一种基于自愈合水凝胶的仿生人工血管制备方法与流程

1.本发明涉及组织工程技术领域，具体涉及一种基于自愈合水凝胶的仿生人工血管制备方法。


背景技术：

2.血管的健康在维持人体正常生理活动方面发挥着重要作用。根据世界卫生组织的最新统计，心血管疾病作为全球范围内发病率和死亡率最高的疾病之一，严重威胁着人类健康。与内科治疗相比，血管移植在治疗心血管疾病引起的血管衰竭方面更加有效。初期血管移植手术使用的是自体血管，但是自体血管移植的来源和质量在一些情况下难以保证，不能完全满足这类手术的需求。近年来，仿生人工血管已成为了很多心血管疾病的首选替代治疗方案。
3.目前，科研人员已发展了多种方法制备仿生人工血管。如通过模具卷曲的方法将细菌纤维素膜卷曲三圈，经冷冻干燥、去除模具之后得到具有三层管壁的中空管状结构，在每层管壁中还可以负载不同种类的细胞(adv.healthcare mater.,2017,1601343)。利用具有变形能力的支架材料也能够自发卷曲实现人工血管的构筑(adv.funct.mater.,2018,1801027)。可以总结看出，通过人工卷曲或者自发卷曲得到的仿生人工血管是不闭合的，而且基于卷曲方法得到人工血管壁内外结构是一致的，与自体血管的外部致密-内部疏松多孔的真实结构差距较大。上述不利因素都严重限制了这些人工血管的实际应用价值。另一方面，静电纺丝技术能够简便地将聚合物或者天然原料的溶液转变成闭合的管状结构材料，但是该方法制备人工血管耗时较长，所得到的人工血管机械性能较差(acta biomater.,2014,10,2739
–
2749)。而且，利用静电纺丝技术制备多层人工血管需要经历多个纺丝过程或者进一步结合其他制备技术(如相分离、3d打印等)，制备过程更加复杂(acta biomater.,2010,6,110
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122；phys.chem.chem.phys.,2015,17,2996
–
2999)。此外，青岛三帝生物科技有限公司王红等(专利号：201611189284.9)利用新兴的3d打印技术制备出三层仿生人工血管，但是该技术对打印设备和操作过程都具有很高的要求，且制备成本较高，不利于广泛使用。因此，亟需发展简便、低成本的闭合人工血管的制备和加工方法，同时使得仿生人工血管具有媲美自体血管的结构和性能。


技术实现要素：

4.为了解决目前仿生人工血管制备中存在的结构不闭合、制备过程耗时且成本高、再加工能力差以及人工血管结构与自体血管结构不吻合等问题，本发明提出了一种基于自愈合水凝胶的仿生人工血管制备方法，基于自愈合水凝胶实现制备和再加工闭合人工血管的简便、高效方法。
5.本发明的技术方案之一，一种基于自愈合水凝胶的仿生人工血管制备方法，包括以下步骤：
6.(1)在水凝胶中形成动态共价键，制备自愈合水凝胶材料；
7.(2)将自愈合水凝胶材料制备成仿生人工血管预制体；
8.(3)仿生人工血管预制体经固化处理后得到所述仿生人工血管。
9.进一步地，所述步骤(1)中，所述水凝胶的基质为海藻酸钠、壳聚糖、明胶、纤维素、细菌纤维素和木质素中的任意一种，所述动态共价键为硼酸酯键、二硫键、亚胺键、酰腙键、diels-alder可逆共价键等中的任意一种；
10.进一步地，所述步骤(2)采用模具卷曲的方法将自愈合水凝胶材料制备成仿生人工血管预制体；
11.进一步地，所述步骤(3)中，固化处理具体为金属阳离子水溶液浸泡交联固化处理。
12.本发明技术方案中，动态共价键的作用有：形成水凝胶和自愈合的作用，在固化处理过程中，金属阳离子与水凝胶基质中的羟基基团发生螯合作用，形成新的网络结构从而实现固化处理。因而在本发明中，1.水凝胶基质不受限，只要能引入动态共价键，具有大量羟基基团都可以(海藻酸钠、壳聚糖、明胶、纤维素、细菌纤维素和木质素都满足)；2.动态共价键种类不受限，多种动态共价键均可实现闭合人工血管制备；3.固化处理的溶液不受限，金属阳离子如ca
2
、mg
2
、zn
2
等二价金属离子和fe
3
、al
3
、cr
3
等三价金属离子均可以实现固化处理。而且，固化处理过程中对动态共价键没有影响，只是形成新的网络结构。
13.动态共价键的形成过程是可逆的，涉及共价键的断裂和形成。该水凝胶中的苯硼酸二醇酯键是可逆的，所以得到的水凝胶具有较强的自愈合能力。固化处理过程中动态共价键可以认为没有影响，但是固化处理后，由于新形成网络结构，对自愈合能力会有影响：具体是固化时间越长，自愈合能力越低。血管再加工，可以是固化之前进行，然后再固化；或者固化时将端口处不固化，愈合加工形成新的血管后再固化端口处。
14.进一步地，所述仿生人工血管形状为直线型、y型、井形、树枝状中的任意一种，由两个或两个以上仿生人工血管预制体通过端口接触自愈合形成。比如将两个直径相同的仿生人工血管预制体的一个端口处进行接触愈合，可以得到一个长度增加的人工血管。
15.进一步地，具体包括以下步骤：
16.①
将水凝胶基质、偶联剂、盐酸多巴胺置于水中混合，氮气氛围下搅拌得到前驱体溶液a；将水凝胶基质、偶联剂、苯硼酸置于水中混合，氮气氛围下搅拌得到前驱体溶液b；
17.②
将前驱体溶液a和前驱体溶液b透析、冷冻干燥得到前驱体a和前驱体b；
18.③
将前驱体a用水溶解后加入前驱体b，搅拌混匀后滴加碱性水溶液搅拌得到自愈合水凝胶材料；
19.④
将所述自愈合水凝胶材料卷曲在模具上得到仿生人工血管预制体；
20.⑤
将所述仿生人工血管预制体在金属阳离子水溶液中浸泡后脱模得到所述基于自愈合水凝胶的仿生人工血管。
21.本发明上述技术方案将多巴胺和3-氨基苯硼酸修饰到海藻酸钠结构中，在碱性条件下通过络合这两种前驱体形成动态共价键，制备出海藻酸钠基自愈合水凝胶材料，并采用模具卷曲的方法将自愈合水凝胶快速、简便地制备成人工血管。进一步，结合人工血管端口处的自愈合能力以及cacl2水溶液对人工血管的表面处理可以实现人工血管的再加工。
22.进一步地，所述步骤
①
中，所述前驱体溶液a中水凝胶基质、偶联剂和盐酸多巴胺的质量比为1:0.96:0.44，所述前驱体溶液b中水凝胶基质、偶联剂和苯硼酸的质量比为1:
0.96:0.39；所述水凝胶基质为海藻酸钠，所述偶联剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐。上述前驱体溶液a和前驱体溶液b合成前均需要进行抽真空通氮气保护且，合成前驱体溶液a时还需进行避光处理。
23.进一步地，所述步骤
②
中，透析优选使用截留分子量为3500da，大小为15cm
×
3cm的透析袋进行透析，透析时间5d，冷冻干燥温度-18℃，冷冻干燥时间4d。
24.进一步地，所述步骤
③
中，前驱体a中水凝胶基质和前驱体b中水凝胶基质的质量比为1:2，所述碱性水溶液为0.1mol/l的氢氧化钠溶液。naoh水溶液会络合这两种前驱体，诱导形成苯硼酸-邻苯二酚动态共价键，从而制备的水凝胶具有自愈合性。
25.进一步地，所述步骤
④
中，模具直径为1-20mm；
26.进一步地，所述步骤
⑤
中，金属阳离子水溶液为浓度为50mm的氯化钙水溶液，浸泡时间为0-100s。通过控制浸泡时间，可以得到内外壁结构不同的人工血管。具体的，氯化钙与水凝胶基质中的羟基等基团发生螯合作用，形成新的网络结构。浸泡时间越长，人工血管外壁孔结构会更加致密，而内壁孔结构因未与氯化钙水溶液接触几乎不发生变化，因而可以得到外部结构致密-内部疏松多孔的类真实血管的结构。
27.本发明的技术方案之二，上述基于自愈合水凝胶的仿生人工血管制备方法所制备的仿生人工血管。
28.与现有技术相比，本发明的有益效果：
29.本发明通过在水凝胶中形成动态共价键，制备自愈合水凝胶材料；然后将自愈合水凝胶材料制备成仿生人工血管预制体；所制备的水凝胶展现出良好的自愈合能力，因而可以简便地通过卷曲的方法制备出闭合人工血管。
30.本发明通过模具卷曲制备的人工血管，其直径和长度可通过模具尺寸来进行调节。
31.本发明制备的闭合人工血管其端口处仍保有自愈合能力，可将相同直径、不同长度的人工血管进行再加工制备所需长度的人工血管。
32.本发明所制备的人工血管可与cacl2水溶液交联，使得血管外表面结构较为致密，内表面则为疏松多孔结构，得到与自体血管三层结构相吻合的结构。外表面致密的结构有利于增加血管的机械强度，而内表面的疏松多孔结构能够促进内皮细胞的粘附、分化以及与血液的物质交换等。
33.本发明以天然高分子材料作为水凝胶基质，有利于构建生物相容性较好的人工血管，从而抑制移植后可能发生的免疫排斥反应。
34.本发明制备的基于自愈合水凝胶的仿生人工血管可以通过制备出标准化长度的人工血管，然后通过组装得到不同形状的人工血管，从而实现人工血管标准化和工业化生产。
附图说明
35.图1为本发明实施例1中海藻酸钠基自愈合水凝胶前驱体alg-pba和alg-da的1h nmr表征谱图，其中a为alg-pba前驱体的1h nmr表征谱图，b为alg-da前驱体的1h nmr表征谱图；
36.图2为本发明实施例1中alg-pba和alg-da两种前驱体合成的自愈合水凝胶照片
图；
37.图3为本发明实施例1中海藻酸钠基水凝胶的自愈合能力演示图；
38.图4为本发明实施例1中海藻酸钠基水凝胶通过卷曲制备仿生人工血管的照片图；
39.图5为本发明实施例1中海藻酸钠基水凝胶制备得到的不同直径和不同长度段的仿生人工血管照片图，其中a为不同直径的仿生人工血管，b为不同长度的仿生人工血管；
40.图6为本发明实施例1中两个相同直径的仿生人工血管通过端口处自愈合的得到一个仿生人工血管的照片图；
41.图7为本发明实施例1中海藻酸钠基水凝胶经cacl2浸泡不同时间后的sem照片图；
42.图8为本发明实施例1中仿生人工血管经cacl2浸泡不同时间后外壁、内壁和截面的sem照片图，其中，a为外壁sem照片图，b为内壁sem照片图，c为截面sem照片图；
43.图9为本发明实施例1中海藻酸钠基水凝胶的细胞毒性测试结果图。
具体实施方式
44.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
45.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
46.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
47.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
48.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
49.实施例1
50.(1)自愈合水凝胶前驱体的合成：氮气氛围、避光条件下，称取海藻酸钠1g，3-氨基苯硼酸0.39g，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐0.96g，置于100ml去离子水中，在室温下搅拌24h合成alg-pba前驱体溶液；氮气氛围、避光条件下，称取海藻酸钠1g，盐酸多巴胺0.44g，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐0.96g，置于100ml去离子水中，在室温下搅拌24h合成alg-da前驱体溶液。
51.(2)alg-da前驱体溶液和alg-pba前驱体溶液分别置于透析袋(截留分子量为3500da，大小为15cm
×
3cm的透析袋，在500ml的2％(w/v)碳酸氢钠和1mmol edta中煮(80℃左右)30min，并用蒸馏水清洗3次)中透析5d，透析期间需勤换水。透析结束后转入培养皿
中，放入-18℃冰箱冷冻干燥，然后将样品放入冷冻干燥机中冷冻干燥4d，即可得到自愈合水凝胶的两种前驱体alg-pba前驱体和alg-da前驱体样品(海藻酸钠基自愈合水凝胶前驱体alg-pba和alg-da的1h nmr表征谱图见图1，其中a为alg-pba前驱体的1h nmr表征谱图，b为alg-da前驱体的1h nmr表征谱图)。
52.(3)先将步骤(2)中的得到的50mg alg-pba前驱体样品放入5ml烧杯中，加入2ml去离子水，待其完全溶解后加入40mg alg-da前驱体样品，室温下搅拌两小时，接着往烧杯中加入300μl 0.1mol/l naoh水溶液,继续搅拌，30s内即可形成alg水凝胶(alg-pba和alg-da两种前驱体合成自愈合水凝胶的过程照片见图2)。
53.(4)制备的海藻酸钠基水凝胶分别制成3个规整的小球，将其中两个小球分别用亚甲基蓝和罗丹明b染色，另一个小球不作处理，然后将这三个小球接触后，在不施加外力的条件下2min内能自动愈合(海藻酸钠基水凝胶的自愈合能力演示图片见图3)。
54.(5)将步骤(3)制得的alg水凝胶均匀涂成一层厚度(厚度为2mm)均匀的水凝胶薄膜，然后将包裹在不同直径(4mm、6mm、8mm、10mm)的聚四氟乙烯棒上，并使其包裹后水凝胶薄膜的两端进行接触愈合，脱模后即可得到仿生人工血管预制体。不同长度的仿生人工血管预制体可以通过调整水凝胶薄膜的尺寸来获得，不同直径的仿生人工血管预制体可以通过调整聚四氟乙烯棒的直径来获得。
55.(6)仿生人工血管的再加工：按照步骤(5)中所述方法制备两个直径相同的仿生人工血管预制体，将两个仿生人工血管预制体的一个端口处进行接触愈合，可以得到一个长度增加的仿生人工血管预制体。
56.(7)仿生人工血管的内外壁处理：将步骤(5)、(6)中所述包裹在聚四氟乙烯棒上的人工血管浸泡在50mm cacl2水溶液中(浸泡时间20s、40s、60s)，取出后进行脱模，即可得到内外壁结构不同的仿生人工血管，过程照片见图4，制备的不同直径和长度的仿生人工血管照片见图5，其中a为不同直径的仿生人工血管，b为不同长度的仿生人工血管，经过步骤(6)接触愈合后浸泡在50mm cacl2水溶液中得到的仿生人工血管照片见图6。sem分析不同浸泡时间得到的仿生人工血管，结果见图7-8。图8中a为外壁sem照片，b为内壁sem照片，c为截面sem照片。由图8可以得出，人工血管的外壁和内壁在cacl2水溶液浸泡之前都是疏松多孔的结构，而浸泡之后ca
2
与凝胶中的海藻酸钠分子结构中的羟基等基团发生螯合作用形成新的网络结构，使得人工血管的外壁变得更加致密。人工血管的内壁因未与cacl2直接接触而未发生明显结构变化。通过人工血管截面的sem图片可以进一步证实该种结构的变化趋势。因而通过简单的cacl2水溶液浸泡处理可以得到外壁结构致密-内壁疏松多孔的结构，该结构与真实人工血管结构相吻合。
57.(8)仿生人工血管的细胞毒性测试：将步骤(3)制得的alg水凝胶冷冻干燥后切成尺寸为2
×2×
1mm的小块，在水中浸泡2天，每6小时更换一次去离子水。消毒后，置于96孔板中，以3
×
103个细胞/孔的密度进行细胞播种，采用的细胞为小鼠成纤维细胞(nih/3t3)，nih/3t3细胞在含有10％胎牛血清fbs 1％青霉素-链霉素的dmem培养基中，对照组则加入100μl dmem培养基。在37℃、5％co2饱和湿度的培养箱中培养0、24小时后用mtt(sigma)比色法检测nih/3t3细胞的增殖情况。结果见图9。图9可以得出，当培养时间从0h到24h，alg水凝胶样品对应的细胞的数量显著增加，且比对照组略高，表明该水凝胶没有明显的细胞毒性。
58.实施例2
59.与实施例1不同之处在于：自愈合水凝胶前驱体合成过程中使用的是羧甲基纤维素钠(cmc)。cmc-pba前驱体的合成：将称取的羧甲基纤维素钠1g、3-氨基苯硼酸0.39g、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐0.96g置于250ml圆底烧瓶中，加入100ml去离子水，在氮气保护下，室温搅拌24h。cmc-da前驱体的合成：将称取的羧甲基纤维素钠1g、盐酸多巴胺0.44g、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐0.96g置于250ml圆底烧瓶中，加入100ml去离子水，在氮气保护下，室温搅拌24h。且该反应需要在避光下进行。反应结束后需对得到的样品进行透析处理。将反应液直接倒入透析袋中，在烧杯中进行透析，透析5d。透析结束后将样品倒入培养皿中，放入-18℃冰箱冷冻定型，然后将样品放入冷冻干燥机中冷冻干燥4d，即可得到自愈合水凝胶两种前驱体cmc-pba前驱体和cmc-da前驱体样品。
60.采用和实施例1相同的步骤将cmc-pba前驱体和cmc-da前驱体样品制备成仿生人工血管。
61.对制备的仿生人工血管进行实施例1相同的扫描电镜分析以及自愈合检测，结果显示和实施例1制备的人工血管具有相似的性质。
62.实施例3
63.与实施例1不同之处在于：自愈合水凝胶前驱体合成过程中使用的是海藻酸钠和聚乙烯醇(pva)。alg-pba前驱体的合成：氮气氛围、避光条件下，称取海藻酸钠1g，3-氨基苯硼酸0.39g，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐0.96g，置于100ml去离子水中，在室温下搅拌24h合成得到alg-pba前驱体溶液；反应结束后需对得到的样品进行透析处理。将反应液直接倒入透析袋中，在烧杯中进行透析，透析5d。透析结束后将样品倒入培养皿中，放入-18℃冰箱冷冻定型，然后将样品放入冷冻干燥机中冷冻干燥4d，即可得到自愈合水凝胶前驱体alg-pba。
64.先将步骤(1)中的得到的50mg alg-pba前驱体样品放入5ml烧杯中，加入2ml去离子水，待其完全溶解后加入1ml质量分数为10％的pva水溶液，室温下搅拌两小时，接着往烧杯中加入300μl 0.1mol/l naoh水溶液,继续搅拌，30s内即可形成alg-pva水凝胶。
65.pva分子中含量大量的羟基，与实施例1中所合成的alg-da具有类似性，因而在制备自愈合水凝胶中依然可行，其凝胶形成原理是一样的，都是基于硼酸酯键形成。
66.采用和实施例1相同的步骤将alg-pva水凝胶制备成仿生人工血管。
67.对制备的仿生人工血管进行实施例1相同的扫描电镜分析以及自愈合检测，结果显示和实施例1制备的人工血管具有相似的性质。
68.在进一步的实验验证中，发现在本发明中，1，水凝胶基质不受限，只要能引入动态共价键，具有大量羟基基团都可以(海藻酸钠、壳聚糖、明胶、纤维素、细菌纤维素和木质素都满足)；2.动态共价键种类不受限，多种动态共价键均可实现闭合人工血管制备；3.固化处理的溶液不受限，ca
2
、mg
2
、zn
2
等二价金属离子和fe
3
、al
3
、cr
3
等三价金属离子均可以实现固化处理。
69.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。