抑制Tau蛋白积累、聚集和缠结形成的组合物和方法与流程

抑制tau蛋白积累、聚集和缠结形成的组合物和方法
1.发明背景
技术领域
2.本公开涉及一种用于抑制tau蛋白积累、聚集或缠结形成的组合物，更具体地，涉及通过将nurr1和foxa2基因一起引入或单独引入nurr1基因来诱导基因的表达而抑制tau蛋白积累、聚集或缠结形成的技术。


背景技术：

3.阿尔茨海默病(ad)是一种慢性神经退行性疾病，其最常见的症状包括记忆丧失、语言障碍、认知障碍、情绪波动等。
4.阿尔茨海默病的神经病理学特征是脑细胞、神经组织、血管以及神经原纤维缠结(nft)中存在的斑块，这些斑块是由tau蛋白积累形成的。阿尔茨海默病的特征还包括淀粉样β聚集或斑块的形成和突触的丧失等。大部分阿尔茨海默病的病因还不清楚。而且，到目前为止还没有治愈阿尔茨海默病的方法。阿尔茨海默病与心血管疾病、癌症一起，是导致死亡的主要原因。据预测，阿尔茨海默病的发病率将随着人类平均寿命的增加而增加。
5.此外，管理和治疗阿尔茨海默病的患者需要巨额费用，同时患者遭受着相当大的精神痛苦。因此，需要一种有效的方法来预防和治疗患有阿尔茨海默病的患者。
6.关于阿尔茨海默病，最近很多研究都集中在tau蛋白上。事实上，脑脊液中的tau水平在阿尔茨海默病的前驱期增加，并且在发病后的病情发展过程中稳定维持着该升高的水平。nft是一种过度磷酸化的tau蛋白，其从阿尔茨海默病的早期阶段就被发现，并且随着病情发展水平稳步上升。也就是说，tau介导的神经元损伤和功能障碍是大多数阿尔茨海默病患者的病理表现。除了ad外，nft还是其他蛋白病的生物标志物，例如，额颞叶痴呆(ftd)、进行性核上性麻痹(psp)、匹克氏病、慢性创伤性脑病(cte)等。迄今为止，治疗这些疾病的产品仍未开发出来。


技术实现要素：

7.技术问题
8.本公开是由于发明人进行的研究从而实验发现：将转录因子nurr1和foxa2一起引入或单独nurr1引入脑细胞中并表达抑制了tau蛋白的积累、聚集或缠结。特别是，当nurr1与共激活剂foxa2联合表达时，发现这两个基因具有抑制tau蛋白积累、聚集或缠结的强大协同作用。在一些实施例中，还发现单独表达的nurr1具有抑制tau蛋白的实质性作用。
9.因此，本公开的一方面提供一种用于抑制tau蛋白积累、聚集或缠结形成的组合物，该组合物包含携带nurr1和foxa2基因或单独的nurr1基因的载体。
10.本公开的再一方面提供一种用于抑制tau蛋白积累、聚集或缠结的组合物，该组合物包含具有引入其中的nurr1和foxa2基因或nurr1基因的神经元或神经胶质。
11.本公开的另一方面提供一种用于抑制tau蛋白磷酸化的组合物，该组合物包含携
带nurr1和foxa2基因或nurr1基因的载体。
12.本公开的还有一方面是提供一种用于抑制tau蛋白磷酸化的组合物，该组合物包含导入有nurr1和foxa2基因或nurr1基因的神经元或神经胶质。
13.本公开的又一方面是提供一种用于预防或治疗由tau蛋白积累、聚集或缠结形成引起的疾病的组合物，该组合物包含携带nurr1和foxa2基因或nurr1基因的载体。
14.本公开的又一方面是提供一种用于预防或治疗由tau蛋白积累、聚集或缠结引起的疾病的组合物，该组合物包含导入有nurr1和foxa2基因或nurr1基因的神经元或神经胶质。
15.本公开的又一方面是提供一种用于预防或治疗tau蛋白病的组合物，该组合物包含携带nurr1和foxa2基因或nurr1基因的载体。
16.本公开的又一方面是提供一种用于预防或治疗tau蛋白病的组合物，该组合物包含导入有nurr1和foxa2基因或nurr1基因的神经元或神经胶质。
17.解决问题的技术方案
18.本技术发明人进行了关于抑制tau蛋白的积累、聚集或缠结形成的方法的研究工作，tau蛋白是tau蛋白病的主要原因。结果，本技术发明人发现将nurr1和foxa2基因一起引入或单独引入nurr1基因，然后表达这些基因具有抑制tau蛋白积累、聚集或神经元纤维缠结(nfl)形成和tau蛋白磷酸化的作用。
19.根据本公开的一方面，提供了一种用于抑制tau蛋白积累、聚集或缠结形成的组合物，该组合物包含携带nurr1和foxa2基因的载体。
20.根据本公开的再一方面，提供了一种用于抑制tau蛋白积累、聚集或缠结形成的组合物，该组合物包含携带nurr1基因而非foxa2基因的载体。
21.根据本公开的另一方面，提供了一种用于抑制tau蛋白积累、聚集或缠结形成的组合物，该组合物包含导入有nurr1和foxa2基因的神经元或神经胶质。
22.根据本公开的还有一方面，提供了一种用于抑制tau蛋白积累、聚集或缠结形成的组合物，该组合物包含导入有nurr1基因的神经元或神经胶质。
23.根据本公开的又一方面，提供了一种用于抑制tau蛋白磷酸化的组合物，该组合物包含携带nurr1和foxa2基因的载体。
24.根据本公开的又一方面，提供了一种用于抑制tau蛋白磷酸化的组合物，该组合物包含携带nurr1基因的载体。
25.根据本公开的又一方面，提供了一种用于抑制tau蛋白磷酸化的组合物，该组合物包含导入有nurr1和foxa2基因的神经元或神经胶质。
26.根据本公开的又一方面，提供了一种用于抑制tau蛋白磷酸化的组合物，该组合物包含导入有nurr1基因的神经元或神经胶质。
27.根据本公开的又一方面，提供了一种用于预防或治疗由tau蛋白积累、聚集或缠结形成引起的疾病的组合物，该组合物包含携带nurr1和foxa2基因的载体。
28.根据本公开的又一方面，提供了一种用于预防或治疗由tau蛋白积累、聚集或缠结形成引起的疾病的组合物，该组合物包含携带nurr1基因的载体。
29.根据本公开的又一方面，提供了一种用于预防或治疗由tau蛋白积累、聚集或缠结形成引起的疾病的组合物，该组合物包含导入有nurr1和foxa2基因的神经元或神经胶质。
30.根据本公开的又一方面，提供了一种用于预防或治疗由tau蛋白积累、聚集或缠结形成引起的疾病的组合物，该组合物包含导入有nurr1基因的神经元或神经胶质。
31.根据本公开的又一方面，提供了一种用于预防或治疗tau蛋白病的药物组合物，该药物组合物包含携带nurr1和foxa2基因的载体。
32.根据本公开的又一方面，提供了一种用于预防或治疗tau蛋白病的药物组合物，该药物组合物包含携带nurr1基因的载体。
33.根据本公开的又一方面，提供了一种用于预防或治疗tau蛋白病的药物组合物，该药物组合物包含导入有nurr1和foxa2基因的神经元或神经胶质。
34.根据本公开的又一方面，提供了一种用于预防或治疗tau蛋白病的药物组合物，该药物组合物包含携带nurr1基因的载体。
35.根据本公开的一个实施例，tau蛋白病是选自下组的疾病：tau蛋白阳性阿尔茨海默病、路易体痴呆、额颞叶痴呆(ftd)、多发梗塞性痴呆(mid)、额颞叶变性(ftld)、进行性铜质神经麻痹(psp)、匹克氏病、慢性创伤性脑病(cte)、皮质基底节变性(cbd)、球状胶质tau蛋白病、亨廷顿病、神经节胶质瘤、神经节细胞瘤、原发性年龄相关的tau蛋白病(part)、嗜银颗粒痴呆、铅中毒脑病、脂褐质沉着症、肌萎缩侧索硬化-帕金森-痴呆(lytico-bodig)以及脑膜血管瘤病，但不限于此。
36.在本公开中，foxa2基因与nurr1基因一起可用于预防和治疗阿尔茨海默病，这是一种tau蛋白病。发现通过引入nurr1和foxa2或单独引入nurr1的表达可以减轻阿尔茨海默病的病理症状。病理症状可能包括：(1)tau蛋白积累，2)β-淀粉样蛋白积累，3)脑细胞老化，4)突触丢失，以及5)外周免疫细胞的积累。此外，nurr1和fox2共同表达或单独表达nurr1导致脑细胞神经营养化，从而表现出预防和治疗阿尔茨海默病——一种tau蛋白病——的作用。
37.在本公开的方法的一个实施例中，表述“引入(转导)nurr1和foxa2”是指将编码这两种基因的核酸一起引入脑细胞。可以分别或同时引入这两个基因。
38.在本公开的方法中，表述“引入(转导)nurr1”是指将编码nurr1基因的核酸引入脑细胞。
39.为了将编码nurr1和/或foxa2的基因引入脑细胞，可以使用本领域公知的将基因引入细胞的技术方法，例如，dna-钙沉淀试验、使用脂质体的方法、使用多胺的方法、电穿孔测定、使用逆转录病毒的方法、使用腺病毒的方法、使用腺相关病毒(aav)的方法等。
40.携带nurr1和/或foxa2时可以使用病毒或非病毒载体。病毒载体的示例包括腺相关病毒(aav)、腺病毒、逆转录病毒和/或慢病毒。非病毒载体的示例包括rna分子、质粒、脂质体复合物、分子缀合物和/或基因剪刀蛋白(crispr，例如，cas9)。因此，根据本公开的nurr1和/或foxa2的引入包括，作为一个实施例，将编码nurr1和foxa2的核酸插入不同的表达载体或一个表达载体，然后将表达载体引入脑细胞。
41.在表达nurr1和/或foxa2的一些实施例中，可以使用基因编辑技术。基因编辑技术用于通过自由修正生物体的遗传信息来显示目标遗传性状。可用于基因编辑技术的系统示例包括锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应核酸酶(talen)和聚簇有规律间隔的短回文重复序列/crispr相关蛋白9(crispr/cas 9)。
42.如本文所用，术语“rna引导的核酸酶”是指能够识别并切割靶基因组上特定位置
的核酸酶，并且尤其是指通过引导rna具有靶特异性的核酸酶。rna引导的核酸酶可以是，但不限于，具体地，源自微生物免疫系统crispr的cas蛋白，更具体地，rna引导的核酸酶可以包括crispr相关蛋白9(cas9)核酸酶及其变体，cas9切口酶。
43.如本文所用，术语“cas蛋白”是crispr/cas系统的主要蛋白组分并且是可以充当活化的核酸内切酶的蛋白。cas蛋白可以与crispr rna(crrna)和反式激活的crrna(tracrrna)形成复合物而发挥其活性。
44.cas9核酸酶识别动植物细胞(包括人类细胞)基因组中的特定核苷酸序列，从而导致双链断裂(dsb)。双链断裂包括切割dna双链以形成平末端或粘性末端。dsb通过细胞中的同源重组或非同源末端连接(nhej)机制被有效修复，在此过程中，研究人员可以将所需的突变引入目标位点。rna引导的核酸酶可以是人工或工程化的非天然存在的rna引导的核酸酶。
45.cas9切口酶可以在其催化结构域之一中包括一个或多个突变，其中一个或多个突变选自由ruvc结构域中的d10a、e762a和d986a组成的组，或者一个或多个突变选自由hnh结构域中的h840a、n854a和n863a组成的组。与cas9核酸酶不同，cas9切口酶会导致单链断裂。因此，使用了两个引导rna，它们允许cas9切口酶起作用，并作为一对起作用。两个引导rna指导crispr复合物与每个目标序列的序列特异性结合，并指导每个目标序列附近dna双链体的一条链的分裂，以在不同的dna链中诱导两个裂口。
46.cas蛋白或基因信息可以从已知的数据库中获得，例如，国家生物技术信息中心(ncbi)的基因库。具体地，cas蛋白可以是cas9蛋白。此外，cas蛋白可以是，但不限于，来自葡萄球菌属、链球菌属、奈瑟菌属、巴氏杆菌属、弗朗西斯菌属或弯曲杆菌属的cas蛋白，更具体地，葡萄球菌属的cas9蛋白。然而，本公开不限于上述示例。在本公开中，cas蛋白可以是重组蛋白。
47.可以不受限制地使用编码nurr1和/或foxa2的核酸，只要该核酸具有本领域已知的编码nurr1和/或foxa2的核苷酸序列即可。此外，核酸可具有编码nurr1和/或foxa2相应的功能等同物的核苷酸序列。功能等同物是指与nurr1和/或foxa2的氨基酸序列具有至少60％、优选至少70％、更优选至少80％的序列同源性(或同一性)的多肽。例如，功能等同物可以包括具有60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同源性的多肽。通过对每个氨基酸序列的一部分进行添加、替换或删除，可以产生功能等同物。氨基酸的缺失或取代优选位于与本公开的多肽的生理活性不直接相关的区域。
48.此外，可以使用本领域已知的基因重组方法制备编码nurr1和/或foxa2蛋白的核酸。基因重组方法的示例包括用于从基因组扩增核酸的pcr扩增、化学合成或制备cdna序列的技术。
49.编码nurr1和/或foxa2的核酸与表达控制序列可操作地连接，并因此可以被插入到表达载体中。术语“可操作地连接”是指一个核酸片段与另一个核酸片段连接，使得一个核酸片段的功能或表达受到另一个核酸片段的影响。此外，术语“表达控制序列”是指控制特定宿主细胞中可操作连接的核酸序列表达的dna序列。这样的控制序列包括用于启动转录的启动子、用于控制转录的任何算子序列、用于编码合适的mrna核糖体结合位点的序列、
以及用于控制转录和翻译终止的序列。所有这些序列通常可以表示为“包含编码nurr1和/或foxa2的核酸的dna构建体”。
50.如本领域已知的，术语“表达载体”是指质粒、病毒载体或其他介质，其中编码结构基因的核酸可以插入其中并且核酸可以在宿主细胞中表达。在一个实施例中，表达载体可以是病毒载体。病毒载体的示例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒(aav)载体、疱疹病毒载体、禽痘病毒载体、慢病毒载体等。特别优选使用腺相关病毒(aav)或慢病毒的方法。
51.腺相关病毒(aav)载体是通过将能够制造病毒的材料引入特定细胞来构建的，而慢病毒载体是通过几个步骤构建的，以便可以在特定细胞系中产生病毒。用于基因治疗的腺相关病毒(aav)或慢病毒载体的主要优点是效率和稳定性。
52.根据本公开，可以通过本领域已知的方法将包含核酸的表达载体引入脑细胞，例如，但不限于，瞬时转染、显微注射、转导、细胞融合、磷酸钙沉淀、脂质体介导的转染、deae葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、基因枪以及用于将核酸引入细胞的其他已知方法。例如，可以将nurr1和/或foxa2基因插入aav或慢病毒载体以构建表达载体，然后将该载体转导到包装细胞中。将转导后的包装细胞孵育后过滤，得到aav或慢病毒溶液，该溶液用于感染脑细胞、神经元和/或神经前体细胞，从而将nurr1和/或foxa2基因导入脑细胞。随后，在使用包含在aav或慢病毒载体中的选择标记确认nurr1和/或foxa2单独或同时表达后，可以获得所需的脑细胞。
53.根据一个实施例，可以通过包括以下步骤的方法制备其中导入并表达了nurr1和foxa2基因的脑细胞：
54.(a)构建包含含有编码nurr1和foxa2的核酸的dna构建体的重组病毒载体；
55.(b)用重组病毒载体转染产病毒细胞系，制备表达nurr1-和foxa2-的重组病毒；以及
56.(c)用nurr1-和foxa2-表达的重组病毒感染脑细胞。
57.首先，如上所述制备含有编码nurr1和foxa2的核酸的dna构建体。
58.根据一个实施例，可以通过包括以下步骤的方法制备其中引入并表达了nurr1的脑细胞：
59.(a)构建包含含有编码nurr1的核酸的dna构建体的重组病毒载体；
60.(b)用重组病毒载体转染产病毒细胞系，制备表达nurr1-的重组病毒；以及
61.(c)用nurr1-表达的重组病毒感染脑细胞。
62.也可以如上所述制备含有编码nurr1和/或foxa2的核酸的dna构建体。
63.dna构建体可以与表达控制序列例如启动子可操作地连接，并插入到本领域已知的病毒载体中，从而构建重组病毒载体。此后，将含有编码nurr1和/或foxa2的核酸的重组病毒载体导入产病毒细胞系，从而制备表达nurr1和/或foxa2的重组病毒。产生与所用病毒载体相对应的病毒的细胞系可以用作产病毒细胞系。然后，用表达nurr1和foxa2或nurr1的重组aav或慢病毒来感染脑细胞。这可以通过使用本领域已知的任何方法来进行。
64.表达根据本公开的nurr1和/或foxa2蛋白的脑细胞可以通过本领域已知的任何方法增殖和温育。
65.本公开的脑细胞在有助于所需类型脑细胞存活或增殖的培养液中温育。优选使用通常用游离氨基酸而不是血清来滋养的培养液。优选在所述培养液中添加所开发的可持续
培养脑细胞的添加剂。添加剂的示例包括可从gibco公司、bovine serum公司等商购获得的n2培养基和b27添加剂。在培养期间，优选在观察培养基和细胞的状况的同时用新鲜培养基更换培养基。在这种情况下，当脑细胞不断增殖融合形成神经球时，可以对脑细胞进行传代培养。根据特定的方案和观察到的细胞生长特征，可以每大约7至8天进行一次传代培养。
66.如本文所述，nurr1和/或foxa2在脑细胞中的引入和表达减轻了阿尔茨海默病——一种tau蛋白病——的病理症状，例如(1)β-淀粉样蛋白积累，(2)tau蛋白积累，(3)脑细胞老化，(4)突触丢失，以及(5)外周免疫细胞的积累，并且导致脑细胞的神经营养化，从而有助于预防和治疗阿尔茨海默病——一种tau蛋白病。nurr1和foxa2或nurr1的表达减轻了阿尔茨海默病——一种tau蛋白病——的病理症状，并显示出预防和治疗阿尔茨海默病——一种tau蛋白病——的作用。
67.在另一方面，本公开提供了将nurr1和foxa2引入其中的脑细胞用于治疗tau蛋白病的用途。
68.此外，本公开提供了将nurr1引入其中的脑细胞用于治疗tau蛋白病的用途。
69.例如，根据待治疗的疾病或病症，这些细胞可以通过将导入有nurr1和foxa2或nurr1的脑细胞直接导入黑质部位而用于治疗。此外，导入有nurr1和foxa2或nurr1的脑细胞可以以含有其治疗有效量的组合物的形式通过给药或移植在治疗上使用。本公开还包括用于治疗tau蛋白病的方法。
70.本公开的一方面涉及一种组合物、基因治疗剂或细胞治疗剂，其包含作为活性成分引入其中的foxa2和nurr1或nurr1的脑细胞，用于预防或治疗由tau蛋白积累、聚集或nfl引起的疾病(例如，阿尔茨海默病)。
71.本公开的基因治疗剂或细胞治疗剂防止tau蛋白和/或β-淀粉样蛋白的积累并保护包括神经元和神经胶质在内的脑细胞免受损伤，从而使记忆相关神经元得到补充(再生)或再次构建(修复)。
[0072]“再生”一词是指对已形成的器官或个体失去的部分进行补充，而“修复”一词又称为“重建”，是指对组织进行重建，然后从分离过一次的细胞或组织中再次重建组织或器官。
[0073]
本公开的组合物或细胞治疗剂可根据给药方式通过含有可接受的载体制备成合适的制剂。适用于不同给药模式的制剂是已知的，并且可以包括通常通过膜和促进迁移的制剂。
[0074]
此外，本公开的组合物可以以通用药物制剂的形式使用。肠胃外制剂可以以无菌水溶液、非水溶剂、悬浮剂、乳液或冷冻干燥剂的形式制备。对于口服给药，本公开的组合物可以制成片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂或威化剂的形式。对于注射剂，可将组合物制备成单剂量安瓿或多剂量容器。此外，本公开的用于治疗的组合物可以与药学上可接受的载体一起施用。例如，对于口服给药，可以使用粘合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂、香料等。对于注射剂，可以使用缓冲剂、防腐剂、镇痛剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等。对于局部给药，可以使用底物、赋形剂、润滑剂、防腐剂等。
[0075]
此外，通过使用本公开的治疗用组合物来治疗tau蛋白病的方法可以包括以适当的方式通过其中引入预定材料的一般途径给予受试者或患者。给药方法的示例包括颅内给药、脑室内给药、脊髓腔给药、腹膜内给药、静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、皮内给药、口服给药、局部给药、鼻内给药、肺内给药以及直肠给药，但不限于此。然而，口服组合物在
口服给药时可能在细胞中被消化，因此，优选地，活性药物被包覆或口服组合物被配制以防止在胃中降解。
[0076]
药物组合物也可以通过可以将活性材料递送至靶细胞的任何装置给药。优选的给药方式和制剂包括立体定向海马体注射、脑室内注射、脑脊液注射、静脉注射、皮下注射、皮内注射、肌内注射或滴注。注射液可以用生理盐水或林格氏液等水性溶剂以及植物油、高级脂肪酸酯(例如，油酸乙酯)、醇(例如，乙醇、苯甲醇、丙二醇或甘油)等非水性溶剂制备。注射剂可含有药物载体，例如，用于防止变质的稳定剂(例如，抗坏血酸、亚硫酸氢钠、焦乳硫酸钠、丁基羟基茴香醚、生育酚、乙二胺四乙酸等)、乳化剂、用于调节ph值的缓冲剂、抑制微生物生长的防腐剂(例如，硝酸苯汞、硫柳汞、苯扎氯铵、苯酚、甲酚、苯甲醇等)。优选地，使用本公开的治疗用组合物治疗tau蛋白病的方法包括以药学有效量施用本公开的治疗用组合物。药物有效量可以由本领域技术人员根据医学领域公知的因素容易地确定，包括受试者(患者)的疾病类型、年龄、体重、健康、和受试者(患者)的性别、受试者(患者)的药物敏感性、给药途径、给药方法、给药次数、治疗时间、混合、组合使用的药物。
[0077]
本公开的又一方面涉及一种治疗由tau蛋白积累、聚集或缠结引起的疾病(例如，阿尔茨海默病)的方法，该方法包括将含有具有foxa2和nurr1或nurr1以治疗有效量引入其中的脑细胞的组合物直接移植到病变部位。可以使用本领域技术人员公知的已知方法进行移植和细胞培养。
[0078]
术语细胞的“治疗有效量”是指足以停止或减轻由tau蛋白病引起的受试者或患者的生理效应的量。所用细胞的治疗有效量可取决于受试者(患者)的需要、受试者(患者)的年龄、生理状况以及健康、预定的治疗效果、需要治疗的组织的大小和面积、病变的严重程度以及选定的分娩途径。此外，可以以小的多重移植物的形式将低细胞剂量的细胞施用于预定靶组织中的一个或多个位点。本公开的细胞可以在移植前完全分离，例如，形成单个细胞的悬浮液，或者可以在移植前几乎完全分离，例如，形成小细胞聚集体。可以通过将这种悬浮液或小细胞聚集体移植或移动到预定组织部位并重建或再生功能缺陷区域来施用细胞。
[0079]
在本领域技术人员的普通技术范围内，可适当地将待施用以实现治疗效果的细胞的剂量范围适当地用于受试者或患者。例如，细胞的剂量范围可能在大约1,000至1,000,000,000或更多的范围内，但对低剂量无效，并且可能不排除对高剂量产生副作用的可能性，因此，100,000至50,000,000可能更可取。
[0080]
然而，细胞的剂量可以由医生考虑到制剂的类型、给药方法、受试者(患者)的年龄或体重、患者的症状等最终适当地确定，但是本公开不限于此。
[0081]
本公开的组合物的合适剂量取决于多种因素，例如，配制方法、给药方式、受试者(患者)的年龄、体重或性别、疾病的严重程度、食物、给药时间、给药途径、排泄率、以及反应敏感性等，普通医生也能很容易判断并开出对所需治疗有效的剂量。通常，本公开的药物组合物含有1
×
103至1
×
10
13
vg/μl的病毒载体或病毒基因，并且通常可以以1
×
106至3
×
10
15
vg/剂的病毒载体或病毒基因的剂量注射一次至五次，而且为保持效果，可在数月或数年后以类似方法再次注射。
[0082]
在本公开中，所述组合物可以以上述药物制剂的形式使用。
[0083]
在本公开中，“基因治疗剂”是指以疾病治疗等为目的将基因材料或携带基因材料
的载体施用于人体的药物。
[0084]
对于可用作基因治疗剂的本公开的组合物，药学上可接受的载体是无菌且生物相容的。因此，可以使用盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、白蛋白注射液、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇及其组合中的一种或多种，并且根据需要，也可添加其他典型的添加剂，例如，抗氧化剂、缓冲剂、以及抑菌剂等。此外，还向组合物中另外加入稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂以及润滑剂，然后将其配制成可注射制剂，例如，水溶液、悬浮液或乳剂、丸剂、胶囊或片剂。此外，靶器官特异性抗体或其他配体可以与载体结合，使得载体可以以靶器官特异性方式起作用。
[0085]
除了直接使用表达nurr1和foxa2或nurr1的载体代替表达nurr1和foxa2或nurr1的脑细胞外，上述内容可以应用或对应于组合物。
[0086]
此外，本公开提供了一种预防或治疗tau蛋白病的方法，该方法包括以治疗有效量向受试者施用含有已用nurr1和foxa2或仅用nurr1转化的脑细胞的组合物。
[0087]
发明的有益效果
[0088]
本公开的特征和优点概括如下。
[0089]
(a)本公开提供了一种用于抑制tau蛋白积累、聚集或缠结的组合物，该组合物包含携带nurr1和foxa2基因或nurr1基因的载体。
[0090]
(b)本公开提供了一种用于抑制tau蛋白积累、聚集或缠结的组合物，该组合物包含导入有nurr1和foxa2基因或nurr1基因的神经元或神经胶质。
[0091]
(c)本公开提供了一种用于抑制tau蛋白磷酸化的组合物，该组合物包含携带nurr1和foxa2基因或nurr1基因的载体。
[0092]
(d)本公开提供了一种用于抑制tau蛋白磷酸化的组合物，该组合物包含导入有nurr1和foxa2基因或nurr1基因的神经元或神经胶质。
[0093]
(e)本公开提供了一种用于预防或治疗由tau蛋白积累、聚集或缠结引起的疾病的组合物，该组合物包含携带nurr1和foxa2基因或nurr1基因的载体。
[0094]
(f)本公开提供了一种用于预防或治疗由tau蛋白积累、聚集或缠结引起的疾病的组合物，该组合物包含导入有nurr1和foxa2基因或nurr1基因的神经元或神经胶质。
[0095]
(g)本公开提供了一种用于预防或治疗tau蛋白病的药物组合物，该组合物包含携带nurr1和foxa2基因或nurr1基因的载体。
[0096]
(h)本公开提供了一种用于预防或治疗tau蛋白病的药物组合物，该组合物包含导入有nurr1和foxa2基因或nurr1基因的神经元或神经胶质。
[0097]
(i)本公开的抑制剂和组合物在使用时可用于预防或治疗由tau蛋白积累、聚集或缠结引起的脑神经疾病，例如，阿尔茨海默病。
附图说明
[0098]
结合附图，从以下详细描述中可以更明显地看出上述以及本公开的其他方面、特点和优势。
[0099]
图1示出了使用aav9病毒的基因传递系统测试程序。
[0100]
图2示出了使用aav9病毒的基因传递检测结果(海马体和脑室中的绿色荧光蛋白(gfp)表达程度)。
[0101]
图3示出了证实将nurr1和foxa2基因引入脑细胞后，小鼠的海马区中β-淀粉样蛋白和tau蛋白的荧光的免疫染色结果。
[0102]
图4示出了证实将nurr1和foxa2基因引入脑细胞后，小鼠的海马区中tau蛋白和磷酸化tau(磷酸化tau，ptau)蛋白的荧光的免疫染色结果。
[0103]
图5示出了将注射nurr1-aav9和foxa2-aav9病毒的小鼠的行为指标与注射对照病毒(gfp-aav9)的小鼠的行为指标进行比较的水迷宫试验结果。
[0104]
图6示出了将注射nurr1-aav9和foxa2-aav9病毒的小鼠的行为指标与注射对照病毒(gfp-aav9)的小鼠的行为指标进行比较的y型迷宫试验结果。
[0105]
图7示出了将注射nurr1-aav9和foxa2-aav9病毒的小鼠的行为指标(正在记录的运动模式)与注射对照病毒(gfp-aav9)的小鼠的行为指标进行比较的水迷宫试验结果。
[0106]
图8示出了将注射nurr1-aav9和foxa2-aav9病毒的小鼠的行为指标(与目标的距离)与注射对照病毒(gfp-aav9)的小鼠的行为指标进行比较的水迷宫试验结果。
[0107]
图9示出了将注射nurr1-aav9和foxa2-aav9病毒的小鼠的行为指标(平均速度)与注射对照病毒(gfp-aav9)的小鼠的行为指标进行比较的水迷宫试验结果。
[0108]
图10示出了描绘磷酸盐缓冲液(pbs)给药对照组、nurr1单独给药组或nurr1和foxa2共同给药组中使用磷酸化tau蛋白(p-tau)和tuj1对3xfad转基因(tg)小鼠进行免疫染色的结果的图像。
[0109]
图11是描绘pbs给药对照组、nurr1单独给药组或nurr1和foxa2共同给药组中使用磷酸化tau蛋白(p-tau)和tuj1对3xfad tg小鼠进行免疫染色的结果的图。
[0110]
实施本发明的最佳方式
[0111]
一种用于抑制tau蛋白积累、聚集或缠结的组合物，所述组合物包含携带nurr1和foxa2基因的载体。
[0112]
本发明的方式
[0113]
在下文中，将参考示例更详细地描述本公开。这些示例仅用于更具体地说明本公开，并且对于本领域技术人员来说显而易见的是，根据本公开的要旨，本公开的范围不受这些示例的限制。
[0114]
此处使用的术语定义如下。
[0115]
术语“脑细胞”是指位于大脑中的细胞，脑细胞由神经元(神经元细胞)、神经胶质(神经胶质细胞)等组成。
[0116]
术语“神经元”是指来自中枢系统的细胞，并且术语“神经元”和“神经元细胞”在本文中可以互换使用。
[0117]
术语“神经胶质细胞”是指占据大脑中存在的细胞的最大部分的细胞，并且神经胶质细胞包括星形胶质细胞或小胶质细胞。
[0118]
星形胶质细胞参与神经元和炎症的保护和营养供应，而小胶质细胞是大脑中负责炎症的细胞，并被认为是一组在脑部疾病(如阿尔茨海默病)中起重要作用的细胞。
[0119]
术语“转导”是指通过噬菌体将遗传性状从一个细胞转移到另一个细胞的过程。当任何类型的细菌被噬菌体感染时，噬菌体dna都会与宿主dna结合。当噬菌体通过细胞裂解而释放时，携带一些宿主dna而不是一些自身dna的噬菌体通常会从细菌细胞中释放出来。当其他细菌被这种噬菌体感染时，前宿主的基因被重新引入细菌中，从而使细菌具有新的
性状。生物学研究中的“转导”一词，一般是指利用病毒载体将特定的外源基因导入靶细胞并表达的过程。
[0120]
术语“抑制积累、聚集或缠结”的概念包括tau蛋白和/或β淀粉样蛋白的积累、聚集或缠结通过阻止其产生而受到抑制的情况，以及已经产生的tau蛋白和/或β淀粉样蛋白的积累、聚集或缠结通过降解而受到抑制的情况。
[0121]“受试者”可以指待测试的用于治疗、观察或实验的脊椎动物，优选哺乳动物，例如，牛、猪、马、山羊、狗、猫、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠、人类等。
[0122]
术语“组织或细胞样品”是指从受试者或患者的组织中获得的类似细胞的集合。组织或细胞样品的来源可以是新鲜冻干的和/或保存的器官或组织样品或来自活检或抽吸物的实体组织；血液或任何血液成分；或在怀孕或靶标发育的可选时间的细胞。组织样品可以是原代的或培养的细胞、或者细胞系。
[0123]
术语“治疗”是指获得有益的或优选的临床结果的方法。出于本公开的目的，有益的或优选的临床结果包括但不限于症状的缓解、疾病程度的降低、疾病状况的稳定(即，没有恶化)、延迟疾病进展或疾病进展率的降低、(部分或整体)改善、疾病状况的暂时缓解或缓解、可检测或不可检测的概率等。此外，术语“治疗”可以指与受试者未接受治疗时的预期存活率相比的存活率的增加。“治疗”表示所有类型的方法，例如，有疗效的治疗和预防措施。治疗包括需要预防的疾病和已经发展的疾病所需的治疗。术语“缓解”病症是指与未治疗的病症相比，减轻病症的程度和/或不良的临床症状和/或延迟或延长疾病进展的时间进程。
[0124]
术语“基因治疗剂”是指其中以治疗疾病等为目的将基因材料或携带基因材料的载体施用于人体的药物。
[0125]
术语“细胞治疗剂”是指使用从人体中分离、培养和特殊操作制备的细胞和组织，用于治疗、诊断和预防目的的药物(根据美国食品及药物管理局(u.s.fda)规定)，即，通过增殖和选择体外的活的自体、同种异体或异种细胞以恢复细胞或组织的功能、或通过其他方法改变细胞生物学特性的一系列行为，用于治疗、诊断和预防目的药物。根据细胞的分化水平，细胞治疗剂主要分为体细胞治疗剂和干细胞治疗剂。
[0126]
需要治疗的“哺乳动物”是指任何属于哺乳动物的动物，包括人、家畜和农场牲畜、以及用于动物园、运动或宠物的动物，例如，狗、马、猫、牛，或猴子。优选地，哺乳动物是人。
[0127]
术语“给药”是指通过使用任何合适的方法将本公开的组合物引入受试者或患者。本公开的组合物可以通过各种口服或肠胃外给药途径给药，只要该组合物能够到达靶组织即可。该组合物可以被腹膜内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内、口服、局部、鼻内、肺内和直肠给药，但本公开不限于此。
[0128]
在本文中，术语“有效量”是指延迟或完全中断待治疗的某种疾病的发作或进展要求的所需量。在本公开中，组合物可以以药学有效量给药。对本领域技术人员来说，每天使用的适量的组合物是由在准确的医学判断范围内的医疗确定的。
[0129]
出于本公开的目的，优选根据各种因素对特定受试者或患者区别施加特定的有疗效的有效量，各种因素包括要达到的反应的类型和程度、包括根据情况是否使用另一种制剂的特定组合物、受试者(患者)的年龄、体重、一般身体状况、性别以及饮食、给药时间和途径、组合物的分泌率、治疗持续时间和与特定组合物一起同时共同给药或使用的药物，以及
医学领域众所周知的相似因素。
[0130]
除非另有定义，本公开中使用的所有技术术语与本公开所属领域的技术人员通常理解的技术术语具有相同的含义。此外，本说明书公开了优选的方法或样本，类似或等效的方法或样本也包括在本公开的范围内。作为参考文献公开的所有出版物的内容在此被并入本文。
[0131]
示例1：引入nurr1和foxa2基因对于tau蛋白病治疗效果和缓解认知功能障碍(学习和记忆力)的研究
[0132]
材料和方法
[0133]
(1)动物护理与实验
[0134]
3xfad动物模型实验的所有程序均经汉阳大学医学院的动物保护和利用委员会(iacuc)批准，批准号为2018-0047a。此外，3xfad动物模型实验的所有程序均按照汉阳大学实验动物使用指南进行。动物被圈养在具有12小时光/暗循环的特定无病原体屏障设施中，并以标准饲料组维持(5053rodent diet 20)。本实验的动物大小通过体外测定和本实验的先导试验确定，无需先前的统计计算。实验按照nih指南进行。为了尽量减少偏差，行为检测主要由两名实验者以盲法实验的方式进行评估。实验中使用了18个月和15个月大的阿尔茨海默病转基因(3xtg-ad)小鼠(美国，缅因州，杰克逊实验室(jackson laboratory))。
[0135]
(2)立体定向aav注射入阿尔茨海默病模型小鼠
[0136]
对于18个月(18m)和15个月(15m)的阿尔茨海默病转基因(3xtg-ad)小鼠(美国，缅因州，杰克逊实验室)，在zoletil 50(0.1毫克/千克)与rompum(93.28微克/千克)混合诱导麻醉10分钟以上，包含nurr1-aav9(1μl) foxa2-aav9(1μl)(共2μl，10
12
vg/μl，nurr1 foxa2组)或nurr1-aav9(1μl) 对照aav9(1μl)(共2μl，5
×
10
11
vg/μl，单独nurr1组)的病毒载体、或仅含有aav9病毒的对照组(2μl，1012vg/μl，仅对照组)被注射到海马体(前囟后1.5毫米；中线外侧
±
1毫米；硬脑膜腹侧-2毫米)和脑室(前囟后0.9毫米；中线外侧
±
1.7毫米；硬脑膜腹侧-2.2毫米)内。每次注射完成后，将针(26号)留在注射部位5-10分钟，然后慢慢取出。当确认在海马体和脑室内(icv)部位注射不准确时，小鼠会被排除在分析之外。
[0137]
(3)病毒产量
[0138]
在cmv启动子控制下表达nurr1或foxa2的慢病毒载体是通过将各自的cdna插入pcdh的多克隆位点(加州，山景城，系统生物科学)而产生的。pgipz-shnurr1和pgipz-shfoxa2慢病毒载体购自open biosystems(伊利诺伊州，罗克福德)。空骨架载体(pcdh或pgipz)用作阴性对照。生产慢病毒并将其用于转导上述体外培养物(foxa2作为一种通过表观遗传调控增强nurr1诱导的da表型表达的共激活因子，yi sh、he xb、rhee yh、park ch、takizawa t、nakashima k、lee sh(2014)。发展(development)141：761-772)。使用quicktiter
tm hiv慢病毒定量试剂盒(加利福尼亚州，圣地亚哥，细胞生物学实验室)测定慢病毒的滴度并且使用200μl/孔(24孔板)或具有106个转导单位(tu)/ml(60-70ng/ml)的2ml/6cm板用于每个转导反应。为了通过立体定向注射诱导体内表达，通过将各自的cdna亚克隆到paav-mcs载体(马萨诸塞州，剑桥，addgene公司)中来产生在cmv启动子控制下表达nurr1或foxa2(用血凝素(ha)标记)的aav。为了评估转基因的表达效率，还生成了表达gfp的aav。aav(血清型9或2)的包装和生产由韩国科学技术研究所(韩国首尔)进行。使用
quicktiter
tm aav定量试剂盒(细胞生物学实验室)测定aav滴度。通过用单个病毒制剂的混合物(1：1、v：v)感染细胞来进行共表达研究。
[0139]
(4)免疫染色
[0140]
培养的细胞和冷冻的脑切片用以下第一抗体染色：nurr1(1：500，兔子，胚胎龄20天，得克萨斯州，达拉斯，圣克鲁斯生物技术公司，和1：1,000，小鼠，安迪生物公司)；foxa2(1：500，山羊，圣克鲁斯生物技术公司)；gfp(1：2,000，兔子，生命技术公司)；gfap(1：200，小鼠，加利福尼亚州，圣安娜，mp生物医学公司)；离子钙接头蛋白抗原(iba-1)(1：200，兔子，和光纯药)，神经元特异性核蛋白(neun)(1：100，小鼠，emd密理博公司)；tau(1：500，小鼠，圣克鲁斯生物技术公司；ptau(1：500，兔子，艾博抗公司)
[0141]
培养的细胞用4％的多聚甲醛(pfa)的pbs溶液固定，并且由0.3％的聚乙二醇辛基苯基醚和1％的bsa阻断40分钟。此外，将细胞与第一抗体一起在4℃下培养过夜。用于如下可视化的二抗：cy3(1：200，杰克逊免疫研究实验室)或alexa fluor488(1：200，生命技术公司)。将染色的细胞与vectashield和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)封固液(维克托实验室)一起封固，并通过落射荧光显微镜(莱卡)和共聚焦显微镜(莱卡pcs sp5)获得图像。
[0142]
(5)行为学试验
[0143]
(5)-1.水迷宫法
[0144]
水迷宫法又称莫里斯水迷宫，广泛用于研究空间记忆力和学习。动物们被放在水坑里，水坑用粉状、脱脂牛奶或无毒涂料涂成不透明的颜色，动物们需要在那里游到一个隐藏的逃生平台。由于这些动物生活在不透明的水里，它们看不到平台，也不能依靠气味找到逃生路线。相反，动物需要依赖外部线索或迷宫外的线索。随着动物们越来越习惯这项工作，动物们可以更快地找到平台。这一范例由理查德
·g·
莫里斯(richard g.morris)在1984年提出，已成为行为神经科学的“黄金标准”之一。
[0145]
(5)-2.y型迷宫法
[0146]
y型迷宫法广泛用于评估临床前研究中的行为，以研究空间学习和记忆力。在y型迷宫法中，动物被放置在y型迷宫中三个臂之一的末端，动物决定在十字路口向左还是向右移动。这些测试可以对一只动物重复多次。观察者记录了y型迷宫中动物的一系列选择(例如，访问特定臂的次数、访问三个臂的总数、选择左臂的次数、选择右臂的次数)。y型迷宫测试的使用包括自发交替测试和认知记忆力测试。在自发交替测试中，观察者观察并记录动物是否倾向于访问最近未访问过的手臂(例如，测量自发交替的次数)。已发现这些测试对海马体损伤、基因操纵和记忆力丧失药物敏感。
[0147]
(6)细胞计数和统计分析
[0148]
使用放大率为200
×
或400
×
的目镜网格，在每个培养盖的随机区域计数免疫染色和dapi染色的细胞。对于所有的数字，数据均表示为平均值
±
sem，并且统计学检验是适当的。使用学生t检验(未配对)或双侧或单向方差分析进行统计比较，然后使用spss进行邦弗朗尼事后分析(统计学21；ibm公司，美国，阿肯色州，本顿维尔)。n、p值和统计分析方法在图例中被说明。p值小于0.05被认为是显著的。
[0149]
结果
[0150]
(1)nurr1和foxa2基因导入对异变病的影响
[0151]
由于腺相关病毒(aav)在人体内的免疫原性非常差，因此主要感染大脑中的神经
元和神经胶质细胞的aav9血清型被用于构建专门针对神经胶质细胞的nurr1和foxa2基因传递系统。为了表达nurr1和foxa2基因，使用了cmv或gfap启动子。nurr1 foxa2-aav9进入海马体和脑室内(icv)，这是阿尔茨海默病(一种tau蛋白病)的病变部位。
[0152]
为了使用aav9病毒来测试基因传递，将针对星形胶质细胞并表达绿色荧光蛋白(gfp)的aav9病毒在gfap启动子控制下分别注射到小鼠海马体和脑室内(icv)。注射gfp-aav9病毒三周后，测量了gfp表达(图1)。作为将gfp-aav9注射到海马体和脑室内(icv)的结果，gfp在整个海马体中表达，特别是在gfap 星形胶质细胞中表达(图2)。gfap、neun和iba1分别用作星形胶质细胞、成熟神经元和小胶质细胞的标记物。gfap和gfp的共表达、gfp和neun的共表达的缺乏以及gfp和iba1的共表达的缺乏表明病毒在星形胶质细胞中特定表达了这些基因。
[0153]
tau蛋白是一组位于正常神经元细胞轴突中的微管相关蛋白(map)。当大脑中发生tau蛋白聚集时，它会导致tau介导的神经元损伤和功能障碍，这被描述为阿尔茨海默病的典型病因和症状。
[0154]
nurr1和foxa2基因被特异性引入15个月和18个月大的3xfad小鼠的海马体和脑室内神经胶质细胞，这是阿尔茨海默病动物模型，其tau蛋白聚集在大脑中，类似于人类患者。引入基因两个月后，通过海马区的免疫染色对tau蛋白进行定量分析。
[0155]
图3a示出了与注射对照-aav9的3xfad小鼠相比，注射nurr1 foxa2-aav9的3xfad小鼠的海马区中tau特异性缠结的显着减少。图3b示出了tau 缠结的定量数据。
[0156]
tau蛋白即使在正常状态下也存在，但已知异常的tau蛋白会导致神经退行性疾病，而tau蛋白的过度磷酸化是正常tau蛋白的特征。
[0157]
nurr1和foxa2基因被特异性引入15个月和18个月大的3xfad小鼠的海马体和脑室内的神经胶质细胞。引入基因两个月后，通过海马区的免疫染色对磷酸化的tau蛋白(磷光体-tau，ptau)进行定量分析。
[0158]
结果发现，与注射对照aav9的小鼠相比，注射了aav9-pgfap-nurr1 foxa2的3xfad小鼠的磷酸化tau水平降低，如通过免疫组织化学(ihc)测量的(图4)。
[0159]
结果表明，nurr1和foxa2的过表达可以减少tau缠结形成的绝对数量或磷酸化tau蛋白的数量，表明nurr1和foxa2的过表达对tau病理学具有治疗作用。
[0160]
(2)通过水迷宫和y型迷宫行为学试验分析nurr1和foxa2基因传递对阿尔茨海默病(ad)小鼠模型的认知障碍(学习和记忆力)的缓解作用
[0161]
研究了神经胶质nurr1和foxa2表达对阿尔茨海默病(一种tau蛋白病)治疗的影响。在这方面，nurr1和foxa2在15-18个月大的3xfad小鼠的海马体和脑室内神经胶质细胞中被特异性表达，这些小鼠通过app、ps1以及tau三个基因的突变经历了阿尔茨海默病的发作。考虑到小鼠平均寿命约为24个月这一事实，15-18个月大的小鼠已经相当老了。在将nurr1和foxa2基因传递给阿尔茨海默病模型小鼠三个月后，对小鼠的认知能力进行了分析。
[0162]
阿尔茨海默病是一种tau蛋白病，是一种以记忆力和认知能力损伤的进展缓慢为特征的神经退行性疾病。水迷宫和y型迷宫试验是作为阿尔茨海默病的动物试验进行的。水迷宫和y型迷宫试验均是代表记忆力和认知能力功效实验的授权实验方法，并且可作为行为测试的指标，用于确定阿尔茨海默病的进展和对阿尔茨海默病的治疗效果。
[0163]
将nurr1 foxa2-aav9病毒注射到15-18个月大的小鼠体内约两周后，水迷宫和y型迷宫行为测试每两周进行一次，持续两个月。比较注射nurr1 foxa2-aav9病毒和对照病毒(gfp-aav9)的小鼠之间的行为指标。动物模型行为测试结果表明，与对照组小鼠相比，表达nurr1 foxa2的小鼠表现出更好的行为指标和更快的反应速度，表明nurr1和foxa2的神经胶质表达带来了负责学习和记忆力的认知活动的显着改善，因此对阿尔茨海默病(一种tau蛋白病)有治疗作用。也就是说，nurr1和foxa2在脑细胞中的表达被鉴定为对阿尔茨海默病具有临床基因治疗作用(图5、图6、图7、图8和图9)。
[0164]
示例2：通过引入nurr1和foxa2基因抑制p-tau蛋白(磷酸化tau蛋白)形成的研究
[0165]
进一步研究了是否可以通过nurr1和foxa2基因导入抑制磷酸化tau蛋白的形成。
[0166]
对于具有app、ps1和tau的突变诱导的18个月和15个月大的阿尔茨海默病转基因(3xtg-ad)小鼠(美国，缅因州，杰克逊实验室)，通过立体定向显微注射，将nurr1-aav9(1μl) foxa2-aav9(1μl)(共2μl，1012vg/μl，nurr1 foxa2组)、单独的nurr1-aav9(1μl)或生理盐水(pbs)注入麻醉小鼠的海马体和脑室内。给药两个月后，处死阿尔茨海默病转基因小鼠，将其固定在多聚甲醛(pfa)中，然后将0.6％的聚乙二醇辛基苯基醚加入到1％的bsa/pbs溶液中封闭1小时。此后，将第一抗体(p-tau、tuj1)与同一溶液结合，并在4℃下进行组织染色过夜。通过作为可视化的第二抗体的cy3(1：200，杰克逊免疫研究实验室)、alexa fluor 488(1：200，生命技术公司)进行二次染色。将染色的细胞与vectashield、dapi封固液(维克托实验室)一起封固，并通过共聚焦显微镜(莱卡pcs sp5)拍摄内嗅皮层区域。拍摄的图像显示在图10中，并且其量化结果显示在图11和表1中。
[0167]
表1
[0168][0169]
由图10和图11可知，实验结果证实，在nurr1和foxa2被引入并表达后，3xfad tg小鼠的大脑神经元中磷酸化tau蛋白表达水平显著降低，并且在单独的nurr1被引入并表达后，磷酸化tau蛋白表达水平显著降低。
[0170]
试验结果表明，在作为阿尔茨海默病模型小鼠的3xfad tg小鼠中，当转录因子nurr1和foxa2一起表达或单独表达nurr1时，与对照组相比，神经元中磷酸化的tau蛋白降低。考虑到磷酸化的tau蛋白是构成神经元纤维缠结——阿尔茨海默病的主要特征——的物质并且在神经元中积累导致神经元细胞死亡，最终导致记忆力衰竭，根据本公开的nurr1和foxa2联合引入或nurr1单独引入有望用于治疗tau蛋白病和阿尔茨海默病。
[0171]
产业上的可利用性
[0172]
本公开涉及一种用于抑制tau蛋白积累、聚集或缠结形成的组合物，更具体地，涉及通过将nurr1和foxa2基因一起引入或单独引入nurr1基因来诱导基因的表达而抑制tau蛋白积累、聚集或缠结形成的技术。