一种尿酸氧化酶负载四氧化三铁复合纳米酶检测尿酸的方法与流程

1.本发明属于化学分析检测技术领域，具体为一种尿酸氧化酶负载四氧化三铁复合纳米酶检测尿酸的方法。


背景技术：

2.尿酸（ua, c5h4n4o3）是人体嘌呤的最终代谢产物，已被认为是一种重要的健康生物标志物，其在健康人血清和尿液中的为0.2-0.5mm。当尿酸浓度增加时，由于其溶解度低，将以晶体形式存在，尿酸与痛风、关节炎、肾结石、高尿酸血症等多种疾病密切相关。随着啤酒、肉类、海鲜和其他嘌呤含量高的食物的过量摄入，这些疾病的风险显著增加。因此，快速、准确地测定血清或尿液中尿酸的浓度对这些疾病的早期诊断和治疗具有重要意义。目前，检测尿酸的方法主要有磷钨酸还原法、高效液相色谱法、尿酸酶还原法等。尿酸酶还原法是基于尿酸氧化酶(uox)从尿酸中产生h2o2，被辣根过氧化物酶(hrp)等过氧化物酶消耗。hrp是一种天然酶，由于其简单、灵敏和选择性，已广泛应用于生物催化和生物传感领域。然而，天然酶的固有缺陷，如在极端条件下稳定性差、制备和纯化过程复杂、回收率低等，严重阻碍了其实际应用。
3.2007年阎锡蕴等首次发现fe3o
4 纳米颗粒具有过氧化物酶催化活性，此后纳米材料的酶活性研究发展迅速。具有天然酶催化活性的纳米材料被统称为纳米酶。纳米酶具有制备成本低、易于批量生产、稳定性高和活性可调节等优点，在替代天然酶用于生物传感、疾病诊断及治疗、食品安全防控等领域具有巨大潜力。但纳米酶也存在酶活低、选择性差等难题。天然酶与纳米酶的结合可以提高反应的整体效率，克服纳米酶的中等活性和低选择性的问题，另一方面，集成催化剂可以提高生物催化级联的多样性/复杂性和多酶体系的稳定性，但如何实现酶和纳米酶之间的协同效应来构建集成催化剂仍然是一个挑战。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明提供了一种尿酸氧化酶负载四氧化三铁复合纳米酶检测尿酸的方法，该方法利用了天然尿酸氧化酶的特异性及纳米酶的强拟过氧化酶活性，一步完成尿酸的检测。
5.本发明采用氧化石墨烯修饰四氧化三铁与血红素、鸟苷-5'-单磷酸形成复合纳米酶（fe3o
4-go-hemin/gmp），尿酸氧化酶通过物理吸附固定于四氧化三铁复合纳米酶（uox@fe3o
4-go-hemin/gmp），利用尿酸氧化酶的特异性，催化氧化尿酸产生h2o2，利用fe3o
4-go-hemin/gmp的强拟过氧化酶活性，催化氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)，产生蓝色化合物（o-tmb），一步完成尿酸检测。本发明方法既保证检测的特异性，又达到操作简单、快速的目的，同时复合酶材料稳定、制备方法易控制。本发明方法用于血液、尿液及唾液中尿酸检测，回收率在96.3-102.9%之间，与尿酸酶-辣根过氧化酶两步法结果一致。
6.本发明尿酸氧化酶负载四氧化三铁复合纳米酶检测尿酸的方法如下：（1）尿酸工作曲线制作
溶液a：一定浓度范围的尿酸100
µ
l；溶液b：1mg/ml uox@fe3o
4-go-hemin/gmp纳米材料100
µ
l；溶液c：10mmol/l的tmb100
µ
l；将a、b及c三种溶液混合，加入50mmol/l、ph 4.0的pbs缓冲液1.5ml，37℃孵育15min，在652nm波长处测定吸光度，其中尿酸在具塞比色管中的浓度范围在10~800
µ
mol/l，以尿酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程；（2）实际样品测定血液中尿酸测定：取新鲜血液5ml，放入离心机离心处理，取上清液，加入重量体积浓度10%的氢氧化钠溶液0.1ml和重量体积浓度5%的硫酸锌溶液1ml，混匀，离心分离，取上清液100
µ
l，加入1mg/ml uox@fe3o
4-go-hemin/gmp纳米材料100
µ
l，10mmol/l的tmb 100
µ
l，50mmol/l、ph 4.0的pbs缓冲液1.5ml，37℃孵育15min，在652nm波长处测定吸光度，代入回归方程，测得尿酸含量；所述离心是在4000-6000r/min 下处理10-15min；尿液中尿酸测定：取新鲜尿样，用活性炭脱色，过滤，用ph5醋酸-醋酸钠缓冲液稀释5倍，取稀释后的尿液 100
µ
l，加入1mg/ml uox@fe3o
4-go-hemin/gmp纳米材料100
µ
l，10mmol/l的tmb 100
µ
l，50mmol/l、ph 4.0的pbs缓冲液1.5ml，37℃孵育15min，在652nm波长处测定吸光度，代入回归方程，测得尿酸含量；所述活性炭添加量为尿液重量的0.5-1%；唾液中尿酸测定：取唾液2ml，加入质量浓度10%的三氯乙酸2ml，混合均匀，8000r/min下离心10min，上清液用 0.22μm滤膜过滤，取滤液100
µ
l，加入1mg/ml uox@fe3o
4-go-hemin/gmp纳米材料100
µ
l，10mmol/l的tmb 100
µ
l，50mmol/l、ph 4.0的pbs缓冲液1.5ml，37℃孵育15min，在652nm波长处测定吸光度，代入回归方程，测得尿酸含量。
7.所述uox@fe3o
4-go-hemin/gmp纳米材料制备如下：（1）四氧化三铁-石墨烯-血红素纳米材料制备将1重量份氧化石墨烯、3-5重量份谷氨酸、6-8重量份fecl3·
6h2o、300-500重量份乙二醇混合，然后加入0.1mol/l的naoh调节ph至10，超声处理2-3h，加入0.05-0.1重量份氯化血红素，超声处理10-15min后，置于马弗炉中，200℃下反应10-12h，反应结束冷却至室温，用纯水洗涤数次，冷冻干燥，得四氧化三铁-石墨烯-血红素纳米材料fe3o
4-go-hemin；所述冷冻干燥是在-20～-40℃下干燥12-24h；（2）四氧化三铁-石墨烯-血红素/尿酸酶纳米材料制备将1-2重量份fe3o
4-go-hemin纳米材料、8-10重量份的cucl2、20-25重量份的鸟苷-5'-单磷酸（gmp）、3-5重量份的尿酸酶（uox）加入到200体积份的10mmol/l、ph 6.8的hepes缓冲液中，室温下搅拌2-3h，外加磁铁或离心分离，用hepes缓冲液洗涤3次，冷冻干燥，得四氧化三铁-石墨烯-血红素/尿酸酶纳米材料uox@fe3o
4-go-hemin/gmp；所述冷冻干燥是在-20～-40℃下干燥12-24h。
8.本发明的优点在于：1、本发明将氧化石墨烯修饰四氧化三铁与血红素、鸟苷-5'-单磷酸制备形成复合纳米酶（fe3o
4-go-hemin/gmp），具有强拟过氧化酶活性，利用天然尿酸氧化酶与纳米酶的物理吸附作用制备的uox@fe3o4-go-hemin/gmp纳米材料能够快速、特性氧化尿酸及tmb，从而建立了尿酸的一步检测法，方法具有操作简单、快速及特异性强等特点；
2、将建立的方法用于血液、尿液及唾液中尿酸检测，回收率在96.3-102.9%间，与尿酸酶-辣根过氧化酶两步法结果一致；3、本发明制备的复合纳米材料稳定、制备方法易控制、回收率高、易于批量生产。
附图说明
9.图1为复合纳米材料氧化尿酸及tmb的紫外可见吸收光谱图；图2为标准品尿酸的标准曲线及线性方程；图3为不同物质对本发明检测体系的干扰实验结果示意图。
具体实施方式
10.下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步详细地描述说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
11.实施例1：血液中尿酸的测定1、四氧化三铁-石墨烯-血红素（fe3o
4-go-hemin）纳米材料制备将0.1g氧化石墨烯、0.35g谷氨酸、0.8g fecl3·
6h2o与50g乙二醇混合，用 0.1mol/l的naoh调节ph至10，超声处理3h，加入0.01g氯化血红素，超声处理15min后，置于马弗炉中，200℃下反应12h，反应结束冷却至室温后用纯水洗涤数次，-40℃下冷冻干燥12h，得fe3o
4-go-hemin纳米材料；2、四氧化三铁-石墨烯-血红素/尿酸酶（uox@fe3o
4-go-hemin/gmp）纳米材料制备将0.2g fe3o
4-go-hemin、0.8g的cucl2、2g的鸟苷-5'-单磷酸（gmp）、0.3g的尿酸酶（uox）加入到20ml的hepes缓冲液（10mm，ph 6.8）中，室温下搅拌3h，外加磁铁分离，用hepes缓冲液洗涤3次，-40℃下冷冻干燥12h，得uox@fe3o
4-go-hemin/gmp纳米材料；3、尿酸工作曲线制作：溶液a：分别取10、50、100、200、500、800
µ
mol/l的尿酸100
µ
l；溶液b：1mg/ml uox@fe3o
4-go-hemin/gmp纳米材料100
µ
l；溶液c：10mmol/l的tmb100
µ
l；将a、b及c三种溶液混合，加入1.5ml的pbs (50mmol/l、ph4.0)，37℃孵育15min，在652nm波长处测定吸光度，以尿酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程（图2）、相关系数、相对标准偏差、线性范围等见表1，紫外吸收光谱见图1；表1线性方程、相关系数、相对标准偏差、线性范围；4、血液中尿酸的测定（1）血液中尿酸测定：取新鲜血液5ml，放入离心机离心（4000r/min下处理15min）处理，取上清液，加入重量体积浓度10%的氢氧化钠溶液0.1ml和重量体积浓度5%的硫酸锌溶液1ml，混匀，6000r/min下离心分离，取上清液100
µ
l，加入1mg/ml uox@fe3o
4-go-hemin/gmp纳米材料100
µ
l，10mmol/l的tmb 100
µ
l，50mmol/l、ph 4.0的pbs缓冲液1.5ml，37℃孵育15min，在652nm波长处测定吸光度，代入回归方程，测得尿酸含量为432
ꢀµ
mol/l；
（2）回收率与精密度实验：在血样中分别添加2个不同浓度的尿酸标准溶液；每个浓度平行测定3次，计算加标回收率，并计算出相对标准偏差rsd，结果见表2；测得尿酸的加标回收率在96.3%-102.9%，rsd在2.12％～4.34％，本方法有好的的准确性和精密度；表2 样品尿酸加标回收率及rsd（n = 3）；（3）方法特异性考察：将尿酸替换为其他物质（浓度为600
µ
mol/l的尿素、甘氨酸、缓冲溶液、柠檬酸、葡萄糖、抗坏血酸、多巴胺和乙酸钠）用于验证本发明检测体系的特异性，尿酸浓度为300
µ
mol/l，图3为本发明检测体系检测尿素、甘氨酸、缓冲溶液、柠檬酸、葡萄糖、抗坏血酸、多巴胺、乙酸钠、尿酸的结果，从图中可以看出，本发明检测体系对尿酸具有较好的选择特异性。 实施例2：尿液中尿酸的测定1、四氧化三铁-石墨烯-血红素（fe3o
4-go-hemin）纳米材料制备将0.1g氧化石墨烯、0.5g谷氨酸、0.6g fecl3·
6h2o与30g乙二醇混合，用 0.1mol/l的naoh调节ph至10，超声处理2h，加入0.005g氯化血红素，超声处理10min，置于马弗炉中，200℃下反应10h，反应结束冷却至室温后用纯水洗涤数次，-20℃冷冻干燥24h，得fe3o
4-go-hemin纳米材料；2、四氧化三铁-石墨烯-血红素/尿酸酶（uox@fe3o
4-go-hemin/gmp）纳米材料制备将0.1g的fe3o
4-go-hemin、1g的cucl2、2.5g的鸟苷-5'-单磷酸（gmp）、0.5g的尿酸酶（uox）加入到20ml的hepes缓冲液（10mmol/l、ph 6.8）中，室温下搅拌2h，6000r/min离心10min，固体用hepes缓冲液洗涤3次，-20℃冷冻干燥24h，得uox@fe3o
4-go-hemin/gmp纳米材料；3、尿酸工作曲线制作：同实施例1；4、尿液样品中尿酸含量的测定取新鲜尿样，用活性炭脱色（活性炭添加量为尿液重量的1%），过滤，用ph5醋酸-醋酸钠缓冲液稀释5倍，取稀释后的尿液 100
µ
l，加入1mg/ml uox@fe3o
4-go-hemin/gmp纳米材料100
µ
l，10mmol/l的tmb 100
µ
l，50mmol/l、ph 4.0的pbs缓冲液1.5ml，37℃孵育15min，在652nm波长处测定吸光度，代入回归方程，测得尿酸含量为1200
µ
mol/l。
12.实施例3：唾液中尿酸含量的测定1、四氧化三铁-石墨烯-血红素（fe3o
4-go-hemin）纳米材料制备将0.1g氧化石墨烯、0.4g谷氨酸、0.7g fecl3·
6h2o与40g乙二醇混合，用 0.1mol/l的naoh调节ph至10，超声处理2.5h，加入0.008g氯化血红素，超声处理12min，置于马弗炉中，200℃下反应11h，反应结束冷却至室温后用纯水洗涤数次，-30℃冷冻干燥15h，得fe3o
4-go-hemin纳米材料；2、四氧化三铁-石墨烯-血红素/尿酸酶（uox@fe3o
4-go-hemin/gmp）纳米材料制备将0.15g的fe3o
4-go-hemin、0.9g的cucl2、2.3g的鸟苷-5'-单磷酸（gmp）、0.4g的尿
酸酶（uox）加入到20ml的hepes缓冲液（10mmol/l、ph 6.8）中，室温下搅拌2.5h，外加磁铁分离，固体用hepes缓冲液洗涤3次，-30℃冷冻干燥15h，得uox@fe3o
4-go-hemin/gmp纳米材料；3、尿酸工作曲线制作：同实施例1；4、唾液样品中尿酸含量的测定取唾液2ml，加入质量浓度10%的三氯乙酸2ml，混合均匀，以8000 r/ min离心10min，上清液用0. 22μm滤膜过滤，取滤液100
µ
l，加入1mg/ml uox@fe3o
4-go-hemin/gmp纳米材料100
µ
l，10mmol/l的tmb 100
µ
l，50mmol/l、ph 4.0的pbs缓冲液1.5ml，37℃孵育15min，在652nm波长处测定吸光度，代入回归方程，测得尿酸含量为412
µ
mol/l。