3,5-二甲氧基甲苯在毒杀线虫中的应用及含有该成分的线虫毒杀剂的制作方法

1.本发明涉及线虫防治技术领域，特别是涉及3,5-二甲氧基甲苯在毒杀线虫中的应用及含有该成分的线虫毒杀剂。


背景技术：

2.根据线虫的形态学特征和取食习性，土壤中的线虫划分为植物寄生线虫、食细菌类线虫、食真菌类线虫和杂食/捕食类线虫。土壤线虫通过改变调节微生物群落结构组成，加快周转微生物生物量、养分及土壤有机质，同时直接参与植物与微生物的养分利用。其中，植物寄生线虫对农业经济造成了巨大的损失，植物寄生线虫在侵入寄主组织时，会吸取植株植物的营养并且分泌一些毒素或酶，诱导寄主植物组织发生病理性变化。线虫的侵入和取食还影响植物对养分的运转和吸收，同时其他病原菌可通过线虫侵入的伤口侵染植物，导致植株矮小，叶片黄化，产量降低。
3.目前化学防治是植物寄生线虫病害的主要防治方式。化学方法防治植物寄生线虫的缺点是一些化学药品能残留到食物链中，对人和动物造成毒害作用，它们通过破坏臭氧层(如甲基溴)进而加剧坏境污染，其中一些含有活性成分甲基溴、涕灭威等的杀线虫剂己经在世界各地被禁止使用。植物寄生线虫寄主范围广、防治难度大，可造成严重的经济损失，因此迫切需要开发出绿色、高效的防治制剂。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供3,5-二甲氧基甲苯在毒杀线虫中的应用及含有该成分的线虫毒杀剂，从而解决现有的杀虫剂毒性大、环境污染、在作物中的残留等问题，提高农业生产的安全性。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明提供一种3,5-二甲氧基甲苯在毒杀线虫中的应用。
7.3,5-二甲氧基甲苯(3,5-dimethoxytoluene)主要存在于细辛等中药材提取物中，是一种已知化合物，其结构式为：
[0008][0009]
进一步地，所述线虫为植物寄生线虫。
[0010]
进一步地，所述线虫为秀丽隐杆线虫。
[0011]
进一步地，所述应用包括3,5-二甲氧基甲苯在药用植物、果树园艺作物、蔬菜作物等线虫病害防治中的应用。
[0012]
本发明发现，3,5-二甲氧基甲苯可缩短线虫的寿命、降低产卵数和抑制生长发育，
增加细胞凋亡水平，进而实现对线虫的毒杀。
[0013]
本发明还提供一种线虫毒杀剂，所述毒杀剂包含毒杀有效量的3,5-二甲氧基甲苯。
[0014]
进一步地，所述线虫毒杀剂组分包括3,5-二甲氧基甲苯和5％吐温80。
[0015]
所述3,5-二甲氧基甲苯与5％吐温80的体积比为1:1-10。
[0016]
进一步地，所述线虫毒杀剂剂型包括乳油、水分散粒剂、粉剂、悬浮剂、微乳剂、颗粒剂或微胶囊剂。
[0017]
上述各种剂型所需要的辅料以及制备各种剂型所使用的方法为本领域技术人员公知的现有技术，在此不做赘述。
[0018]
所述线虫毒杀剂不同剂型中的助剂或载体成分包括分散介质、分散剂、乳化剂、润湿剂、增稠剂、ph缓冲剂、消泡剂、防冻剂、崩解剂、粘结剂或填料中的一种或几种。
[0019]
本发明公开了以下技术效果：
[0020]
3,5-二甲氧基甲苯是从植物中提取的天然化合物，主要存在于细辛、中国月季等天然植物的提取物中，本发明将其用于线虫的毒杀，实现了较强的杀虫效果。3,5-二甲氧基甲苯与一般化学农药相比，具有低毒性、效果好、来源广、安全等特点，可以作为理想的环境友好型农药，较好的解决了现有的杀虫剂毒性大、环境污染、在作物中的残留等问题，提高了农业生产的安全性。
附图说明
[0021]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0022]
图1为实施例4中各组染色后的线虫荧光强度；
[0023]
图2为实施例4中各组染色后的线虫荧光照片(
×
10)。
具体实施方式
[0024]
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0025]
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
[0026]
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
[0027]
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
[0028]
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
[0029]
秀丽隐杆线虫是一种模式生物，通常以各种细菌为食，普遍生活在土壤之中且对其他生物体没有寄生作用，秀丽隐杆线虫是第一个进行全基因组测序的生物，由302个神经元组成，复杂的分布于头和尾多个神经节处。秀丽隐杆线虫是体型小、生存周期短、产卵量大、结构简单、易于在实验室培养的模式生物，在进化上与植物寄生线虫关系最近。人们常将秀丽隐杆线虫作为研究植物寄生线虫的工具。
[0030]
本发明实施例所用3,5-二甲氧基甲苯为市售3,5-二甲氧基甲苯标准品。
[0031]
实施例中采用3,5-二甲氧基甲苯溶液作为药剂，具体配制步骤：将10mg 3,5-二甲氧基甲苯标准品加入l ml 5％吐温-80中，用涡旋搅拌器涡旋搅拌，制成10mg/ml 3,5-二甲氧基甲苯溶液。
[0032]
实施例1 3,5-二甲氧基甲苯对秀丽隐杆线虫的室内毒力测定
[0033]
试验所用线虫为模式生物秀丽隐杆线虫l4期线虫，恒温恒湿生化培养箱20℃中进行培养繁殖。采用裂解法获得虫卵，具体方法如下：用m9缓冲液将平板中的秀丽隐杆成虫冲洗置于1.5ml的离心管中，4000rpm离心留沉淀，冲洗3次后，再加入1ml的裂解液(1％的次氯酸钠1ml 5mm的氢氧化钠1ml，用前混匀)，剧烈震荡至显微镜下看到虫体破裂即可，离心弃上清，用m9冲洗数次，于缓冲液中20℃孵育过夜，第二天即可得到同期化的线虫，将得到的同期化线虫于ngm培养基中培养至l4期。收集同期化的l4期线虫，用于试验分析。
[0034]
其中，ngm培养基的配制：准确称取nacl 1.50g，琼脂粉8.50g，胰蛋白胨1.25g，再加入12.5ml 1m pbs缓冲液(ph＝6)，蒸馏水定容至500ml，121℃高压蒸汽灭菌20min，在恒温水浴锅中冷却至55℃，在超净工作台中，将其加入0.5ml 1m cacl2、0.5ml 1m mgso4、0.5ml 5mg/ml胆固醇乙醇溶液，混合均匀后倒板。
[0035]
具体的：1m磷酸缓冲液(ph＝6)的配制：精确称取21.66g磷酸二氢钾和9.33g磷酸氢二钾，加入200ml蒸馏水，置于37℃震荡器中下充分溶解，常温放置；
[0036]
1m氯化钙的配制：取1.11g氯化钙于50ml离心管中，加入10ml蒸馏水，在121℃条件下灭菌20min，4℃保存；
[0037]
1m硫酸镁的配制：取2.4647gmgso4于50ml离心管中，加入10ml蒸馏水，在121℃条件下灭菌20min，4℃保存；
[0038]
5mg/ml胆固醇乙醇溶液的配制：称取50mg胆固醇，加无水乙醇10ml，充分溶解后，用0.22μm的无菌滤膜过滤除菌，4℃保存。将上述孵化出的秀丽隐杆线虫l4期线虫备用。用少量吐温80和k-medium(1.18g kcl，1.5g nacl蒸馏水定容至500ml，121℃高压灭菌)溶液设置不同浓度梯度处理，以吐温80和k-medium混合溶液为空白对照，取96孔细胞培养板，每孔加入配好的不同浓度的药剂150μl，向各个孔中挑入30条同步化后的l4期线虫，置于20℃生化培养箱培养24h后，在体视显微镜下判断线虫死亡存活情况，用铂丝针轻触秀丽隐杆线虫有反应即视为存活，无反应为死亡。实验重复3次，计算半数致死浓度(lc
50
)。
[0039]
根据数据结果，采用spss软件计算各处理的半数致死浓度(lc
50
)。作用结果如表1
所示。
[0040]
表1 3,5-二甲氧基甲苯对秀丽隐杆线虫的室内毒力测定
[0041][0042]
根据表1数据可以知晓，3,5-二甲氧基甲苯对秀丽隐杆线虫半数致死浓度(lc
50
)为437mg/l，置信区间为430-444mg/l。
[0043]
实施例2 3,5-二甲氧基甲苯对秀丽隐杆线虫产卵数的影响
[0044]
采用实施例1所述的方法进行秀丽隐杆线虫的培养，将收集的l3期线虫，转移到不添加5-fudr的96孔板中，药液剂量设置为24h lc
50
的1/10、1/100、1/1000，即为高、中、低剂量。待线虫生长至l4期后，转移到空的ngm培养基中，每个ngm培养基培养1条，每24h转移1次，直至线虫产卵期结束并记录线虫繁殖的总量。每组至少有8条线虫，实验重复3次，以吐温80和k-medium混合溶液为空白对照，数据结果见表2。
[0045]
表2 3,5-二甲氧基甲苯对秀丽隐杆线虫产卵数的影响
[0046][0047]
从表2的数据可以看出，3,5-二甲氧基甲苯高、中、低剂量对秀丽隐杆线虫产卵数均有抑制作用，且呈剂量依赖性。高剂量的3,5-二甲氧基甲苯给药后的产卵数相较于对照降低了45.30％，具有明显的抑制线虫产卵的作用。
[0048]
实施例3 3,5-二甲氧基甲苯对秀丽隐杆线虫生长发育的影响
[0049]
采用实施例1所述的方法进行秀丽隐杆线虫的培养，将收集的l4期线虫，转移到添加12.5mg/l的5-fudr(5-氟尿嘧啶脱氧核苷)的96孔板中，药液剂量设置为24h lc50的1/10、1/100、1/1000，即为高、中、低剂量。每个孔中挑入30条线虫，暴露处理48h后，放在60℃的温箱中10min，用热蒸汽处死线虫使线虫身体变直，再在体视显微镜下观察并拍照，使用显微镜自带的显微尺测量线虫的身宽及体长，实验重复3次，以吐温80和k-medium混合溶液为空白对照，数据结果见表3。
[0050]
表3 3,5-二甲氧基甲苯对秀丽隐杆线虫身宽体长的影响
[0051][0052]
从表3的数据可以看出，3,5-二甲氧基甲苯高、中、低剂量对秀丽隐杆线虫身宽和体长均有抑制作用，且呈剂量依赖性。高剂量的3,5-二甲氧基甲苯给药后的身宽和体长相较于对照分别降低了15.38％、18.18％，对线虫具有明显的发育毒性。
[0053]
实施例4 3,5-二甲氧基甲苯对秀丽隐杆线虫细胞凋亡水平的影响
[0054]
采用实施例1所述的方法进行秀丽隐杆线虫的培养，将收集的l4期线虫，转移到添加12.5mg/l的5-fudr(5-氟尿嘧啶脱氧核苷)的96孔板中，药液剂量设置为24h lc50的1/10、1/100、1/1000，即为高、中、低剂量。线虫给药处理4d后，挑至含5μg/ml的吖啶橙(ao)染液和op50的m9缓冲液中，每组10条，于20℃染色1h，吸出染色后的线虫，于含op50的ngm板中恢复45min，全程注意避光。将线虫挑至含2％琼脂的玻片上，加入1滴左旋咪唑溶液麻醉线虫，在荧光倒置显微镜下观察拍照，并用image j软件分析各照片荧光强度，实验重复3次，数据结果见图1和图2。
[0055]
从图1和图2可以看出，与空白对照相比，3,5-二甲氧基甲苯不同剂量给药后，线虫细胞凋亡水平升高且呈剂量依赖性。低、中、高剂量的3,5-二甲氧基甲苯给药后，相对荧光强度相较于对照分别降低了38.17％、45.67％，65.67％。
[0056]
从上述内容可以看出，3,5-二甲氧基甲苯对秀丽隐杆线虫有很好的毒杀效果，可缩短秀丽隐杆线虫的寿命、降低产卵数和延缓生长发育，增加细胞凋亡水平，说明3,5-二甲氧基甲苯可能对植物寄生线虫有防治作用，同时3,5-二甲氧基甲苯具有来源广、安全和环境友好的特性，是目前少有的优秀杀虫剂的替代品，具有很好的杀线虫效果。
[0057]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。