体或其活性片段的一种或多种配体或其修饰产物在制备用于检测受试者中的炎症反应发生和/或炎症程度的试剂盒中的应用。


背景技术：

2.炎症是机体对各种致炎因子引起损害而产生的一种基本病理过程，也是许多疾病的重要组成部分。炎症时病理变化有变质、渗出和增生，局部症状有红、肿、热、痛、痒和功能障碍，全身症状有发热和外周血白细胞变化。以上变化和症状的出现与炎症时体内神经、体液和组织因素的改变有关，特别与炎症化学介质和炎症细胞有关。
3.很多疾病都会导致炎症反应。严重的炎症反应可能导致休克和脓毒症，甚至发生死亡，因此监测体内炎症的发生以及严重程度非常重要。
4.目前在临床中没有标准化的判断或检测炎症反应的启动及程度的特异性指标，尤其是可以定量的生物标志物。临床医生一般根据患者病情和体征及一些生化指标(例如血常规)进行经验性判断。
5.因此，需要能够特异性监测体内炎症反应和炎症程度的生物标志物及其定量方法，尤其能够快速定量地检测监测体内炎症反应和炎症程度的生物标志物的标准化方法和试剂盒。
6.发明概述
7.本发明的目的是提供乌司他丁前体-间-α-抑制剂(iαi)和前-α-抑制剂(pαi)在体液中的浓度变化在判断炎症反应中的用途。具体的说，本发明所述的乌司他丁前体-间-α-抑制剂(iαi)和前-α-抑制剂(pαi)浓度作为炎症反应发生的启动时间及程度的诊断指标的应用、用于准确定量该指标的一种或多种物质以及这些物质配体或其修饰产物在制备用于检测受试者中的炎症反应发生和/或炎症程度的试剂盒中的应用。
8.申请人已经出乎意料地发现，乌司他丁前体(特别是间-α-抑制剂(iαi)和前-α-抑制剂(pαi))能够作为受试者体内炎症反应和/或炎症程度的特异性标志物，从而能够通过特异性结合乌司他丁前体或其片段的特定配体测定受试者体内的乌司他丁前体的浓度变化来快速准确地监测或检测炎症反应和/或炎症程度。
9.具体来说，本发明提供了：
10.1.特异性结合乌司他丁前体或其活性片段的一种或多种配体或其修饰产物在制备用于检测受试者中的炎症反应发生和/或炎症程度的试剂盒中的应用。
11.其中，所述一种或多种配体包含层粘连蛋白、凝血因子、促炎细胞因子和基质蛋白中的至少两种。
12.其中，于所述层粘连蛋白为层粘连蛋白5，所述凝血因子为凝血因子ii，所述促炎细胞因子为白介素i，并且所述基质蛋白为mmp-2。
13.其中，所述修饰产物包含生物素化的修饰产物。
14.其中，所述一种或多种配体或其修饰产物包含生物素化的层粘连蛋白5、生物素化的凝血因子ii、生物素化的白介素i和生物素化的mmp-3中的至少两种，优选四种。
15.其中，所述乌司他丁前体在受试者体内的浓度降低指示炎症反应的发生并且所述乌司他丁前体在受试者体内的浓度降低程度指示炎症反应的程度。
16.其中，所述试剂盒对于乌司他丁前体或其活性片段的检测限为0.020微克/ml或更低，以及所述试剂盒对于乌司他丁前体的检测准确度为90％或更高。
17.其中，所述体液选自受试者的血浆、血清、尿液、组织培养上清液和血清中的任意一者。
18.其中，所述试剂盒包含特异性结合乌司他丁前体或其活性片段的一种或多种配体或其修饰产物，特异性结合乌司他丁前体或其活性片段的一种或多种配体或其修饰产物的检测剂以及任选地以下中的一种或多种：洗涤缓冲液、封闭剂、用于检测标记的底物，对照试剂和用法说明书。
19.其中，所述乌司他丁前体包含间-α-抑制剂(iαi)和前-α-抑制剂(pαi)中的至少一者或者两者。
20.本发明发现了特定的配体或者其修饰性产物的组合能够有效准确特异性地测定受试者体内的乌司他丁前体的浓度，以快速准确地监测或检测炎症反应和/或炎症程度，具有无创、准确、早期并且精确度高的优点。特别是，相比现有的方法，本发明鉴定出生物素化的层粘连蛋白5、生物素化的凝血因子ii、生物素化的白介素i和生物素化的mmp-3的组合对于测定受试者体内的乌司他丁前体的浓度具有更高的准确度和灵敏度。因此，所鉴定出的生物素化的层粘连蛋白5、生物素化的凝血因子ii、生物素化的白介素i和生物素化的mmp-3的组合能够制备成用于监测或检测炎症反应和/或炎症程度的改进试剂盒，从而更好地用于临床中。
21.发明详述
22.在以下描述中，为了深入地理解本发明，对许多具体细节进行了说明。但是，应当理解，本发明在不包括这些具体细节的情况下也可以实施。
23.本技术出乎意料地发现乌司他丁前体-间-α-抑制剂(iαi)和前-α-抑制剂(pαi)或其浓度可用于受试者的炎症反应的启动和程度的判断指标，开拓了乌司他丁前体-间-α-抑制剂(iαi)和前-α-抑制剂(pαi)的新用途。应用乌司他丁前体-间-α-抑制剂(iαi)和前-α-抑制剂(pαi)浓度的改变可以提示炎症反应的启动和程度，在临床中作为炎症反应的诊断指标，可以在临床诊治过程中尽早及时找到炎症失衡的打破点，抓住治疗时机，在过度炎症反应之前实施干预措施，避免患者病情因炎症过度反应而造成脏器功能损害从而导致机体不可逆的损伤，防止病情恶化，挽救患者生命，减少治疗费用，改善预后，减轻家庭负担，有效节约医疗资源。从而，为医生目前在诊治过程中不知何时打破平衡点，当意识到时炎症风暴时已经失控，从而失去了最佳的抢救时机的状态提供了一个重要的手段
24.在2020年新冠肺炎的治疗中，国家卫计委也提到尽量避免患者由轻到重的发展，早期进行炎症过度反应(炎症风暴)的干预。当人们有检测标准可以确定炎症过度反应的启动和程度，提前干预，防止恶化，可使普通民众减轻恐慌，增加医护人员的治疗信心。本发明的新用途更好满足国家医疗的需要。
25.本发明还发现了特定的配体或者其修饰性产物的组合能够有效准确特异性地测
定受试者体内的乌司他丁前体的浓度，以快速准确地监测或检测炎症反应和/或炎症程度。
26.本文所用的术语“乌司他丁前体”是指乌司他丁在体液中的无活性前体，特别是指-间-α-抑制剂(iαi)和前-α-抑制剂(pαi)。间-α抑制剂(iαi)具有225kda的分子量，并且包含bikunin轻链以及与bikunin连接的2个多肽重链，h1和h2。前-α抑制剂(pαi)具有120kda的分子量，并且只有单个重链(h3)连接bikunin。
27.乌司他丁是产生于人体的天然抗炎物质，炎症启动了乌司他丁的抑炎活性，是属于人体先天免疫活性能力的一部分。它的前体是间-α-抑制剂蛋白(iaip)和前-α-抑制剂蛋白(paip)，体内炎症反应发生时，乌司他丁前体间-α-抑制剂(iαi)变为有活性的乌司他丁，参与体内炎症控制，因此前体浓度的下降标志着炎症反应的启动和程度。
28.本文所用的配体包含层粘连蛋白、凝血因子、促炎细胞因子和基质蛋白中的至少两种。
29.优选地，所述层粘连蛋白为层粘连蛋白5，所述凝血因子为凝血因子ii，所述促炎细胞因子为白介素i，并且所述基质蛋白为mmp-2。
30.可以将配体进行修饰，以产生修饰产物。优选的修饰产物包含生物素化的配体。
31.优选地，所述生物标志物包含生物素化的层粘连蛋白5、生物素化的凝血因子ii、生物素化的白介素i和生物素化的mmp-2中的至少两种，更优选四种。
32.乌司他丁前体的测量
33.可采用许多不同的技术定量确定受试者体液中的乌司他丁前体的量或者浓度或表达水平。
34.例如，可以在在rna水平、多肽水平和/或阵列水平测量乌司他丁前体的量或者浓度。在另一个方面中，优选可以采用酶联免疫吸附测定(elisa)检测受试者体液中的乌司他丁前体的量或者浓度或表达水平。
35.(a)在rna水平
36.可在rna水平下检测基因表达。可采用rna提取技术从受试者体液中提取乌司他丁前体的rna，所述技术包括(例如)使用酚/异硫氰酸胍提取(rnazol b；biogenesis公司)、rneasy rna制备试剂盒(qiagen公司)或paxgene(preanalytix公司，瑞士)。利用核糖核酸杂交的典型分析模式包括核运行分析、rt-pcr、rna酶保护分析(melton等，nuc.acids res.12:7035)、northern印迹和原位杂交。还可通过如下所述的微阵列分析来检测基因表达。
37.对于northern印迹，首先通过在变性条件下用琼脂糖凝胶电泳根据大小分离rna样品。然后将rna转印到膜上，交联并与标记探针杂交。可以使用非同位素或高特异性活性放射标记探针，其包括随机引物的、缺口翻译的或pcr产生的dna探针，在体外转录的rna探针和寡核苷酸。此外，只具有部分同源性的序列(例如得自可能含有外显子的不同物种或基因组dna片段的cdna)可用作探针。
38.核酸酶保护分析(包括核糖核酸酶保护分析和s1核酸酶分析)提供了用于检测和定量特定mrna的高灵敏方法。npa的基础为反义探针(放射性标记的或非同位素的)与rna样品的溶液杂交。杂交后，单链未杂交的探针和rna被核酸酶降解。留下的经保护的片段在丙烯酰胺凝胶上分离。npa允许同时检测多种rna种类。
39.原位杂交(ish)是用于特定mrna在细胞或组织中的定位的强大和灵活的工具。探
针的杂交发生在细胞或组织内。由于整个过程中细胞结构得到保持，因此ish提供了mrna在组织样品中的位置信息。
40.该过程通过在中性缓冲福尔马林中固定样品，并将组织包埋在石蜡中而开始。然后将样品切成薄片，并放置到显微镜玻片上。或者，可以将组织切片冷冻并且在多聚甲醛中后固定。在将切片经过一系列清洗以脱蜡和再水化后，进行蛋白酶k消化以增加探针的进入度，然后将标记的探针与样品切片杂交。放射性标记探针通过切片上干燥后的液膜而显现，而非同位素标记的探针则采用比色法或荧光试剂来简便地检测。后者的检测方法是荧光原位杂交(fish)技术的基础。
41.检测可采用的方法包括放射性标记、酶标记、化学发光标记、荧光标记和其他合适的标记。
42.通常，rt-pcr用于扩增rna目标物。在这个过程中，逆转录酶用于将rna转换为互补的dna(cdna)，然后将其扩增以方便检测。相对定量rt-pcr技术包括同时扩增内部对照物以及所关注的基因。内部对照物用于校正样品。一旦进行校正，可在样品之间对特定mrna的相对丰度进行直接比较。常用的内部对照物包括(例如)gapdh、hprt、肌动蛋白和亲环蛋白。
43.许多dna扩增方法是已知的，其中大部分都依赖于酶的链式反应(如聚合酶链式反应、连接酶链式反应、或自身持续序列复制)或将全部或部分载体复制进入被克隆的dna。
44.许多目标和信号放大(tas)方法已在文献中记载，例如文献“landegren,u.等,science 242:229-237(1988)”和“lewis,r.,genetic engineering news 10:1,54-55(1990)”对这些方法进行了综述。
45.pcr为在(例如)专利文献us 4,683,195和4,683,202等中描述的核酸扩增方法。pcr在诊断情况中可用于扩增任意已知的核酸(mok等，1994，gynaecologic oncology 52:247-252)。自身持续序列复制(3sr)是tas的一种变形，其包括借助于逆转录酶(rt)、聚合酶和核酸酶活性的顺次循环(通过多种酶混合液和合适的寡核苷酸引物介导)而等温扩增核酸模板(guatelli等,1990,proc.natl.acad.sci.usa 87:1874)。连接扩增反应或连接扩增系统使用dna连接酶和4种寡核苷酸(每种目标链两种)。该技术在文献“wu,d.y.和wallace,r.b.,1989,genomics 4:560”中有所描述。在qβ复制酶技术中，复制单链rna的噬菌体qβ的rna复制酶用于扩增目标dna(如文献“lizardi等，1988,bio/technology 6:1197”所述的那样)。
46.定量pcr(q-pcr)为获得待确定的样品中转录物的相对量的技术。本文描述了执行qpcr的合适方法。
47.在本发明中可以采用其它可供选用的扩增技术。例如，滚环(rolling circle)扩增(lizardi等，1998,nat genet 19:225)是市售可得的扩增技术(rcat
tm
)，其由dna聚合酶推动并且可以在等温条件下以线性或几何动力学复制环形寡核苷酸探针。另一项技术-链置换扩增(sda；walker等，1992,proc.natl.acad.sci.usa80:392)以专属于特定目标物的特别确定的序列开始。
48.用于检测本文所述的的乌司他丁前体的合适的探针可处于合适的容器中方便地封装为检测试剂盒的形式。在这种试剂盒中，探针可以结合到到固体载体上，其中试剂盒所针对的设计的分析模式需要这种结合。该试剂盒可以包含用于处理待探测样品、将探针与样品中核酸杂交的合适试剂，对照试剂，用法说明等。合适的试剂盒可包括(例如)qpcr反应
的引物或执行fish的标记探针。
49.(b)在多肽水平
50.乌司他丁前体在体液中的表达水平或者浓度及其变化也可通过测量由乌司他丁前体基因编码的多肽检测。这可通过采用能结合乌司他丁前体基因编码的多肽的分子实现。直接或间接结合多肽以检测蛋白的存在的合适的分子/试剂包括天然形成的分子如肽和蛋白质(例如抗体)，或者其也可以是合成分子。
51.乌司他丁前体的基因或蛋白质的抗体可由市售来源得到或通过本领域技术人员熟知的技术获得。在一个实施方案(其中改变的表达通过蛋白生物标志物的翻译后修饰形式的改变的表达自我表征)中，可采用特异性针对乌司他丁前体的这些不同形式的抗体。
52.抗体的制备方法是本领域技术人员已知的。如果需要多克隆抗体，则用具有多肽表位的免疫原多肽来接种所选的动物(例如，鼠、兔、羊、马等)。收集接种动物的血清，并且根据已知的程序处理。如果含有针对多肽表位的多克隆抗体具有针对其它抗原的抗体，则可采用免疫亲和层析来纯化该多克隆抗体。多克隆抗血清的制备和处理技术为本领域已知。为了产生较大的免疫原性反应，多肽或其片段可经半抗原修饰为另一多肽，以用作动物或人体的免疫原。
53.在一个实施方案中，多克隆抗体是通过用高度纯化的人血浆来源的iaip对兔子进行免疫接种来产生的。优选的多克隆抗体为r-16pab。
54.针对多肽中表位的单克隆抗体也可由本领域技术人员容易地制备。由杂交瘤细胞制备单克隆抗体的一般方法是众所周知的。可通过细胞融合来构建永久的制备抗体的细胞株，并且也可通过其他技术(如用致癌dna直接转化b淋巴细胞或用eb病毒传染)制备。针对本发明多肽表位制得的单克隆抗体群可通过各种特性(即同型和抗原表位亲和性)筛选。优选的单克隆抗体为针对人iaip的轻链的纯化小鼠单克隆抗体，如mab69.26或mab69.31。
55.另一项可供选用的技术包括筛选噬菌体展示库，其中，(例如)噬菌体在其外壳表面表达scfv片段，其中所述外壳具有一系列互补决定区(cdr)。这种技术是本领域中众所周知的。
56.根据本发明的目的，除非另外指明，否则术语“抗体”包括全抗体，或全抗体的保留了其靶抗原结合活性的片段。这些片段包括fv、f(ab')和f(ab')2片段，以及单链抗体(scfv)。另外，抗体及其片段可以为在(例如)ep239400a中所述的人源化抗体。本文所用的术语“抗体”还包括类抗体亲和试剂。例如：单克隆和多克隆抗体、重组抗体、抗体的蛋白水解和重组片段(fab、fv、scfv、双抗体)、单结构域抗体(vhh、sdab、纳米抗体、ignar、vnar)以及构建为具有类抗体特异结合性的与抗体无关的蛋白质，具体如下：
57.名称基于：
58.affibodies蛋白a、z结构域6kda
59.affitinssac7d(源自嗜酸热硫化叶菌)7kda
60.anticalins脂笼蛋白20kda
61.darpins锚蛋白重复序列模体14kda
62.fynomersfyn、sh3结构域7kda
63.kunitz域多肽各种蛋白酶抑制剂6kda
64.monobodies纤连蛋白
65.如上所述，诸如免疫印迹等标准实验技术可用于检测乌司他丁前体的活性或者浓度相比于健康受试者的改变水平。
66.基因表达也可通过检测多肽的翻译后加工或核酸的转录后修饰的变化来确定。例如，可以测量多肽的差异磷酸化、多肽的断裂或rna的选择性剪接。可通过采用专门的蛋白质分析法或诸如2d聚丙烯酰胺凝胶电泳等技术来检测基因产物(如多肽)的表达水平以及它们的翻译后修饰的表达水平。
67.可通过下列方法将抗体用于检测乌司他丁前体的表达水平或者浓度，所述方法包括：(a)提供本发明所述的抗体；(b)在允许形成抗体-抗原复合物的条件下将生物样品与所述抗体孵育；(c)确定是否形成包含所述抗体的抗体-抗原复合物。
68.合适的样品包括组织提取物，所述组织例如为肝、肌肉和骨组织，或来源于这些组织的赘瘤。其他合适的例子包括血液或尿液样品。
69.特异性结合乌司他丁前体蛋白的抗体可用于本领域技术人员众所周知的诊断或预测方法和试剂盒中，以检测或定量体液或组织中乌司他丁前体蛋白的表达水平或者浓度。上述测试的结果可用于诊断或预测受试者中的炎症的发生或程度，或评价药物剂量和治疗的有效性。
70.可通过本领域已知的任意方法分析抗体的免疫特异性结合。可采用的免疫分析包括(但不限于)竞争性和非竞争性分析系统，其采用的技术例如为western印迹、免疫组织化学、放射性免疫分析、elisa、夹心免疫分析、免疫沉淀分析、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散分析、凝集反应分析、补体固定分析、免疫放射分析、荧光免疫分析和蛋白a免疫分析。
71.上述分析法为本领域的常规技术(参见(例如)文献“ausubel等，eds,1994,current protocols in molecular biology,vol.1,john wiley&sons,inc.,new york”，其全文以引用方式并入本文中)。
72.本发明所用的抗体优选结合到固体载体，并且/或者处于合适的容器中与合适的试剂、对照物、说明等一起封装在试剂盒内。
73.其它方法包括(但不限于)2d-page，虽然这较为不适合大规模筛选。更新的技术包括基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof ms)。在maldi-tof分析中，将复杂混合物中的蛋白质都固定在固态金属基体中，用脉冲激光束解吸附以产生横穿零场飞行管的气态离子，然后根据其质量依赖的速度分离。可通过使用信息工具搜索蛋白质和多肽序列数据库鉴定每种蛋白质和多肽。表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(seldi-tof ms)是一种基于亲和性的质谱，其中蛋白质被选择地吸附到化学修饰的固体表面，通过洗涤除去杂质，应用吸收能量的基质，并且通过激光解吸质谱分析鉴定蛋白质。
74.seldi-tof-ms可用于检测完整的蛋白或特定蛋白质片段的存在/缺失。此外seldi-tof-ms也可因为由化学基团的添加/去除所导致的质量差异而用于检测蛋白质的翻译后修饰。因此，单个残基的磷酸化由于磷酸酯基团而导致80da的质量变化。可由翻译后修饰产生的分子量的数据库可在互联网上自由获得(http://www.abrf.org/index.cfm/dm.home？avgmass＝all)。此外，特定的多肽可采用seldi-tof-ms通过基于亲和性的方法用抗体捕获，其中所述抗体能特异性识别蛋白质的翻译后修饰形式，或者可同等识别蛋白质的所有形式。
75.阵列
76.一般来说，阵列技术和与之相关的各种技术及应用在众多的教科书和文件中均有描述。这些包括文献lemieux等，1998,molecular breeding 4:277-289；schena和davis.parallel analysis with biological chips,in pcr methods manual(eds.m.innis,d.gelfand,j.sninsky)；schena和davis，1999，genes，genomes and chips.in dma microarrays：a practical approach(ed.m.schena)，oxford university press，oxford，uk，1999)；the chipping forecast(nature genetics special issue；january 1999 supplement)；mark schena(ed.)，microarray biochip technology,(eaton publishing company)；cortes，2000，the scientist 14(17):25；gwynne and page,microarray analysis：the next revolution in molecular biology，science，1999，august 6；eakins和chu，1999，trends in biotechnology，17:217-218；以及各种万维网。
77.阵列技术克服了分子生物学传统方法的缺点，其中传统方法一般基于“一个实验一个基因”的方式进行，从而导致低通量以及无法认识基因功能的“全貌”。目前，阵列技术的主要应用包括序列的识别(基因/基因突变)和基因表达水平(丰度)的确定。基因表达分析可以利用阵列技术，可任选地结合蛋白组学技术(celis等，2000，febs lett，480(1):2-16；lockhart和winzeler，2000，nature 405(6788):827-836；khan等，1999，20(2):223-9)。阵列技术的其它应用也为本领域所公知；例如基因的发现、癌症研究(marx，2000，science 289：1670-1672；scherf等，2000，nat genet 24(3):236-44；ross等，2000，nat genet 2000，24(3):227-35)、snp分析(wang等，1998,science 280(5366):1077-82)、药物发现、药物基因组学、疾病诊断(例如，utilising microfluidics devices：chemical&engineering news，february 22，1999，77(8):27-36)、毒理学(rockett和dix(2000)，xenobiotica 30(2)：155-77；afshari等，1999，cancer res 59(19):4759-60)以及毒理基因组学(功能基因组与分子毒理学的杂化)。毒理基因组学的目的在于找到对有毒物质的毒性反应与接触该有毒物质的对象的基因图谱的变化之间的关系(nuwaysir等，1999，molecular carcinogenesis 24：153-159)。
78.在本发明的情况中可采用阵列技术来(例如)分析乌司他丁前体蛋白的表达。一般情况下，任何样品库或组可以有序方式布置在阵列中，这通过空间分隔所述库或组中的成员来进行。用于阵列分析的合适的库的例子包括核酸库(包括dna、cdna、寡核苷酸等库)、肽、多肽和蛋白质库，以及包含任意分子(如配体库)等的库。因此，如果在本发明中引用“库”时，除非上下文另有规定，否则这种引用应被认为包括阵列形式的库的引用。
79.样品(例如库的成员)一般是固着或固定到固相上(优选为固体基质)，以限制样品的扩散和掺杂。在优选实施方案中，可制备结合dna的配体库。特别是，所述的库可以固定在基本平坦的固相上，包括膜和非多孔基质(如塑料和玻璃)。此外，样品优选以有利于索引(即引用或访问特定样品)的方式布置。通常情况下将样品以点的形式施加在网格形式中。常见分析系统可适用于该目的。例如，可将阵列固定在微孔板表面，其中多个样品位于一个孔中，或是每个孔中具有单一样品。此外，固体基质可为膜，如硝酸纤维素或尼龙膜(例如印迹实验中所用的膜)。可选用的其它基质包括玻璃或硅基基质。因此，可通过本领域已知的任意合适的方法(例如通过电荷相互作用或通过化学偶合)将样品固定到孔壁或孔底部、或
膜表面。可采用其他布置和固定的手段，例如吸移、滴触(drop-touch)，压电手段、喷墨和气泡喷射技术、静电施加等。在硅基芯片的情况下，可利用光刻法将样品布置和固定在芯片上。
80.可通过“点”在固体基质上来布置样品；这可通过手工或使用机器人沉积样品来完成。一般情况下，阵列可被描述为巨阵列或微阵列，其区别在于样品点的大小。巨阵列通常包含点大小为约300微米或更大的样品，并且可以容易地通过现有的凝胶和印迹扫描仪成像。微阵列上的样品点大小通常具有小于200微米的直径，并且这些阵列通常包含成千上万个点。因此，微阵列可需要专门的机器人技术和成像设备，这可能需要定制。在文献“cortese，2000，the scientist 14(11):26”的综述中大致描述了该装置。
81.本领域已经描述了制备固定化的dna分子库的技术。一般来说，大多数现有技术的方法都描述了如何合成单链核酸分子库，其采用(例如)掩模技术在固体基质的各种离散位置建立各种序列排列。us 5,837,832(其内容以引用方式并入本文)描述了改进的基于超大规模整合技术制备固定到硅基基质的dna阵列的方法。特别是，us 5,837,832描述了被称为“嵌装”的策略以在基质的空间限定的位置合成特定的探针组，所述策略可用于制备本发明的固定化的dna库。us 5,837,832也提供了可采用的较早技术的文献。
82.也可按照下述方式在表面上合成肽(或多肽模拟物)阵列：将每个不同的库成员(例如独特的肽序列)设置在阵列中离散的预定的位置。每个库成员的特征是由其在阵列中的空间位置确定的。确定阵列中在预定的分子(例如靶标或探针)与反应性库成员之间发生结合相互作用的位置，从而基于空间位置确定反应性库成员的序列。在文献us 5,143,854；wo 90/15070和wo 92/10092；fodor等，1991，science 251:767；dower和fodor，1991，ann.rep.med.chem.26:271中描述了这些方法。
83.为了有助于检测，靶标和探针可用任意容易检测的报告物标记，例如荧光、生物发光、磷光、放射性等报告物标记。在本文的其它部分讨论了这样的报告物、其检测、其与靶标/探针的偶联等。在文献“shalon等，1996，genome res 6(7):639-45”中也公开了探针和靶标的标记。
84.dna阵列的具体例子包括如下：
85.模式i：采用机器人点样法将探针cdna(～500-～5,000碱基长度)固定到固体表面(如玻璃)上，并将其暴露于一组独立地或以混合物的形式存在的靶标。这种方法被广泛认为是在斯坦福大学开发的(ekins和chu，1999，trends in biotechnology,17:217-218)。
86.模式ii：原位(芯片上)或通过常规合成随后芯片上固定来合成寡核苷酸阵列(～20-～25-mer寡核苷酸)或肽核酸(pna)探针。将该阵列暴露于已经标记的样品dna、杂交并确定互补序列的特征/丰度。该dna芯片由affymetrix有限公司销售，商标为
87.在(例如)文献“marshall和hodgson，1998，nature biotechnology 16(1):27-31”中描述了一些市售可得的微阵列模式的例子。
88.数据分析也是阵列实验的一个重要部分。微阵列实验的原始数据通常为图像，其需要转化为基因表达矩阵-表格，其中行代表(例如)基因，列代表(例如)各种样品(如组织)或实验条件，并在每个单元格中的数字表示(例如)特定样品中特定基因的表达水平。如果需要提取潜在的生物过程有关的知识，这些矩阵必须进一步分析。数据分析方法(包括监督和未监督的数据分析以及生物信息学方法)在brazma和viio j，2000，febs lett 480(1):
17-24中披露。
89.如上所述，蛋白质、多肽等也可被固定在阵列中。例如，抗体已经被应用于采用蛋白质芯片的蛋白质组的微阵列分析中(borrebaeck ca,2000，immunol today 21(8):379-82)。例如，在文献“macbeath和schreiber，2000，science，289(5485):1760-1763”中综述了多肽阵列。
90.elisa
91.elisa法是用于测定体液中乌司他丁前体的浓度或者含量的一种优选方法。elisa法可以包括应用亲和素和生物素的elisa、竞争性elisa法和双抗体夹心法。
92.应用亲和素和生物素的elisa法涉及亲和素-生物素系统。亲和素－生物素系统在elisa中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素或者生物素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素或者亲和素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗体显色。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。
93.竞争性elisa法操作步骤如下：(1)将特异抗体或者抗原与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。(2)待测管中加受检标本和一定量标记抗原或者抗体的混合溶液，使之与固相抗体或者抗原反应。如受检标本中无靶标，则标记抗原或者抗体能顺利地与固相抗体或者抗原结合。如受检标本中含有靶标，则与标记抗原或者抗体以同样的机会与固相结合，竞争性地占去了标记抗原或者抗体与固相载体结合的机会，使标记抗原或者抗体与固相载体的结合量减少。(3)加底物显色：参考管中由于结合的标记抗原或者抗体最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。可以采用上述的r-16pab进行竞争性elisa法。具体地，将96孔高结合微孔板用纯化的绵羊iaip包被。通过阴离子交换色谱在toyopearl q-600c-ar柱上从绵羊血清中纯化绵羊iaip。结合的iaip用含有nacl的缓冲液洗脱。将纯化的绵羊iaip在缓冲液中稀释，并在室温下固定在微孔板上。随后，用封闭液封闭微孔板。绵羊血浆在pbs中稀释，已知量的纯化绵羊iaip在含有bsa的pbs中连续稀释，以建立标准曲线，用于样品中iaip浓度的定量分析。将样品和连续稀释的iaip标准品加入孔中后，将稀释于pbs中的r-16pab加入每个孔中。将板在室温下孵育，然后使用自动洗板机用pbs和0.05％tween洗涤。通过在室温下加入hrp缀合的山羊抗兔igg(invitrogen，carlsbad，ca，usa)1小时来检测结合的r-16pab。洗涤后，将enhanced k-blue tmb底物加入孔中，加入hcl溶液终止反应。在spectramax plus酶标仪上测量450nm处的吸光度。
94.双抗体夹心法包括下列步骤：将针对人iaip的轻链的纯化小鼠单克隆抗体(mab 69.26)在32℃下以200ng/孔固定在96孔微板(immulon 600，greiner bioone)上2小时。在用5％脱脂干燥奶粉封闭1小时并用tbs-t(tbs 0.05％tween 20)洗涤之后，将未知样品和已知iaip标准物在tbs 0.1％tween 20中稀释并添加至微板(最终体积50ul/孔)。将样品和系列稀释的iaip标准物溶液在32℃下温育1小时。在用tbs-t洗涤微板若干次之后，将生物素酰化的肝素在含有20mm乙酸 25mm nacl的缓冲液中稀释，ph 4.0(1:2500)，并且每孔添加50μl。将生物素酰化的肝素在32℃下温育30分钟，并且然后使用tbs-t将微板洗涤至少三次。最后，将1:5000(50ul/孔)稀释的hrp缀合的链霉抗生物素蛋白(pierce)添加至微板。在洗涤之后，添加50μl底物tmb，并且通过添加50μl 1m hcl来使反应停止，并且在450nm波长
处在分光光度计上读取颜色变化。使用四点逻辑回归生成标准曲线，并且绘制七点曲线。基于所生成的标准曲线计算未知样品的iaip浓度。
95.试剂盒部分
96.本发明的一个方面一种用于定量样品中的iaip的试剂盒，其中所述试剂盒包括特异于结合所述乌司他丁前体的一种或多种配体或修饰产物、用于特异性结合乌司他丁前体或其活性片段的一种或多种配体或其修饰产物的检测剂以及任选地以下中的一种或多种：洗涤缓冲液、封闭剂、用于检测标记的底物，对照试剂和用法说明书。
97.试剂盒的组分中的一种或多种可以提供在容器中，诸如管或小瓶，和/或以随时可用的形式提供(例如，施加到试剂盒的支持物(例如，板或测试条))。
98.在一些实施方案中，所述检测剂被标记。。
99.本发明的另一个方面涉及上述试剂盒在上述任意方法中的用途。
100.诊断和预测
101.本发明还涉及乌司他丁前体作为生物标志物在诊断或预测炎性疾病中的用途。
102.如本文所用，术语“预测方法”是指能够预测已诊断为具有炎性疾病的进展的方法。更具体而言，炎症疾病选自由以下组成的组：败血症、败血症性休克、无菌性败血症、创伤、损伤、中风、急性炎性疾病、sirs、急性肺损伤、ards、肺炎、坏死性小肠结肠炎、急性胰腺炎、肾病、急性肾损伤、肝损伤、急性循环衰竭、手术引起的炎症、脓肿引起的炎症、多发性硬化症、子痫前期、癌症、癌症转移、肿瘤浸润、外周动脉疾病、1型或2型糖尿病、动脉粥样硬化性心血管疾病、间歇性跛行、严重肢体缺血性疾病、心肌梗塞、颈动脉闭塞、脐带闭塞、低出生体重、早产、肺功能不全、周围神经病变、缺氧缺血、细菌感染、伤口、烧伤、割伤、挫伤、骨折、外科手术、组织缺血、类风湿性关节炎、脑膜炎、炎性肠病、慢性阻塞性肺病、鼻炎、未足月产或感染性疾病。
103.如本文所用，术语“诊断方法”是指能够确定受试者(人或动物)中的炎症的存在和/或程度的方法。如上所述，合适的诊断包括针对本文确定的任意基因的探针，如qpcr引物、fish探针等。
104.因此，一个优选实施方案涉及上述生物标志物在个性化医疗应用中的用途。
105.在一个优选实施方案中，所述个性化医疗应用旨在确定受试者是否需要对炎症反应进行干预。
106.在本发明中，优选本文所述的方法在体外进行。
107.例子
108.实施例1-纯化iaip的制备
109.使用乙酸将牛乳或人乳调节至ph 4.5，并以8500rpm离心20min。收集上清液。然后，通过添加4m tris缓冲液将乳上清液的ph调节至ph 7.0。过滤后，将乳上清液用含有20mm tris ph 7.5和150mm nacl的缓冲液1:3稀释，以进一步进行色谱分离。然后，将稀释的乳施加到tosoh gigacap q-650柱上。收集未结合的级分(流过物)后，首先用含有盐的缓冲液(20mm tris ph 7.5 300mm nacl)洗涤柱，并且随后用低ph缓冲液(50mm乙酸，ph 4.5)洗涤柱。收集洗涤级分，并且然后使用含有20mm tris ph 7.5和750mm nacl的洗脱缓冲液洗脱柱。
110.在7.5％sds-page凝胶(biorad tgx凝胶)上分离未结合的洗涤级分和洗脱级分的
等分试样，并且随后将其转移到硝酸纤维素膜上以进行蛋白质印迹分析。在用5％脱脂干乳封闭后，将硝酸纤维素膜与针对大鼠iaip的生物素化兔多克隆抗体(r22c)一起孵育。此多克隆抗体与人iαip和牛iαip发生交叉反应。将牛乳和人乳来源的iaip结合到柱上，并使用750mm nacl从柱上洗脱，由此得到纯化的iaip。通过兔多克隆抗体r22c通过凝胶法检测得到的纯化iaip，其相对应的250kda的特异性条带。
111.实施例2-生物素化的层粘连蛋白5的制备
112.使用生物素酰肼试剂将层粘连蛋白5与生物素缀合。简而言之，将浓度为0.5mm的层粘连蛋白5(得自默克公司)的溶液(含有tris-hcl和nacl)与0.35mg交联剂试剂edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-3乙基碳二亚胺盐酸(得自)和0.5mm先前已溶解dmso中的生物素-peg4-酰肼(得自thermofisher公司)在轻微搅拌下在室温下混合1小时。通过在具有过滤膜(millipore)的amicon超离心过滤器装置上超滤来进行未缀合生物素和pbs缓冲液交换，重复三次。在重水中稀释之后，得到生物素酰化的层粘连蛋白5的溶液。最后通过bca法检测，蛋白饱和信号大于0.3nm，证明了蛋白的成功生物素化。
113.实施例3-生物素化的凝血因子ii的制备
114.使用生物素酰肼试剂将凝血因子ii与生物素缀合。简而言之，将浓度为0.3m的凝血因子ii(得自默克公司)的溶液与0.15mg交联剂试剂edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-3乙基碳二亚胺盐酸(得自)和0.3mm先前已溶解在mes缓冲液ph 5.3中的dmso中的生物素-peg4-酰肼(得自thermofisher公司)在轻微搅拌下在室温下混合半小时。通过在具有过滤膜(millipore)的amicon超离心过滤器装置上超滤来进行未缀合生物素和缓冲液交换，重复三次。在重水中稀释之后，得到生物素酰化的凝血因子ii的溶液。最后通过bca法检测，蛋白饱和信号大于0.5nm，证明了蛋白的成功生物素化。
115.实施例4-生物素化的白介素i的制备
116.使用生物素酰肼试剂将白介素i与生物素缀合。简而言之，将浓度为0.4m的白介素i的溶液与0.2mg交联剂试剂edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-3乙基碳二亚胺盐酸(得自)和0.4mm先前已溶解在mes缓冲液ph 5.5中的dmso中的生物素-peg4-酰肼(得自thermofisher公司)在轻微搅拌下在室温下混合1.5小时。通过在具有过滤膜(millipore)的amicon超离心过滤器装置上超滤来进行未缀合生物素和缓冲液交换，重复三次。在重水中稀释之后，得到生物素酰化的白介素i的溶液。最后通过bca法检测，蛋白饱和信号大于1nm，证明了蛋白的成功生物素化。
117.实施例5-生物素化的mmp-2的制备
118.将mmp-2与生物素缀合。简而言之，将浓度为0.3m的mmp-2的溶液与0.4mm先前已溶解在mes缓冲液ph 7.0中的dmso中的nhs-lc-lc-生物素(得自thermofisher公司)在轻微搅拌下在室温下混合7小时。通过在过滤膜(millipore)的amicon超离心过滤器装置上超滤来进行未缀合生物素和缓冲液交换。在dmso中稀释之后，得到生物素酰化的mmp-2的溶液。最后通过bca法检测，蛋白饱和信号大于0.4nm，证明了蛋白的成功生物素化
119.实施例6-elisa测定
120.将96孔微孔板(得自merck公司)用实施例1中获得的纯化iaip包被，其中包被液为ph 9.0的碳酸钠缓冲液。结合的iaip用含有pbs缓冲液洗脱。将纯化的iaip在0.01mol/
lpbs-tween 20溶液ph 7.4中稀释，并在室温下在微孔板上(100ng/孔)在4℃下固定过夜。随后，用在0.01mol/lpbs-tween 20溶液中的脱脂奶粉封闭微孔板。将牛血清(得自)与实施例2得到的生物素化的层粘连蛋白5在0.01mol/lpbs-tween 20溶液ph 7.4中稀释，以得到样品溶液。将已知量的纯化iaip在含有1％bsa的0.01mol/lpbs-tween 20溶液ph 7.4中连续稀释，以建立标准曲线，用于样品中iaip浓度的定量分析。将100μl样品溶液和连续稀释的iaip标准品加入孔中后。将板在室温下孵育1小时，然后使用pbs和0.05％tween洗涤。通过在室温下加入1:1000稀释的hrp缀合的链霉抗生物素蛋白(piere公司)。洗涤后，将50μl tmb底物(默克公司)加入孔中，加入50μl 1m hcl溶液终止反应。在thermo scientific微孔板读数仪上测量450nm处的吸光度。每个样品一式三份进行测试，并且对所有样品重复测定至少两次。
121.实施例7-11
122.按照与实施例6基本相同的方式进行elisa测定，不同之处在于分别用实施例3-5中制备的生物素化的凝血因子ii、生物素化的白介素i、生物素化的mmp-2以及生物素化的层粘连蛋白5、生物素化的凝血因子ii、生物素化的白介素i和生物素化的mmp-2的混合物替换实施例6中的生物素化的层粘连蛋白5，从而得到实施例7-11的测试结果。
123.对照例
124.按照与实施例6基本相同的方式进行elisa测定，不同之处在于用生物素化的肝素替换实施例6中的生物素化的层粘连蛋白5。
125.表1示出根据实施例6测定产生的数据，并且根据该数据绘制了标准曲线(r＝0.9970，斜率＝32.6725，截距＝50.6732)。根据标准曲线计算得到样品中的iaip的量的信号。较低的信号表示样品的iaip的量较高。
126.表1
[0127][0128]
根据实施例6的方法分别获得了实施例7-11和对照例的数据，并且根据该数据分别绘制了标准曲线(r＝0.89或更高，斜率＝33或更低)。根据标准曲线计算得到样品中的iaip的量的信号。较低的信号表示样品的iaip的量较高。
[0129]
根据测试数据制作了根据实施例7-11和对照例的方法测定的多指标roc曲线，其中通过使用随机森林决定树分析法最小化训练集过度拟合，并且为了制备平滑的roc曲线，进行了120个交互验证，并且将结果平均化。根据roc曲线获得的各实施例和对照例的准确
度、特异度和灵敏度如下表2所示。
[0130]
表2
[0131][0132][0133]
如表2所示，采用多指标因素获得的roc曲线表明，对于实施例11的测试方法而言，联合准确度最高，达到91％。实施例6-10的测定方法的准确度也较高，为80-88％。与此形成对比的是，对照例的准确度为75％。
[0134]
总之，本发明证明了特异性结合乌司他丁前体或其活性片段的一种或多种配体的组合能够准确并且有效的检测体液中的iaip的量或者浓度，从而能够简捷、无创、准确、早期地监测患者iaip的浓度变化，由此提示患者炎症反应的启动和程度。此时，可以进行抗炎治疗，以防止炎症发展成重症。
[0135]
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超过权利要求所记载的技术方案的前提下，还有其他的改型。可以理解的是，以上实施例仅仅是为了说明本公开的原理而采用的示例性实施例，然而本公开并不局限于此。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本公开的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本公开的保护范围。