生物相容性柔性止血片的制作方法

1.本发明涉及一种生物相容性柔性止血片，其可适当地用于最小化手术程序期间的出血。该止血片包括：
2.·
粘性纤维载体结构，其包括三维互连间隙空间，以及
3.·
分布在间隙空间内的反应性聚合物颗粒，其包含(i)携带至少三个反应性亲电基团的水溶性亲电子聚合物，所述反应性亲电基团能够在形成共价键的情况下与组织和血液中的胺基团反应，以及(ii)含有至少两个反应性亲核基团的亲核交联剂，所述反应性亲核基团能够在形成共价键的情况下与亲电子聚合物的反应性亲电基团反应。
4.发明背景
5.在对薄壁组织的手术程序期间的一个主要挑战是实现对出血的控制。缝合控制、电灼和超声密封在例如肝或肾的手术期间经常是不足的。因此，像肝切除术或部分肾切除术的程序需要另外的方式来控制出血。为此，已经开发了多种局部止血产品并且在临床上使用。
6.lewis等人(control of bleeding in surgical procedures：critical appraisal of hemopatch(sealing hemostat)，dove press journal：medical devices evidence and research，22 dec.2015，1-9)描述了由合成的蛋白质反应性单体和胶原背衬组成的止血垫(hemopatch)。用蛋白质反应性单体覆盖活性侧：n-羟基琥珀酰亚胺官能化聚乙二醇(nhs-peg)。nhs-peg将胶原垫快速固定到组织以促进和维持止血。
7.schuhmacher等人(safety and effectiveness of a synthetic hemostatic patch for intraoperative soft tissue bleeding，med devices(auckl).2015；8：167
–
174)描述了由可吸收的背衬材料、氧化的纤维素和聚乙二醇水凝胶组成的止血贴片(veriset
tm
)。veriset
tm
止血贴片作为即用型贴片提供，所述即用型贴片将聚乙二醇侧向下应用于出血部位。
8.boerman等人(next generation hemostatic materials based on nhs-ester functionalized poly(2-oxazoline)s，biomacromolecules(2017)，18，2529-2538)描述了通过将n-羟基琥珀酰亚胺酯(nhs)官能化聚(2-噁唑啉)(nhs-pox)涂覆到明胶贴片上获得的合成的非生物活性止血产品，其通过在聚合物、宿主血液蛋白、明胶和组织之间形成共价交联来密封伤口部位并且防止手术期间出血。
9.us 2010/0233246描述了生物相容性聚合物装置，其包括用两部分反应性聚乙二醇粉末浸渍的胶原海绵或片，其中所述反应性粉末包括具有亲核基团的第一聚乙二醇和具有亲电基团的第二聚乙二醇，其中聚乙二醇粉末在干燥状态下保持非反应性。
10.wo 2010/059280描述了无水纤维片，其包含第一组分的纤维聚合物和第二组分，所述聚合物含有亲电基团或亲核基团，当所述片暴露于与生物组织接触的水性介质时，所述第二组分能够交联所述第一组分以形成交联水凝胶，所述交联水凝胶粘附至所述生物组织；其中：
11.a)其中第二组分是具有与第一组分的纤维聚合物相同或不同的主链结构的纤维
聚合物，并且如果第一组分含有亲核基团，则第二组分含有亲电基团，或者如果第一组分含有亲电基团，则第二组分含有亲核基团；
12.b)第二组分是第一组分的纤维聚合物上的涂层，并且其中如果第一组分含有亲核基团，则所述涂层含有亲电基团，或者如果第一组分含有亲电基团，则所述涂层含有亲核基团；或者
13.c)第二组分是分散和截留在第一组分的纤维聚合物的间隙内的干燥粉末，其中如果第一组分含有亲核基团，则所述粉末含有亲电基团，或者如果第一组分含有亲电基团，则所述粉末含有亲核基团。
14.us 2011/0250257描述了无水纤维片，其包含第一组分的纤维聚合物和第二组分，所述聚合物含有亲电基团或亲核基团，当所述片暴露于与生物组织接触的水性介质时，所述第二组分能够交联所述第一组分以形成交联水凝胶，所述交联水凝胶粘附至所述生物组织；其中所述第二组分是纤维聚合物，并且如果所述第一组分含有亲核基团，则所述第二组分含有亲电基团，或者如果所述第一组分含有亲电基团，则所述第二组分含有亲核基团；或者
15.第二组分是第一组分的纤维聚合物上的涂层，其中如果第一组分含有亲核基团，则所述涂层含有亲电基团，或者如果第一组分含有亲电基团，则所述涂层含有亲核基团；或者
16.第二组分是分散和截留在第一组分的纤维聚合物的间隙内的干燥粉末，其中如果第一组分含有亲核基团，则所述粉末含有亲电基团，或者如果第一组分含有亲电基团，则所述粉末含有亲核基团。
17.wo 2011/124640描述了制造止血海绵的方法，其包括：
18.a)提供包含干燥形式的生物材料的基质的海绵，
19.b)提供干燥粉末形式的一种反应性聚合物材料，
20.c)使a)和b)接触，使得b)的材料存在于所述海绵的至少一个表面上，以及
21.d)将b)的材料固定在a)的海绵上。
22.固定可以通过熔化足够长的时间段来实现。
23.wo 2012/057628描述了包含至少1重量％亲电活化聚噁唑啉(el-pox)的干物质的组织粘附性医疗产品，所述el-pox包含至少2个反应性亲电基团，包括至少一个侧链亲电基团。除了el-pox之外，医疗产品可以包含亲核活化的聚噁唑啉(nu-pox)。组织粘附性产品的实例包括粘附组织带、组织密封剂、止血多孔材料和植入物。
24.wo 2016/056901描述了选自经涂覆的网、经涂覆的泡沫或经涂覆的粉末的粘附性止血产品，所述止血产品包含：
25.·
多孔固体基材，其具有至少5体积％的孔隙率，并且包含外表面，所述外表面包含含有反应性亲核基团的亲核聚合物；
26.·
覆盖所述固体基材的至少一部分的粘附性涂层，所述涂层包含亲电活化的聚噁唑啉(el-pox)，所述el-pox包含平均至少1个反应性亲电基团。
27.所述粘附性止血产品通过包括以下步骤的方法生产：提供多孔固体基材；用包含el-pox和溶剂的涂料液体涂覆基材；并且去除溶剂。


技术实现要素：

28.本发明的发明人已经开发了一种生物相容性柔性止血片，其特别适于在腹腔镜手术程序期间防止出血。
29.根据本发明的止血片包含粘性纤维载体结构，该粘性纤维载体结构保持包含聚合物的小颗粒，该聚合物能够与宿主血液蛋白和组织共价结合，并由此诱导止血和/或组织粘附。因此，本发明的一个方面涉及生物相容性柔性止血片，其包含：
30.·
粘性纤维载体结构，其包括三维互连间隙空间；以及
31.·
分布在所述间隙空间内的多个反应性聚合物颗粒，其包含(i)携带至少三个反应性亲电基团的水溶性亲电聚合物，所述反应性亲电基团能够在形成共价键的情况下与组织和血液中的胺基团反应，以及(ii)含有至少两个反应性亲核基团的亲核交联剂，所述反应性亲核基团能够在形成共价键的情况下与亲电聚合物的反应性亲电基团反应，所述反应性聚合物颗粒具有0.5μm至100μm的直径并且以所述纤维载体结构的至少3重量％的量存在。
32.本发明的止血片包括粘性纤维载体结构，当血液可以穿透间隙空间时，该粘性纤维载体结构便利地吸收血液。这种纤维载体结构可以容易地用反应性聚合物颗粒浸渍。与用液体浸渍不同，这种干浸渍不影响载体结构的结构完整性或机械性能。当血液被本发明的止血片吸收时，一旦这些颗粒被血液“润湿”，反应性聚合物颗粒中的水溶性亲电聚合物就开始溶解，从而允许亲电聚合物与血液和组织中的反应性亲核基团以及亲核交联剂的反应性亲核基团反应，从而诱导血液凝固和组织密封，这两者都有助于止血。
33.尽管发明人不希望受到理论的束缚，但据信本发明的止血片的有利性质可归因于反应性聚合物颗粒分布在纤维载体结构中以产生最小的弯曲摩擦的事实，以及这些反应性聚合物颗粒由于小的粒径而在与血液或其它水性体液接触时迅速溶解的事实。因此，在将所述片应用到伤口部位上时，一方面反应性亲电聚合物与另一方面血液蛋白、组织和亲核交联剂之间发生快速共价交联，导致形成水凝胶，该水凝胶密封伤口表面并阻止出血，并且由于水凝胶中的反应性亲电基团和组织中的胺/硫醇基团之间形成共价键，该水凝胶可提供纤维片与组织的强粘附。纤维载体结构在应用期间和应用之后提供机械强度，并防止过度溶胀。
34.通过将携带反应性亲电基团的聚合物和亲核交联剂组合在单个颗粒中，确保了这两种反应性组分可以均匀地分布在整个止血片中，在运输和处理过程中不发生分离，并且当颗粒与血液接触时这些组分可以彼此立即反应。
35.由于其柔性，本发明的止血片可以适当地应用于不规则形状的出血部位。如果已经应用的片没有完全阻止出血，则可以将止血片一层一层地应用。
36.本发明的另一方面涉及制备止血片的方法，所述方法包括：
37.·
提供如上所定义的粘性纤维载体结构的片；
38.·
提供如上所定义的反应性聚合物颗粒；以及
39.·
将反应性聚合物颗粒分布在纤维载体结构的间隙空间内。
具体实施方式
40.因此，本发明的一个方面涉及生物相容性柔性止血片，其包含：
41.·
粘性纤维载体结构，其包括三维互连间隙空间；以及
42.·
分布在所述间隙空间内的多个反应性聚合物颗粒，其包含(i)携带至少三个反应性亲电基团的水溶性亲电聚合物，所述反应性亲电基团能够在形成共价键的情况下与组织和血液中的胺基团反应，以及(ii)含有至少两个反应性亲核基团的亲核交联剂，所述反应性亲核基团能够在形成共价键的情况下与亲电聚合物的反应性亲电基团反应，所述反应性聚合物颗粒具有0.5μm至100μm的直径并且以所述纤维载体结构的至少3重量％的量存在。
43.除非另有说明，如本文所用的术语“止血片”是指具有阻止受损组织出血的能力的片。本发明的止血片可以通过将血液转变成凝胶和/或通过形成封闭伤口部位的密封来实现止血。
44.如本文所用的术语“组织粘附性”是指止血片由于在片与组织之间形成共价键而附着至组织的能力。这些共价键的形成通常需要水的存在。
45.如本文所用的术语“间隙空间”是指纤维载体结构内的空隙(“空的”)空间。纤维载体结构内的间隙空间允许将反应性聚合物颗粒引入到结构中。血液和其它体液也可以进入间隙空间，允许反应性聚合物颗粒内的水溶性亲电聚合物和亲核交联剂溶解。
46.具有0.5至100μm的直径的反应性聚合物颗粒的浓度以纤维载体结构本身(即没有反应性聚合物颗粒)的重量％表示。
47.根据本发明使用的“携带反应性亲电基团的水溶性亲电聚合物”携带能够在形成共价键的情况下与组织和血液中的胺基团反应的至少三个反应性基团。该水溶性亲电聚合物具有至少1kda的分子量和至少50g/l的在20℃的蒸馏水中的溶解度。
48.如本文使用的术语“吸水能力”是止血片吸收水的能力的量度。通过以下方法测定吸水能力：称量干燥片的样品(重量＝wd)，然后将样品浸入蒸馏水(37℃)中持续45分钟。然后，将样品从水中取出，并且去除附着在基材外部的水，然后再次称量样品(重量＝ww)。吸水能力＝100％
×
(w
w-wd)/wd。吸水能力表示基材的孔隙率以及其在水的存在下溶胀的能力。
49.如本文使用的术语“胶原”是指动物体内各种结缔组织的细胞外间隙中的主要结构蛋白。胶原形成三条多肽链的特征性三螺旋。根据矿化程度，胶原组织可以是刚性的(骨)或顺应性的(腱)或具有从刚性至顺应性的梯度(软骨)。除非另外说明，术语“胶原”还包括除了明胶之外的改性胶原。
50.如本文使用的术语“明胶”是指通过从动物(例如家养的牛、鸡、猪和鱼)的皮肤、骨和结缔组织提取的胶原的部分水解产生的肽和蛋白质的混合物。在水解期间，各胶原链之间的天然分子键被分解成更容易重排的形式。
51.如本文使用的术语“聚噁唑啉”是指聚(n-酰基亚烷基亚胺)或聚(芳酰基亚烷基亚胺)，并且还被称为pox。pox的实例是聚(2-乙基-2-噁唑啉)。术语“聚噁唑啉”也涵盖pox共聚物。
52.反应性聚合物颗粒可以均匀地分布在纤维载体结构的间隙空间内，在某种意义上，颗粒密度在整个载体结构中基本上相同。反应性聚合物颗粒也可以不均匀地分布在整个载体结构中。例如，如果止血片以纤维载体结构薄层和反应性聚合物颗粒层的层压体的形式制备，则片内的反应性聚合物颗粒密度可能波动。对于某些应用，如果反应性聚合物颗
粒密度显示出梯度，例如，反应性颗粒的密度在片的旨在应用于出血伤口的一侧附近最低，而在片的另一侧附近最高，则可能是有利的。
53.反应性聚合物颗粒的直径分布可以适当地通过使用malvern mastersizer 2000结合不锈钢样品分散单元的激光衍射来测定。样品分散单元填充有约120ml的环己烷，其在1800rpm的搅拌速度下稳定5至10分钟，随后进行背景测量(空白测量)。将样品管摇动并且水平转动20次。然后，将约50mg分散在含有环己烷的样品分散单元中。在将样品引入分散单元之后，在进行测量之前，将样品在1800rpm下搅拌1.5分钟以确保所有颗粒被适当地分散。对分散的颗粒不进行超声处理。平均粒度表示为d[4,3]，体积加权平均直径表示为(σnidi4)/(σnidi3)。
[0054]
在特别优选的实施方案中，与us 2011/0250257中描述的纤维组织密封剂不同，本发明的止血片不形成水凝胶，即，可以吸收大量水以形成弹性凝胶的水溶胀性聚合物基质。
[0055]
根据特别优选的实施方案，本发明的止血片是可生物吸收的，这意味着载体结构、反应性聚合物颗粒和止血片的任何其它组分最终被吸收在体内。载体结构和反应性聚合物颗粒的吸收通常需要其中包含的聚合物的化学分解(例如水解)。人体对止血片的完全生物吸收通常在1至10周内，优选在2至8周内实现。
[0056]
根据另一个优选的实施方案，粘性纤维载体结构是耐水性的。这里，术语“耐水性”是指粘性纤维载体结构不是水溶性的，并且在中性ph条件(ph7)和37℃的温度下不会在水中崩解而形成胶态分散体。
[0057]
本发明的止血片通常具有0.5至25mm的非压缩平均厚度。更优选地，非压缩平均厚度为1至10mm，最优选为1.5至5mm。
[0058]
止血片的尺寸优选使得片的顶部和底部各自具有至少2cm2、更优选至少10cm2、最优选25至50cm2的表面积。通常，片的形状是矩形，并且具有25至200mm的长度，25至200mm的宽度。
[0059]
止血片优选具有小于200mg/cm3、更优选小于150mg/cm3、最优选10至100mg/cm3的非压缩密度。
[0060]
在本发明的一个实施方案中，反应性聚合物颗粒均匀分布在纤维载体结构的间隙空间内。在本发明的另一个实施方案中，止血片是包括交替的纤维载体结构层和反应性聚合物颗粒层的层压体。在后一个实施方案中，反应性聚合物颗粒优选已经进入分开反应性聚合物颗粒层的纤维载体结构层。
[0061]
本发明的止血片优选基本上是无水的。通常，止血片具有不超过5wt.％、更优选不超过2wt.％、最优选不超过1wt.％的含水量。
[0062]
止血片的吸水能力优选为至少50％、更优选为100％至800％、最优选为200％至500％。
[0063]
本发明的止血片优选是无菌的。
[0064]
在本发明的止血片中使用纤维载体结构提供了反应性聚合物颗粒可以毫无困难地均匀地分布在整个载体结构中的优点。这种均匀分布在例如发泡的载体结构中更难实现。
[0065]
纤维载体结构中的纤维优选具有1至500μm、更优选2至300μm、最优选5至200μm的平均直径。纤维的平均直径可以适当地使用显微镜来测定。
[0066]
典型地，纤维载体结构中至少50wt.％、更优选至少80wt.％的纤维具有1至300μm的直径和至少1mm的长度。
[0067]
优选地，纤维载体结构中至少50wt.％、更优选至少80wt.％的纤维具有至少1000的纵横比(长度与直径的比率)。
[0068]
根据本发明使用的纤维载体结构优选为毡结构、编织结构或针织结构。最优选地，纤维载体结构是毡结构。在此，术语“毡结构”是指通过将纤维纠缠和压制在一起以形成粘性材料而产生的结构。
[0069]
根据特别优选的实施方案，纤维载体结构是可生物降解的。
[0070]
纤维载体结构优选包含含有纤维聚合物的纤维，所述纤维聚合物选自纤维素、改性纤维素、羧甲基葡聚糖、聚(乳酸-共-乙醇酸)(plga)、透明质酸钠/羧甲基纤维素、聚乙烯醇及其组合。更优选地，纤维载体结构包括含有改性纤维素、甚至更优选氧化纤维素、最优选氧化再生纤维素的纤维。
[0071]
纤维载体结构优选包含至少50wt.％、更优选至少80wt.％、最优选至少90wt.％的含有上述纤维聚合物的纤维。
[0072]
在优选的实施方案中，纤维载体结构包含至少50wt.％、更优选至少80wt.％和最优选至少90wt.％的含有至少50wt.％纤维聚合物的纤维。
[0073]
在甚至更优选的实施方案中，纤维载体结构包含至少50wt.％、更优选至少80wt.％和最优选至少90wt.％的由改性纤维素制成的纤维，更优选由氧化纤维素制成的纤维，和最优选由氧化再生纤维素制成的纤维。
[0074]
包含在纤维载体结构中的纤维优选不包含携带反应性亲核基团的聚合物，所述反应性亲核基团能够在形成共价键的情况下与水溶性亲电聚合物的反应性亲电基团反应。同样，包含在纤维载体结构中的纤维优选不包含含有两个或更多个反应性亲核基团的亲核交联剂，所述亲核交联剂能够在形成共价键的情况下与水溶性亲电聚合物的反应性亲电基团反应。
[0075]
本发明包括再生氧化纤维素的使用和非再生氧化纤维素的使用，前者是优选的。氧化纤维素可以通过氧化剂的作用由纤维素生产。氧化纤维素除了含有起始材料的原始羟基外还含有羧酸。在氧化之前，纤维素可以保持未用未经组织的纤维再生，或者它可以再生以形成经组织的纤维。当用四氧化二氮处理纤维素纤维时，羟基被氧化成羧酸基团，产生聚糖醛酸。
[0076]
优选的纤维载体结构具有开孔结构，其对空气的渗透性为至少0.1l/min
×
cm2，更优选至少0.5l/min
×
cm2。根据en iso 9237:1995(纺织品-织物对空气的渗透性的测定)测定透气性。
[0077]
纤维载体结构中的纤维可以通过本领域已知的方法生产，例如电纺、电吹纺和高速旋转喷雾器纺丝。us 2015/0010612中描述了通过高速旋转喷雾器纺丝生产纤维载体结构。也可以使用市售的止血纤维片作为纤维载体结构。合适的商业产品的实例包括surgicel snow
tm
(来自johnson&johnson medical)、nu-knit
tm
(来自johnson&johnson medical)和(来自ethicon)。
[0078]
反应性聚合物颗粒优选以纤维载体结构的5至90重量％、更优选10至80重量％、甚至更优选20至75重量％、最优选50至70重量％的量存在于本发明的止血片中。
[0079]
反应性聚合物颗粒优选含有至少10wt.％的水溶性亲电聚合物。更优选地，反应性聚合物颗粒含有至少50wt.％、更优选至少90wt.％的亲电聚合物。
[0080]
分布在纤维载体结构的间隙空间内的反应性聚合物颗粒优选具有2至75μm、更优选1至50μm、最优选1至25μm的体积加权平均粒度。
[0081]
本发明的反应性聚合物颗粒可以以各种方式制备，例如通过研磨，通过喷雾干燥聚合物溶液，通过冷冻干燥，通过喷雾冷却聚合物熔体，通过使粉末混合物粒化，或通过流化床涂覆。
[0082]
水溶性亲电聚合物通常具有至少2kda、更优选至少5kda、最优选10至100kda的分子量。
[0083]
水溶性亲电聚合物在20℃的蒸馏水中的溶解度优选为至少100g/l、更优选至少200g/l。
[0084]
根据本发明使用的水溶性亲电聚合物优选含有至少4个反应性亲电基团、更优选至少8个反应性亲电基团、甚至更优选至少16个反应性亲电基团、最优选至少32个反应性亲电基团。
[0085]
止血片中的反应性聚合物颗粒优选包含携带反应性亲电基团的水溶性亲电聚合物，所述反应性亲电基团选自羧酸酯、磺酸酯、膦酸酯、五氟苯基酯、对硝基苯基酯、对硝基噻吩基酯、酰卤基团、酸酐、酮、醛、异氰酸根合、硫代异氰酸根合、异氰基、环氧化物、活化羟基基团、烯烃、缩水甘油醚、羧基、琥珀酰亚胺基酯、磺基琥珀酰亚胺基酯、马来酰亚氨基(马来酰亚胺基)、乙烯磺酰基、酰亚氨基酯、乙酰乙酸酯、卤代缩醛、邻二硫吡啶、二羟基-苯基衍生物、乙烯基、丙烯酸酯、丙烯酰胺、碘乙酰胺及其组合。更优选地，反应性亲电基团选自羧酸酯、磺酸酯、膦酸酯、五氟苯基酯、对硝基苯基酯、对硝基噻吩基酯、酰卤基团、酸酐、酮、醛、异氰酸根合、硫代异氰酸根合、异氰基、环氧化物、活化羟基基团、缩水甘油醚、羧基、琥珀酰亚胺基酯、磺基琥珀酰亚胺基酯、酰亚氨基酯、二羟基-苯基衍生物及其组合。甚至更优选地，反应性亲电基团选自卤代缩醛、邻二硫吡啶、马来酰亚胺、乙烯砜、二羟基苯基衍生物、乙烯基、丙烯酸酯、丙烯酰胺、碘乙酰胺、琥珀酰亚胺基酯及其组合。最优选地，反应性亲电基团选自马来酰亚胺、乙烯基、丙烯酸酯、丙烯酰胺、琥珀酰亚胺基酯、磺基琥珀酰亚胺基酯及其组合。
[0086]
可使用的琥珀酰亚胺基酯的实例包括琥珀酰亚胺基戊二酸酯、琥珀酰亚胺基丙酸酯、琥珀酰亚胺基琥珀酰胺、琥珀酰亚胺基碳酸酯、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯、二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)、双(2-琥珀酰亚氨基氧基羰氧基)乙基砜、3,3'-二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)、琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯、磺基琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯、磺基琥珀酰亚胺基-4-(n-马来酰亚氨基甲基)-环己烷-1-甲酸酯、二硫代双-磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯、二磺基琥珀酰亚胺基酒石酸酯；双[2-(磺基-琥珀酰亚胺基氧羰基氧乙基砜)]、乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)、二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)。
[0087]
可以使用的二羟基苯基衍生物的实例包括二羟基苯基丙氨酸、3,4-二羟基苯基丙氨酸(dopa)、多巴胺、3,4-二羟基氢化肉桂酸(doha)、去甲肾上腺素、肾上腺素和儿茶酚。
[0088]
存在于反应性聚合物颗粒中的水溶性亲电聚合物优选地选自聚噁唑啉、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨基甲酸酯(例如，如wo2017/171551中描述)及其组合。甚至更优选
地，亲电聚合物选自聚噁唑啉、聚乙二醇及其组合。最优选地，亲电聚合物是聚噁唑啉。
[0089]
包含反应性亲电基团的聚噁唑啉优选地衍生自其重复单元由下式(i)表示的聚噁唑啉：
[0090]
(chr1)mncor2[0091]
其中r2和每个r1独立地选自h、任选取代的c
1-22
烷基、任选取代的环烷基、任选取代的芳烷基、任选取代的芳基；并且m是2或3。
[0092]
优选地，式(i)中的r1和r2选自h和c
1-8
烷基，甚至更优选地选自h和c
1-4
烷基。r1最优选为h。式(i)中的整数m优选等于2。
[0093]
根据优选实施方案，聚噁唑啉是聚合物，甚至更优选是2-烷基-2-噁唑啉的均聚物，所述2-烷基-2-噁唑啉选自2-甲基-2-噁唑啉、2-乙基-2-噁唑啉、2-丙基-2-噁唑啉、2-丁基-2-噁唑啉及其组合。优选地，聚噁唑啉是2-丙基-2-噁唑啉或2-乙基-噁唑啉的均聚物。最优选地，聚噁唑啉是2-乙基-噁唑啉的均聚物。
[0094]
根据特别优选的实施方案，携带反应性亲电基团的亲电聚合物包含至少20个噁唑啉单元、更优选至少30个噁唑啉单元、最优选至少80个噁唑啉单元。亲电聚合物优选每个噁唑啉残基包含平均至少0.05个反应性亲电基团。甚至更优选地，亲电聚合物每个噁唑啉残基包含平均至少0.1个反应性亲电基团。最优选地，亲电聚合物每个噁唑啉残基包含平均0.12至0.5个反应性亲电基团。
[0095]
亲电聚合物通常携带平均至少10个、更优选至少20个反应性亲电基团。
[0096]
聚噁唑啉可以在其侧链中携带反应性亲电基团(侧链反应性亲电基团)，在其末端携带反应性亲电基团，或在其侧链和末端携带反应性亲电基团。根据本发明使用的聚噁唑啉有利地含有一个或多个侧链反应性亲电基团。通常，聚噁唑啉每单体含有0.03至0.5个侧链反应性亲电基团，更优选每单体含有0.04至0.35个侧链反应性亲电基团，甚至更优选每单体含有0.05至0.25个侧链反应性亲电基团。
[0097]
根据本发明应用的包含反应性亲电基团的聚乙二醇(peg)优选是多臂peg或星形peg，其包含至少3个臂，更优选至少4个臂，所述臂用反应性亲电基团封端。
[0098]
反应性聚合物颗粒中的亲核交联剂通常含有至少3个反应性亲核基团，更优选至少5个反应性亲核基团，甚至更优选至少10个反应性亲核基团，最优选至少20个反应性亲核基团。
[0099]
亲核交联剂的反应性亲核基团优选选自胺基团、硫醇基团、膦基团及其组合。更优选地，这些反应性亲核基团选自胺基团、硫醇基团及其组合。甚至更优选地，反应性亲核基团是胺基团。这些胺基团优选选自伯胺基团、仲胺基团及其组合。最优选地，胺基团是伯胺基团。
[0100]
亲核交联剂优选具有至少1wt.％，更优选5-10wt.％和最优选15-25wt.％的氮含量。
[0101]
在本发明的一个实施方案中，亲核交联剂是分子量小于1,000g/mol、更优选小于700g/mol、最优选小于400g/mol的低分子量多胺。合适的低分子量多胺的实例包括二赖氨酸；三赖氨酸；四赖氨酸；五赖氨酸；二半胱氨酸；三半胱氨酸；四半胱氨酸；五半胱氨酸；包含两个或更多个选自赖氨酸、鸟氨酸、半胱氨酸、精氨酸及其组合的氨基酸残基和其它氨基酸残基的寡肽；精胺；三(氨基甲基)胺；精氨酸及其组合。
[0102]
根据本发明的另一个实施方案，亲核交联剂是高分子量(》1,000g/mol)多胺，选自亲核活化的pox(nu-pox)；胺官能化的聚乙二醇、壳聚糖；壳聚糖衍生物(例如，如wo 2009/028965中所述的二羧基衍生的壳聚糖聚合物)、聚乙烯亚胺；聚乙烯胺；聚烯丙基胺；胺官能化的聚(甲基)丙烯酸酯；含有胺官能部分的糖，例如氨基糖苷；包含两个或更多个选自赖氨酸、鸟氨酸、半胱氨酸、精氨酸及其组合的氨基酸残基的多肽；及其组合。天然来源的或重组的白蛋白是可以适当地作为多肽使用的多肽的实例。4,6-二取代脱氧链霉胺(卡那霉素a、阿米卡星、妥布霉素、地贝卡星、庆大霉素、西索米星、奈替米星)、4,5-二取代脱氧链霉胺(新霉素b、c和新霉素e(巴龙霉素))和非脱氧链霉胺氨基糖苷，例如链霉素，是可以使用的氨基糖苷的实例。最优选地，高分子量多胺是nu-pox。
[0103]
在本发明的另一个实施方案中，在交联聚合物中使用的亲核交联剂是包含2个或更多个硫醇基团的低分子量多硫醇，所述低分子量多硫醇具有小于1,000g/mol、更优选小于700g/mol、最优选小于400g/mol的分子量。合适的低分子量多胺的实例包括三巯基丙烷、乙二硫醇、丙二硫醇、2-巯基乙基醚、2,2'-(亚乙二氧基)二乙硫醇、四(乙二醇)二硫醇、五(乙二醇)二硫醇、六乙二醇二硫醇；硫醇改性的季戊四醇、二季戊四醇、三羟甲基丙烷或双三羟甲基丙烷；含有至少两个半胱氨酸残基的寡肽。
[0104]
根据本发明的又一个实施方案，在交联聚合物中使用的亲核交联剂是高分子量(》1,000g/mol)多硫醇，选自：包含至少两个硫醇基团的nu-pox；硫醇官能化的聚(甲基)丙烯酸酯；含有硫醇官能部分的多糖，含有两个或更多个半胱氨酸残基的多肽。
[0105]
优选地，亲核交联剂是高分子量多胺，选自：亲核活化的pox(nu-pox)；胺官能化的聚乙二醇、壳聚糖；壳聚糖衍生物，聚乙烯亚胺；聚乙烯胺；聚烯丙基胺；胺官能化的聚(甲基)丙烯酸酯；含有胺官能部分的糖；包含两个或更多个选自赖氨酸、鸟氨酸、半胱氨酸、精氨酸及其组合的氨基酸残基的多肽；及其组合。更优选地，亲核交联剂选自nu-pox；胺官能化的聚乙二醇；明胶、胶原、壳聚糖及其组合。
[0106]
壳聚糖是甲壳质(聚-n-乙酰基-d-葡糖胺)的可生物降解的、无毒的、复合碳水化合物衍生物，甲壳质是天然存在的物质。壳聚糖是脱乙酰化形式的甲壳质。根据本发明应用的壳聚糖优选具有大于70％的脱乙酰度。
[0107]
高分子量多胺优选包含三个或更多个胺基团，更优选包含10个或更多个胺基团，最优选包含20个或更多个胺基团。
[0108]
根据特别优选的实施方案，亲核交联剂选自明胶、胶原、壳聚糖及其组合。甚至更优选地，亲核交联剂选自明胶、胶原及其组合，明胶是最优选的。明胶优选以交联明胶的形式，最优选以减少交联的明胶的形式应用于反应性聚合物颗粒中。减少交联的明胶是已经部分水解的交联明胶(gelfoam)。交联明胶中肽键的部分水解可以通过例如碱性处理来实现。交联明胶的水解导致增加的游离羧基和游离胺基团的密度和增加的水溶性。
[0109]
根据优选的实施方案，亲核交联剂含有两个或更多个反应性胺基团，并且亲电聚合物的反应性亲电基团选自羧酸酯、磺酸酯、膦酸酯、五氟苯基酯、对硝基苯基酯、对硝基噻吩基酯、酰卤基团、酸酐、酮、醛、异氰酸根合、硫代异氰酸根合、异氰基、环氧化物、活化羟基、缩水甘油基醚、羧基、琥珀酰亚胺基酯、磺基琥珀酰亚胺基酯、酰亚氨基酯、二羟基-苯基衍生物及其组合。
[0110]
根据另一个优选的实施方案，亲核交联剂含有两个或更多个反应性硫醇基团，并
且亲电聚合物的反应性亲电基团选自卤代缩醛、邻二硫吡啶、马来酰亚胺、乙烯砜、二羟基苯基衍生物、乙烯基、丙烯酸酯、丙烯酰胺、碘乙酰胺、琥珀酰亚胺基酯、磺基琥珀酰亚胺基酯及其组合。更优选地，反应性亲电基团选自琥珀酰亚胺基酯、磺基琥珀酰亚胺基酯、卤代缩醛、马来酰亚胺或二羟基苯基衍生物及其组合。最优选地，反应性亲电基团选自马来酰亚胺或二羟基苯基衍生物及其组合。
[0111]
除水溶性亲电聚合物和亲核交联剂外，反应性聚合物颗粒可适当地含有选自葡聚糖、藻酸盐、氧化纤维素(包括氧化再生纤维素(orc))、羟乙基纤维素、羟甲基纤维素、透明质酸的多糖；及其组合。优选地，这种多糖以至少15wt.％、更优选至少25wt.％和最优选至少50wt.％的浓度包含在反应性聚合物颗粒中。
[0112]
含有水溶性亲电聚合物和亲核交联剂的反应性聚合物颗粒可以通过湿法制粒和随后干燥，优选在减压下制备。应该选择粒化液体，使得在亲电聚合物与亲核交联剂之间的粒化期间很少或不发生反应。这可以例如通过使用这两种组分中的至少一种不溶于其中的粒化液体来实现。最优选地，携带反应性亲电基团的水溶性聚合物不溶于粒化液体。
[0113]
根据特别优选的实施方案，反应性聚合物颗粒是颗粒附聚物，其包含：(i)含有水溶性亲电聚合物的亲电颗粒；和(ii)含有亲核交联剂的亲核颗粒。
[0114]
亲电颗粒优选含有至少30wt.％，更优选至少50wt.％和最优选至少80wt.％的水溶性亲电聚合物。
[0115]
亲核颗粒优选含有至少30wt.％，更优选至少50wt.％和最优选至少80wt.％的亲核交联剂。
[0116]
通常，根据该实施方案的反应性杂化颗粒具有以下组成：
[0117]
(a)25wt.％至75wt.％的水溶性亲电聚合物；
[0118]
(b)25wt.％至75wt.％的亲核交联剂；
[0119]
(c)0wt.％至50wt.％多糖；
[0120]
其中组分(a)至(c)的组合一起构成反应性聚合物颗粒的至少80重量％，更优选至少90重量％。根据特别优选的实施方案，在该实施方案中使用的亲电聚合物是聚噁唑啉(el-pox)。
[0121]
反应性聚合物颗粒优选按以下量含有水溶性亲电聚合物和亲核交联剂：使得由水溶性亲电聚合物提供的反应性亲电基团的总数与由亲核交联剂提供的反应性亲核基团的总数之间的比率为1:1.5至1.5:1，更优选1:1.2至1.2:1，并且最优选1:1.1至1.1:1。
[0122]
根据另一个有利的实施方案，反应性聚合物颗粒含有干燥缓冲体系。优选地，缓冲体系的缓冲ph为7至11、更优选为8至10。优选地，缓冲体系具有至少10mmol.l-1
.ph-1
的缓冲能力。更优选地，缓冲能力为至少25mmol.l-1
.ph-1
，最优选缓冲能力为至少50mmol.l-1
.ph-1
。
[0123]
根据本发明的特别优选的实施方案，纤维载体结构包含含有氧化纤维素的纤维，并且反应性聚合物颗粒含有与亲核交联剂组合的el-pox。优选地，亲核交联剂选自nu-pox；胺官能化的聚乙二醇；明胶；胶原及其组合。
[0124]
在另一个优选的实施方案中，反应性聚合物颗粒含有至少25wt.％，最优选至少50wt.％的明胶，优选为减少交联的明胶的形式。
[0125]
本发明人出乎意料地发现，通过使用含有1至20wt.％、更优选2.5至15wt.％、最优选5至10wt.％的非反应性非离子聚合物的反应性聚合物颗粒，可以获得具有特别理想的粘
附性质的止血片。该非反应性非离子聚合物不含有反应性亲电基团或反应性亲核基团。
[0126]
在非常优选的实施方案中，用非反应性非离子聚合物涂覆反应性聚合物颗粒。
[0127]
非反应性非离子聚合物的熔点优选为40至70℃、更优选45至65℃、最优选50至60℃。在此，熔点是指聚合物完全熔融时的温度。
[0128]
可适用于本发明的反应性聚合物颗粒的非反应性非离子聚合物的实例包括泊洛沙姆、聚乙二醇及其组合。泊洛沙姆是非离子三嵌段共聚物，其由聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))的中心疏水链与聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))的两个亲水链侧接组成，并且由式(i)表示：
[0129][0130]
其中a是10至110的整数并且b是20至60的整数。当a是80且b是27时，该聚合物被称为泊洛沙姆188。可用于本发明的其它已知的泊洛沙姆是泊洛沙姆237(a＝64；并且b＝37)、泊洛沙姆338(a＝141；并且b＝44)和泊洛沙姆407(a＝101；并且b＝56)。其它已知的且可用于本发明的泊洛沙姆包括泊洛沙姆108、泊洛沙姆182、泊洛沙姆183、泊洛沙姆212、泊洛沙姆217、泊洛沙姆238、泊洛沙姆288、泊洛沙姆331、泊洛沙姆338和泊洛沙姆335。
[0131]
根据特别优选的实施方案，非反应性非离子聚合物是泊洛沙姆，甚至更优选平均分子量为2,000至18,000的泊洛沙姆、最优选平均分子量为7,000至10,000的泊洛沙姆。
[0132]
应用于颗粒附聚物中的泊洛沙姆优选在室温下是固体。
[0133]
本发明的另一方面涉及含有一个或多个根据本发明的止血片的密封包装。
[0134]
本发明的又一方面涉及制备止血片的方法，所述方法包括：
[0135]
·
提供如上定义的粘性纤维载体结构的片；
[0136]
·
提供如上定义的反应性聚合物颗粒；以及
[0137]
·
将反应性聚合物颗粒分布在纤维载体结构的间隙空间内。
[0138]
反应性聚合物颗粒可以使用干法或湿法分布在间隙空间内，优选干法。在干法中，反应性聚合物颗粒以粉末的形式应用，并且该粉末以干燥形式分散遍及间隙空间。
[0139]
根据这种干法的一个优选实施方案，通过摇动或振动纤维载体结构的片将反应性聚合物颗粒分布在纤维载体结构的间隙空间内。
[0140]
根据干法的另一个实施方案，止血片通过层压方法制备，所述层压方法包括：
[0141]
a)提供纤维载体结构的片，
[0142]
b)将反应性聚合物颗粒的层沉积到纤维载体结构的片上；
[0143]
c)将另一个纤维载体结构的片叠加到反应性聚合物颗粒的层上；以及
[0144]
任选地重复步骤b)和步骤c)一次或多次。
[0145]
通过摇动或振动层压体可以促进如此获得的层压体内的反应性聚合物颗粒的分布。
[0146]
在分布反应性聚合物颗粒的湿法中，反应性聚合物颗粒在低沸点有机液体中的分散体用于浸渍纤维载体结构，随后蒸发低沸点有机液体，优选在减压下蒸发。通常，低沸点有机液体在大气压下的沸点小于150℃、更优选小于98℃、最优选小于80℃。
[0147]
优选地，在本方法中，将含有分布的反应性聚合物颗粒的载体结构加热至高于水溶性亲电聚合物的玻璃温度的温度至少5分钟。通过以这种方式加热反应性聚合物颗粒，颗粒将变粘稠并且粘附至纤维载体结构。通常，将聚合物颗粒加热至至少40℃、更优选50至80℃的温度至少15分钟。
[0148]
本方法优选包括对止血片进行灭菌。止血片可以在无菌包装之前灭菌。或者，可以在密封包装内对片进行灭菌。
[0149]
通过以下非限制性实施例进一步说明本发明。
[0150]
实施例
[0151]
通常：无论何处未明确提及干燥后的残余水分含量(在干燥粉末、颗粒和/或粘性纤维载体结构中)，水平低于2.0％w/w。
[0152]
nhs-pox的制备
[0153]
含有20％nhs-酯基团的nhs侧链活化的聚[2-(乙基/羟基-乙基-酰胺-乙基/nhs-酯-乙基-酯-乙基-酰胺-乙基)-2-噁唑啉]三元共聚物(＝el-pox，20％nhs)如下合成：
[0154]
使用60％2-乙基-2-噁唑啉(etox)和40％2-甲氧基羰基-乙基-2-噁唑啉(mestox)通过crop合成聚[2-(乙基/甲氧基-羰基-乙基)-2-噁唑啉]共聚物(dp＝ /-100)。获得含有40％2-甲氧基羰基-乙基的统计共聚物(1h-nmr)。
[0155]
其次，含有40％2-甲氧基羰基-乙基的聚合物与乙醇胺反应，得到具有40％2-羟基-乙基-酰胺-乙基的共聚物(1h-nmr)。此后，根据1h-nmr，使一半的2-羟基-乙基-酰胺-乙基与琥珀酸酐反应，得到具有60％2-乙基、20％2-羟基-乙基-酰胺-乙基和20％2-羧基-乙基-酯-乙基-酰胺-乙基的三元共聚物。最后，用n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和二异丙基碳二亚胺(dic)活化2-羧基-乙基-酯-乙基-酰胺-乙基，得到el-pox，20％nhs。根据1h-nmr，nhs-pox含有20％nhs-酯基团。将nhs-pox在2℃至8℃下溶解在水中(60g在300ml中)，在-80℃冷却半小时并冷冻干燥。将如此获得的冷冻干燥的粉末在旋转蒸发器中在40℃下干燥直至通过karl fischer滴定测定的水含量低于0.8％w/w。使用球磨机(retch mm400)研磨该干燥(白色)粉末，直至平均粒度不超过40μm(d[4,3])，并且真空密封在alu-alu袋中。
[0156]
nhs-pox粉末的染色
[0157]
将20克的nhs-pox粉末溶解在水中，并且使用高性能分散仪器(ultra-turrax，ika)与50mg brilliant blue r(sigma aldrich)混合。在混合(2分钟)后立即将溶液在-78℃下冷冻，随后冷冻干燥过夜。将如此获得的冷冻干燥的粉末在旋转蒸发器中在40℃下干燥直至通过karl fischer滴定测定的残余水含量低于0.8％w/w。然后，使用球磨机(retch mm400)研磨干燥的(蓝色)粉末，直至蓝色染色的nhs-pox粉末具有不超过40μm(d[4,3])的平均粒度，并且真空密封在alu-alu袋中。
[0158]
nu-pox的制备
[0159]
通过etox和mestox的crop合成在烷基侧链中含有乙基和胺基团的聚噁唑啉，随后用乙二胺对甲基酯侧链进行酰胺化以得到聚(2-乙基/氨基乙基酰氨基乙基-2-噁唑啉)共聚物(nu-pox)。根据1h-nmr，nu-pox含有10％nh2。将nu-pox在2℃至8℃下溶解在水中(60g在300ml中)，在-80℃冷却半小时并冷冻干燥。将如此获得的冷冻干燥的粉末在旋转蒸发器中在40℃下干燥直至通过karl fischer滴定测定的水含量低于0.8％w/w。将该干燥粉末在台式研磨机中研磨直至平均粒度不超过100μm(d[4,3])，并且真空密封在alu-alu袋中。
[0160]
制备反应性nhs-pox/nu-pox颗粒
[0161]
在高剪切混合器中用异丙醇(ipa)润湿蓝色或白色(未染色的)nhs-pox粉末，直至获得含有约1至2％w/w ipa的均匀雪花状粉末。此后，添加nu-pox粉末并且混合。将润湿的蓝色nhs-pox粉末与nu-pox粉末以1:0.6的摩尔比混合，所述摩尔比是指由nhs-pox提供的nhs基团的数量与由nu-pox提供的胺基团的数量的比率。还将润湿的未染色nhs-pox粉末与nu-pox粉末以其它摩尔比(1:0.8；1:1和1:1.2)混合。
[0162]
混合后，将湿颗粒在减压下干燥直至ipa含量小于0.1％w/w，如经由1h-nmr测定的。使用球磨机(retch mm400)研磨干燥的颗粒，直至平均粒度不超过50μm(d[4,3])，并且真空密封在alu-alu袋中。
[0163]
如此获得的颗粒的粒度分布大约为：90vol％《20μm,70vol％《10μm和40vol％《5μm。
[0164]
使用1h-nmr光谱分析nhs-pox/nu-pox颗粒(1:1)。将25mgd的颗粒通过超声20分钟溶解在三氟乙酸(0.20ml)中。在颗粒完全溶解后，用含有马来酸(2.5mg/ml)作为内标的氘化二甲亚砜(dmso-d6)(0.80ml)稀释样品，转移至nmr管并且记录1h-nmr光谱。根据获得的光谱，可以计算与nhs-pox结合的nhs的量，以及颗粒中存在的nhs和胺基团的摩尔比。颗粒中与nhs-pox结合的nhs的量等于与nhs-pox起始材料结合的nhs的量，表明在粒化期间没有衰减或交联。
[0165]
使用已知量的内标(马来酸)和由不同浓度的nhs-pox和nu-pox记录的1h-nmr光谱构建的校准曲线测定nmr样品中的总聚合物回收率，即nhs-pox和nu-pox的组合。测得总聚合物回收率为99％，表明没有形成不溶性交联材料。
[0166]
通过尺寸排阻色谱法进一步分析nhs-pox/nu-pox颗粒(1:1)。将20mg的颗粒用乙酸酐(1.00ml)在50℃下处理1小时。随后，添加甲醇(2.00ml)，并且将混合物在50℃下再搅拌1小时。取等分试样(0.75ml)，并且在减压下去除所有挥发物。将样品吸收在含有50mm氯化锂的n,n-二甲基乙酰胺(2.50ml)中，其为用于sec分析的洗脱液。相对于聚(甲基丙烯酸甲酯)标准物测量sec，并且根据获得的尺寸排阻色谱图确定mn、mw和pdi。pdi不超过1.5，表明在粒化期间没有发生交联。该尺寸排阻色谱方法的分析验证表明0.05mol％水平的nhs-pox与nu-pox的有意交联将pdi增加至超过2.5。
[0167]
反应性nhs-pox/nu-pox/p188颗粒的制备
[0168]
反应性nhs-pox/nu-pox颗粒如前所述进行制备。随后，通过将nhs-pox/nu-pox颗粒与p188粉末一起在高剪切混合器中在65℃加热10分钟，随后冷却至环境条件，制备p188涂覆的反应性nhs-pox/nu-pox颗粒(2.5％w/w或5％w/w p188)。使用球磨机(retch mm400)研磨涂覆的颗粒，直至平均粒度不超过40μm(d[4,3])，并且真空密封在alu-alu袋中。
[0169]
如此获得的颗粒的粒度分布为约：90vol.％《80μm，50vol.％《40μm并且10vol.％《10μm。
[0170]
使用1h-nmr光谱分析nhs-pox/nu-pox/p188(2.5％)颗粒。将25mg的粉末通过超声20分钟溶解在三氟乙酸(0.20ml)中。在颗粒完全溶解后，用氘化二甲亚砜(dmso-d6)(0.80ml)稀释样品，转移至nmr管并且记录1h-nmr光谱。根据获得的光谱，与nhs-pox相比计算未反应的nhs的量为98％。
[0171]
通过尺寸排阻色谱法进一步分析nhs-pox/nu-pox/p188(2.5％)颗粒。将20mg的颗
粒用乙酸酐(1.00ml)在50℃下处理1小时。随后，添加甲醇(2.00ml)，并且将混合物在50℃下再搅拌1小时。取等分试样(0.75ml)，并且在减压下去除所有挥发物。将样品吸收在含有50mm氯化锂的n,n-二甲基乙酰胺(2.50ml)中，其为用于sec分析的洗脱液。相对于聚(甲基丙烯酸甲酯)标准物测量sec，并且从获得的尺寸排阻色谱图确定mn、mw和pdi。pdi不超过1.5，表明在粒化期间没有发生交联。
[0172]
减少交联的明胶(rxl)的制备
[0173]
根据三种程序制备减少交联的明胶(rxl)：
[0174]
·
通过在40℃下搅拌2小时，将12g的明胶粉末(gelita medical gmbh)溶解在350ml的0.1摩尔氢氧化钠水溶液中。获得澄清溶液后，使混合物冷却至环境温度，并且通过添加32.5ml的1.0摩尔盐酸水溶液将ph调节至7。使用液氮快速冷冻溶液并且冷冻干燥。随后，将粉末在咖啡研磨机中研磨，在减压下干燥并且真空密封在alu-alu袋中。此后，这种减少交联的明胶将被称为rxl-ls(低盐)。
[0175]
·
通过在40℃下搅拌10分钟，将12g的明胶粉末(gelita medical gmbh)溶解在360ml的1.0摩尔氢氧化钠水溶液中。将获得的澄清溶液冷却至环境温度，并且通过添加30ml的浓盐酸溶液(37％w/w)将ph降低至7。使用液氮快速冷冻溶液并且冷冻干燥。随后，将粉末在咖啡研磨机中研磨，在减压下干燥并且真空密封在alu-alu袋中。此后，这种减少交联的明胶将被称为rxl-hs(高盐)。
[0176]
反应性nhs-pox/rxl颗粒(低盐和高盐)的制备
[0177]
如下制备nhs-pox/rxl反应性颗粒：在高剪切混合器中用ipa润湿5g的蓝色nhs-pox粉末，直至获得含有约1至2％w/w ipa的均匀雪花状粉末。此后，添加5g的rxl、rxl-ls或rxl-hs粉末并且混合。混合后，将湿颗粒在减压下干燥直至ipa含量小于0.1％w/w，如经由1h-nmr测定的。将干燥的颗粒在咖啡研磨机中研磨，直至平均粒度不超过90μm(d[4,3])，并且真空密封在alu-alu袋中。
[0178]
如此获得的颗粒的粒度分布为约：90vol.％《190μm，50vol.％《60μm并且10vol.％《15μm。
[0179]
通过1h-nmr光谱分析来分析含有rxl的颗粒。为此，将含有5％(v/v)乙酸的氘化氯仿(cdcl3)(1.0ml)添加至25mg的颗粒中。通过超声处理样品20分钟选择性地提取nhs-pox。使分散体通过0.22μm过滤器，转移至nmr管并且记录1h-nmr光谱。根据获得的光谱，与nhs-pox相比计算未反应的nhs的量为98％。
[0180]
使用三甲基硅烷作为内标和由不同浓度的nhs-pox的1h-nmr光谱构建的校准曲线测定nmr样品中nhs-pox的回收率。测得总nhs-pox回收率为100％，表明没有形成不溶性交联材料。
[0181]
通过尺寸排阻色谱法进一步分析nhs-pox/rxl颗粒。因此，从用于1h-nmr光谱分析的溶液中取得等分试样(0.15ml)。将该溶液用含有50mm氯化锂(1.00ml)的n,n-二甲基乙酰胺稀释，其为用于sec分析的洗脱液。相对于聚(甲基丙烯酸甲酯)标准物测量sec，并且根据获得的尺寸排阻色谱图确定mn、mw和pdi。pdi不超过1.5，再次表明在粒化期间没有发生交联。
[0182]
含有碳酸盐的反应性nhs-pox/rxl颗粒的制备
[0183]
首先，通过将25.31g的碳酸钠和20.06g的碳酸氢钠溶解在350ml超纯水中，来制备
碳酸钠和碳酸氢钠的1:1摩尔/摩尔混合物。将溶液在液氮中快速冷冻并且冷冻干燥。将所得粉末在减压下干燥并且真空密封在alu-alu袋中。
[0184]
如下制备nhs-pox/rxl/碳酸盐颗粒：使用高剪切混合器混合5g的rxl-ls或rxl-hs和0.178g的碳酸钠/碳酸氢钠。然后，添加含有约1至2％w/w ipa的5g的蓝色nhs-pox并且混合直至获得均匀粉末。混合后，将湿颗粒在减压下干燥直至ipa含量小于0.1％w/w，如经由1h-nmr测定的。将干燥的颗粒在咖啡研磨机中研磨，直至平均粒度不超过100μm(d[4,3])，并且真空密封在alu-alu袋中。
[0185]
反应性nhs-peg/rxl(低盐)颗粒的制备
[0186]
将0.62克的rxl-ls与0.88克的nhs-peg 4-臂mw10k(来自creative pegworks)在研杵和研钵中混合，直至获得均匀的粉末；加入约2滴的ipa并混合。混合后，将颗粒在减压下干燥并真空密封在alu-alu袋中。
[0187]
含有碳酸盐的反应性nhs-peg/rxl(低盐)颗粒的制备
[0188]
将0.62克的rxl-ls与0.12克的冷冻干燥的碳酸钠和碳酸氢钠的1:1摩尔/摩尔混合物在研杵和研钵中混合，直到获得均匀的粉末。接着，将0.84克的nhs-peg 4-臂mw10k(来自creative pegworks)与rxl/碳酸盐粉末混合；加入约2滴的ipa并混合。在获得均匀的颗粒后，将其在减压下干燥并真空密封在alu-alu袋中。
[0189]
粘性纤维载体结构
[0190]
在根据本发明制备止血片中，选择以下市售止血产品用作纤维载体结构：
[0191]
·
snow
tm
：粘性纤维载体结构，其由通过受控氧化再生纤维素(orc)制备的纤维的可吸收非织造织物组成。尺寸为5.1cm
×
10.2cm，水含量不超过2.0％w/w
[0192]
·
snow
tm-hybrid：通过受控氧化再生纤维素(orc)制备的纤维的致密针织可吸收织物，其以若干尺寸(例如，15.2cm
×
22.9cm)针织在snow
tm
上，切割成5.1cm
×
10.2cm的尺寸。
[0193]
·
如下制备由氧化再生纤维素(orc)和polyglactin 910组成的粘性纤维载体结构，其尺寸(长度，宽度)为97.0至102.5mm，厚度为1.40至2.50mm。将聚(乙交酯-共-丙交酯)(pgl，90/10mol/mol)熔纺成纤维。将80旦尼尔复丝纱固结成800旦尼尔固结纱。将固结的纱线在约110℃下卷曲。将卷曲的纱线切成长度为约1.25“的短纤维。精确称量20g卷曲的短纤维并均匀地放置在多辊梳理机的进料传送带上。控制环境条件(温度：21℃/55％rh)。然后对短纤维进行梳理以产生非织造棉絮。将棉絮从拾取辊上取下并切成4个相等的部分。垂直于收集方向将它们重新送入载体。在第二次通过之后，将棉絮称重(19.8g:99％织物产率)，然后压实成毡。将密实毡精确地铺在orc织物上，并通过针刺设备中的2个通道牢固地连接。将多层织物修整并在3个离散的异丙醇浴中冲洗以除去纺丝整理剂和任何机油。将洗过的多层织物在烘箱中在70℃下干燥30分钟，冷却并称重。含水量不超过2.0％w/w
[0194]
出血实验
[0195]
·
使用标准化的离体和体内猪出血模型来评估止血功效。所有模型使用肝素将血液的凝固时间增加至活化凝固时间(act)的约2至3倍。
[0196]
·
离体模型：将来自屠宰场的肝素化新鲜血液灌注具有新鲜肝脏的活的离体猪模型，以尽可能接近地模拟真实的体内情况。将肝脏安装在灌注机上，通过灌注机进行氧合作
用，将血液的ph、温度和血压保持在体内边界内。在屠宰场收集两个肝脏和10升肝素化血液(5000单位/l)。肝脏用冰运输；血液在环境温度下运输。在收集后2小时内，针对用手套和氰基丙烯酸酯胶封闭的肝脏检查损伤。
[0197]
·
灌注参数：流速600ml/min；压力10至12mmhg；温度37℃( /-1℃)；卡波原0.25升/分钟
[0198]
·
使用平的圆形旋转磨具，在肝脏表面上形成圆形出血伤口(8mm直径)，使用橡胶外置物，使得穿孔出血的深度总是3mm
[0199]
·
在肝脏适当灌注(颜色和温度检查)后，根据以下程序测试样品：将样品切割成正确的尺寸(2.7
×
2.7cm)；照相机打开；照相机上的位点数量；活检穿孔8mm；切下活组织；用纱布(2x)从出血中去除血液；在预称重的纱布中收集血液30秒；对出血进行评分(由2位研究人员评分)；将样品用预润湿的纱布(盐水)放置在出血处上，并且在小压力下保持1分钟；观察5分钟(检查并评分粘附性和止血)并且在30分钟后重复。
[0200]
体内模型：在经麻醉的猪(家猪，雄性，体重范围：40kg，成年)中造成标准化组合的穿透性脾脏破裂。进行中线剖腹术以通达脾脏和其它器官。使用手术刀，进行n＝3(s1
…
s3)囊下标准化损伤(10mm
×
10mm)。通过预润湿的纱布(盐水)在温和的压力下应用止血产品并保持1分钟。在应用产品后，评估止血时间(tth)。如果tth等于零，这意味着在1分钟压力后已经实现了止血。
[0201]
用于贴片的评分体系：凝固
[0202][0203][0204]
用于贴片的评分体系：应用后10分钟的粘附性
[0205][0206]
实施例1
[0207]
用染色的聚合物颗粒浸渍载体结构
[0208]
将振动筛式摇动器as300(retsch)操作两个连续的各自5分钟的周期，以将染色的nhs-pox粉末引入不同的载体结构中。在生产之后，将止血贴片包装在含有1g的二氧化硅的
alu-alu袋中并且真空密封。
[0209]
使用上述摇动机，将蓝色nhs-pox粉末引入三种不同的载体结构中：
[0210]
·
明胶泡沫(gelitagelita medical germany)，海绵
[0211]
·
胶原泡沫(mbp，德国)，海绵
[0212]
·
纤维载体结构(snow
tm
，ethicon，usa)
[0213]
发现在摇动处理后，蓝色nhs-pox粉末几乎不渗透明胶泡沫或胶原泡沫。在用手术刀切割泡沫之后，明显没有深度浸渍。与此相反，摇动处理使蓝色nhs-pox粉末均匀地分散在整个纤维载体结构中。
[0214]
实施例2
[0215]
止血贴片(snow
tm
；5.1
×
10.2cm，约0.37克)用反应性nhs-pox/nu-pox颗粒浸渍。在这些颗粒中nhs-pox与nu-pox的摩尔比在1:0.6至1:2变化，所述摩尔比是指由nhs-pox提供的nhs基团的数量与由nu-pox提供的胺基团的数量的比率。
[0216]
通过在振动筛分机as 300(retsch)中分别摇动一克颗粒持续两个连续的5分钟周期，将它们分布在整个贴片中。接着，将止血贴片包装在含有1g二氧化硅的alu-alu袋中并真空密封。
[0217]
将贴片切成2
×
2cm片并在离体肝脏灌注模型中测试(n＝3)。测定1分钟压力后的止血时间(tth)、止血能力和粘附性。在肝和脾切除的体内猪肝素化模型中也测试了最佳性能的贴片(1:1nhs-pox:nu-pox)。结果示于表1中。
[0218]
表1
[0219][0220]
实施例3
[0221]
将本文之前所述的由氧化再生纤维素(orc)和polyglactin 910(约0.72克)组成的粘性纤维载体结构用反应性nhs-pox/nu-pox(1:1)颗粒或用涂有5％w/w p188的nhs-pox/nu-pox(1:1)颗粒浸渍。
[0222]
通过在振动筛分机as 300(retsch)中分别摇动一克颗粒持续两个连续的5分钟周期，将它们分布在整个贴片中。接着，将止血贴片包装在含有1g二氧化硅的alu-alu袋中并真空密封。
[0223]
将贴片切成2.5
×
2.5cm的片，并使用猪体内模型在标准化的脾和肝擦伤上进行测试。随着测试时间的进展，脾和肝被外化。用盐水浸泡的海绵或垫和/或盐水灌洗使两个器官保持湿润。适当大小的肝实质/脾的切片(～4cm2)被磨损以引起中度至重度出血。通过外
科手术刀产生擦伤。将贴片放置成与出血区域直接接触，并在1分钟内应用手动压塞。测定1分钟压力后的止血时间(tth)、止血能力以及粘附性。结果示于表2中。
[0224]
表2
[0225][0226]
*：不含p188的颗粒
[0227]
**：包含p188的颗粒
[0228]
实施例4
[0229]
在此之前描述的两种不同的粘性纤维载体结构用不同的反应性聚合物粉末浸渍。这样获得的贴片的止血性质在上述离体体和体内猪流血模型中测试。
[0230]
所用的纤维载体结构为：
[0231]
·
sw:snow
[0232]
·
ns:snow
tm-hybrid
[0233]
使用气动摇动装置用1.4克粉末浸渍这些纤维载体结构。将纤维载体片垂直振动。长冲程类型的发动机(ntk 25al l，出自netter vibration gmbh)在6bar,11hz和30mm的振幅下操作。使用4个15秒的循环将粉末分散到纤维载体结构中。颗粒分布在片的整个厚度上。片表面上的分布也是均匀的。
[0234]
测试了七种不同的反应性聚合物颗粒。这些颗粒含有水溶性亲电聚合物和亲核交联剂。前面已经描述了这些颗粒的制备。
[0235]
测试的颗粒如下所列：
[0236]
·
nhs-pox/nu-pox
[0237]
·
nhs-pox/nu-pox，含p188(2.5％)
[0238]
·
nhs-pox/nu-pox，含碳酸盐和p188(2.5％)
[0239]
·
nhs-pox/rxl(高盐)
[0240]
·
nhs-pox/rxl(高盐)，含碳酸盐
[0241]
·
nhs-pox/rxl(低盐)
[0242]
·
nhs-pox/rxl(低盐)，含碳酸盐
[0243]
测试的纤维载体结构和反应性聚合物粉末的不同组合示于表3中。
[0244]
表3
[0245][0246]
将含有具有p188的颗粒的贴片在65℃固定10分钟，以允许p188熔化并将颗粒固定在载体内，从而降低脆性(即，由于运输和/或处理，从载体中损失颗粒)。使用低温熔点聚合物固定剂如p188不会对机械操作特性产生负面影响。
[0247]
用这些贴片在离体和体内猪出血模型中获得的结果总结于表4中。
[0248]
表4
[0249][0250][0251]
*：在肝切除上测试
[0252]
**：在脾和肾切除上测试
[0253]
实施例5
[0254]
止血贴片(snow
tm
；5.1
×
10.2cm，平均重量0.37g)用nhs-pox/nu-pox颗粒(1:1)或nhs-pox粉末和nu-pox粉末的粉末混合物浸渍。
[0255]
nhs-pox和nu-pox的粉末混合物通过使用研钵将两种聚合物混合成干粉来制备。该粉末混合物中nhs-pox与nu-pox的摩尔比为1:1，所述摩尔比是指由nhs-pox提供的nhs基团的数量与由nu-pox提供的胺基团的数量的比率。
[0256]
通过在振动筛分机as 300(retsch)中摇动1.2克的颗粒或粉末混合物分别持续两个连续的5分钟周期来浸渍止血贴片。接着，将止血贴片包装在含有1g二氧化硅的alu-alu袋中并真空密封。
[0257]
将贴片切成2
×
2cm片并在离体肝脏灌注模型中测试(n＝3)。测定1分钟压力后的止血时间(tth)、止血能力以及粘附性。结果示于表5中。
[0258]
表5
[0259]