一种基于切割活性顺式结构脱氧核酶的荧光铜离子探针的制作方法

1.本发明属于分析化学领域，涉及一种铜离子探针，具体涉及一种基于顺式结构脱氧核酶检测饮用水中铜离子含量的荧光探针。


背景技术：

2.铜是人体必需的微量元素，对维持身体健康和器官的正常运行不可或缺。例如，酶催化功能也需要铜离子的参与和活化，对铁的代谢和人体的造血功能也有重要的影响。然而，铜在人体内的含量有一定的标准，过多或过少都会对人体各项机能产生危害。如果铜含量过低，会对人体发育造成影响，也会影响中枢神经和免疫系统。如果铜含量过高，也会对人体产生危害。短时间铜含量过高，会引起胃肠道紊乱，出现恶心、呕吐、胃痉挛等症状，如果长时间处于高浓度铜含量的环境中，会对心脑血管、肝以及肾脏产生危害。
3.饮用水是人体摄入铜离子的主要途径，水中铜离子含量与人体健康密切相关，对饮用水中铜离子含量的测定具有非常重要的意义。目前，已开发出多种检测水中铜离子的方法，例如，如光谱法、电化学法等，然而，这些方法大多需要复杂的仪器和样品制备过程，甚至有些材料会造成环境污染。相比之下，酶法检测具有专一性强，而荧光信号具有灵敏度高，是一种价格低廉、绿色环保、简单便捷的方法。因此，我们设计构建了一种基于顺式结构脱氧核酶的荧光探针，用于检测饮用水中铜离子含量。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种基于顺式结构脱氧核酶检测饮用水中铜离子含量的荧光探针。
5.为实现上述目的，本发明通过以下技术来实现：
6.荧光铜离子探针的检测原理：
7.荧光铜离子探针由一条dna链构成。
8.顺式结构脱氧核酶dna链5’端第18个脱氧核苷酸(胸腺嘧啶脱氧核苷酸)化学修饰荧光分子为5-羧基荧光素(5-fam)。
9.顺式结构脱氧核酶5’端第20个脱氧核苷酸(腺嘌呤脱氧核苷酸)化学修饰荧光淬灭分子为黑洞淬灭分子1(black hole quencher-1)。
10.顺式结构脱氧核酶通过碱基互补配对原则自身折叠，酶链5’端第18个脱氧核苷酸标记的荧光分子与第20个脱氧核苷酸(腺嘌呤脱氧核苷酸)化学修饰荧光淬灭分子接近，荧光分子发生淬灭作用，无荧光信号发射。
11.在检测体系中，当只含有半胱氨酸时，顺式结构脱氧核酶无催化活性。
12.当加入铜离子后，铜离子与半胱氨酸共同作用促使顺式结构脱氧核酶在第19个脱氧核苷酸(胞嘧啶脱氧核苷酸)发生自身切割反应。
13.随着切割片段离开顺式结构脱氧核酶，切割片段上修饰的荧光分子与荧光淬灭分子分离，淬灭作用消失，荧光分子可以发射荧光信号。
14.荧光信号强度和铜离子浓度之间可以建立数学关系，从而达到检测铜离子浓度目的。
15.荧光铜离子探针检测原理见图1。
16.荧光铜离子探针检测下线：
17.本探针检测下线为1nmol/l，铜离子浓度与探针荧光信号强度关系见图2。
18.荧光铜离子探针检测专一性：
19.当本探针检测10种二价金属离子(mg
2
、ca
2
、mn
2
、co
2
、ni
2
、cu
2
、zn
2
、cd
2
、ba
2
以及pb
2
)时，只有铜离子会使本探针荧光信号显著增强，而其他9种二价金属离子不会使荧光信号增强(见图3)。
20.荧光铜离子探针对样品检测：
21.检测自来水样品铜离子含量为1.8
±
0.11μmol/l。
附图说明
22.图1为荧光铜离子探针检测原理图，f表示荧光分子，q表示荧光淬灭分子。
23.图2为荧光铜离子探针检测范围和荧光信号关系图。
24.图3为荧光铜离子探针检测专一性图。
具体实施方式
25.本发明实验所使用仪器为tecan infinite f200酶标仪。
26.所使用dna为生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
27.下面通过具体的实施方式对本发明荧光铜离子探针作进一步说明。
28.荧光铜离子探针对自来水样品检测：
29.用烧杯接过夜水管中自来水1l，用微量移液器取10个50μl水样品。
30.检测体系组成包括50μl水样品、30nmol/l顺式结构脱氧核酶、20μmol/l半胱氨酸、200mmol/l氯化钾以及20mmol/l4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液(ph 7.8)，总检测体积为100μl。
31.在37℃水浴中反应10分钟后，利用微量移液器将检测液转移到96孔荧光检测板中，使用tecan infinite f200多功能酶标仪检测荧光信号，然后将荧光值代入公式中计算铜离子浓度。


技术特征：
1.一种基于切割活性顺式结构脱氧核酶的荧光铜离子探针，其特征在于：该探针由顺式结构脱氧核酶、半胱氨酸以及缓冲体系组成。2.如权利要求1所述一种基于切割活性顺式结构脱氧核酶的荧光铜离子探针，其特征在于：脱氧核酶的dna序列为5
’‑
atcgtctctcttacgactcatgtctgacatgacgagtcttctctcactgagagaaaa-3’。3.如权利要求1所述一种基于切割活性顺式结构脱氧核酶的荧光铜离子探针，其特征在于：切割位点位于脱氧核酶5’端第19个脱氧核苷酸(胞嘧啶脱氧核苷酸)。4.如权利要求1所述一种基于切割活性顺式结构脱氧核酶的荧光铜离子探针，其特征在于：脱氧核酶5’端第18个脱氧核苷酸(胸腺嘧啶脱氧核苷酸)化学修饰荧光分子为5-羧基荧光素(5-fam)，第20个脱氧核苷酸(腺嘌呤脱氧核苷酸)化学修饰荧光淬灭分子为黑洞淬灭分子1(black hole quencher-1)。5.如权利要求1所述一种基于切割活性顺式结构脱氧核酶的荧光铜离子探针，其特征在于：顺式结构脱氧核酶使用浓度为30nmol/l。6.如权利要求1所述一种基于切割活性顺式结构脱氧核酶的荧光铜离子探针，其特征在于：半胱氨酸使用浓度为20μmol/l。7.如权利要求1所述一种基于切割活性顺式结构脱氧核酶的荧光铜离子探针，其特征在于：缓冲体系由200mmol/l氯化钾(kcl)和30mmol/l4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)缓冲溶液(ph为7.8)组成。

技术总结
本发明公开一种基于切割活性顺式结构脱氧核酶的荧光铜离子探针，属于饮用水中金属离子检测领域。在顺式结构脱氧核酶切割位点左右两侧分别化学修饰荧光分子和荧光淬灭分子。化学分子修饰后的顺式结构脱氧核酶与半胱氨酸组成一种荧光铜离子探针。当检测样品中含有铜离子时，半胱氨酸与铜离子共同作用使该脱氧核酶自身发生切割反应，切割片段携带荧光分子并与脱氧核酶脱离进而发射荧光信号。本探针检测铜离子下限为1nmol/L并显示出检测专一性。使用本发明可以实现饮用水中铜离子含量检测。用本发明可以实现饮用水中铜离子含量检测。用本发明可以实现饮用水中铜离子含量检测。


技术研发人员：姜大志 许家翠 贾子怡 王富龙 张红缨 孙妍红 董洪钵 盛永杰
受保护的技术使用者：吉林大学
技术研发日：2021.11.22
技术公布日：2022/2/23