一种以茶树带腋芽茎段为外植体建立高效快繁体系的方法与流程

1.本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种以茶树带腋芽茎段为外植体建立高效快繁体系的方法。


背景技术：

2.茶是世界上最古老，最受欢迎的含咖啡因的饮料，具有极大的经济、药用和文化价值。茶树( camellia sinensis)为山茶科山茶属灌木或小乔木，多年生木本植物， 茶树的叶子可制茶，因此茶树苗木具有极大的需求量。茶树繁殖通常是扦插和籽播，传统的扦插具有所需原材料多、成活率低、偏冠现象等较多缺点，而籽播也具有需求量大、萌发时间长、萌发率低等问题，因此不能在短时间内提供大量的苗木。
3.自茶树组织培养技术开展，国内外学者通过茶树不同类型外植体培养成功建立茶树组培快繁体系。在茶树组培快繁研究中，腋芽培养为离体培养中常用的类型, 其在连续培养中能产生更多的丛生芽, 且发育生长得较好, 具有稳定的遗传特性和较高的繁殖系数。植物组织培养具有所需原材料少、不受季节与有害生物限制、品种稳定遗传、繁殖系数高、培养周期短等优点，能在短时间内提供大量的苗木，利用组培技术能够在短期内解决茶树工厂化育苗和规模化种植的问题。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种以茶树带腋芽茎段为外植体建立高效快繁体系的方法，实现了茶树高效的快繁体系，为建立茶树工厂化育苗提供技术支撑。
5.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种以茶树带腋芽茎段为外植体建立高效快繁体系的方法，包括外植体消毒、腋芽萌发、腋芽增殖、壮苗和无根苗生根五个阶段，具体的，包括如下步骤：s1、外植体消毒：4-5月，摘取茶树植株鲜嫩的带腋芽茎段，本实验选取的是云南大理茶古茶树l32株系为材料，在超净台中进行茎段消毒处理后，将其切成每段有1～2个腋芽；s2、腋芽萌发：将完成消毒的茎段上端平切下端斜切，切掉叶柄后，接种到添加有2 mg.l-1
的6-ba、0.9 mg.l-1
的naa的wpm基本培养基上，进行腋芽萌发及培养；s3、 腋芽增殖：待腋芽萌发到2.8 cm左右时，将腋芽切下，基部斜切，接种到添加有3.5 mg.l-1
的6-ba和0.8mg.l-1
的2,4-d的wpm培养基上进行增殖丛生芽；s4、壮苗：将长势基本一致的丛生芽剪成 1～3 株单芽，接种至添加有2 mg.l-1 6-ba 和0.6 mg.l-1 2,4-d的wpm培养基上进行壮苗培养；s5、组培苗的生根和移栽：待无根苗平均高度约5 cm 左右后，接种至1/2ms的生根培养基上进行培养，待根系长出后，将组培苗炼苗移栽。
6.进一步地，所述的步骤s1中，消毒处理时，剪取茶树植株中鲜嫩的带腋芽茎段7～8 cm，剪去叶片保留部分叶柄；在洗洁剂溶液中浸泡8 min ，自来水反复冲洗0.5 h 以上后；
在0.5%多菌灵溶液中浸泡10min，自来水冲洗3 h 以上，浸泡期间不断搅拌；放入超净工作台，用75%的酒精浸泡消毒2min，无菌水清洗4次；再用20%的次氯酸钠溶液浸泡13min，无菌水冲洗7次，无菌吸水纸吸去表面水分，切成含有1～2个腋芽的单个茎段，用于接种。
7.进一步地，所述的步骤s2中，腋芽萌发的wpm培养基的ph=5.80，萌发培养时间为50d。
8.进一步地，所述的步骤s3中，腋芽增殖的wpm培养基的ph=5.80，增殖培养时间为45d。
9.进一步地，所述的步骤s4中，壮苗的wpm培养基的ph=5.80，壮苗培养时间为45d。
10.进一步地，所述的步骤s5中，生根培养基为1/2 ms基本培养基中加入1.4 mg.l-1
的iba后配置所得，接种前用生根粉浸泡8min，培养基的ph=5.80，生根培养65d，根系长出后，植株炼苗时间为6 d，移栽所用基质由黄土：蛭石：珍珠岩按质量比2：1：1的比例均匀混合所得。
11.进一步地，植物组织培养各个阶段的培养条件均为光照强度为2 100 lx，每日光照12 h，培养温度(23
±
2)℃。各个阶段以 wpm 或1/2ms为基础培养基，其中蔗糖浓度 2.5%，植物凝胶 0.25%。
12.本发明以茶树带腋芽茎段作为材料，外植体在消毒后，在添加3.5 mg.l-1
的6-ba和0.8mg.l-1
的2,4-d 的wpm培养基作用下诱导腋芽增殖，在添加1.4 mg.l-1 iba的1/2ms培养基作用下诱导生根，成功建立了茶树高效的快繁体系，可在组织培养和工厂化育苗的步骤中进行使用。
附图说明
13.图1为本发明实施例外植体各阶段的状态图；图中：a.培养0d时带腋芽茎段的萌发情况；b.培养50 d时带腋芽茎段的萌发情况；c.培养0d时腋芽的增殖情况；d.培养45 d时腋芽的增殖情况； e.培养45 d时的壮苗情况； f-g.培养65d后无根苗诱导生根情况； h.茶树的移栽生长情况。
具体实施方式
14.为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
15.试验资料培养基及培养条件：腋芽萌发培养基为：wpm 2 mg.l-1
6-ba 0.9 mg.l-1 naa；腋芽增殖培养基为：wpm 3.5 mg.l-1
6-ba 0.8 mg.l-1 2,4-d；组培苗壮苗培养基为：wpm 2 mg.l-1 6-ba 0.6 mg.l-1
2,4-d；无根苗生根培养基为：1/2ms 1.4 mg.l-1 iba。所述培养的各个阶段，光照强度2 100 lx，每日光照12 h，温度(23
±
2)℃。
16.实施例1 一种以茶树带腋芽茎段为外植体建立高效快繁体系的方法外植体的消毒：取茶树中7～8 cm嫩绿的枝条，剪去叶片保留部分叶柄；在洗洁剂溶液中浸泡8 min后，自来水反复冲洗0.5 h以上；在0.5%多菌灵溶液中浸泡10min，期间不断搅拌，浸泡后自来水冲洗3 h以上；放入超净工作台，用75%的消毒酒精进行消毒2min，无菌水清洗4次；用20%的次氯酸钠溶液浸泡13min后，无菌水冲洗7次。无菌的吸水纸吸去表面
水分，用手术刀将其切成带1～2个腋芽的茎段，上端平切下端斜切，切掉叶柄。
17.从表 1可看出，用不同时间组合的75%酒精和20%次氯酸钠溶液对带腋芽茎段进行消毒处理，随着20%次氯酸钠溶液消毒时间的增加，污染率随之降低，但死亡率也随之上升。当使用20%次氯酸钠溶液的消毒13min时，死亡率最高。随着20%次氯酸钠溶液消毒时间的减少，外植体的存活率呈现出上升的趋势。综合比较污染率、存活率及死亡率三个指标，最终确定带腋芽茎段外植体消毒最佳时间为75%酒精2 min，20%次氯酸钠溶液消毒13 min，此时存活率平均为67.88%。
18.表1 不同消毒时间组合对带腋芽茎段的影响腋芽萌发：外植体消毒后，接种到加入2 mg.l-1
的6-ba、0.9 mg.l-1
的naa的wpm培养基中，进行腋芽萌发及培养，培养时间为50 d左右，如图1中a和b 所示。
19.腋芽增殖：待腋芽萌发到2.8 cm左右时，将腋芽切下，基部斜切，接种到加入3.5 mg.l-1
的6-ba和0.8mg.l-1
的2,4-d的wpm培养基上进行增殖，增殖系数为4.32。培养时间为45 d左右，如图1中c和d 所示。
20.壮苗培养：将长势基本一致，生长至 2～3 cm 的丛生芽剪成 1～3 株单芽，接种至以 wpm作为基础培养基，添加2 mg.l-1 6-ba 和0.6 mg.l-1 2,4-d壮苗培养基上进行培养。培养时间为45 d左右，如图1中e所示。
21.生根培养和移栽：将壮苗培养基中长势健壮、高度5 cm 左右的无根苗下端斜切，用 60.0 mg/l iba 无菌溶液浸泡 8 min，接种到加入1.4 mg.l-1 iba的1/2ms培养基进行生根培养，培养时间65 d左右。如图1中f和g 所示；待根系长出后，植株自然光炼苗6 d，将植株根部培养基洗净，移栽到黄土：蛭石：珍珠岩按质量比2：1：1均匀混合的基质中，如图1中h所示。
22.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。