一种同时检测大鼠血浆中四种吲哚类物质的高效液相色谱法的制作方法

1.本发明属于检测技术领域，具体涉及同时检测大鼠血浆中硫酸吲哚酚、吲哚乙酸、吲哚丙酸和吲哚四种吲哚类物质的高效液相色谱方法。


背景技术：

2.肠道菌群作为机体的一种重要“器官”，对宿主的健康起着至关重要的作用，它不仅帮助宿主从食物中获取营养和能量，还产生了许多代谢产物参与宿主的新陈代谢。在正常情况下肠道菌群与宿主及外部环境之间保持着动态平衡，一旦肠道菌群紊乱，平衡失衡，会引发宿主多种功能的丧失，如屏障功能、炎症和免疫功能丧失等，从而诱发疾病。
3.吲哚及其衍生物是色氨酸在肠道菌群作用下的代谢产物，可与芳烃受体相互作用，影响宿主的免疫、代谢和行为等。研究表明这些吲哚类物质与细菌感染、肠道炎症、癌症、糖尿病以及神经系统疾病等密切相关。因此，建立大鼠血浆中吲哚类物质的定性、定量的快速检测方法对研究疾病的发病机制具有极其重要的意义。
4.目前大鼠血浆吲哚类物质常见的检测方法是超高效液相色谱-质谱法，但此方法尚不能广泛普及。因此，开发一种简便的高效液相色谱同时检测大鼠血浆中多种吲哚类物质的方法具有重要价值。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是建立一种同时检测大鼠血浆中四种吲哚类物质的高效液相色谱方法，实现对大鼠血浆中四种含量差异较大的吲哚类物质同时定量检测，具有灵敏度高、重现性好、分析时间短、样本用量小等优点。
6.为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
7.本发明公开了一种同时检测大鼠血浆中吲哚类物质含量的高效液相色谱-荧光检测方法，包括以下步骤：(1)标准品溶液的配制；(2)液液萃取处理样本；(3)采用高效液相色谱法进行定性定量测定。
8.步骤(1)所述的标准品溶液的配制具体方法为：
9.用甲醇分别配制100.00μmol/l吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，iaa)、2.00mmol/l吲哚丙酸(indole-3-propionate，ipa)、200.00μmol/l吲哚(indole，ind)标准品储备溶液，用50％甲醇配制1.50mmol/l硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate，3-inds)标准品储备液，所有储备溶液置于-20℃冰箱保存，使用时将储备溶液用甲醇/水(50/50，v/v)稀释至所需浓度，配制系列浓度标准工作液。
10.步骤(2)所述的液液萃取的具体操作为：
11.取edta抗凝血浆300μl，加入10μl内标溶液，再加入萃取剂1100μl，涡旋混匀，于25℃150rpm振摇10min；13,300g离心15min，取上清，真空离心浓缩干燥后复溶于200μl流动相；
12.进一步的，所述萃取剂为乙醚和乙酸乙酯的混合液，其体积比为3:5；
13.进一步的，所述内标液为20.00mg/l甲萘酚的甲醇溶液。其具体配制方法为：
14.精密称取甲萘酚溶于甲醇，配置浓度为5.00g/l的甲萘酚储备溶液，使用时用50％甲醇稀释至所需浓度。
15.步骤(3)中液相色谱条件如下：
16.色谱柱：shim-packvp-ods(150mm
×
4.6mm，4.6μm)；
17.流动相a：10mmol/lnah2po4溶液；
18.流动相b：甲醇；等度洗脱，流动相a的比例为40％；
19.流速：0.8ml/min；
20.柱温：30℃；
21.荧光检测器：采用程序检测波长；
22.进样量：20μl。
23.进一步的，所述程序检测波长为：
24.表1波长程序表
[0025][0026]
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
[0027]
本发明方法使大鼠血浆中吲哚类物质得到充分提取分离，采用程序检测波长可实现大鼠血浆中含量差异较大的四种吲哚类物质同时定量检测，具有灵敏度高、重现性好、分析时间短、样本用量小等优点。
附图说明
[0028]
图1为吲哚类物质和内标标准品色谱图
[0029]
图2为大鼠血浆的色谱图
具体实施方式
[0030]
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步的描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0031]
以下实施例所用的仪器和材料来源如下：
[0032]
(1)仪器：thermo fisher scientific u3000型高效液相色谱仪(thermo fisher scientific公司)；millipore超纯水过滤装置及millipore真空泵(美国millipore公司)；fresco 17低温台式离心机(thermo公司)；zwy-100h恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司)；vortex-qilnbeier涡旋振荡器(scientific instrument公司)；savantdna120真空离心浓缩仪(thermo公司)；电子分析天平(上海精天电子仪器有限公司)。
[0033]
(2)试剂耗材：甲醇(色谱级，tedia公司)；乙腈(色谱级，tedia公司)；shim-packvp-ods色谱柱(shimadzu公司)。
[0034]
实施例1
[0035]
1.血浆样本预处理
[0036]
取edta抗凝血浆300μl，加入10μl内标溶液(甲萘酚，20.00mg/l)，加入乙醚/乙酸乙酯(3/5，v/v)混合萃取剂1100μl，涡旋混匀，于25℃150rpm振摇10min。13,300g离心15min，将上清液转移至另一离心管，真空离心浓缩干燥。200μl流动相复溶，12,200g离心10min，取20μl上清液进样分析。
[0037]
2.液相色谱条件
[0038]
流动相：流动相a为10mmol/lnah2po4溶液；
[0039]
流动相b为甲醇，采用等度洗脱方法，流动相a的比例为40％。
[0040]
色谱柱：shim-packvp-ods(150mm
×
4.6mm，4.6μm)。
[0041]
流速：0.8ml/min。
[0042]
柱温：30℃。
[0043]
进样量：50μl。
[0044]
荧光检测器：程序检测波长
[0045]
表1波长程序表
[0046][0047]
记录色谱图，采用标准曲线法定量。
[0048]
实施例2
[0049]
本实施例是考察所述方法用于测定血浆中3-inds、iaa、ipa和ind的线性及检测限。将30μl系列混合标准工作液分别添加到270μl混合血浆，制备校准样品。样品经预处理后重复测定三次，以混合血浆加入待测物的浓度为横坐标(x)，待测物与内标的峰面积比值减去混合血浆待测物与内标峰面积的比值为纵坐标(y)，绘制校准曲线，以三倍信噪比(s/n＝3)计算检测限，各分析物r2≥0.9980，结果见表2。
[0050]
表2血浆吲哚类物质的标准曲线和检测限
[0051][0052]
实施例3
[0053]
本实施例是考察本发明所述方法用于测定大鼠血浆中3-inds、iaa、ipa和ind的精密度。采用真实样本进行精密度的考察，选取高、中、低三种浓度的吲哚类物质的混合血浆，经过样品预处理后，日内重复测定5次，连续测定5天，计算待测物与甲萘酚的比值，进行精
密度评估，结果见表3。相对标准偏差均等于或小于2.5％，表明本发明具有良好的精密度。
[0054]
表3精密度(n＝5)
[0055][0056]
实施例4
[0057]
本实施例是考察本发明所述方法用于测定大鼠血浆样本中3-inds、iaa、ipa和ind的回收率。在血浆基质中分别加入高、中、低三种浓度的吲哚类物质混合标准品，经过样品预处理后，每个浓度平行测定3次，进行回收率试验。相对回收率＝(加标后血浆基质中吲哚类物质的测定浓度-加标前血浆基质中吲哚类物质的测定浓度)/加入的吲哚类物质标准品浓度
×
100％，结果见表4所示。平均回收率在91.1％～106％之间，表明该方法具有良好的准确度。
[0058]
表4回收率试验(n＝3)
[0059][0060]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详细的描述，但是在本发明基础上可以作一些修改或改进而以作他用。这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。