一种基于有机酸评价半夏和鹞落坪半夏品质的方法与流程

1.本发明属于中药化学成分分析领域，更具体地说，涉及一种基于有机酸评价半夏和鹞落坪半夏品质的方法。


背景技术：

2.半夏(pinellia ternate)为天南星科(araceae)半夏属(pinellia)多年生草本植物，主要分布于湖北、河南、安徽、山东、四川等地；以块茎入药，具有镇咳、祛痰、止吐、镇静、催眠、抗肿瘤等功效，是我国常用的大宗药材。鹞落坪半夏(pinelliayaoluopingensis)是安徽鹞落坪国家级自然保护区的特有种，与半夏具有相似的功效，但药效作用要快于半夏，可能与其化学成分有关。
3.研究表明，有机酸是半夏重要的化学成分，主要为琥珀酸、草酸、苹果酸、乌头酸、甲酸、乙酸等，且与镇咳祛痰作用具有相关性。2015版《中国药典》中记录了半夏有机酸含量测定采用的是电位滴定法，以琥珀酸含量计算，进行质量控制；但该方法只能粗略反映半夏有机酸成分的含量，无法分析有机酸成分的种类。现有技术中，翟兴英等利用超高效液相色谱-飞行时间质谱法(uplc-q-tof-ms/ms)对半夏化学成分进行了种类分析，但未针对半夏有机酸成分进行提取和分离检测，因此鉴定到的有机酸种类较少。目前，关于鹞落坪半夏有机酸成分的研究鲜见报道。
4.因此，需要对半夏和鹞落坪半夏有机酸成分的提取和测定方法进行优化，深入比较半夏和鹞落坪半夏有机酸种类和含量差异，为半夏属质量控制和种类鉴定提供参考。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于有机酸评价半夏和鹞落坪半夏品质的方法，具体是采用uplc-ms/ms(ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry)检测半夏与鹞落坪半夏中的有机酸成分及含量，用于半夏与鹞落坪半夏品质的评价和比较。
6.为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
7.一种基于有机酸评价半夏和鹞落坪半夏品质的方法，包括以下步骤：
8.(1)将待测样品杀青烘烤至恒重，并研磨过筛，收集粉末，所述待测样品为半夏块茎或鹞落坪半夏块茎；
9.(2)将步骤(1)所得粉末与乙醇溶液混合，进行热回流提取，并进行减压浓缩，得到有机酸粗提液；
10.(3)将步骤(2)中获得的有机酸粗提液用无水碳酸钠水溶液调节ph值至10～12，用乙酸乙酯反复萃取至萃取液无色，合并萃取液；
11.(4)将步骤(3)所得萃取液用盐酸酸化至ph值2～3，再以乙酸乙酯反复萃取，合并萃取液；
12.(5)将步骤(4)所得萃取液减压蒸干后，用乙醇溶液复溶，得到总游离有机酸待测
样品；
13.(6)用超高效液相色谱-串联质谱检测所述总游离有机酸待测样品(包括质控样本qc)，并用标准物质数据库和三重四级杆质谱的多反应检测模式mrm(multiple reaction monitoring)，对总游离有机酸待测样品的成分分别进行定性和定量分析；
14.(7)基于步骤(6)中定性和定量分析的结果，获得总游离有机酸的具体成分及其在半夏和鹞落坪半夏中含量的差异。
15.优选地，所述步骤(1)中，杀青温度为100℃～110℃，杀青时间为10～20min；烘烤温度为50℃～60℃，烘烤时间为24～72h；样品粉末过筛目数为50～70目。
16.优选地，所述步骤(2)中，粉末的质量与乙醇溶液的体积比为300～500mg：3～5ml；热回流提取温度为60℃～80℃，提取时间为1～2h，提取次数为2～3次；乙醇溶液浓度为70％～80％。
17.优选地，所述步骤(3)中，无水碳酸钠水溶液浓度为3％～5％，乙酸乙酯萃取次数为3～5次；所述步骤(4)中，乙酸乙酯萃取次数为3～5次。
18.优选地，所述步骤(6)中色谱检测条件为：色谱柱是agilent sb-c18 1.8μm
×
2.1mm
×
100mm；流动相a相为体积浓度为0.1％的甲酸水溶液，流动相b相为体积浓度为0.1％的甲酸乙腈溶液。
19.优选地，所述流动相流速：0.35ml/min；所述色谱柱的柱温40℃；进样量具体为4μl；洗脱梯度：0.00min b相比例为5％，9.00min内b相比例线性增加到95％，并维持在95％ 1min，10.00～11.10min，b相比例降为5％，并以5％平衡至14min。
20.优选地，所述步骤(6)中质谱检测条件：线性离子阱(lit)和三重四极杆(qqq)扫描在三重四极杆线性离子阱质谱仪(q trap)，ab4500 q trapuplc/ms/ms系统上获得的，该系统配备esi turbo离子喷雾接口，由analyst1.6.3软件(ab sciex)控制运行正负两种离子模式。
21.优选地，电喷雾离子源(esi)操作参数为：离子源，涡轮喷雾；源温度550℃；离子喷雾电压(is)5500v(正离子模式)/-4500v(负离子模式)；离子源气体i(gsi)，气体ii(gsii)和帘气(cur)分别设置为50、60和25psi，碰撞诱导电离参数设置为高。
22.优选地，在qqq和lit模式下分别用10μmol/l和100μmol/l聚丙二醇溶液进行仪器调谐和质量校准；qqq扫描使用mrm模式，并将碰撞气体(氮气)设置为中等；通过优化去簇电压(dp)和碰撞电压(ce)，完成各个mrm离子对的dp和ce；根据每个时期内洗脱的代谢物，在每个时期监测一组特定的mrm离子对。
23.优选地，所述标准物质数据库具体为mwdb。
24.相比于现有技术，本发明的有益效果为：
25.(1)本发明针对半夏核心药用成分有机酸进行提取，并对获得的总有机酸粗提液进行除杂，获得较纯的半夏总有机酸提取物，利用uplc-ms/ms进行检测，结合标准物质数据库进行分析，可鉴定达109种有机酸成分(其中104种有机酸未见或鲜见报道)，并且筛选得到半夏与鹞落坪半夏中91种含量显著差异的有机酸成分，且均为鹞落坪半夏高于半夏；
26.(2)本发明所提供的方法，可分别用于对普通半夏和安徽鹞落坪国家级自然保护区特有种鹞落坪半夏中有机酸成分分析，也可用于二者比较分析研究，将在评判二者药用功效的潜力和差别方面具有重要应用价值和前景，例如可用于进一步阐明鹞落坪半夏药效
快于普通半夏的原因。本发明为半夏属质量控制提供了优良的技术手段，也为后期鹞落坪半夏的开发利用提供技术支撑。
附图说明
27.图1为半夏和鹞落坪半夏有机酸成分正离子模式下总离子流图；
28.图2为半夏和鹞落坪半夏有机酸成分负离子模式下总离子流图；
29.图3为半夏和鹞落坪半夏差异有机酸成分热图，热图中右侧的有机酸名称按由上至下的顺序依次为：十三碳二酸、2一甲基丁二酸、戊二酸、2-氨基异丁酸、辛二酸、3-羟基肉桂酸、香草酸、l-苹果酸、6-氨基己酸、十六烷基二酸、异阿魏酸、阿魏酸、柠檬酸、琥珀酸、异柠檬酸、甲基丙二酸、4-乙酰氨基丁酸、壬二酸、奎宁酸、4-胍基丁酸、3-脱氢-l-苏糖酸、3-氨基-2-萘甲酸、4-戊烯酸、单甲基戊二酸、3-(3-羟苯基)-3-羟基丙酸、3-甲基丙烯酸、甲基丁烯酸、2-甲基戊二酸、2-丙基琥珀酸、γ-氨基丁酸、对香豆酸、延胡索酸、2-羟基异己酸、原儿茶酸、2-(甲酰氨基)苯甲酸、十四烷二酸、丙二酸、咖啡酸、芥子酸、柠康酸、1-甲基哌啶-2-羧酸、3-甲基苹果酸、2-呋喃甲酸、苯丙酮酸、β-羟基异戊酸、扁桃酸、氨基丙二酸、龙胆酸、5-乙酰氨基戊酸、己二酸、庚二酸、2-丙基苹果酸、2-异丙基苹果酸、3-o-阿魏酰奎宁酸、肉桂酸、对羟基苯乙酸、3-甲基水杨酸、吡咯-2-羧酸、癸二酸、3，4-二羟基苯乙酸、顺式-对香豆酰酒石酸、5-甲氧基水杨酸、d-半乳糖醛酸、2-甲基苹果酸、乙基丙二酸、氨甲环酸、10-羟基癸酸、乙酰氧基乙酸、十二烷二酸、3-羟基扁桃酸、3-甲氧基苯甲酸、反式-5-o-对香豆酰莽草酸、葡萄糖基丁香酸、阿魏酰丁香酸、3-羟基戊二酸、dl-3-苯基乳酸、高龙胆酸、2-羟基-3-苯基丙酸、2-羟基乙基膦酸、6-羟基己酸、d-木糖酸、羟苯基乳酸、二甲基丙二酸、2-丙基戊二酸、9-氧代壬酸、α-酮戊二酸、2-羟基-2-甲基-3-氧代丁酸、3，4-二羟基苯乙酸、3-羟基-3-甲基-2-氧代戊酸、2-羟基-4-甲基戊酸、2-乙酰-2-羟基丁酸。
具体实施方式
30.下面以实施例作进一步说明，但不作为对本发明的限制。
31.实施例1：半夏和鹞落坪半夏有机酸成分的提取及检测
32.1.仪器与试药
33.(1)仪器：超高效液相色谱仪uplc(shimadzu nexera x2)和串联质谱仪ms/ms(applied biosystems 4500qtrap)、高速万能粉碎机。
34.(2)试药：半夏和鹞落坪半夏块茎材料由合肥师范学院生命科学学院提供，乙醇、乙腈、甲酸和乙酸乙酯为色谱级，其他试剂为分析纯。
35.2.材料预处理
36.将新鲜采集的半夏和鹞落坪半夏块茎用清水洗净后，切片，于105℃烘箱中杀青15min后，60℃烘干至恒重(48h)。随后，用高速万能粉碎机研磨成粉末后，过60目筛。
37.3.总游离有机酸的提取
38.(1)称取烘干的半夏和鹞落坪半夏粉末300～500mg于离心管中，加入3～5ml 75％～80％乙醇，60℃～80℃加热回流提取2～3次，每次1～2h，合并提取液，减压蒸干浓缩至小体积；
39.(2)加入3％～5％无水碳酸钠溶液，调节ph值至11，用乙酸乙酯反复萃取3～5次，
合并萃取液；
40.(3)用盐酸酸化步骤(2)所得萃取液至ph值至2，再以乙酸乙酯反复萃取3～5次，合并萃取液；
41.(4)将步骤(3)所得萃取液减压蒸干后用1～2ml的75％乙醇复溶，过0.22μm微孔滤膜即可进样。
42.4.样品的检测分析
43.(1)色谱条件
44.色谱柱为agilent sb-c181.8μm
×
2.1mm
×
100mm；流动相：a相为超纯水(加入0.1％的甲酸)，b相为乙腈(加入0.1％的甲酸)；流速：0.35ml/min；柱温40℃；进样量4μl；洗脱梯度：0.00min b相比例为5％，9.00min内b相比例线性增加到95％，并维持在95％ 1min，10.00～11.10min，b相比例降为5％，并以5％平衡至14min。
45.(2)质谱条件
46.线性离子阱(lit)和三重四极杆(qqq)扫描是在三重四极杆线性离子阱质谱仪(q trap)，ab4500 q trap uplc/ms/ms系统上获得的，该系统配备了esi turbo离子喷雾接口，可由analyst 1.6.3软件(ab sciex)控制运行正负两种离子模式。esi源操作参数：离子源，涡轮喷雾；源温度550℃；离子喷雾电压(is)5500v(正离子模式)/-4500v(负离子模式)；离子源气体i(gsi)，气体ii(gsii)和帘气(cur)分别设置为50、60和25psi，碰撞诱导电离参数设置为高。
47.在qqq和lit模式下分别用10μmol/l和100μmol/l聚丙二醇溶液进行仪器调谐和质量校准。qqq扫描使用mrm模式，并将碰撞气体(氮气)设置为中等。通过进一步的dp和ce优化，完成了各个mrm离子对的dp和ce。根据每个时期内洗脱的代谢物，在每个时期监测一组特定的mrm离子对。
48.本发明中，质控样本qc是将半夏总游离有机酸待测样品和鹞落坪半夏总游离有机酸待测样品等体积混合，用于分析样本在相同的处理方法下的重复性。自建数据库mwdb是武汉迈特维尔生物科技有限公司建立的标准物质数据库，包含5000多种植物和中药材中代谢产物。
49.5.有机酸成分的定性分析
50.基于自建数据库mwdb，根据二级谱信息进行物质定性，分析时去除了同位素信号，含k

、na

、nh
4
的重复信号，以及本身是其他更大分子量物质的碎片离子的重复信号。从半夏和鹞落坪半夏中共鉴定出109种有机酸成分，其中草酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸和反式乌头酸在半夏中已有报道，其余104种有机酸未见或鲜见报道。具体结果如表1所示。
51.表1 半夏和鹞落坪半夏中分离、鉴定出的有机酸成分
52.53.54.55.[0056][0057]
实施例2：半夏和鹞落坪半夏差异有机酸成分的筛选
[0058]
1.有机酸成分的定量分析
[0059]
利用软件analyst 1.6.3处理质谱数据，获得半夏和鹞落坪半夏代谢物总离子流图(tic)。通过三重四级杆筛选出每个物质的特征离子，用multiaquant软件进行色谱峰的积分和校正，完成有机酸成分的定量分析。
[0060]
2.差异有机酸成分的筛选
[0061]
将半夏和鹞落坪半夏不同有机酸成分色谱峰积分(峰面积)进行比较，差异倍数为2倍以上或0.5倍以下的成分，即为筛选出的差异有机酸成分。
[0062]
由图1和图2可知，半夏和鹞落坪半夏正、负离子模式下的总离子流图(tic)峰形不同，表明两种半夏有机酸含量存在差异。进一步，利用物质的峰面积差异倍数(大于2倍或小于0.5倍)筛选含量存在显著差异的有机酸成分，结果如图3所示。109种有机酸中，有91种有机酸含量在两种半夏中存在显著差异，且均为鹞落坪半夏高于半夏，特别是4-戊烯酸、3-甲基丙烯酸、甲基丁烯酸、单甲基戊二酸、3-(3-羟苯基)-3-羟基丙酸这5种有机酸的含量，差异倍数分别为13578倍、6204倍、7149倍、22281倍和2914倍，表明鹞落坪半夏的品质要好于半夏。
[0063]
以上列举具体实施案例对本发明进行补充说明，以上实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表本发明的保护范围，其他人根据本发明的提示做出的非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。