用于治疗非酒精性脂肪肝炎的组合物和方法与流程

1.本发明涉及使用bcl-2抑制剂化合物或包含其的组合物治疗非酒精性脂肪性肝炎(nash)的方法。


背景技术：

2.细胞凋亡是程序性细胞死亡的过程，是组织稳态的必需生物学过程。在哺乳动物中，它已被证明可以调节早期胚胎发育。在生命的晚期，细胞死亡是一种默认机制，通过该机制除去潜在危险细胞，例如携带癌症缺陷的细胞。已知几种凋亡途径。最重要的凋亡途径之一涉及bcl-2蛋白家族，其是细胞凋亡的线粒体(也称为“内在”)途径的关键调节剂。参见danial和korsmeyer，cell 776：205-219(2004)。结构同源结构域bh1、bh2、bh3和bh4是bcl-2家族蛋白的特征。bcl-2蛋白质家族可以进一步分为三个亚族，这取决于每种蛋白质含有多少同源结构域及其生物活性，即它是否具有促凋亡或抗细胞凋亡功能。
3.bcl-2蛋白的第一亚组含有具有全部四个同源结构域的蛋白质，即bh1、bh2、bh3和bh4。它们的一般作用是抗细胞凋亡，即保护细胞免于开始细胞死亡过程。诸如bcl-2、bcl-w、bcl-xl、mcl-1和bfl-1/al的蛋白质是该第一亚组的成员。属于bcl-2蛋白的第二亚组的蛋白质含有三个同源结构域bh1、bh2和bh3，并具有促凋亡作用。第二个亚组的两个主要代表性蛋白质是bax和bak。bcl-2蛋白的第三个亚组由仅含有bh3结构域的蛋白质组成，该亚组的成员通常被称为“仅bh3蛋白质”。它们对细胞的生物学作用是促细胞凋亡的。bim、bid、bad、bik、noxa、hrk、bmf和puma是第三个蛋白质亚家族的例子。bcl-2家族蛋白调节细胞死亡的确切机制尚不完全清楚。在bcl-2家族蛋白调节细胞死亡的一种推定中，仅bh3蛋白进一步分类为“活化剂”，例如bim和bid，或“敏化剂”，例如bad、bik、noxa、hrk、bmf和puma，蛋白质取决于它们的调节功能。
4.组织稳态的关键之一是实现细胞中bcl-2蛋白的三个亚组之间相互作用的平衡。研究已经阐明了bcl-2家族蛋白的促凋亡和抗凋亡亚组相互作用以允许细胞经历程序性细胞死亡的机制。在细胞中接收细胞内或细胞外信号后，发生仅bh3蛋白的翻译后或转录激活。仅bh3蛋白是凋亡级联的主要诱导物，其包括作为一步，在细胞中线粒体膜上的促凋亡蛋白bax和bak的活化。激活已经锚定在线粒体膜上或迁移到该膜上的bax和/或bak后，bax和/或bak寡聚化导致线粒体外膜透化(momp)，细胞色素c的释放和下游激活效应子半胱天冬酶，最终导致细胞凋亡。一些研究人员假设某些仅含bh3的蛋白质，例如puma、bim、bid，是“活化剂”，因为这些蛋白质直接参与促凋亡蛋白bax和bak以启动momp，而其他仅含bh3的蛋白质，例如bad、bik和noxa是“致敏剂”并通过结合抗凋亡蛋白(例如bcl-2、bcl-xl、bcl-w、mcl-1)间接诱导bax和bak寡聚化，并取代和“释放”“激活剂”仅bh3蛋白质，其随后结合并激活促凋亡蛋白质，例如bax、bak，以诱导细胞死亡。其他研究表明，抗凋亡蛋白直接与bax和bak接触，所有仅bh3蛋白通过与抗凋亡蛋白结合调节这种相互作用，如bcl-2、bcl-xl、bcl-w、mcl-1，这导致了bax和bak的释放。参见adams和cory，oncogene 26：1324-1337(2007)和willis等，science 375：856-859(2007)。虽然抗凋亡和促凋亡bcl-2家族蛋白调节细胞凋
亡的确切相互作用仍在研究中，但有大量科学证据表明抑制仅bh3蛋白与抗细胞凋亡bcl-2族蛋白质结合的化合物促进细胞凋亡。
5.失调的凋亡途径涉及许多重要疾病的病理学，例如神经变性病症(上调的细胞凋亡)，例如阿尔茨海默氏病；和增殖性疾病(下调的细胞凋亡)，例如癌症、自身免疫疾病和促血栓形成病症。
6.例如，在小鼠模型和人类患者中，据报道bcl-2信号传导缺陷可引起自身免疫或与自身免疫相关。特别是，适当的bcl-2信号传导对b细胞发育至关重要，而bcl-2信号传导失调与自我耐受力的丧失和自身免疫性疾病的发展有关(tischner et al.(2010),cell death dis.1(6):e48)。因此，bcl-2抑制剂化合物可为自体免疫疾病和其他b细胞相关疾病的治疗中恢复正常bcl-2信号传导提供有吸引力的治疗策略。
7.b细胞还通过抗体非依赖性机制与肝损伤后肝纤维化的发展联系在一起。例如，对四氯化碳引起的肝损伤的小鼠模型研究表明，与野生型小鼠相比，b细胞缺陷型小鼠的肝脏中胶原蛋白沉积明显更少，这是肝纤维化发展的标志(novobrantseva et al.(2005),j.clin.invest.115:3072
–
3082).因此，bcl-2抑制剂可通过恢复正常的b细胞调节来治疗与肝纤维化有关的疾病，例如非酒精性脂肪性肝炎。始终需要小分子，其选择性地抑制一种类型或一组bcl-2蛋白的活性，用于治疗过度增殖性疾病，例如非酒精性脂肪肝炎。
8.因此对于治疗非酒精性脂肪性肝炎，针对选择性抑制一种类型或一部分bcl-2蛋白活性的小分子，存在持续性的需求。


技术实现要素：

9.本文发明了在患者中治疗非酒精性脂肪性肝炎的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的以下式(i)化合物:
[0010][0011]
或其药学上可接受的盐，水合物，溶剂化物，立体异构体或互变异构体，其中a，e和y如本文所定义。
[0012]
本文还发明了治疗患者的非酒精性脂肪性肝炎的方法，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的包含上述式(i)化合物或药学上可接受的盐，水合物的药物组合物，其
溶剂化物，立体异构体或互变异构体。
[0013]
在一个实施方案中，一种用于治疗患者的非酒精性脂肪性肝炎的方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的式(i)的化合物：
[0014][0015]
或其药学上可接受的盐，溶剂化物，水合物，立体异构体或互变异构体，其中：
[0016]
a选自以下组成的组：
[0017][0018]
e选自以下组成的组:
[0019]
碳原子,且是双键；或
[0020]
–
c(h)
–
,且是单键；或
[0021]
氮原子,且是单键；
[0022]
y选自
–
c(h)
–
和
–o–
；
[0023]
r1选自氢和
–
n(r
7a
)(r
7b
)；
[0024]
r2,r3,r4,r5,和r6各自独立选择氢，任选取代的c
1-6
烷基,任选取代的c
3-6
环烷基,杂环基,任选取代的杂芳基,(杂环)烷基；
[0025]r7a
选自任选取代c
1-6
烷基和任选取代(杂环)烷基；和
[0026]r7b
选自h和c
1-4
烷基。
[0027]
在一个实施方案中，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的式(i)的化合物，为式(ii):
[0028][0029]
或其药学上可接受的盐，溶剂化物，水合物，立体异构体或互变异构体。
[0030]
在一个实施方案中，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的选自以下的化合物：
[0031][0032]
或其药学上可接受的盐，溶剂化物，水合物或互变异构体。
[0033]
在一个实施方案中，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的化合物，其中该化合物为:
[0034]
[0035]
或其药学上可接受的盐，溶剂化物，水合物或互变异构体。
[0036]
在一个实施方案中，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的化合物，其中该化合物为:
[0037][0038]
或其药学上可接受的盐，溶剂化物，水合物或互变异构体。
[0039]
在一个实施方案中，该方法包括向有此需要的患者施用治疗有效量的化合物，所述化合物选自表1中所列的化合物，如本文所发明。
[0040]
在一个实施方案中，一种用于治疗患者的非酒精性脂肪性肝炎的方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的包含下式(i)化合物的药物组合物：
[0041][0042]
或其药学上可接受的盐，溶剂化物，水合物，立体异构体或互变异构体，其中：
[0043]
a选自以下组成的组：
[0044]
[0045]
e选自以下组成的组：:
[0046]
碳原子,且是双键；或
[0047]
–
c(h)
–
,且是单键；或
[0048]
氮原子,且是单键；
[0049]
y选自
–
c(h)
–
和
–o–
；
[0050]
r1选自h和
–
n(r
7a
)(r
7b
)；
[0051]
r2,r3,r4,r5,和r6各自独立地选自氢,任选取代c
1-6
烷基,任选取代c
3-6
环烷基,杂环基,任选取代的杂芳基,(杂环)烷基；；
[0052]r7a
选自任选取代c
1-6
烷基和任选取代(杂环)烷基；和
[0053]r7b
选自h和c
1-4
烷基。
[0054]
在一个实施方案中，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的包含式(i)的化合物的药物组合物，其进一步为式(ii)化合物:
[0055][0056]
或其药学上可接受的盐，溶剂化物，水合物，立体异构体或互变异构体。
[0057]
在一个实施方案中，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含选自以下的化合物:
[0058][0059]
或其药学上可接受的盐，溶剂化物，水合物或互变异构体。
[0060]
在一个实施方案中，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含
[0061][0062]
或其药学上可接受的盐，溶剂化物，水合物或互变异构体。.
[0063]
在一个实施方案中，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含
[0064][0065]
或其药学上可接受的盐，溶剂化物，水合物或互变异构体。
[0066]
在一个实施方案中，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物包含选自表1中所列化合物的化合物，如本文所述。
[0067]
在一个实施例中,一种治疗患者的非酒精性脂肪性肝炎的方法，包括向有需要的患者施用治疗有效量的化合物，其中为(s)-n-((4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰胺。
[0068]
在一个实施例中，诊断有需要的患者患有一种或多种疾病，选自心血管疾病，慢性肾脏疾病，2型糖尿病，肥胖症和代谢综合征，其中代谢综合征选自高血糖症，高脂血症和胰岛素抵抗(ir)。
[0069]
在一个实施例中,将化合物或药物组合物以足以引起一种或多种选自以下的作用的剂量施用于有需要的患者：减少肝脂肪变性，减少小叶炎症，减少肝细胞球囊扩张和减少肝纤维化。
[0070]
在一个实施例中,将化合物或药物组合物以足以减轻患者肝脂肪变性的剂量施用于有需要的患者。
[0071]
在一个实施例中,将化合物或药物组合物以足以减轻患者小叶炎症的剂量施用于有需要的患者。
[0072]
在一个实施例中,将化合物或药物组合物以足以使患者肝细胞膨胀的剂量给予有需要的患者。
[0073]
在一个实施例中,将化合物或药物组合物以足以减轻患者游离纤维化的剂量施用于有需要的患者。
[0074]
在一个实施例中,该方法进一步包括向有需要的患者施用治疗有效量的奥贝胆酸。
[0075]
在一个实施例中,奥贝胆酸在式(i)化合物之前给药。
[0076]
在一个实施例中,奥贝胆酸与式(i)化合物同时给药。
[0077]
在一个实施例中,奥贝胆酸在式(i)化合物之后给药。
[0078]
在一个实施方案中，式(i)的化合物
[0079][0080]
或其药学上可接受的盐，溶剂化物，水合物，立体异构体或互变异构体，用于制造用于治疗有需要的患者的非酒精性脂肪性肝炎的药物，其中：
[0081]
a选自以下组成的组:
[0082][0083]
e选自以下组成的组：
[0084]
碳原子,且是双键；或
[0085]
–
c(h)
–
,且是单键；或
[0086]
氮原子,且是单键；
[0087]
y选自
–
c(h)
–
和
–o–
；
[0088]
r1选自h和
–
n(r
7a
)(r
7b
)；
[0089]
r2,r3,r4,r5,和r6各自独立地选自氢,任选取代c
1-6
烷基,任选取代c
3-6
环烷基杂环基,任选取代的杂芳基,(杂环)烷基；
[0090]r7a
选自任选取代c
1-6
烷基和任选取代(杂环)烷基；和
[0091]r7b
选自h和c
1-4
烷基。
[0092]
在一个实施方案中，用于制造药物的化合物是式(i)的化合物，其进一步为式(ii)化合物:
[0093][0094]
或其药学上可接受的盐，溶剂化物，水合物，立体异构体或互变异构体。
[0095]
在一个实施方案中，用于制造药物的化合物选自下组：
[0096]
或其药学上可接受的盐，溶剂化物，水合物或互变异构体。.在一个实施方案中，用于制造药物的化合物是：
[0097][0098]
或其药学上可接受的盐，溶剂化物，水合物或互变异构体。
[0099]
在一个实施方案中，用于制造药物的化合物是:
[0100][0101]
或其药学上可接受的盐，溶剂化物，水合物或互变异构体。
[0102]
在一个实施方案中，用于制造药物的化合物选自由表1中所述的化合物，如本文所述。
[0103]
在一个实施例中,(s)-n-((4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰胺用于制造用于治疗有需要的患者的非酒精性脂肪性肝炎的药物。
[0104]
在一个实施例中,该药物用于治疗被诊断为患有心血管疾病，慢性肾脏疾病，2型糖尿病，肥胖症和代谢综合征的患者的非酒精性脂肪性肝炎。其中代谢综合征选自高血压，高血糖症，高脂血症和胰岛素抵抗(ir)。
[0105]
在一个实施例中,所述化合物或药物组合物用于制备用于治疗非酒精性脂肪性肝炎的药物，其中所述化合物或药物组合物以足以引起一种或多种选自下组的作用的剂量施用于需要其的患者：减少肝脏脂肪变性，减少小叶炎症，减少肝细胞球囊扩张和减少肝纤维化。
[0106]
在一个实施例中,所述化合物或药物组合物用于制备用于治疗非酒精性脂肪性肝炎的药物，其中所述化合物或药物组合物以足以减轻患者肝脂肪变性的剂量施用于需要其
的患者。
[0107]
在一个实施例中,所述化合物或药物组合物用于制备用于治疗非酒精性脂肪性肝炎的药物，其中所述化合物或药物组合物以足以减轻患者小叶炎症的剂量施用于有需要的患者。
[0108]
在一个实施例中,所述化合物或药物组合物用于制备用于治疗非酒精性脂肪性肝炎的药物，其中所述化合物或药物组合物以足以减少患者肝细胞球囊扩张的剂量施用于有需要的患者。
[0109]
在一个实施例中，所述化合物或药物组合物用于制备用于治疗非酒精性脂肪性肝炎的药物，其中所述化合物或药物组合物以足以降低患者肝纤维化严重程度的剂量施用于需要其的患者。
[0110]
在一个实施例中，用于在有需要的患者中治疗系统性非酒精性脂肪性肝炎的化合物，包括式(i)化合物：
[0111][0112]
或其药学上可接受的盐，溶剂化物，水合物，立体异构体或互变异构体，其中:
[0113]
a选自以下组成的组:
[0114][0115]
e选自以下组成的组:
[0116]
碳原子，且是双键；或
[0117]
–
c(h)
–
,且是单键；或
[0118]
氮原子,且是单键；
[0119]
y选自
–
c(h)
–
和
–o–
；
[0120]
r1选自h和
–
n(r
7a
)(r
7b
)；
[0121]
r2,r3,r4,r5,和r6各自独立地选自氢,任选取代c
1-6 alkyl,烷基,任选取代c
3-6
环烷基,杂环基,任选取代的杂芳基,(杂环)烷基；
[0122]r7a
选自任选取代c
1-6
烷基和任选取代(杂环)烷基；和
[0123]r7b
选自h和c
1-4
烷基。
[0124]
在一个实施方案中，用于在有需要的患者中治疗非酒精性脂肪性肝炎的化合物包含式(i)的化合物，其进一步为式(ii)化合物:
[0125][0126]
或其药学上可接受的盐，水合物，溶剂化物，立体异构体或互变异构体。
[0127]
在一个实施方案中，用于在有需要的患者中治疗非酒精性脂肪性肝炎的化合物包括选自以下的化合物：
[0128][0129]
或其药学上可接受的盐，溶剂化物，水合物或互变异构体。
[0130]
在一个实施方案中，用于在有需要的患者中治疗非酒精性脂肪性肝炎的化合物包括:
[0131][0132]
或其药学上可接受的盐，水合物，溶剂化物或互变异构体.
[0133]
在一个实施方案中，用于在有需要的患者中治疗非酒精性脂肪性肝炎的化合物包括：
[0134][0135]
或其药学上可接受的盐，水合物，溶剂化物或互变异构体。
[0136]
在一个实施例中，用于在有需要的患者中用于治疗非酒精性脂肪性肝炎的化合物包括选自表1中所列化合物的化合物，如本文所述。
[0137]
在一个实施例中，用于在有需要的患者中治疗非酒精性脂肪性肝炎的化合物，包括(s)-n-((4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰胺。
[0138]
在一个实施例中，该化合物用于治疗患者的非酒精性脂肪性肝炎，其中该患者被诊断患有一种或多种疾病，所述疾病选自心血管疾病，慢性肾脏疾病，2型糖尿病，肥胖症和代谢综合征，其中代谢综合征选自高血压，高血糖症，高脂血症和胰岛素抵抗(ir)。
[0139]
在一个实施例中，所述化合物用于治疗患者的非酒精性脂肪性肝炎，其中所述化合物或药物组合物以足以引起一种或多种选自下组的作用的剂量施用于有需要的患者：脂肪变性，减少的小叶炎症，减少的肝细胞膨胀和减少的肝纤维化。
[0140]
在一个实施例中，所述化合物用于治疗患者的非酒精性脂肪性肝炎，其中所述化合物或药物组合物以足以减轻患者肝脂肪变性的剂量施用于需要其的患者。
[0141]
在一个实施例中，所述化合物用于治疗患者的非酒精性脂肪性肝炎，其中所述化合物或药物组合物以足以减轻患者小叶炎症的剂量施用于有需要的患者。
[0142]
在一个实施例中，所述化合物用于治疗患者的非酒精性脂肪性肝炎，其中所述化合物或药物组合物以足以减少患者小叶肝细胞球囊扩张的剂量施用于需要其的患者。
[0143]
在一个实施例中，所述化合物用于治疗患者的非酒精性脂肪性肝炎，其中所述化合物或药物组合物以足以减轻患者肝纤维化的剂量施用于有需要的患者。
附图说明
[0144]
图1a显示了与未经治疗的对照组相比，用化合物1和/或oca治疗的诱发性非酒精性脂肪性肝炎小鼠的肝脏组织的he染色横断面。
[0145]
图1b显示了与未治疗的对照组相比，用化合物1和/或oca治疗的诱发性非酒精性脂肪性肝炎小鼠的nas得分分析。
[0146]
图2a显示了与未治疗的对照组相比，用化合物1和/或oca治疗的诱发性非酒精性脂肪性肝炎小鼠的肝组织的天狼星红染色横截面。
[0147]
图2b显示了与未治疗的对照相比，用化合物1和/或oca治疗的诱导性非酒精性脂肪性肝炎小鼠的纤维化评分分析。
[0148]
图3a显示了与未经处理的对照相比，用化合物1或gft505处理的诱导性非酒精性脂肪性肝炎小鼠的肝脏组织的he染色横断面。
[0149]
图3b显示了与未治疗的对照相比，用化合物1或gft505治疗的诱导性非酒精性脂肪性肝炎小鼠的nas评分分析。
[0150]
图4a显示了与未治疗的对照组相比，用化合物1或gft505治疗的诱导性非酒精性脂肪性肝炎小鼠的肝组织的天狼星红染色横截面。
[0151]
图4b显示了与未治疗的对照相比，用化合物1或gft505治疗的诱导性非酒精性脂肪性肝炎小鼠的纤维化评分分析。
具体实施方式
[0152]
本发明涉及能够调节bcl-2家族蛋白的化合物或其药学上可接受的盐，溶剂化物，水合物，互变异构体和立体异构体。能够调节bcl-2家族蛋白的化合物可用于治疗，预防或改善与bcl-2家族蛋白的活性有关的疾病和病症。
[0153]
在一些方面，本发明特征在于通过向有需要的患者施用治疗有效量的能够调节bcl-2家族蛋白的化合物或药物组合物来治疗或改善患者的非酒精性脂肪性肝炎(nash)的方法。包含能够调节bcl-2家族蛋白的化合物。
[0154]
定义
[0155]
在本发明中，“一”和“一个”用于指代该冠词的语法对象中的一个或多个(例如，至少一个)。举例来说，“一个元素”是指一个元素或不止一个元素。
[0156]
除非另外指出，否则术语“和/或”在本发明中用于表示“和”或“或”。
[0157]
如本文所用，术语“约”包括所述数字
±
10％。因此，“约10”表示9至11。
[0158]
在本发明中，术语“烷基”本身或作为另一基团的一部分使用是指含有一至十二个碳原子的未取代的直链或支链脂族烃，即c1-12烷基，或指的碳原子数，例如，诸如甲基的c1
烷基，诸如乙基的c2烷基，诸如丙基或异丙基的c3烷基，诸如甲基、乙基、丙基或异丙基的c1-3烷基等。在一个实施方案中，烷基是直链c1-6基。在另一个实施方案中，烷基是支链c3-6烷基。在另一个实施方案中，烷基是直链c1-4烷基。在另一个实施方案中，烷基是支链c3-4烷基。在另一个实施方案中，烷基是直链或支链c3-4烷基。在另一个实施方案中，烷基部分或完全被氘化，即烷基的一个或多个氢原子被氘原子取代。非限制性的示例性c1-12烷基包括甲基、-cd3、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、异丁基、3-戊基、己基、庚基、辛基、壬基和癸基。非限制性的示例性c1-4烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基和异丁基。非限制性示例性c1-4基团包括甲基、乙基、丙基、异丙基和叔丁基。
[0159]
在本发明中，术语“任选取代的烷基”本身或作为另一基团的一部分使用是指未取代的烷基或被一个、两个或三个取代基取代的烷基，所述取代基独立地选自卤素、硝基、氰基、羟基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基和任选取代的芳基。在一个实施方案中，任选取代的烷基被两个取代基取代。在另一个实施方案中，任选取代的烷基被一个取代基取代。在另一个实施方案中，任选取代的烷基是未取代的。非限制性的任选取代的烷基包括-ch2ph、-ch2ch2no 2、-ch2ch2oh、-ch2ch2och3和-ch2ch2f。
[0160]
在本发明中，术语“环烷基”本身或作为另一基团的一部分使用是指未取代的饱和或部分不饱和的，例如含有一个或两个双键的环状脂族烃，含有一至三个具有三至十二个碳原子的环，即c3-12环烷基，或指定的碳原子数。在一个实施方案中，环烷基具有两个环。在一个实施方案中，环烷基具有一个环。在另一个实施方案中，环烷基是c3-8环烷基。在另一个实施方案中，环烷基是c3-6环烷基。在另一个实施方案中，环烷基是c3-5环烷基，非限制性示例性环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、降冰片基、十氢化萘、金刚烷基、环己烯基、环戊烯基、环戊酮、螺[3.3]庚烷和双环[3.3]壬烷。
[0161]
在本发明中，术语“任选取代的环烷基”本身或作为另一基团的一部分使用是指未取代的或被一个、两个或三个取代基取代的环烷基，所述取代基独立地选自：卤素、硝基、氰基、羟基、烷基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、卤代烷基和杂环基。在一个实施方案中，任选取代的环烷基被两个取代基取代。在另一个实施方案中，任选取代的环烷基被一个取代基取代。在另一个实施方案中，任选取代的环烷基是未取代的。
[0162]
在本发明中，术语“卤代烷基”本身或作为另一基团的一部分使用是指被一个或多个氟、氯、溴和/或碘原子取代的烷基。在一个实施方案中，烷基被一个、两个或三个氟和/或氯原子取代。在另一个实施方案中，卤代烷基是c1-4卤代烷基。非限制性示例性卤代烷基包括氟甲基、2-氟乙基、二氟甲基、三氟甲基、五氟乙基、1,1-二氟乙基、2,2-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、3,3,3-三氟丙基、4,4,4-三氟丁基和三氯甲基。
[0163]
在本发明中，术语“烷氧基”本身或作为另一基团的一部分使用是指与末端氧原子连接的任选取代的烷基。在一个实施方案中，烷氧基是与末端氧原子连接的c1-6烷基。在另一个实施方案中，烷氧基是与末端氧原子连接的c1-4烷基。非限制性示例性烷氧基包括甲氧基、乙氧基和叔丁氧基。
[0164]
在本发明中，术语“杂环基”本身或作为另一基团的一部分使用是指未取代的饱和和部分不饱和的，例如含有一个或两个双键，含有一个、两个或三个环的环状基团具有3至14个环成员，即3至14元杂环，其中一个环的至少一个碳原子被杂原子取代。术语“杂环基”意指包括环状脲基，例如咪唑烷基-2-酮，环状酰胺基团，例如β-内酰胺、γ-内酰胺、δ-内酰
胺和ε-内酰胺，和环状氨基甲酸酯基团，例如噁唑烷基-2-酮。在一个实施方案中，杂环基是含有一个环和一个或两个氧和/或氮原子的4-、5-、6-、7-或8-元环状基团。在一个实施方案中，杂环基是含有一个环和一个或两个氮原子的5-或6-元环状基团。在一个实施方案中，杂环基是含有两个环和一个或两个氮原子的8-、9-、10-、11-或12-元环状基团。在一个实施方案中，杂环基是含有一个环和一个氧原子的4-或5-元环状基团。杂环基可任选地通过碳或氮原子与分子的其余部分连接。非限制性示例性杂环基包括1,4-二噁烷、2-氧代吡咯烷-3-基、2-咪唑烷酮、哌啶基、吗啉基、哌嗪基、吡咯烷基、8-氮杂双环[3.2.1]辛烷(降托烷)、6-氮杂螺[2.5]辛烷、6-氮杂螺[3.4]辛烷、二氢吲哚基、二氢吲哚-2-酮和1,3-二氢-2h-苯并[d]咪唑-2-酮。
[0165]
在本发明中，本文所用的术语“任选取代的杂环基”本身或另一基团的一部分是指未取代的或被一个、两个或三个取代基取代的杂环，所述取代基独立地选自：卤素、硝基、氰基、羟基、烷基、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、卤代烷基和杂环基。
[0166]
在本发明中，术语“(杂环)烷基”本身或作为另一基团的一部分使用是指被一个任选取代的杂环基取代的烷基。在一个实施方案中，(杂环)烷基是被一个任选取代的4-至6-元杂环基取代的c1-4烷基。杂环基可以通过碳或氮原子与烷基连接。非限制性示例性(杂环)烷基包括：
[0167][0168]
如本文所用，术语“杂芳基”是指具有5至14个环原子的单环芳族基团，其含有一个或多个选自n，o和s的环杂原子，其余的环原子为c。实例包括但不限于，呋喃基，噻吩基，吡咯基，吡啶基，吡唑基，嘧啶基，咪唑基，异噁唑基，噁唑基，噁二唑基，吡嗪基，噻吩-2-基，异噻唑基，噻唑基，噻二唑基，三唑基，三嗪基。
[0169]
如本文所用，术语“任选取代的杂芳基”是指未被取代或被一个，两个或三个取代基取代的杂芳基，所述取代基独立地选自卤素，硝基，氰基，羟基，烷基，烷氧基，氨基，烷基氨基，二烷基氨基，卤代烷基和杂环。
[0170]
如本文所用，术语“异构体”是指具有相同组成和分子量但物理和/或化学性质不同的化合物。结构上的差异可以在构造上(例如，几何异构体)或在旋转偏振光平面的能力上(立体异构体)。关于立体异构体，本发明的化合物可以具有一个或多个不对称碳原子，并且可以作为外消旋体，外消旋混合物或作为单个对映异构体或非对映异构体存在。
[0171]
如本文所用，术语“立体异构体”或“立体异构形式”是单个分子的所有异构体的通
用术语，所述异构体仅在其原子的取向上不同。它包括具有一个以上手性中心的化合物的对映体和异构体，所述手性中心彼此不为镜像(非对映异构体)。
[0172]
术语“手性中心”和“不对称碳原子”是指连接4个不同基团的碳原子。
[0173]
术语“对映异构体”和“对映异构体”是指不能在其镜像上叠加并因此具有光学活性的分子，其中对映异构体在一个方向上旋转偏振光平面并且其镜像化合物以相反方向围绕偏振光平面旋转。
[0174]
术语“外消旋”是指等份的对映体的混合物，并且该混合物是光学无活性的。
[0175]
术语“绝对构型”是指手性分子实体(或基团)的原子的空间排列及其立体化学描述，例如r或s。
[0176]
本说明书中使用的立体化学术语和惯例旨在与pure&appl.chem 68:2193(1996)中描述的那些一致，另有说明的除外。
[0177]
术语“对映体过量”或“ee”是指一种对映体与另一种对映体相比存在多少的量度。对于r和s对映体的混合物，对映体过量百分比定义为|r-s|*100，其中r和s是混合物中对映体的相应摩尔或重量分数，使得r s＝l.使用手性物质的旋光度知识，对映体过量百分比定义为([α]
obs
/[α]
max
)*100,其中[α]
obs
是对映体混合物的旋光度，和[α]
max
可以是纯对映体的旋光度。使用各种分析技术可以确定对映体过量，包括nmr光谱、手性柱色谱或光学偏振测定。
[0178]
术语“对映体纯的”或“对映纯的”是指手性物质的样品，其所有分子(在检测限内)具有相同的手性感。在一个实施方案中，具有一个或多个手性中心的本发明化合物是对映体纯的。
[0179]
术语“对映体富集的”或“对映体富集的”是指手性物质的样品，其对映体过量大于50％，例如，约60％或更多，约70％或更多，约80％或更多，约90％或更多，约95％或更多，约98％或更多，或约99％或更多。富含对映异构体的化合物可以是对映体纯的。在一个实施方案中，具有一个或多个手性中心的本发明化合物是对映体富集的。
[0180]
如本文所用的术语“药学上可接受的盐”是指在目标患者(例如哺乳动物，例如人)中生理学上耐受的本发明化合物的任何盐，例如通过与酸或碱反应获得的盐。
[0181]
术语“盐”等的使用旨在等同地应用于本发明化合物的对映异构体，立体异构体，旋转异构体，互变异构体，位置异构体和外消旋体的盐。
[0182]
本文所用的术语“溶剂化物”是本发明化合物与溶剂分子，例如二溶剂化物，单溶剂化物或半溶剂化物的组合，物理缔合和/或溶剂化，其中溶剂分子与本发明化合物的比例分别为约2：1，约1：1或约1：2。这种物理缔合涉及不同程度的离子键和共价键，包括氢键。在某些情况下，可以分离溶剂化物，例如当将一种或多种溶剂分子掺入结晶固体的晶格中时。因此，“溶剂化物”包括溶液相和可分离的溶剂化物。
[0183]“患者”或“受试者”是哺乳动物，例如人，小鼠，大鼠，豚鼠，狗，猫，马，牛，猪或非人灵长类动物，例如猴子，黑猩猩，狒狒或恒河猴。
[0184]
如本文所用，术语“治疗”、“治疗”、“治疗”等是指消除、减轻或改善疾病或病症，和/或与其相关的症状。尽管不排除，但治疗疾病或病症不需要完全消除与其相关的疾病、病症或症状。术语“治疗”和同义词考虑将治疗有效量的本发明化合物施用于需要这种治疗的受试者。可以对症治疗，例如，抑制症状。它可以在短时间内实现，在中期内定向，或者可
以是长期治疗，例如在维持治疗的背景下。
[0185]
如本发明中所使用的，术语“施用”，“施用”或“施用”是指直接向受试者施用所发明的化合物，所发明的化合物的药学上可接受的盐或组合物，药学上可接受的盐。化合物或组合物对受试者的作用，可以在受试者体内形成等量的活性化合物。
[0186]
如本文所用，术语“预防”、“预防”和“预防”是指预防疾病或病症和/或其伴随症状发作或阻止受试者获得疾病的方法。如本文所用，“预防”，“预防”和“预防”还包括延迟疾病发作和/或其伴随症状并降低受试者获得疾病的风险。术语“预防”、“预防”和“预防”可以包括“预防性治疗”，其是指在受试者中降低重建疾病或病症或先前控制的疾病或病症的复发的可能性。没有，但有风险或易于重新发展疾病或病症或疾病或病症的复发。
[0187]
如本文所用的术语“治疗有效量”或“有效剂量”是指当通过本发明的方法施用时，有效递送活活性成分的量是足够的，以有效递送用于治疗有此需要的个体感兴趣的病症或疾病的活性成分。
[0188]
在本发明中使用的术语“载体”包括载体，赋形剂和稀释剂，并且是指与载体或赋形剂有关的材料，组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂，稀释剂，赋形剂，溶剂或包囊材料。将药剂从受试者的一个器官或身体的一部分转移到另一个器官或身体的另一部分。
[0189]
在本发明中，术语“bcl-2蛋白”或“bcl-2蛋白家族”是指以下蛋白中的任何一种或多种:bax,bak,bid,bcl-2,bcl-xl,mcl-1,bcl-w,bfl-l/al,bim,puma,bad,bik/blk,noxa,bmf,hrk/dp5,和beclin-1.参见cold spring harb perspect biol 2013；5:a008714。
[0190]
术语“疾病”或“病症”或“障碍”表示通常被视为病理状况或功能的紊乱和/或异常，并且可以以特定体征、症状/或异常功能形式表现出来。本发明的化合物抑制bcl-2蛋白，例如bcl-2和/或bcl-xl，并且可以用于治疗或预防疾病、病症或障碍，例如：非酒精性脂肪性肝炎。
[0191]
在一些实施方案中,本发明的化合物可用于治疗“bcl-2蛋白介导的疾病”，例如bcl-2介导的疾病和/或bcl-xl介导的疾病。bcl-2蛋白介导的疾病是已知其中bcl-2蛋白起作用的任何病理状况。
[0192]
发明内容
[0193]
一方面，本发明涉及式i的化合物
[0194]
[0195]
或其药学上可接受的盐，水合物，溶剂化物，立体异构体或互变异构体，其中:
[0196]
a选自以下组成的组：
[0197][0198]
e选自以下组成的组：:
[0199]
碳原子,且是双键；或是
[0200]
–
c(h)
–
,且是单键；或
[0201]
氮原子,且是单键；
[0202]
y选自
–
c(h)
–
和
–o–
；
[0203]
r1选自氢和
–
n(r
7a
)(r
7b
)；
[0204]
r2,r3,r4,r5,和r6各自独立地选自氢,任选取代c
1-6
烷基,任选取代c
3-6
环烷基,杂环基,任选取代的杂芳基,(杂环)烷基；
[0205]r7a
选自任选取代c
1-6
烷基和任选取代(杂环)烷基；和
[0206]r7b
选自h和c
1-4
烷基。
[0207]
在一些实施方案中，a为在一些实施方案中，a为在一些实施方案中，a为在一些实施方案中，a为在一些实施方案中，a为在一些实施方案中，a为
[0208]
在一些实施方案中,e是碳原子,其中是双键.在一些实施方案中,e is
–
c(h)
–
,其中是单键.在一些实施方案中,e是氮原子,其中是单键。
[0209]
在一些实施方案中,r1是氢.在一些实施方案中,r1是
–
n(r
7a
)(r
7b
)。
[0210]
在一些实施方案中,r2是任选取代c
1-6
烷基。在一些实施方案中,r2是任选取代基c
1-4
烷基.在一些实施方案中,r2是任选取代c3烷基.在一些实施方案中,r2是异丙基.在一些实施方案中,r2是任选取代c
3-6
环烷基.在一些实施方案中,r2是任选取代c
3-5
环烷基.在一些实施方案中,r2是环丙基.在一些实施方案中,r2是任选取代的杂芳基.在一些实施方案中,r2是吡啶基。
[0211]
在一些实施方案中,r3是(杂环)烷基.在一些实施方案中,r3是
[0212]
在一些实施方案中,r4是(杂环)烷基.在一些实施方案中,r
4 is
[0213]
在一些实施方案中,r5是(杂环)烷基.在一些实施方案中,r
5 is在一些实施方案中,r5是杂环基.在一些实施方案中,r5是四氢-2h-吡喃基。
[0214]
在一些实施方案中,r6是(杂环)烷基.在一些实施方案中,r
6 is在一些实施方案中,r6是杂环基.在一些实施方案中,r6是四氢-2h-吡喃基。
[0215]
在一些实施方案中,r
7a
是任选取代的c
1-6
烷基在一些实施方案中,r
7a
是任选取代的c
1-4
烷基。在一些实施方案中,r
7a
是任选取代基的甲基。在一些实施方案中,r
7a
是甲基。在一些实施方案中,r
7a
任选取代基的(杂环)烷基。在一些实施方案中,r
7a
是在一些实施方案中,r
7a
是在一些实施方案中,r
7a
是
[0216]
在一些实施方案中,r
7b
是氢。在一些实施方案中,r
7b
是c
1-4
烷基.在一些实施方案中,r
7b
是c
1-3
烷基.在一些实施方案中,r
7b
是甲基。
[0217]
在一些实施方案中，本发明涉及选自表1的式(i)化合物或其药学上可接受的盐，水合物，溶剂化物，立体异构体或互变异构体。
[0218]
表1
[0219]
[0220]
[0221]
[0222]
[0223]
[0224]
[0225][0226]
式(i)的化合物可包含一个或多个不对称中心，因此可产生对映异构体，非对映异构体和其他立体异构体形式。本发明意在涵盖所有此类可能形式的使用，包括外消旋和拆分形式及其混合物。鉴于本发明，例如对映异构体，可以根据本领域已知的方法分离各个立体异构体。当本文所述的化合物包含烯属双键或其他几何不对称中心时，除非另有说明，否则它们应同时包括e和z几何异构体。所有互变异构体也意图被本发明内容涵盖。测定结果可以反映就外消旋形式，对映体纯形式或就立体化学而言任何其他形式所收集的数据。本发明化合物的各个立体异构体，例如基本上不含其他异构体，或者可以例如作为外消旋体或与所有其他或其他选择的立体异构体混合。
[0227]
在一些实施方案中，具有一个或多个手性中心的式(i)化合物为对映体富集。
[0228]
另外，本发明内容涵盖所有几何和位置异构体。例如，如果式(i)的化合物结合有双键或稠环，则顺式和反式形式以及其混合物均包括在本发明的范围内。如果化合物包含双键，则除非另有说明，否则取代基可以为e或z构型。如果化合物包含二取代的环烷基，则除非另有说明，否则环烷基取代基可具有顺式或反式构型。
[0229]
在一些实施方案中，本发明涉及式(i)的化合物，其进一步为式(ii):
[0230][0231]
或其药学上可接受的盐，水合物，溶剂化物，立体异构体或互变异构体。
[0232]
在一些实施方案中，本发明涉及式(ii)化合物选自化合物(1)和化合物(2):
[0233][0234]
或其药学上可接受的盐，水合物，溶剂化物或互变异构体。.
[0235]
在一些实施方案中，本发明涉及化合物(1)
[0236][0237]
或其药学上可接受的盐，水合物，溶剂化物或互变异构体。
[0238]
在一些实施方案中，本发明涉及化合物(2)
[0239][0240]
或其药学上可接受的盐，水合物，溶剂化物或互变异构体。
[0241]
在一些实施方案中，本发明涉及化合物(1)和化合物(2)的混合物。
[0242]
在一些实施方案中，本发明涉及选自以下的化合物:
[0243]
(s)-n-((4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰胺；和
[0244]
(r)-n-((4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰胺,
[0245]
或其药学上可接受的盐，水合物，溶剂化物或互变异构体。
[0246]
在一些实施例中，本发明涉及(s)-n-((4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰胺,或其药学上可接受的盐，水合物，溶剂化物或互变异构体。
[0247]
在一些实施例中，本发明涉及(r)-n-((4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰胺,或其药学上可接受的盐，水合物，溶剂化物或互变异构体。
[0248]
在一些实施方案中，本发明涉及以下物质的混合物(s)-n-((4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰胺和(r)-n-((4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰胺,
[0249]
本发明内容包括通过使一个或多个原子被具有不同原子质量或质量数的原子替换而被同位素标记(即，放射性标记)的任何本发明化合物。可以掺入所发明的化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟和氯的同位素，例如：2h(或氘(d)),3h,
11
c,
13
c,
14
c,
15
n,
18
o,
17
o,
35
s,和
36
c1,分别地,例外为.,3h,
11
c,和
14
c。在一个实施方案中，提供了一种组合物，其中式(i)化合物内的基本上所有原子被具有不同原子质量或质量数的原子替换。在另
一个实施方案中，提供了一种组合物，其中式(i)化合物内的位置处的一部分原子被替换，即式(i)化合物在具有不同原子质量或质量数的原子的位置富集。同位素标记的式(i)化合物可通过本领域已知的方法制备。
[0250]
本发明包括制备和使用本发明的化合物的盐，包括无毒的药学上可接受的盐。药学上可接受的加成盐的实例包括无机和有机酸加成盐和碱性盐。药学上可接受的盐包括但不限于金属盐，例如钠盐、钾盐、铯盐等；碱土金属，如钙盐、镁盐等；有机胺盐如三乙胺盐、吡啶盐、甲基吡啶盐、乙醇胺盐、三乙醇胺盐、二环己胺盐、n,n'-二苄基乙二胺盐等；无机酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；有机酸盐如柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、富马酸盐、扁桃酸盐、乙酸盐、二氯乙酸盐、三氟乙酸盐、草酸盐、甲酸盐等；磺酸盐如甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐等；和氨基酸盐，如精氨酸盐、天冬氨酸盐、谷氨酸盐等。
[0251]
当本发明的化合物含有相对酸性的官能团时，可以通过使这类化合物的中性形式与足够量的纯净或在合适的惰性溶剂中的所需碱接触来获得碱加成盐。药学上可接受的无机碱的盐包括铝，铵，钙，铜，铁(iii)，铁(ii)，锂，镁，锰，钾，钠，锌等。药学上可接受的有机碱的盐包括伯，仲，叔和季胺的盐，包括取代的胺，环胺，天然存在的胺等，例如精氨酸，甜菜碱，咖啡因，胆碱，n，n'-二苄基乙二胺，二乙胺，2-二乙基氨基乙醇，2-二甲基氨基乙醇，乙醇胺，乙二胺，n-乙基吗啉，n-乙基哌啶，葡糖胺，葡糖胺，组氨酸，胺，异丙胺，赖氨酸，甲基葡糖胺，吗啉，哌嗪，哌啶，聚胺树脂，普鲁卡因，嘌呤，可可碱，三乙胺，三甲胺，三丙胺，氨丁三醇等。
[0252]
当本发明的化合物包含相对碱性的官能度时，可以通过使这种化合物的中性形式与足够量的纯净或在合适的惰性溶剂中的所需酸接触来获得酸加成盐。适用于制备药学上可接受的酸加成盐的酸包括乙酸，抗坏血酸，苯磺酸，苯甲酸，樟脑磺酸，柠檬酸，乙磺酸，富马酸，葡糖酸，葡糖酸，谷氨酸，马尿酸，氢溴酸，盐酸，等离子，乳酸，乳糖酸，马来酸，苹果酸，扁桃，甲磺酸，粘胶，萘磺酸，烟碱，硝酸，二氧化硫，泛酸，磷酸，琥珀酸，硫酸，酒石酸，对甲苯磺酸等。
[0253]
本发明的化合物可以形成酸加成盐或碱加成盐，其可以是药学上可接受的盐。
[0254]
本发明内容涵盖式(i)的化合物的溶剂化物的制备和用途。溶剂化物通常不会显着改变化合物的生理活性或毒性，因此可作为药理等效物。式(i)的化合物可以与药学上可接受的溶剂例如水，甲醇，乙醇等以溶剂化形式存在，并且意图是本发明包括式(i)化合物的溶剂化形式和非溶剂化形式。
[0255]
在一个实施方案中，溶剂化物是水合物。“水合物”涉及溶剂化物的特定亚组，其中溶剂分子是水。溶剂化物通常可以起药理学等价物的作用。溶剂化物的制备在本领域中是已知的。参见,例如,m.caira et等人,j.pharmaceut.sci.,93(3):601-611(2004),其描述了氟康唑溶剂化物的制备。e.c.van tonder等人.,描述了溶剂化物、半溶剂化物、水合物等的类似制备。和a.l.bingham等人，aaps pharm.sci.tech.,5(1):article 12(2004),chem.commun.603-604(2001).制备溶剂化物的典型的非限制性方法包括将式(i)化合物在高于20℃至约25℃的温度下溶解在所需的溶剂(有机物、水或其混合物)中，然后冷却溶液。以足以形成晶体的速率，并通过已知方法分离晶体，例如过滤。诸如红外光谱的分析技术可用于确认溶剂化物晶体中溶剂的存在。
[0256]
式(i)的化合物能够调节bcl-2家族蛋白的活性。在一些实施方案中，式(i)的化合
物能够调节bcl-2和/或bcl-xl的活性。在一些实施方案中，式(i)的化合物能够抑制bcl-2和/或bcl-xl。
[0257]
化合物(1),(s)-n-((4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰胺,能够调节bcl-2家族蛋白的活性.在一些实施方案中，化合物(1)能够调节bcl-2和/或bcl-xl的活性。在一些实施方案中，化合物(1)能够抑制bcl-2和/或bcl-xl。
[0258]
化合物(2),(r)-n-((4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰胺,能够调节bcl-2家族蛋白的活性.在一些实施方案中，化合物(2)能够调节bcl-2和/或bcl-xl的活性。在一些实施方案中，化合物(2)能够抑制bcl-2和/或bcl-xl。
[0259]
本发明包括以下发现式(i)的化合物及其药学上可接受的盐，溶剂化物，水合物，立体异构体和互变异构体，或包含式(i)的化合物的药物组合物可用于治疗疾病或病症与bcl-2家族蛋白的活性有关，例如非酒精性脂肪性肝炎。
[0260]
本发明包括发现化合物(1),(s)-n-((4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰胺,及其药学上可接受的盐，溶剂化物，水合物，立体异构体和互变异构体，或包含化合物(1)的药物组合物，可用于治疗与bcl-2家族蛋白活性相关的疾病或病症，例如非酒精性脂肪性肝炎。
[0261]
本发明包括发现化合物(2),(r)-n-((4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰胺,及其药学上可接受的盐，溶剂化物，水合物，立体异构体和互变异构体,或包含化合物(2)的药物或药物组合物可用于治疗与bcl-2家族蛋白的活性有关的疾病或病症，例如非酒精性脂肪性肝炎。
[0262]
制备化合物的方法
[0263]
本发明的化合物可以通过多种方法制备，包括标准化学方法。在下面给出的实施例中描述了合适的合成路线。
[0264]
本发明的化合物，例如.,式(i)化合物或其药学上可接受的盐，水合物，溶剂化物，立体异构体或互变异构体可以通过有机合成领域中已知的方法制备，如部分通过实施例中所述的合成方案所述的那样。在以下描述的方案中，充分理解的是，根据一般原理或化学，在必要时使用敏感或反应性基团的保护基。根据有机合成的标准方法(t.w.greene和p.g.m.wuts，“有机合成中的保护基”，第三版，wiley，纽约，1999)控制保护基。.使用本领域技术人员显而易见的方法在化合物合成的方便阶段除去这些基团。选择过程以及反应条件和执行顺序应与式(i)化合物的制备一致。
[0265]
本领域技术人员将认识到式(i)化合物中存在立体中心。因此，本发明包括可能的立体异构体(除非在合成中另有说明和/或指明)，并且不仅包括外消旋化合物，而且还包括单独的对映异构体和/或非对映异构体。.除非另有说明，否则当需要将化合物作为单一对映异构体或非对映异构体时，可以通过立体有择合成或通过拆分最终产物或任何方便的中
间体来获得。最终产物，中间体或起始原料的拆分可能会受到本领域已知的任何合适方法的影响，参见,例如,"有机化合物的立体化学"e.l.eliel,s.h.wilen,和l.n.mander(wiley-lnterscience,1994)。
[0266]
鉴于本发明内容，使用本领域技术人员已知的方法或通过以下通用方案中所示的说明性方法来制备本发明内容的化合物。例如，制备本发明化合物的方法发明在美国专利号10,221,174中，其全部内容通过引用并入本文。
[0267]
在下面显示的通用方案1-4中，y，r2和r4a定义如下：
[0268]
y＝ch2或o
[0269]
r2＝
–
no2[0270]r4a
＝如上关于式(i)所定义的a.
[0271]
通用方案1
[0272][0273]
在通用方案1,化合物a在碱(例如：三乙胺)存在下与r
4a
nh2反应,得到化合物b。
[0274]
通用方案2
[0275][0276]
在通用方案2中，使4-溴-2-氟苯甲酸甲酯与化合物c反应，得到化合物d，化合物d的酯水解得到化合物e。化合物e与来自通用方案1的化合物b偶合得到化合物f。
[0277]
通用方案3
[0278][0279]
在通用方案3中，化合物g被转化为化合物h。
[0280]
通用方案4
[0281][0282]
在通用方案4中,使来自通用方案3的化合物h与boc-保护哌嗪反应得到化合物j,除去boc基团，得到化合物k。使化合物k与2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-氟苯甲酸甲酯反应，得到化合物l，水解化合物l的酯，得到化合物m。将化合物m与来自通用方案1的化合物b偶联，得到式(i)化合物，其中e是氮原子和是单键。
[0283]
通用方案5
[0284][0285]
在通用方案5中，使来自通用方案3的化合物h与4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1,2,3,6-四氢吡啶反应，得到化合物i。化合物i与来自通用方案2的化合物f偶联，得到式(i)化合物，其中e是碳原子和是双键。
[0286]
披露化合物的使用方法
[0287]
式(i)化合物是bcl-2蛋白质的抑制剂，例如bcl-2和/或bcl-xl，因此，在一些实施例中，所述化合物是可用于在体外或体内研究由bcl-2蛋白质介导过程的工具化合物.在体外，式(i)的工具化合物可用于研究bcl-2家族蛋白抑制对纯化蛋白，细胞提取物，完整细胞和细胞系模型等的影响。在体内，公式(i)的工具化合物可能有助于研究bcl-2家族蛋白抑制在细胞系来源的异种移植物、患者来源的异种移植物、敲除小鼠模型、敲除小鼠模型等的作用。
[0288]
式(i)的化合物是bcl-2蛋白(例如bcl-2和/或bcl-xl)的抑制剂，因此可以通过将这些化合物给予受试者治疗或预防由bcl-2蛋白介导的许多疾病，病症或失调。因此，本发明总体上涉及一种用于治疗或预防患有bcl-2蛋白(例如bcl-2和/或bcl-xl)的动物的对bcl-2蛋白(例如bcl-2和/或bcl-xl)的抑制有响应的疾病，病症或失调的方法。所述方法包括向动物施用有效量的一种或多种本发明的化合物。
[0289]
在一个实施方案中，本发明的化合物的bcl-2和/或bcl-xl ic50小于约10μm。在另一个实施方案中，本发明的化合物的bcl-2和/或bcl-xl ic50小于约5μm。在另一个实施方案中，本发明的化合物的bcl-2和/或bcl-xl ic50小于约1μm。在另一个实施方案中，本发明
的化合物的bcl-2和/或bcl-xl ic50小于约0.5μm。在另一个实施方案中，本发明的化合物的bcl-2和/或bcl-xl ic50小于约0.1μm。在另一个实施方案中，本发明的化合物的bcl-2和/或bcl-xl ic50小于约0.05μm。在另一个实施方案中，本发明的化合物的bcl-2和/或bcl-xl ic50小于约0.025μm。在另一个实施方案中，本发明的化合物的bcl-2和/或bcl-xl ic50小于约0.010μm。在另一个实施方案中，本发明的化合物的bcl-2和/或bcl-xl ic50小于约0.005μm。在另一个实施方案中，本发明的化合物的bcl-2和/或bcl-xl ic50小于约0.0025μm。在另一个实施方案中，本发明的化合物的bcl-2和/或bcl-xl ic50小于约0.001μm。
[0290]
本发明内容还涉及在需要治疗的动物例如人中抑制bcl-2家族蛋白的方法，所述方法包括向所述动物施用治疗有效量的至少一种本发明所述化合物。在另一个实施方案中，本发明内容涉及在需要其的动物例如人中抑制bcl-2家族蛋白的方法，该方法包括向该动物施用治疗有效量的药物组合物，该药物组合物至少包含本发明的一种化合物。
[0291]
本发明内容还涉及在需要其的动物例如人中抑制bcl-2的方法，该方法包括向该动物施用治疗有效量的至少一种本发明内容的化合物。在另一个实施方案中，本发明内容涉及在需要其的动物例如人中抑制bcl-2的方法，该方法包括向该动物施用治疗有效量的包含至少一种本发明化合物的药物组合物。
[0292]
本发明内容还涉及在需要其的动物例如人中抑制bcl-xl的方法，所述方法包括向所述动物施用治疗有效量的至少一种本发明内容的化合物。在另一个实施方案中，本发明内容涉及在需要其的动物例如人中抑制bcl-xl的方法，该方法包括向该动物施用治疗有效量的包含至少一种本发明化合物的药物组合物。
[0293]
在一个方面，本发明内容提供了一种在受试者例如人中治疗或预防疾病的方法，该方法包括给予治疗有效量的本发明化合物或包含至少一种本发明化合物的药物组合物。在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗，预防或改善受试者的非酒精性脂肪肝疾病的方法，例如非酒精性脂肪肝。人，其包括施用治疗有效量的本发明的化合物或包含至少一种本发明的化合物的药物组合物。
[0294]
本发明提供了一种治疗或改善受试者非酒精性脂肪性肝炎的方法，例如人。其包括向有此需要的患者施用治疗有效量的本发明化合物或包含至少一种本发明化合物的药物组合物。
[0295]
被诊断为非酒精性脂肪性肝炎的患者经常被诊断为患有许多其他常见合并症。例如，通常将患有非酒精性脂肪性肝炎或非酒精性脂肪肝的患者与选自但不限于心血管疾病，慢性肾脏病，2型糖尿病，肥胖症和/或新陈代谢的疾病同时诊断综合征，其中代谢综合征可以包括但不限于高血压，高血糖症，高脂血症和/或胰岛素抵抗(ir)。因此，在一些实施方案中，本发明涉及治疗或改善受试者的非酒精性脂肪性肝炎的方法，其中所述受试者另外被诊断患有一种或多种选自心血管疾病，慢性肾脏疾病，2型的其他疾病或病状。糖尿病，肥胖症和代谢综合征。在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗或改善受试者的非酒精性脂肪性肝炎的方法，其中该受试者另外被诊断出患有心血管疾病。在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗或改善受试者的非酒精性脂肪性肝炎的方法，其中该受试者另外被诊断患有慢性肾脏疾病。在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗或改善受试者的非酒精性脂肪性肝炎的方法，其中该受试者另外被诊断患有2型糖尿病。在一个实施方案中，本发明涉及
一种治疗或改善受试者的非酒精性脂肪性肝炎的方法，其中所述受试者另外被诊断患有肥胖症。在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗或改善受试者的非酒精性脂肪性肝炎的方法，其中所述受试者还被诊断患有代谢综合征。
[0296]
本发明的化合物可以以原料化学品的形式施用于受试者，而不存在任何其它组分。本发明化合物还可以作为含有与一种或多种适合的药学上可接受的载体组合的化合物的药物组合物的一部分施用于受试者。此类载体可选自药学上可接受的赋形剂和助剂。术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的载体”包括任何标准药物载体、溶剂、表面活性剂或载体。适合的药学上可接受的载体包括含水载体和非水载体。标准药物载体及其制剂描述于remington’s pharmaceutical sciences,mack publishing co.,easton,pa.第19版，1995年。
[0297]
本发明内容范围内的药物组合物包括其中本发明内容的化合物与一种或多种药学上可接受的载体组合的所有组合物。在一个实施方案中，本发明的化合物以有效实现其预期治疗目的的量存在于组合物中。尽管个体需求可能变化，但是确定每种化合物的有效量的最佳范围在本领域技术范围内。通常，本发明的化合物可以以每kg哺乳动物体重约0.0025至约1500mg的剂量或等量的药学上可接受的盐，水合物口服给予哺乳动物例如人。每天，其溶剂化物，立体异构体或其互变异构体，以治疗特定的疾病。给予哺乳动物的本发明化合物的有效口服剂量为每千克哺乳动物体重约0.0025至约200mg，或等量的其药学上可接受的盐或溶剂化物。在一些实施方案中，本发明的化合物可以每千克哺乳动物体重约10mg的剂量或其等价量的药学上可接受的盐或溶剂合物施用于哺乳动物。在一些实施方案中，可以以每kg哺乳动物约30mg的剂量或其等价量的其药学上可接受的盐或溶剂化物的形式向哺乳动物施用本发明的化合物。对于肌内注射，剂量通常约为口服剂量的一半。在一些实施方案中，本发明的化合物或其药学上可接受的盐，水合物，溶剂化物，立体异构体或互变异构体每天给药一次。
[0298]
单位口服剂量可包含约0.01mg至约1g的本发明化合物，例如约0.01mg至约500mg，约0.01mg至约250mg，约0.01mg至约100mg，0.01mg至0.1mg。约50mg，例如约0.1mg至约10mg的化合物。单位剂量可以每天一次或多次给药，例如，以一种或多种片剂或胶囊剂的形式给药，每个片剂或胶囊剂包含约0.01mg至约1g的化合物或等量的药学上可接受的盐，水合物，溶剂化物，立体异构体或其互变异构体。
[0299]
在一些实施方案中，将本发明的化合物或包含至少一种本发明的化合物的药物组合物以足以引起选自肝脂肪变性减少的一种或多种作用的剂量给予有需要的患者，减少小叶炎症，减少肝细胞膨胀和减少肝纤维化。
[0300]
在一个实施方案中，将本发明的化合物或包含至少一种本发明的化合物的药物组合物以足以减轻患者肝脂肪变性的剂量施用于有需要的患者。
[0301]
在一个实施方案中，将本发明的化合物或包含至少一种本发明的化合物的药物组合物。以足以减轻患者小叶炎症的剂量施用于有需要的患者。
[0302]
在一个实施方案中，将本发明的化合物或包含至少一种本发明的化合物的药物组合物以足以减少患者肝细胞球囊扩张的剂量施用于有需要的患者。
[0303]
在一个实施方案中，将本发明的化合物或包含至少一种本发明的化合物的药物组合物以足以减轻患者肝纤维化的剂量施用于有需要的患者。
[0304]
本发明内容的化合物或包含本发明内容的化合物的药物组合物可以给予可能经历本发明内容的化合物的有益作用的任何患者或受试者。在此类患者或受试者中，最重要的是哺乳动物，例如人和伴侣动物，尽管本发明内容并不意图限于此。在一个实施方案中，患者或受试者是人类。
[0305]
本发明的化合物或包含本发明的化合物的药物组合物可以通过实现其预期目的的任何方式施用。例如，可以通过口服，肠胃外，皮下，静脉内，肌内，腹膜内，经皮，鼻内，透粘膜，直肠，阴道内或口腔途径给药或通过吸入给药。取决于特定受试者的情况，并考虑到以下因素，例如年龄，性别，健康状况和接受者的体重，待治疗的疾病或病症，同时治疗的种类，如果有的话，治疗的频率以及所需效果的性质。
[0306]
在一个实施方案中，本发明的化合物或包含本发明的化合物的药物组合物可以口服施用。在另一个实施方案中，本发明的药物组合物可以口服施用，并配制成片剂，糖衣丸，胶囊或口服液体制剂。在一个实施方案中，口服制剂包含本发明化合物的挤出的多颗粒。
[0307]
或者，本发明的化合物或包含本发明的化合物的药物组合物可以经直肠给药，并制成栓剂。
[0308]
或者，本发明的化合物或包含本发明化合物的药物组合物可通过注射施用。
[0309]
或者，本发明的化合物或包含本发明化合物的药物组合物可以透皮施用。
[0310]
或者，本发明的化合物或包含本发明化合物的药物组合物可通过吸入或通过鼻内或经粘膜施用。
[0311]
或者，本发明的化合物或包含本发明化合物的药物组合物可通过阴道内途径施用。
[0312]
本发明的药物组合物可以包含约0.01至99重量％，例如约0.25至75重量％的本发明的化合物，例如约1％，约5％，约10％，约15％，约20％，约25％，约30％，约35％，约40％，约45％，约50％，约55％，约60％，约65％，约70％，或约75重量％的本发明的化合物。
[0313]
本发明的药物组合物可以包含一种或多种式(i)的化合物。在一些实施方案中，药物组合物包含前述结构的化合物1和化合物2，或其药学上可接受的盐，水合物，溶剂化物或互变异构体。在一个实施方案中，药物组合物以至少90％的纯度包含前述结构的化合物1或其药学上可接受的盐，溶剂化物，水合物或互变异构体，其中所述组合物包含小于10％，例如小于或等于10％。小于上述化合物2的9％，小于8％，小于7％，小于6％，小于5％，小于4％，小于3％，小于2％或小于1％结构体。
[0314]
本发明内容的药物组合物以本身就本发明内容已知的方式制造，例如，通过常规的混合，制粒，制糖衣片，溶解，挤出或冻干方法。因此，通过将活性化合物与固体赋形剂混合，任选地研磨所得混合物，并在需要或必要时加入合适的助剂后，将所得颗粒混合物加工成颗粒状混合物，以获得片剂或糖衣丸芯，这样得到用于口服的药物组合物。
[0315]
合适的赋形剂包括填充剂，例如糖(例如，乳糖，蔗糖，甘露醇或山梨糖醇)，纤维素制剂，磷酸钙(例如，磷酸三钙或磷酸氢钙)，以及粘合剂，例如淀粉糊(使用(例如玉米淀粉，小麦淀粉，大米淀粉或马铃薯淀粉)，明胶，黄芪胶，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮。如果需要，可以添加一种或多种崩解剂，例如上述淀粉，以及羧甲基淀粉，交联的聚乙烯吡咯烷酮，琼脂或海藻酸或其盐，例如海藻酸钠。
[0316]
助剂通常是流量调节剂和润滑剂，例如二氧化硅，滑石粉，硬脂酸或其盐(例如硬
脂酸镁或硬脂酸钙)和聚乙二醇。糖衣杏仁核具有抗胃液的合适包衣。为此目的，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选地包含阿拉伯胶，滑石粉，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇和/或二氧化钛，漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。为了产生耐胃液的包衣，可以使用合适的纤维素制剂例如乙酰纤维素邻苯二甲酸酯或羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯的溶液。可以将染料或颜料添加到片剂或糖衣丸包衣中，例如用于鉴定或表征活性化合物剂量的组合。
[0317]
可以口服使用的其他药物制剂的实例包括由明胶制成的推入配合胶囊，或由明胶和增塑剂如甘油或山梨糖醇制成的密封的软胶囊。推入配合胶囊可以包含颗粒形式的化合物，其可以与填充剂(例如乳糖)，粘合剂(例如淀粉)和/或润滑剂(例如滑石粉或硬脂酸镁)以及稳定剂混合，或者以以下形式混合：挤压的多颗粒。在软胶囊中，优选将活性化合物溶解或悬浮在合适的液体中，例如脂肪油或液体石蜡。另外，可以添加稳定剂。
[0318]
用于直肠给药的可能的药物制剂包括例如栓剂，其由一种或多种活性化合物与栓剂基质的组合组成。合适的栓剂基质包括天然和合成的甘油三酸酯和石蜡烃。也可以使用由活性化合物与基础材料(例如液体甘油三酸酯，聚乙二醇或石蜡烃)的组合组成的明胶直肠胶囊。
[0319]
用于肠胃外给药的合适制剂包括水溶性形式的活性化合物的水溶液，例如水溶性盐，碱性溶液或酸性溶液。或者，可以将活性化合物的悬浮液制备为油性悬浮液。用于例如悬浮液的合适的亲脂性溶剂或媒介物可包括脂肪油(例如芝麻油)，合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯)，甘油三酸酯或聚乙二醇，例如聚乙二醇-400(peg-400)。水性悬浮液可包含一种或多种增加悬浮液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠，山梨糖醇和/或葡聚糖。悬浮液可任选地包含稳定剂。
[0320]
在另一个实施方案中，本发明提供了试剂盒，其包含以有助于其用于实施本发明方法的方式包装的本发明化合物(或包含本发明化合物的药物组合物)。在一个实施方案中，试剂盒包括包装在诸如密封瓶或容器的容器中的本发明化合物(或包含本发明化合物的药物组合物)，标签附于容器上或包含在试剂盒中，本文描述了化合物或组合物用于实施本发明内容的方法的用途。在一个实施方案中，化合物或组合物包装成单位剂型。试剂盒可进一步包括适于根据预期的施用途径施用组合物的装置。
[0321]
在另一个实施方案中，将本发明的化合物或包含本发明的化合物的药物组合物与第二治疗剂一起施用给受试者。第二治疗剂不同于本发明的化合物。可以同时或顺序施用本发明的化合物和第二治疗剂以达到所需的效果。在一些实施方案中，第二治疗剂在本发明的化合物或包含本发明的化合物的药物组合物之前施用。在一些实施方案中，第二治疗剂在本发明的化合物或包含本发明的化合物的药物组合物之后施用。在一些实施方案中，第二治疗剂与本发明的化合物或包含本发明的化合物的药物组合物同时施用。另外，本发明的化合物和第二治疗剂可以作为单一组合物或两种独立的组合物施用。
[0322]
以提供其期望的治疗效果的量施用第二治疗剂。每种第二治疗剂的有效剂量范围是本领域已知的，并且在这种既定范围内将第二治疗剂施用于需要其的个体。
[0323]
本发明内容的化合物和第二治疗剂可以作为单一单位剂量一起施用或作为多单位剂量分开地施用，其中本发明内容的化合物在第二治疗剂之前施用，反之亦然。可以施用一剂或多剂本发明的化合物和/或一剂或多剂第二种治疗剂。因此，本发明内容的化合物可以与一种或多种第二治疗剂联合使用，所述第二治疗剂例如但不限于用于治疗非酒精性脂
肪性肝病的治疗剂。
[0324]
在一些实施方案中，第二治疗剂是用于治疗非酒精性脂肪肝疾病的治疗剂。在一些实施方案中，第二治疗剂是用于治疗非酒精性脂肪性肝炎的治疗剂。例如，用于治疗非酒精性脂肪性肝炎的治疗剂，或目前正在研究用于治疗非酒精性脂肪性肝炎的治疗剂，可包括但不限于脂肪酶抑制剂，微生物组调节剂，ppar激动剂，glp-1/dpp-4剂，fxr胆汁酸剂，抗脂质剂，抗炎药，抗caspase剂，抗氧化剂，thr-β激动剂和抗纤维化剂。
[0325]
用于治疗非酒精性脂肪变性的脂肪酶抑制剂的非限制性实例包括奥利司他(orlistat)，一种用于肥胖症的脂肪酶抑制剂，其通过减少饮食中的脂肪吸收起作用。
[0326]
用于治疗非酒精性脂肪变性的微生物组调节剂的非限制性实例包括大环内酯类抗生素，例如索洛霉素，其可以调节患者的肠道菌群以减少细菌产生的生物分子产物如脂多糖的释放。
[0327]
用于治疗非酒精性脂肪变性的ppar激动剂的非限制性例子包括elafibranor(也称为gft505)，吡格列酮和saroglitazar。
[0328]
用于治疗非酒精性脂肪变性的glp-1/ddp-4药剂的非限制性实例包括艾塞那肽，利拉鲁肽，西他列汀和维达列汀。
[0329]
用于治疗非酒精性脂肪变性的fxr胆汁酸剂的非限制性实例包括奥贝胆酸(oca)和成纤维细胞生长因子19(fgf-19)。
[0330]
用于治疗非酒精性脂肪变性的抗脂质剂的非限制性实例包括芳族聚酰胺和他汀类，例如阿托伐他汀，氟伐他汀，洛伐他汀，匹伐他汀，普伐他汀，瑞舒伐他汀和辛伐他汀。
[0331]
用于治疗非酒精性脂肪变性的抗炎治疗剂的非限制性实例包括西昔洛韦和己酮可可碱。
[0332]
用于治疗非酒精性脂肪变性的抗半胱天冬酶试剂的非限制性实例包括emricasan。
[0333]
用于治疗非酒精性脂肪变性的抗氧化剂的非限制性实例包括维生素e和己酮可可碱。
[0334]
用于治疗非酒精性脂肪变性的thr-β激动剂的非限制性例子包括美司美林(mgl-3196)和asc41。
[0335]
用于治疗非酒精性脂肪变性的抗纤维化剂的非限制性实例包括辛妥珠单抗和贝拉胶蛋白，也称为gr-md-02。
[0336]
如本领域中所述制备和施用上述第二治疗活性剂，其中的一种或多种可以与本发明的化合物组合使用。
[0337]
在一些实施方案中，第二治疗剂是奥贝胆酸。在一些实施方案中，将奥贝胆酸以约0.1至约100mg/kg的剂量给予需要其的患者。在一些实施方案中，将奥贝胆酸以约30mg/kg的剂量给予需要其的患者。在一个实施方案中，奥贝胆酸在本发明的化合物之前施用。在一个实施方案中，奥贝胆酸与本发明的化合物同时施用。在一个实施方案中，奥贝胆酸与本发明内容的化合物同时给药，其中本发明内容的化合物和奥贝胆酸以单一药物组合物的形式给药。在一个实施方案中，奥贝胆酸在本发明的化合物之后施用。在一个实施方案中，奥贝胆酸以约30mg/kg的剂量施用，并且本发明的化合物以约50mg/kg的剂量施用。
[0338]
考虑到体重指数与非酒精性脂肪性肝炎之间的关系，通常会指导诊断为非酒精性
脂肪性肝炎的患者通过减少热量摄入和保持规律的体育锻炼来调整饮食。因此，在一些实施方案中，使用本文发明的方法来治疗非酒精性脂肪性肝炎的患者也可能正在消耗减少卡路里的饮食和/或可能维持规律的体育锻炼方案。
[0339]
实施例
[0340]
实施例1-中间体的合成
[0341]
中间体1:合成1-环丁亚基丙-2-酮的合成
[0342][0343]
向环丁酮(5.0g，71.4mmol)的甲苯(200ml)溶液中加入1-(三苯基亚正膦基)-2-丙酮(22.7g，71.4mmol)，将混合物回流过夜。减压除去溶剂,残余物用硅胶柱色谱纯化(乙乙酯/己烷1/10-1/5)，得到1-环丁亚基丙-2-酮(5.0g)，为黄色油状物。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ5.95-5.93(m,1h),3.19-3.13(m,2h),2.91-2.84(m,2h),2.21(s,3h),2.21-2.11(m,2h)。
[0344]
中间体2:螺[3.5]壬烷-6,8-二酮的合成
[0345][0346]
向1-环丁亚基丙-2-酮(23.1g，0.21mol)和丙二酸甲酯(30.3g，0.23mol)的甲醇(150ml)溶液中加入甲醇钠(41.4g，30％甲醇溶液)。将混合物在n2下加热回流4小时并浓缩。将所得残余物在2n氢氧化钾(200ml)中于70℃水解4小时。用乙酸乙酯(100ml)萃取混合物，然后用1n盐酸盐滴定至ph3-5。将所得溶液加热至70℃，保持5小时，并用乙酸乙酯(100ml
×
3)萃取。将合并的有机层用硫酸镁干燥并浓缩，得到螺[3.5]壬烷-6.8-二酮(19.8g，62.3％)，为黄色固体。该产物无需进一步纯化直接用于下一步。.1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.05(s,1h),5.17(s,1h),2.50-2.35(m,4h),1.92-1.79(m,2h),1.79-1.72(m,4h)。
[0347]
中间体3:8-异丁氧基螺[3.5]壬-7-烯-6-酮的合成
[0348][0349]
向螺[3.5]壬烷-6,8-二酮(19.8g，0.13mol)在甲苯(150ml)中的溶液中加入4-甲苯磺酸(248mg，0.0013mol)和异丁醇(14.5g，0.2mol)。将混合物加热至回流并通过共沸蒸馏除去水。真空除去溶剂，通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/石油醚1/10-1/3)纯化残余物，得到8-异丁氧基螺[3.5]壬-7-烯-6-酮(25.0g，92.7％)，为浅黄色油状物。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ5.31(s,1h),3.59(d,j＝6.8hz,2h),2.51(s,2h),2.45(s,2h),2.12-1.96(m,1h),1.93-1.83(m,6h),0.99(d,j＝6.8hz,6h).
[0350]
中间体4:螺[3.5]壬-7-烯-6-酮的合成
[0351][0352]
在室温下向8-异丁氧基螺[3.5]壬-7-烯-6-酮(25.0g，0.12mol)的甲苯(100ml)溶液中滴加
[0353]
(40ml,70％甲苯溶液,0.18mol).混合物加热至45℃，保持4小时，然后用1n盐酸盐淬灭。过滤混合物，浓缩滤液，并通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/石油醚1/10)纯化，得到螺[3.5]壬-7-烯-6-酮(9.0g，55％)，为淡黄色油状物。
[0354]
中间体5:螺[3.5]壬-6-酮的合成
[0355][0356]
将螺[3.5]壬-7-烯-6-酮(9.0g)在1atm h2下氢化，用在甲醇(80ml)中的10％pd/c(1.0g)催化5.5小时。过滤除去pd/c，浓缩滤液，得到螺[3.5]壬-6-酮(8.8g，96.4％)，为无色油状物，将其不经进一步纯化直接用于下一步。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ2.38(s,2h),2.23-2.20(m,2h),1.89-1.75(m,10h)。
[0357]
中间体6:6-氧代螺[3.5]壬烷-7-甲酸甲酯的合成
[0358][0359]
在室温下向氢化钠(5.1g，0.13mol)的四氢呋喃(150ml)中的悬浮液中加入碳酸甲酯(28.7g，0.32mol)，然后加入螺[3.5]壬烷-6-酮的四氢呋喃(30ml)溶液。将混合物回流2小时。通过饱和氯化铵水溶液淬灭反应，并用乙酸乙酯(100ml
×
3)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤并浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化所得残余物，得到6-氧代螺[3.5]壬烷-7-甲酸甲酯(4.0g，32％)，为浅黄色油状物。
[0360]
中间体7:6-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)螺[3.5]壬-6-烯-7-甲酸甲酯的合成
[0361][0362]
向6-氧代螺[3.5]壬烷-7-甲酸甲酯(4.0g，0.02mol)的四氢呋喃(25ml)溶液中加入碳酸钾(5.6g，0.04mol)和n,n-双(三氟甲基磺酰基)苯胺(7.9g，0.022mol)。将混合物在室温下搅拌过夜，用水稀释，并用乙酸乙酯(100ml
×
3)萃取。将合并的有机层用饱和盐水洗涤，用硫酸镁干燥并浓缩。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/石油醚1/50-1/10)纯化得到的残余物，得到6-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)螺[3.5]壬-6-烯-7-甲酸甲酯(5.0g，76％)，为浅
黄色油状物。
[0363]
中间体8:6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-甲酸甲酯的合成
[0364][0365]
将6-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)螺[3.5]壬-6-烯-7-甲酸甲酯(5.0g，0.015mol)、4-氯苯基硼酸(2.58g，0.017mol)、csf(4.63g，0.03mol)和pd(pph3)4(173mg，0.15mol)在1,2-二甲氧基-乙烷(30ml)和甲醇(15ml)中的混合物在n2下加热至70℃并保持2小时。减压除去溶剂，残余物用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/石油醚1/10)纯化，得到6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-甲酸甲酯(4.0g，92％)，为无色油状物。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.30(d,j＝8.5hz,2h),7.06(d,j＝8.5hz,2h),3.48(s,3h),2.50-2.44(m,2h),2.43(t,j＝2.3(2.3or 6.3？)hz,2h),2.02-1.80(m,6h),1.74(t,j＝6.3hz,2h)。
[0366]
中间体9:(6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲醇的合成
[0367][0368]
向6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-甲酸甲酯(4.0g，0.014mol)在四氢呋喃(20ml)中的溶液中加入libh4(910mg，0.042mol)的四氢呋喃(10ml)溶液。将混合物在室温下搅拌过夜，用1n盐酸水溶液淬灭，并用乙酸乙酯(100ml
×
3)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸镁干燥并浓缩。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/石油醚1/10-1/3)纯化得到的残余物，得到(6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲醇(3.0g，81.7％)，为白色固体。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.31(d,j＝8.4hz,2h),7.09(d,j＝8.4hz,2h),3.93(d,j＝4.2hz,2h),2.37-2.26(m,2h),2.01-1.77(m,8h),1.74(t,j＝6.3hz,2h)。
[0369]
中间体10:7-(氯甲基)-6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯的合成
[0370][0371]
向(6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲醇(3.5g，0.013mol)和三甲胺(2.7g，0.026mol)在二氯甲烷(20ml)的溶液中滴加甲磺酰氯(3.0g，0.026mol)。将混合物在室温下搅拌5小时。减压除去溶剂，通过硅胶柱色谱法纯化残余物，得到7-(氯甲基)-6-(4-氯苯基)
螺[3.5]壬-6-烯(2.75g，75.5％)，为黄色油状物。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.31(d,j＝8.4hz,2h),7.09(d,j＝8.5hz,2h),3.93(s,2h),2.34-2.25(m,4h),1.97-1.78(m,6h),1.74(t,j＝6.3hz,2h)。
[0372]
中间体11:2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-溴苯甲酸甲酯的合成
[0373][0374]
将1-(三异丙基甲硅烷基)-1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-醇(1.91g)、4-溴-2-氟苯甲酸甲酯(1.70g)和k3po4(1.86g)在二甘醇二甲醚(20ml)中的混合物在115℃下搅拌1小时。将反应冷却，用乙酸乙酯(100ml)稀释，并用水、盐水洗涤，并浓缩。通过硅胶色谱法(乙酸乙酯/己烷1/3)纯化残余物，得到2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-溴苯甲酸甲酯(1.8g)。为白色固体。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ9.28(s,1h),8.18(d,j＝2.5hz,1h),7.79(d,j＝8.4hz,1h),7.62(d,j＝2.5hz,1h),7.40-6.96(m,2h),6.96(d,j＝1.7hz,1h),6.51-6.48(m,1h),3.89(s,3h)。
[0375]
中间体12:2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-溴苯甲酸的合成
[0376][0377]
向2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-溴苯甲酸甲酯(300mg，0.867mmol)的二噁烷(10ml)溶液中加入1n naoh(2.2ml，2.2mmol)，并将混合物在室温下搅拌2小时。将混合物用1n hcl酸化，用乙酸乙酯萃取，用盐水洗涤，用无水mgso4干燥。减压蒸发，得到粗2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-溴苯甲酸，为无色油状物。该产物无需进一步纯化直接用于下一步。
[0378]
中间体13:2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-溴-n-((3-硝基-4-(((四氢-2h-吡喃-4-基)甲基)氨基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺的合成
[0379]
[0380]
向2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-溴苯甲酸(100mg，0.3mmol)在dcm(10ml)中的溶液中加入3-硝基-4-(((四氢-2h-吡喃-4-基)甲基)氨基)苯磺酰胺(95mg，0.3mmol)、dmap(55mg，0.45mmol)和edci(115mg，0.6mmol)，将混合物在室温下搅拌24小时。减压除去溶剂，通过硅胶色谱(dcm/meoh 95/5)纯化残余物，得到2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-溴-n-((3-硝基-4-(((四氢-2h-吡喃-4-基)甲基)氨基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺，为黄色油状物(80mg)。ms m/z630[m h]

。
[0381]
中间体14:(s)-n-((4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-溴苯甲酰胺的合成
[0382][0383]
向2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-溴苯甲酸(100mg，0.3mmol)在dcm(10ml)中的溶液中加入(s)-4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基-3-硝基苯磺酰胺(95mg，0.3mmol)、dmap(55mg，0.45mmol)和edci(115mg，0.6mmol)，将混合物在室温下搅拌24小时。减压除去溶剂，通过硅胶色谱(dcm/meoh 95/5)纯化残余物，得到(s)-n-((4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-溴苯甲酰胺。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.79(s,1h),8.59-8.52(m,2h),8.05(d,j＝2.6hz,1h),7.85(dd,j＝9.2,2.4hz,1h),7.66(d,j＝2.6hz,1h),7.59-7.49(m,1h),7.48(d,j＝8.2hz,1h),7.34(dd,j＝8.2,1.8hz,1h),7.12(d,j＝9.2hz,1h),6.88(d,j＝1.8hz,1h),6.50-6.40(m,1h),3.83-3.37(m,2h),3.72-3.56(m,2h),3.56-3.42(m,2h),3.37-3.01(m,3h)。
[0384]
中间体15:(r)-n-((4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-溴苯甲酰胺的合成
[0385][0386]
向2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-溴苯甲酸(100mg，0.3mmol)在dcm(10ml)中的溶液中加入(r)-4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基-3-硝基苯磺酰胺(95mg，0.3mmol)、dmap(55mg，0.45mmol)和edci(115mg，0.6mmol)，将混合物在室温下搅拌24小时。
1-基)苯甲酸乙酯(2.5g)在下一步中而无需进一步纯化。
[0393]
中间体18:2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酸乙酯的合成
[0394][0395]
向7-(氯甲基)-6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯(851mg，3mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(10ml)中的溶液中加入碳酸钾(1.26g，9mmol)、碘化钾(100mg，0.6mmol)和2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(哌嗪-1-基)苯甲酸乙酯(1.53g，3.3mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物用水稀释，用乙酸乙酯(50ml
×
3)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，浓缩并通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/石油醚1/5-1/1)纯化，得到2-(1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酸乙酯(1.3g，71％)，为白色固体。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ9.98(s,1h),8.20(d,j＝2.6hz,1h),7.91(d,j＝9.0hz,1h),7.51(d,j＝2.6hz,1h),7.38(t,j＝3.5hz,1h),7.28(d,j＝8.3hz,2h),6.97(d,j＝8.3hz,2h),6.62(dd,j＝9.0,2.5hz,1h),6.45(dd,j＝3.5,2.0hz,1h),6.32(d,j＝2.5hz,1h),4.26(q,j＝7.1hz,2h),3.20-3.12(m,4h),2.77(s,2h),2.31-2.17(m,8h),1.98-1.72(m,6h),1.68(t,j＝6.3hz,2h),1.25(t,j＝7.1hz,3h)。
[0396]
中间体19:2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酸的合成
[0397][0398]
将2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酸乙酯(1.3g，2.1mmol)和2n氢氧化钾(12ml，0.042mol)的
二噁烷(15ml)溶液加热至60℃过夜。将混合物用1n盐酸水溶液中和至ph 7并用乙酸乙酯(50ml
×
3)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸镁干燥，并浓缩，得到2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酸(1.1g，88.7％)，为白色固体。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ10.34(s,1h),8.19(d,j＝2.6hz,1h),8.02(d,j＝9.0hz,1h),7.63(d,j＝2.6hz,1h),7.38-7.34(m,1h),7.27(d,j＝8.3hz,2h),6.96(d,j＝8.3hz,2h),6.63(dd,j＝9.0,2.4hz,1h),6.44(dd,j＝3.5,1.5hz,1h),6.22(d,j＝2.4hz,1h),3.81(s,2h),3.17-3.10(m,4h),2.80(s,2h),2.30-2.20(m,6h),1.98-1.72(m,6h),1.67(t,j＝6.3hz,2h)。
[0399]
中间体20:1-(氧杂环丁烷-3-亚基)丙-2-酮的合成
[0400][0401]
向氧杂环丁烷-3-酮(20.6g，0.28mol)的dcm(300ml)溶液中加入1-(三苯基亚正膦基)丙-2-酮(98.6g，0.31mol)。将混合物在室温下搅拌过夜。减压除去dcm直至沉淀出固体。过滤除去固体，浓缩滤液，用硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/乙酸乙酯1/5-1/3)纯化，得到1-(氧杂环丁烷-3-亚基)丙-2-酮(23.3g，74.3％)，为黄色油状物。
[0402]
中间体21:2-氧杂螺[3.5]壬烷-6,8-二酮的合成
[0403][0404]
向1-(氧杂环丁烷-3-亚基)丙-2-酮(23.3g，0.21mol)和丙二酸甲酯(30.2g,0.23mol)的甲醇(150ml)溶液中加入甲醇钠(41.3g，30％meoh溶液)。将混合物在n2下加热至回流1小时。减压除去溶剂，得到6-羟基-8-氧代-2-氧杂螺[3.5]壬-6-烯-5-甲酸甲酯，其不经纯化直接用于下一步骤。向koh水溶液(2mol/l，200ml)中加入6-羟基-8-氧代-2-氧杂螺[3.5]壬-6-烯-5-甲酸甲酯。在室温下搅拌30分钟后，用乙酸乙酯(150ml
×
3)萃取水溶液。用1n盐酸盐将水层调节至ph3-5并在50℃下加热4小时。减压除去水，残余物通过硅胶柱色谱纯化，得到2-氧杂螺[3.5]壬烷-6,8-二酮(2.5g，77.0％)，为浅黄色固体。该产物无需进一步纯化直接用于下一步。
[0405]
中间体22:8-异丁氧基-2-氧杂螺[3.5]壬-7-烯-6-酮的合成
[0406][0407]
向2-氧杂螺[3.5]壬烷-6,8-二酮(25g，0.16mol)在甲苯(150ml)中的溶液中加入tsoh(238mg，0.0016mol)和异丁醇(18g，0.24mol)。在室温下搅拌1小时后完成反应。减压除去溶剂，残余物用硅胶柱色谱纯化(乙酸乙酯/石油醚1/5-1/3)，得到8-异丁氧基-2-氧杂螺[3.5]壬-7-烯-6-酮(6g，43％)，为浅黄色油状物。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ5.34(s,1h),4.47
(d,j＝6.1hz,2h),4.45(d,j＝6.1hz,2h),3.60(d,j＝6.8hz 2h),2.80(s,2h),2.68(s,2h),2.09-2.01(m,1h),0.98(d,j＝6.8hz,6h)。
[0408]
中间体23:2-氧杂螺[3.5]壬-7-烯-6-酮的合成
[0409][0410]
向8-异丁氧基-2-氧杂螺[3.5]壬-7-烯-6-酮(14.7g，0.07mol)的甲苯(100ml)溶液中滴加(40.4g,70％在甲苯中).将混合物加热至45℃并保持2小时，并用1nhcl溶液淬灭。将混合物浓缩并通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/石油醚/10-1/5)纯化，得到2-氧杂螺[3.5]壬-7-烯-6-酮(8.8g，91％)，为无色油状物。该产物无需进一步纯化直接用于下一步。
[0411]
中间体24:2-氧杂螺[3.5]壬-6-酮的合成
[0412][0413]
向2-氧杂螺[3.5]壬-7-烯-6-酮(8.8g)的四氢呋喃(80ml)溶液中加入pd/c(1g)。将混合物在室温下在1atm h2下氢化2小时。反应完成后，过滤除去pd/c，浓缩溶液，得到2-氧杂螺[3.5]壬-6-酮(8.0g，89.6％)，为无色油状物。该产物无需进一步纯化直接用于下一步。
[0414]
中间体25:6-氧代-2-氧杂螺[3.5]壬烷-7-甲酸甲酯的合成
[0415][0416]
向氢化钠(4.6g，0.11mol)的四氢呋喃(150ml)悬浮液中在n2下逐滴加入碳酸甲酯(25.7g，0.28mol)。滴加完成后，将混合物加热至回流。然后加入2-氧杂螺[3.5]壬-6-酮(11.2g，0.057mol)的四氢呋喃(30ml)溶液。将反应加热回流2小时，用饱和氯化铵水溶液淬灭，用乙酸乙酯(100ml
×
3)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，在减压下浓缩，并将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，得到6-氧代-2-氧杂螺[3.5]壬烷-7-甲酸甲酯(4.5g，69％)，为无色油状物。该产物无需进一步纯化直接用于下一步。
[0417]
中间体26:6-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-2-氧杂螺[3.5]壬-6-烯-7-甲酸甲酯的合成
[0418][0419]
向6-氧代-2-氧杂螺[3.5]壬烷-7-甲酸甲酯(4.5g，加入0.02mol)和碳酸钾(6.3g，
0.0 4 6m o l)在d m f(30m l)中的混悬液中加入n,n-双(三氟甲基磺酰基)苯胺(8.9g，0.025mol)。将混合物在室温下搅拌过夜，用水稀释，并用乙酸乙酯(100ml
×
3)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经mgso4干燥，并在减压下浓缩。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/石油醚1/10-1/3)纯化残余物，得到6-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-2-氧杂螺[3.5]壬-6-烯-7-甲酸甲酯(6.6g，86％)，为浅黄色油状物。该产物无需进一步纯化直接用于下一步。
[0420]
中间体27:6-(4-氯苯基)-2-氧杂螺[3.5]壬-6-烯-7-甲酸甲酯的合成
[0421][0422]
向6-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-2-氧杂螺[3.5]壬-6-烯-7-甲酸甲酯(6.6g，0.02mol)在1,2-二甲氧基-乙烷(30ml)和甲醇(10ml)的溶液中加入4-氯-苯基硼酸(3.13g，0.02mol)、csf(6.08g，0.04mol)和pd(pph3)4(231mg，0.2mmol)并将混合物在n2下加热至70℃保持30分钟。减压除去溶剂，残余物用硅胶柱色谱纯化(乙酸乙酯/石油醚1/5-1/3)，得到6-(4-氯苯基)-2-氧杂螺[3.5]壬-6-烯-7-甲酸甲酯(5.1g，87.3％)，为浅黄色固体。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.33(d,j＝8.4hz,2h),7.07(d,j＝8.4hz,2h),4.54(d,j＝5.6hz,2h),4.48(d,j＝5.6hz,2h),3.48(s,3h),2.74-2.70(m,2h),2.55-2.50(m,2h),2.04(t,j＝6.4hz,2h)。
[0423]
中间体28:(6-(4-氯苯基)-2-氧杂螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲醇的合成
[0424][0425]
在室温下向6-(4-氯苯基)-2-氧杂螺[3.5]壬-6-烯-7-甲酸甲酯(2.1g，0.0072mol)在四氢呋喃(20ml)溶液中滴加libh4(475mg，0.022mol))的四氢呋喃(10ml)溶液。将混合物在室温下搅拌4小时，用1n hcl溶液淬灭，并用乙酸乙酯(100ml
×
3)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经mgso4干燥并浓缩。通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/石油醚1/5-1/1)纯化残余物，得到(6-(4-氯苯基)-2-氧杂螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲醇(1.5g，78.9％)，为白色固体。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.34(d,j＝8.4hz,2h),7.07(d,2h,j＝8.4hz),4.54(d,2h,j＝6.0hz),4.46(d,2h,j＝5.6hz),3.93(s,2h),2.62(s,2h),2.40-2.33(m,2h),2.03(t,2h,j＝6.4hz)。
[0426]
中间体29:7-(氯甲基)-6-(4-氯苯基)-2-氧杂螺[3.5]壬-6-烯的合成
[0427][0428]
向(6-(4-氯苯基)-2-氧杂螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲醇(1.5g，5.7mmol)和三乙胺(836mg，8.6mmol)的二氯甲烷(15ml)溶液中加入甲磺酰氯(980mg，8.6mmol)，并将该混合物在室温下搅拌3.5小时。减压除去溶剂，通过硅胶柱色谱法纯化残余物，得到7-(氯甲基)-6-(4-氯苯基)-2-氧杂螺[3.5]壬-6-烯(1.4g，87.0％)，为白色固体。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.35(d,2h,j＝8.4hz),7.16(d,2h,j＝8.4hz),4.53(d,2h,j＝6.0hz),4.45(d,2h,j＝5.6hz),3.86(s,2h),2.64(s,2h),2.40-2.33(m,2h),2.03(t,2h,j＝6.4hz)。
[0429]
中间体30:2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)-2-氧杂螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酸乙酯的合成
[0430][0431]
向2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(哌嗪-1-基)苯甲酸乙酯(382mg，0.82mmol)在dmf(10ml)中的溶液中加入7-(氯甲基)-6-(4-氯苯基)-2-氧杂螺[3.5]壬-6-烯(200mg，0.75mmol)、碳酸钾(310mg，2.25mmol)、dipea(290mg，2.25mmol)和碘化钾(24.9mg，0.15mmol)，将混合物在室温下搅拌过夜。将混合物用水稀释并用乙酸乙酯(50ml
×
3)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，浓缩并通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/石油醚1/5-1/1)纯化，得到2-(1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-乙基-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)-2-氧杂螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酸乙酯(370mg，80.6％)，为白色固体。ms m/z 613[m h]

。
[0432]
中间体31:2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)-2-氧杂螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酸的合成
[0433][0434]
在60℃下向2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)-2-氧杂螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酸乙酯(370mg，0.6mmol)在二噁烷(10ml)中的溶液中加入2n氢氧化钾(6ml，12mmol)，将该混合物在60℃搅拌过夜。将溶液用1n盐酸中和至ph7并用乙酸乙酯(100ml
×
3)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸镁干燥并浓缩，得到2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)-2-氧杂螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酸(1.1g，88.7％)，为白色固体。ms m/z 585[m h]

.
[0435]
中间体32:2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(1-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌啶-4-基)苯甲酸甲酯的合成
[0436][0437]
向7-(氯甲基)-6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯(850mg，3.04mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(10ml)中的溶液中加入碳酸钾(1.26g，2.2mmol)、碘化钾(100mg，0.61mmol)和2-(2h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(哌啶-4-基)苯甲酸甲酯(1.0g，3.34mmol)，在室温下将混合物搅拌过夜。然后将混合物用水稀释并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化所得残余物，得到2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(1-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌啶-4-基)苯甲酸甲酯(1.0g，55.2％)，为浅黄色固体。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ9.39(br s,1h),8.19(d,j＝2.6hz,1h),7.87(d,j＝8.1hz,1h),7.57(d,j＝2.6hz,1h),7.39(dd,j＝3.5,2.5hz,1h),7.30-7.23(m,2h),7.04-6.93(m,3h),6.72(d,j＝1.6hz,1h),6.49(dd,j＝3.5,2.0hz,1h),3.87(s,3h),
2.81-2.75(m,2h),2.73-2.71(m,2h),2.28(s,2h),2.25-2.15(m,2h),1.98-1.76(m,6h),1.75-1.51(m,9h)。
[0438]
实施例2-(r)-n-((4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰胺(化合物2)的合成
[0439][0440]
将2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酸,(r)-4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基)-3-硝基本磺酰胺,edci和4-(n,n-二甲基氨基)吡啶和二氯甲烷的混合物在室温下反应过夜，然后加入水，水层用二氯甲烷萃取，合并的有机层用盐水洗涤，浓缩并通过硅胶柱纯化，得到(r)-n-((4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰胺.1h nmr(400mhz,甲醇-d4)δ8.66(d,j＝2.4hz,1h),7.99(d,j＝2.4hz,1h),7.84(dd,j＝9.2,2.4hz,1h),7.64(d,j＝8.9hz,1h),7.51(d,j＝2.4hz,2h),7.45(d,j＝3.3hz,1h),7.37(d,j＝8.4hz,2h),7.10(d,j＝8.4hz,2h),6.94(d,j＝9.2hz,1h),6.76(dd,j＝8.9,2.3hz,1h),6.40(d,j＝3.3hz,1h),6.36(d,j＝2.3hz,1h),3.87(dd,j＝11.8,4.2hz,3h),3.83-3.70(m,3h),3.67(s,2h),3.62(dd,j＝11.7,2.9hz,1h),3.51-3.41(m,2h),3.40-3.35(m,1h),3.29(dq,j＝3.2,1.6hz,1h),2.41(s,2h),2.26(s,2h),2.00-1.77(m,6h)。
[0441]
实施例3-(s)-n-((4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰胺的合成(化合物1)
[0442][0443]
将2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酸,(s)-4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基)-3-硝基苯甲酰胺,edci和4-(n,n-二甲基氨基)吡啶和二氯甲烷的混合物在室温下反应过夜，然后加入水，水层用二氯甲烷萃取，合并的有机层用盐水洗涤，浓缩并通过硅胶柱纯化，得到(s)-n-((4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰胺.1h nmr(400mhz,甲醇-d4)δ8.66(d,j＝2.4hz,1h),7.99(d,j＝2.4hz,1h),7.84(dd,j＝9.2,2.4hz,1h),7.64(d,j＝8.9hz,1h),7.51(d,j＝2.4hz,2h),7.45(d,j＝3.3hz,1h),7.37(d,j＝8.4hz,2h),7.10(d,j＝8.4hz,2h),6.94(d,j＝9.2hz,1h),6.76(dd,j＝8.9,2.3hz,1h),6.40(d,j＝3.3hz,1h),6.36(d,j＝2.3hz,1h),3.87(dd,j＝11.8,4.2hz,3h),3.83-3.70(m,3h),3.67(s,2h),3.62(dd,j＝11.7,2.9hz,1h),3.51-3.41(m,2h),3.40-3.35(m,1h),3.29(dq,j＝3.2,1.6hz,1h),2.41(s,2h),2.26(s,2h),2.00-1.77(m,6h)。
[0444]
实施例4-(r)-n-((4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(1-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)苯甲酰胺的合成
[0445][0446]
向(r)-n-((4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-溴苯甲酰胺在1,2-二甲氧基-乙烷(10ml)和水(1ml)中
的溶液中加入1-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1,2,3,6-四氢吡啶、pd(dppf)cl2和k2co3，并将混合物在80℃下搅拌12小时。将反应冷却至室温并用水稀释。将混合物用乙酸乙酯(30ml
×
3)萃取，经无水mgso4干燥，并浓缩。通过c18反相制备型hplc纯化残余物，得到(r)-n-((4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(1-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)苯甲酰胺。1h nmr(400mhz,甲醇-d4)δ8.68(d,j＝2.3hz,1h),7.97(d,j＝2.6hz,1h),7.88(dd,j＝9.3,2.3hz,1h),7.63(d,j＝8.2hz,1h),7.50(d,j＝2.6hz,1h),7.46(d,j＝3.5hz,1h),7.30(d,j＝8.4hz,2h),7.16(dd,j＝8.2,1.7hz,1h),7.10(d,j＝8.4hz,2h),6.94(d,j＝9.3hz,1h),6.85(d,j＝1.7hz,1h),6.41(d,j＝3.5hz,1h),5.94-5.90(m,1h),3.95-3.40(m,14h),3.15-3.03(m,1h),2.68-2.45(m,2h),2.43(s,2h),2.30-2.20(m,2h),2.03-1.77(m,8h)。
[0447]
实施例5-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(1-((6-(4-氯苯基)-2-氧杂螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)-n-((3-硝基-4-(((四氢-2h-吡喃-4-基)甲基)氨基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺的合成
[0448][0449]
使用类似于实施例4所述的方法制备标题化合物。1h nmr(400mhz,甲醇-d4)δ8.70(d,j＝2.3hz,1h),7.99(d,j＝2.5hz,1h),7.90(dd,j＝9.2,2.3hz,1h),7.61(d,j＝8.2hz,1h),7.57(d,j＝2.5hz,1h),7.48(d,j＝3.5hz,1h),7.31(d,j＝8.4hz,2h),7.20-7.10(m,3h),6.96(d,j＝9.2hz,1h),6.82(d,j＝1.6hz,1h),6.44(d,j＝3.5hz,1h),5.93-5.86(m,1h),4.53(d,j＝5.9hz,2h),4.49(d,j＝5.9hz,2h),4.00-3.90(m,2h),3.77-3.33(m,7h),3.26(d,j＝7.0hz,2h),3.15-3.00(m,1h),2.70-2.65(m,2h),2.63-2.25(m,4h),2.07(t,j＝6.3hz,2h),2.00-1.85(m,1h),1.75-1.65(m,2h),1.46-1.30(m,2h)。
[0450]
实施例6-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(1-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)-n-((3-硝基-4-(((四氢-2h-吡喃-4-基)甲基)氨基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺的合成
[0451][0452]
使用类似于实施例4所述的方法制备标题化合物。1h nmr(400mhz,甲醇-d4)δ8.71(t,j＝1.9hz,1h),8.00-7.95(m,1h),7.90(dd,j＝9.3,1.9hz,1h),7.63(dd,j＝8.1,1.4hz,1h),7.56-7.50(m,1h),7.46(dd,j＝3.5,1.4hz,1h),7.33-7.26(m,2h),7.18-7.06(m,3h),6.96(dd,j＝9.3,1.4hz,1h),6.81(s,1h),6.43(dd,j＝3.5,1.5hz,1h),5.93-5.86(m,1h),4.00-3.94(m,2h),3.83-3.36(m,7h),3.26(d,j＝7.0hz,2h),3.10-3.04(m,1h),2.67-2.40(m,4h),2.30-2.24(m,2h),2.02-1.77(m,9h),1.74-1.67(m,2h),1.45-1.30(m,2h)。
[0453]
实施例7-(r)-n-((4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(1-((6-(4-氯苯基)-2-氧杂螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)苯甲酰胺的合成
[0454][0455]
使用类似于实施例4所述的方法制备标题化合物。1h nmr(400mhz,甲醇-d4)δ8.68(d,j＝2.3hz,1h),7.99(d,j＝2.5hz,1h),7.89(dd,j＝9.2,2.3hz,1h),7.65(d,j＝8.2hz,1h),7.54(d,j＝2.5hz,1h),7.48(d,j＝3.4hz,1h),7.33(d,j＝8.4hz,2h),7.21-7.16(m,1h),7.13(d,j＝8.4hz,2h),6.95(d,j＝9.3hz,1h),6.86(d,j＝1.6hz,1h),6.43(d,j＝3.5hz,1h),5.94-5.90(m,1h),4.60-4.43(m,4h),3.95-3.40(m,14h),3.15-3.00(m,1h),2.80-2.60(m,4h),2.38-2.25(m,2h),2.08(t,j＝6.3hz,2h)。
[0456]
实施例8-(r)-n-((4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)-2-氧杂螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰胺的合成
[0457][0458]
将2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)-2-氧杂螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酸(290mg，0.5mmol)、(r)-4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基-3-硝基苯磺酰胺(236mg，0.75mmol)、edci(191mg，1mmol)、4-(n,n-二甲基氨基)吡啶(591mg，0.75mmol)的二氯甲烷(15ml)中的混合物在室温下搅拌过夜。真空除去溶剂，所得残余物通过硅胶柱纯化，得到(r)-n-((4-(((1,4-二噁烷-2-基)甲基)氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)-2-氧杂螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰胺(150mg，34.1％)，为黄色固体。1h nmr(400mhz,甲醇-d4)δ8.67(d,j＝2.3hz,1h),7.99(d,j＝2.3hz,1h),7.85(dd,j＝9.3,2.3hz,1h),7.64(d,j＝8.8hz,1h),7.52(d,j＝2.3hz,1h),7.45(d,j＝3.5hz,1h),7.39(d,j＝8.4hz,2h),7.13(d,j＝8.4hz,2h),6.95(d,j＝9.3hz,1h),6.76(dd,j＝8.8,2.4hz,1h),6.41(d,j＝3.5hz,1h),6.34(d,j＝2.4hz,1h),4.54(d,j＝5.9hz,2h),4.48(d,j＝5.9hz,2h),3.93-3.35(m,19h),2.70-2.65(m,2h),2.33(s,2h),2.08(t,j＝6.3hz,2h)。
[0459]
实施例9-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)-2-氧杂螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)-n-((3-硝基-4-(((四氢-2h-吡喃-4-基)甲基)氨基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺的合成
[0460][0461]
将2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)-2-氧杂螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酸(250mg，0.43mmol)、3-硝基-4-(((四氢-2h-吡喃-4-基)甲基)氨基)苯磺酰胺(202mg，0..64mmol)、edci(164mg，0.86mmol)、4-(n,n-二甲基氨基)吡啶(78mg，0.64mmol)的二氯甲烷(10ml)中的混合物在室温下搅拌过夜，然后浓缩。通过硅胶柱纯化得到的残余物，得到2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)-2-氧杂螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)-n-((3-硝基-4-(((四
氢-2h-吡喃-4-基)甲基)氨基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺(150mg，39.6％)，为黄色固体。1h nmr(400mhz,甲醇-d4)δ8.70(d,j＝2.3hz,1h),8.01(d,j＝2.6hz,1h),7.87(dd,j＝9.2,2.3hz,1h),7.66(d,j＝8.8hz,1h),7.56(d,j＝2.6hz,1h),7.47(d,j＝3.5hz,1h),7.39(d,j＝8.4hz,2h),7.13(d,j＝8.4hz,2h),6.97(d,j＝9.2hz,1h),6.76(dd,j＝8.8,2.4hz,1h),6.43(d,j＝3.5hz,1h),6.32(d,j＝2.4hz,1h),4.54(d,j＝5.9hz,2h),4.48(d,j＝5.9hz,2h),4.03-3.94(m,2h),3.67(s,2h),3.55-3.27(m,12h),2.69(s,2h),2.35-2.25(m,2h),2.08(t,j＝6.3hz,2h),2.05-1.93(m,1h),1.76-1.69(m,2h),1.45-1.35(m,2h)。
[0462]
实施例10-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)-n-((3-硝基-4-(((四氢-2h-吡喃-4-基)甲基)氨基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺的合成
[0463][0464]
将2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酸(1.75g，3mmol)、3-硝基-4-(((四氢-2h-吡喃-4-基)甲基)氨基)苯磺酰胺(1.43g，4.5mmol)、edci(1.15g，6mmol)和4-(n,n-甲氨基)吡啶(550mg，4.5mmol)和二氯甲烷(40ml)的混合物在室温下反应过夜，然后加水。水层用二氯甲烷萃取，合并的有机层用盐水洗涤，浓缩并通过硅胶柱纯化，得到2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)-n-((3-硝基-4-(((四氢-2h-吡喃-4-基)甲基)氨基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺(1.7g，64.4％)，为黄色固体。1h nmr(400mhz,甲醇-d4)δ8.70(d,j＝2.3hz,1h),8.01(d,j＝2.7hz,1h),7.87(d,j＝9.2,2.3hz,1h),7.66(d,j＝8.9hz,1h),7.55(d,j＝2.7hz,1h),7.47(d,j＝3.4hz,1h),7.38(d,j＝8.4hz,2h),7.10(d,j＝8.4hz,2h),6.97(d,j＝9.2hz,1h),6.77(dd,j＝8.9,2.4hz,1h),6.44(d,j＝3.4hz,1h),6.34(d,j＝2.4hz,1h),4.02-3.94(m,3h),3.66(s,3h),3.49-3.38(m,2h),3.41-3.25(m,7h),2.42(s,3h),2.26(s,3h),2.00-1.67(m,4h),1.45-1.38(m,2h)。
[0465]
实施例11-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)-n-((3-硝基苯基)磺酰基)苯甲酰胺的合成
[0466][0467]
使用类似于实施例10所述的方法制备标题化合物。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.70(s,1h),9.47(s,1h),8.62(d,j＝2.2hz,1h),8.44(d,j＝8.3hz,1h),8.27(d,j＝7.9hz,1h),8.02-7.97(m,1h),7.84-7.75(m,1h),7.56-7.43(m,3h),7.40(d,j＝8.3hz,2h),7.11(d,j＝8.3hz,2h),6.72(d,j＝8.9hz,1h),6.40-6.35(m,1h),6.30(s,1h),3.80-3.65(m,2h),3.55(s,2h),3.28-2.95(m,4h),2.82-2.65(m,2h),2.31(s,2h),2.22-2.15(m,2h),1.93-1.60(m,8h)。
[0468]
实施例12-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌嗪-1-基)-n-((4-(甲基氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)苯甲酰胺的合成
[0469][0470]
使用类似于实施例10所述的方法制备标题化合物。1h nmr(400mhz,甲醇-d4)δ8.78(d,j＝2.3hz,1h),8.05(d,j＝2.6hz,1h),7.96(dd,j＝9.2,2.3hz,1h),7.80(d,j＝8.9hz,1h),7.61(d,j＝2.6hz,1h),7.46(d,j＝3.5hz,1h),7.34(d,j＝8.4hz,2h),7.01(d,j＝8.4hz,2h),6.90(d,j＝9.2hz,1h),6.68(dd,j＝8.9,2.4hz,1h),6.46(d,j＝3.5hz,1h),6.18(d,j＝2.4hz,1h),3.60(s,2h),3.50-3.12(m,8h),3.06(s,3h),2.38(s,2h),2.30-2.16(m,2h),1.97-1.73(m,8h)。
[0471]
实施例13-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(4-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7
–
基)甲基)哌嗪-1-基)-n-((4-(二甲基氨基)-3-硝基苯基)磺酰基)苯甲酰胺的合成
[0472][0473]
使用类似于实施例10所述的方法制备标题化合物。1h nmr(400mhz,甲醇-d4)δ8.41(d,j＝2.2hz,1h),8.08(d,j＝2.5hz,1h),7.91(dd,j＝9.4,2.3hz,1h),7.81(d,j＝8.9hz,1h),7.68(d,j＝2.3hz,1h),7.48(d,j＝3.5hz,1h),7.34(d,j＝8.0hz,2h),7.04(d,j＝9.4hz,1h),7.01(d,j＝8.0hz,2h),6.71-6.63(m,1h),6.51(d,j＝3.5hz,1h),6.15(d,j＝1.9hz,1h),3.59(s,2h),3.52-3.20(m,8h),2.98(s,6h),2.38(s,2h),2.25-2.17(m,2h),1.96-1.72(m,8h)。
[0474]
实施例14-2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(1-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7
–
基)甲基)哌啶-4-基)-n-((3-硝基-4-(((四氢-2h-吡喃-4-基)甲基)氨基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺的合成
[0475][0476]
将2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(1-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌啶-4-基)苯甲酸(200mg，0.34mmol)、3-硝基-4-(((四氢-2h-吡喃-4-基)甲基)氨基)苯磺酰胺(162mg，0.52mmol)、edci(130mg，0.68mmol)、4-(n,n-二甲基氨基)吡啶(63.4mg，0.52mmol)在二氯甲烷(15ml)中的混合物在室温下搅拌过夜，然后通过硅胶柱色谱法纯化得到2-((1h-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基)氧基)-4-(1-((6-(4-氯苯基)螺[3.5]壬-6-烯-7-基)甲基)哌啶-4-基)-n-((3-硝基-4-(((四氢-2h-吡喃-4-基)甲基)氨基)苯基)磺酰基)苯甲酰胺(170mg，57.3％)，为黄色固体。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.94(s,1h),11.64(s,1h),8.50-8.42(m,2h),7.97(d,j＝2.6hz,1h),7.76(dd,j＝9.2,2.2hz,1h),7.52-7.36(m,5h),7.11(d,j＝7.9hz,2h),6.99(d,j＝9.2hz,1h),6.91-6.86(m,1h),6.55(s,1h),6.37(s,1h),3.89-3.79(m,2h),3.35-2.90(m,10h),2.32-2.10(m,5h),1.95-1.15(m,17h)。
[0477]
实施例15-式(i)的化合物抑制bcl-2和bcl-xl
[0478]
荧光素标记的bim(81-106)、bak(72-87)和bid(79-99)肽，命名为flu-bim、flu-bak和flu-bid分别用作bcl-2、bcl-xl和mcl-1的fp测定中的荧光探针。通过监测由固定浓度的荧光探针和浓度逐渐增加至全饱和的蛋白质组成的混合物的总荧光偏振值，flu-bim对bcl-2、flu-bak对bcl-xl和flu-bid对mcl-1的kd值确定分别为0.55
±
0.15、4.4
±
0.8和6.9
±
0.9nm。使用infinite m-1000读板仪(tecan u.s.，researchtriangle park，nc)在microfluor 196孔、黑色圆底板(thermo scientific)中测量荧光偏振值。向每个孔中加入1nm flu-bim，或2nm flu-bak或2nm flu-bid和增加浓度的bcl-2、或bcl-xl或mcl-1至测定缓冲液(100mm磷酸钾，ph7.5，100μg/ml牛γ-球蛋白，0.02％叠氮化钠，invitrogen，含有0.01％triton x-100和4％dmso)中的125μl终体积。将板混合并在室温下温育1小时，同时轻轻摇动以确保平衡。以485nm的激发波长和530nm的发射波长测量以毫微极化单位(m p)的极化值。然后通过使用graphpad prism 5.0software(graphpad software,san diego,calif.)拟合s形剂量依赖性fp增加作为蛋白质浓度的函数来计算平衡解离常数(kd)。
[0479]
从竞争性结合实验确定本发明内容的代表性化合物对bcl-2、bcl-xl和bcl-1的ki值，其中将抑制剂的连续稀释液加入到96孔板中，每孔含有固定浓度的荧光探针和蛋白质。将5μl经测试的在dmso中的抑制剂和120μl预温育的蛋白质/探针复合物在测定缓冲液中的混合物加入测定板中，并在室温下温和振荡温育2小时。bcl-2测定的蛋白质和探针的最终浓度为1.5nm和1nm，bcl-xl测定的最终浓度为10nm和2nm，mcl-1测定的最终浓度分别为20nm和2nm。仅含有蛋白质/探针复合物的阴性对照(相当于0％抑制)和仅含有游离探针的阳性对照(相当于100％抑制)包括在每个测定板中。如上所述测量fp值。通过竞争曲线的非线性回归拟合确定ic50值。基于测量的ic50值，探针对蛋白质的kd值和蛋白质和探针在竞争性测定中的浓度，使用nikolovska-coleska等，analytical biochemistry 332:261-73(2004)中描述的等式计算竞争性抑制剂的ki值，还使用huang,journal of biomolecular screening 8:34-38(2003)的等式计算ki值。
[0480]
表2提供了本发明的代表性化合物对bcl-2，bcl-xl和mcl-1的抑制活性。
[0481]
表2
[0482][0483]
实施例16-在hfd/ccl4 nash小鼠模型中，化合物1的治疗可改善nas得分
[0484]
使用nash的小鼠模型证明了化合物1在体内治疗非酒精性脂肪性肝炎的能力。
[0485]
年龄为18周的雄性c57bl/6j小鼠购自集萃药康有限公司.，ltd(南京,江苏).首先给小鼠喂食高脂饮食(hfd)11周，以诱导肥胖。然后连续四周每周两次腹膜内注射四氯化碳(25％ccl4，0.5μl/g)，以诱导肝脏损伤，导致炎症，细胞死亡和纤维化。第一次注射四氯化碳的日期定为第0天。在第7天，将动物随机分组并开始治疗。在下面的实验设计表3中示出了每组的测试物品施用和动物数量。
[0486]
表3
[0487][0488]
注释:第1组接受正常饮食喂养，并腹膜内注射橄榄油代替ccl4.
[0489]
溶媒：10％peg400、5％cremophor el，0.1n naoh，1x磷酸盐缓冲液
[0490]
在第28天对所有动物实施安乐死以收集血液和肝脏样本以进行生化和组织学分析。
[0491]
分析每组动物的肝组织的nas评分。具体来说，评估的分数是：
[0492]
1)脂肪变性的未加权总和(0-3)；
[0493]
2)小叶炎症(0-3)；
[0494]
3)肝细胞膨胀(0-2)；和
[0495]
4)肝纤维化评分(0-4),天狼星红染色后.
[0496]
取每组动物的肝组织，通过苏木精-伊红(he)染色分析nas得分，并通过天狼星红染色分析肝纤维化。
[0497]
染色后，评估所制备样品的nas得分。在苏木精-伊红染色的切片中，根据脂肪变性，炎性细胞浸润和肝细胞脂肪变性的程度评估nas评分。为每个肝叶选择五个视野综合评分，评估标准列于表4。
[0498]
表4
[0499][0500][0501][0502]
注释:
[0503]
a)气球膨胀的特征是肝细胞肿胀，细胞质变松。肝细胞呈球形，细胞质几乎透明
[0504]
b)脂肪变性的特征是肝细胞中的液泡状规则圆形脂质滴，分为大脂质滴和小脂质滴。大脂质滴可将肝细胞核推至细胞边缘，小脂质滴可在肝脏中积聚，细胞核位于细胞中心；
[0505]
c)在肝小叶的门静脉区域，炎症细胞浸润的特征是肝细胞索和中央静脉区域分散或存在大量炎症细胞，主要是中性粒细胞和巨噬细胞，
[0506]
d)肝细胞水样变性的特征是肝细胞大小不规则的空泡，细胞质是一个不同程度的网络。
[0507]
染色后，另外评估肝脏的纤维化。用aperio versa 200brightfield&fluorescenc切片扫描仪扫描所有染有天狼星红的切片。在5倍视野下随机选择两个视野。这两个区域覆盖了肝脏组织面积的85％。进行定量分析以计算切片中纤维化沉积的面积。
[0508]
prism版本6(graphpad software inc.，圣地亚哥，加利福尼亚)用于所有统计分析和图形表示。
[0509]
为研究化合物1作为单一药物或与fxr激动剂奥贝胆酸(oca)联合使用对nash和纤维化的作用，对高脂饮食(hfd)和ccl4诱导的c57bl/6j小鼠进行了治疗以单药或以表3所示的组合形式使用浓度为50mg/kg的化合物1和30mg/kg的oca(剂量为qd，口服)，如表3所示。药物治疗21天后，将动物安乐死以收集肝脏样本进行病理分析。肝组织的he染色表明，与健康对照组相比，高脂饮食和ccl4注射可导致严重的脂肪变性，小叶炎症和肝细胞球囊扩张，用化合物1和oca单独或组合治疗后，所有这些症状均得到缓解(图1a)。
[0510]
如nas评分分析(图1b)所示，化合物1减轻了炎症和脂肪变性，对膨胀产生了适度的影响。化合物1显示出比单独的oca更好的抗炎作用。化合物1和oca的组合对nas得分的活性优于化合物1或oca作为单一药物。值得注意的是，与单药治疗相比，在用化合物1和oca联合治疗后观察到炎症显着减轻。与oca相比，化合物1作为单一药物对纤维化的影响不大，如肝组织的天狼星红染色(图2a)和纤维化评分分析(图2b)所示。
[0511]
总体上，这些结果表明，基于通过在非酒精性脂肪变性的小鼠模型中减少炎症，膨胀和脂肪变性的nas评分减轻，化合物1对于治疗非酒精性脂肪性肝炎是有效的。此外，化合物1已显示出在这种非酒精性脂肪性肝炎模型中减轻纤维化的潜力，强调化合物1可用于治疗非酒精性脂肪性肝炎。
[0512]
实施例17-化合物1的治疗可改善nas中的nas评分
[0513]
hfd/ccl4 nash鼠标模型
[0514]
年龄为10天的雄性sd大鼠,从维通利华有限公司购买(北京).
[0515]
在出生后两周给大鼠一次腹膜内注射二乙基亚硝胺(den)，并继续母乳喂养两周。
[0516]
四周后，总共选择了56只雄性大鼠，并根据动物的体重分为7组。以高脂，高胆固醇饮食(hfd-chol)开始喂养大鼠，喂养周期为12周。腹膜内注射den之前，随机选择5只雄性大鼠作为对照组，以标准饮食喂养，不注射den。
[0517]
在hfd-chol饮食喂养7周后，将动物随机化并开始用赋形剂或指定的化合物治疗。下表5中显示了试验组的给药和每组中的动物数量。
[0518]
表5
[0519][0520]
注释:第一组是“健康对照组”，接受标准饮食且未注射den.
[0521]
溶媒:40％peg400/60％phosal 50pg
[0522]
在最后一次给药的当天(测试结束)测量动物的体重。将动物禁食6小时后，对所有动物实施安乐死以收集血液和肝脏样品以进行生化和组织学分析。
[0523]
在he染色后，分析每组动物的肝组织的nas得分，脂肪变性的未加权总和(0-3)，小叶炎症(0-3)和肝细胞膨胀(0-2)得分，并在天狼星红染色后分析肝纤维化评分(0-4)。
[0524]
使用上文实施例16中发明的方法分析每组动物的肝组织的nas得分。具体而言，评估得分:
[0525]
1)脂肪变性的未加权总和(0-3)；
[0526]
2)小叶炎症(0-3)；
[0527]
3)肝细胞膨胀(0-2)；和
[0528]
4)肝纤维化评分(0-4),天狼星红染色后.
[0529]
prism版本6(graphpad software inc.，圣地亚哥，加利福尼亚)用于所有统计分析和图形表示。
[0530]
为了探索化合物1对nash和纤维化的作用，与pparα/δ激动剂gft505相比，用10mg/kg和30mg化合物1治疗den-hfd-chol诱导的非酒精性脂肪性肝炎的大鼠/kg(qd，po)和gft505，浓度为30mg/kg(qd，po)，如表5所示。药物治疗42天后，对动物实施安乐死以收集肝脏样品以进行病理分析。肝组织的he染色表明，与健康对照组相比，den注射和hfd chol饮食诱导了严重的脂肪变性，小叶炎症和肝细胞膨胀，所有这些在用化合物1或gft505治疗后均得到缓解(图3a)。如图3b所示，通过化合物1和gft505处理，nas得分显着降低。具体而言，
虽然化合物1和gft505都完全消除了膨胀现象，但化合物1的抗炎作用有所改善，但对脂肪变性的作用却比gft505适度。
[0531]
如肝组织的天狼星红染色(图4a)和纤维化评分分析(图4b)所示，化合物1还证明了适度的纤维化缓解。
[0532]
总的来说，这些结果表明基于在非酒精性脂肪变性的大鼠模型中通过减少炎症，膨胀和脂肪变性的nas评分减轻，化合物1对于非酒精性脂肪性肝炎的治疗是有效的。此外，化合物1已显示出在这种非酒精性脂肪性肝炎模型中减轻纤维化的潜力，强调化合物1可用于治疗非酒精性脂肪性肝炎。
[0533]
本发明使相关领域的技术人员能够根据多个和变化的实施例来制造和使用在此提供的发明。本领域技术人员容易想到的本发明的各种变更，修改和改进，包括某些变更，修改，替代和改进，也是本发明的一部分。因此，前述描述是通过示例的方式来说明本文提供的发现。此外，前述说明书和实施例是本发明的示例，而不是限制本发明。因此，本发明的范围在所附权利要求中提出。
[0534]
本文引用的所有专利和出版物均全文以引用的方式全文并入本文。