一种使用专属性肽段组鉴别三文鱼的方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种使用专属性肽段组鉴别三文鱼的方法。


背景技术：

2.三文鱼(鲑科，salmonidae)肉质鲜美，富含dha、epa和虾青素等生物活性物质，深受广大消费者喜爱。三文鱼是鲑科鱼类的商品名，属硬骨鱼纲、鲑形目、鲑属，最常见的是鲑鱼(大西洋鲑鱼、太平洋鲑鱼、银鲑)和鳟鱼(虹鳟、金鳟)。其中，大西洋鲑鱼(salmo salar)被视为品质最好，多进口于挪威、丹麦、智利等高纬度海洋寒冷区域。太平洋鲑鱼(oncorhynchus keta)洄游进入我国黑龙江、图们江等水域，乌苏里江较多。同为太平洋鲑鱼属(oncorhynchus)的虹鳟鱼原产于北美洲的太平洋沿海，我国于1959年引进，现在是我国主要的淡水养殖鱼类之一。相较于大西洋鲑鱼，太平洋鲑鱼和虹鳟鱼口感较差，生产成本及营养价值较低，但消费者仅凭鱼肉外观很难辨别。受利益驱使，不法商家用廉价的太平洋鲑鱼和虹鳟鱼冒充大西洋鲑鱼，这些欺诈行为不仅危害水产品行业的公信度外，还损害了三文鱼产品质量诚信度和消费者利益。因此，有必要对三文鱼的物种进行鉴定。
3.目前三文鱼物种鉴别技术主要是基于dna的分子生物学技术和蛋白质组学技术。其中，以pca为主的dna检测技术，操作步骤繁琐，耗时长。


技术实现要素：

4.据此，本发明提供了一种使用专属性肽段组鉴别三文鱼的方法，该方法采用特征多肽的方法鉴别不同三文鱼种属，不受蛋白稳定性和深加工技术的影响，是一种能高效准确鉴别三文鱼种属的方法。
5.本发明首先涉及一组特征肽段在鉴定鲑科(salmonidae)鱼类亚种中的应用，
6.所述的鲑科鱼类亚种为：大西洋鲑鱼(salmo salar)、太平洋鲑鱼(oncorhynchus keta)和虹鳟鱼(oncorhynchus mykiss)；
7.具体的，所述的特征肽段为：
8.(1)来自大西洋鲑鱼(salmo salar)的如下蛋白的特征肽段：
9.序列如seq id no.1所示的肽段来自于，蛋白glycogen phosphorylase,muscle form(gi|213515556)；
10.序列如seq id no.2所示的肽段来自于，蛋白myosin-binding protein c,fast-type-like(gi|929275161)；
11.序列如seq id no.3所示的肽段来自于，蛋白sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium atpase 1isoform x2(gi|929274646)；
12.序列如seq id no.4所示的肽段来自于，蛋白myosin,light polypeptide 3-1(gi|213514656)；
13.序列如seq id no.5所示的肽段来自于，蛋白phosphoglycerate kinase(gi|929235375)；
14.序列如seq id no.6所示的肽段来自于，蛋白myosin binding protein h-like(gi|213511568)；
15.序列如seq id no.7所示的肽段来自于，蛋白sarcalumenin-like isoform x2(gi|929094737)；
16.序列如seq id no.8所示的肽段来自于，蛋白l-lactate dehydrogenase a chain(gi|213510970)；
17.序列如seq id no.9所示的肽段来自于，蛋白myoglobin(gi|221221136)；
18.(2)来自大太平洋鲑鱼(oncorhynchus keta)的如下蛋白的特征肽段：
19.序列如seq id no.10所示的肽段来自于，蛋白triosephosphate isomerase b-like(gi|1695879275)；
20.序列如seq id no.11所示的肽段来自于，蛋白myomesin-2-like isoform x2(gi|1695910459)；
21.(3)来自虹鳟鱼(oncorhynchus mykiss)的如下蛋白的特征肽段：
22.序列如seq id no.12所示的肽段来自于，蛋白isocitrate dehydrogenase[nadp](gi|642108671)；
[0023]
序列如seq id no.13所示的肽段来自于，蛋白myomesin-2-like isoform x2(gi|1211256714)；
[0024]
序列如seq id no.14所示的肽段来自于，蛋白myomesin-2-like isoform x2(gi|1211256714)；
[0025]
更具体的，所述各个特征肽段的质谱法检测的质荷比(m/z)数据为：
[0026]
seq id no.1所示特征肽段的质荷比(m/z)为582.266；
[0027]
seq id no.2所示特征肽段的质荷比(m/z)为617.856；
[0028]
seq id no.3所示特征肽段的质荷比(m/z)为934.439；
[0029]
seq id no.4所示特征肽段的质荷比(m/z)为803.441；
[0030]
seq id no.5所示特征肽段的质荷比(m/z)为991.462；
[0031]
seq id no.6所示特征肽段的质荷比(m/z)为541.263；
[0032]
seq id no.7所示特征肽段的质荷比(m/z)为772.894；
[0033]
seq id no.8所示特征肽段的质荷比(m/z)为492.956；
[0034]
seq id no.9所示特征肽段的质荷比(m/z)为548.299；
[0035]
seq id no.10所示特征肽段的质荷比(m/z)为620.326；
[0036]
seq id no.11所示特征肽段的质荷比(m/z)为706.430；
[0037]
seq id no.12所示特征肽段的质荷比(m/z)为466.254；
[0038]
seq id no.13所示特征肽段的质荷比(m/z)为746.412；
[0039]
seq id no.14所示特征肽段的质荷比(m/z)为591.275。
[0040]
本发明还涉及一种使用质谱检测方法，通过所述特征肽段，鉴定鲑科(salmonidae)鱼类亚种的方法，所述的鲑科鱼类亚种为：大西洋鲑鱼(salmo salar)、太平洋鲑鱼(oncorhynchus keta)和虹鳟鱼(oncorhynchus mykiss)，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
[0041]
(1)样本预处理
[0042]
1)称取研磨成粉的待测鲑科鱼类样品，加入蛋白提取液(8m尿素和50mm nh4hco3)提取蛋白，高速低温离心，收集上清液；
[0043]
2)加入dtt(1mol/l)至上述蛋白上清液中，60℃反应1小时；
[0044]
3)取iaa(1mol/l)加入冷却到室温的上述溶液中，室温避光反应1小时；
[0045]
4)使用10kda分子量截留超滤离心管离心，取碳酸氢铵溶液重复冲洗膜上蛋白3次；
[0046]
5)取trypsin酶溶液加入上述蛋白溶液中，37℃酶解16小时；
[0047]
6)采用10kda分子量截留超滤离心管离心收集下层肽段滤液，待上机检测；
[0048]
(2)质谱检测，并将检测结果与seq id no.1～14的特征肽段的标准谱图进行匹配，从而得出待测样本的种属信息。
[0049]
所述的质谱检测的步骤为：
[0050]
1)采用ab sciex tripletof质谱系统，
[0051]
流动相a：0.1％甲酸-水，流动相b：0.1％甲酸-乙腈；
[0052]
流速0.25ml/min；
[0053]
洗脱梯度：0～2min，5％b；2～27min，5～20％b；27～37min，20～35％b；37～39min，35～80％b；39～42min，80％b；42～46min，5％b；
[0054]
tof扫描范围：350～1500da，正离子模式，gs1：35，gs2：45，curtain gas：35，isvf：5500，tem：500，dp：100，ce：10。
[0055]
或2)采用ab sciex 5500三重四极杆检测系统，
[0056]
流动相a：0.1％甲酸-水，流动相b：0.1％甲酸-乙腈；
[0057]
流速0.35ml/min；
[0058]
洗脱梯度：0～10min，10～10.5％b；10～10.5min，10.5～45％b；10.5～13min，45～95％b；13～13.1min，95～10％b；13.1～15min，10％；
[0059]
电喷雾离子源，正离子反应模式，检测方式：mrm，喷雾电压：5500v，离子传输管温度：575℃；雾化气压力：60psi，辅助加热气压力：50psi，气帘压力：35psi。
[0060]
本发明还涉及所述的特征肽段组在制备鉴定鲑科(salmonidae)鱼类亚种检测试剂盒中的应用，所述的特征肽段组为seq id no.1-14任一或任意组合后的组，优选的，所述的试剂盒是基于质谱检测的试剂盒。
附图说明
[0061]
图1，大西洋鲑鱼特征肽段seq id no.1veevdamdagk质谱图。
[0062]
图2，大西洋鲑鱼特征肽段seq id no.2iveapgppevvk质谱图。
[0063]
图3，大西洋鲑鱼特征肽段seq id no.3efddlpsfelqsdavr质谱图。
[0064]
图4，大西洋鲑鱼特征肽段seq id no.4aaapapapepevvaapppldlstvk质谱图。
[0065]
图5，大西洋鲑鱼特征肽段seq id no.5vlnnmeignslyddegak质谱图。
[0066]
图6，大西洋鲑鱼特征肽段seq id no.6tgdwfnilehyar质谱图。
[0067]
图7，大西洋鲑鱼特征肽段seq id no.7eeevedvlsnilr质谱图。
[0068]
图8，大西洋鲑鱼特征肽段seq id no.8lithvlvgepvgsr质谱图。
[0069]
图9，大西洋鲑鱼特征肽段seq id no.9lfaehpetltlfpk质谱图。
[0070]
图10，太平洋鲑鱼特征肽段seq id no.10ahvseavansvr质谱图。
[0071]
图11，太平洋鲑鱼特征肽段seq id no.11vgggtatltlpllak质谱图。
[0072]
图12，虹鳟鱼特征肽段seq id no.12atdfvvskpgtfk质谱图。
[0073]
图13，虹鳟鱼特征肽段seq id no.13daapavagapgapisvk质谱图。
[0074]
图14，虹鳟鱼特征肽段seq id no.14sageieeyqr质谱图。
[0075]
图15，随机选取的一个三文鱼样本的检测结果图。
[0076]
图1～15中，纵坐标为intensity(峰强度)，单位cps(每秒的计数)；横坐标为retention time(保留时间)，单位为min(分钟)。
具体实施方式
[0077]
实施例1，三文鱼特征肽段的筛选
[0078]
1、dda采集和质谱库的建立
[0079]
三组三文鱼样本在95％的置信水平上共鉴定到912条蛋白质，13615条肽段，该搜库结果用于构建swath相对定量的质谱库。大西洋鲑鱼鉴定蛋白682条；太平洋鲑鱼鉴定蛋白549条；虹鳟鱼鉴定蛋白513条。其中，大西洋鲑鱼独有蛋白395条；太平洋鲑鱼独有蛋白269条；虹鳟鱼独有蛋白218条。
[0080]
2、swath数据采集
[0081]
使用peakview分析swath数据，查看独有蛋白对应肽段信息，重点关注每条多肽的提取离子流图、实际碎片与谱图碎片比对和肽段在样品中的丰度分布，筛选得到具有检测特异性的肽段。
[0082]
3、物种特征肽段的筛选
[0083]
基于上述备选肽段，在ncbi进行blastp检索，当肽段氨基酸序列100％匹配且具有唯一性时，则认为该肽段具有生物特异性。
[0084]
4、mrm方法优化及检测分析
[0085]
采用skyline计算肽段传输离子对，并根据谱图结果优化梯度洗脱程序。确定mrm采集方法的最佳目标肽段碰撞能量、解聚电压及保留时间等，建立实验室日常快速检测方法，见表1。
[0086]
表1特征肽段mrm质谱参数
[0087][0088]
实施例2，大西洋鲑鱼(salmo salar)特异性多肽的序列来源和比对信息
[0089]
经过质谱分析，多肽seq id no.1～9在大西洋鲑鱼(salmo salar)中有独立响应，且峰形好，强度高，在太平洋鲑鱼(oncorhynchus keta)和虹鳟鱼(oncorhynchus mykiss)中无响应。具体的：
[0090]
图1是多肽veevdamdagk在大西洋鲑鱼中的质谱图，其m/z为582.266。
[0091]
图2是多肽iveapgppevvk在大西洋鲑鱼中的质谱图，其m/z为617.856。
[0092]
图3是多肽efddlpsfelqsdavr在大西洋鲑鱼中的质谱图，其m/z为934.439。
[0093]
图4是多肽aaapapapepevvaapppldlstvk在大西洋鲑鱼中质谱图，其m/z为803.441。
[0094]
图5是多肽vlnnmeignslyddegak在大西洋鲑鱼中质谱图，其m/z为991.462。
[0095]
图6是多肽tgdwfnilehyar在大西洋鲑鱼中质谱图，其m/z为541.263。
[0096]
图7是多肽eeevedvlsnilr在大西洋鲑鱼中质谱图，其m/z为772.894。
[0097]
图8是多肽lithvlvgepvgsr在大西洋鲑鱼中质谱图，其m/z为492.956。
[0098]
图9是多肽lfaehpetltlfpk在大西洋鲑鱼中质谱图，其m/z为548.299。
[0099]
实施例3，太平洋鲑鱼(oncorhynchus keta)和虹鳟鱼(oncorhynchus mykiss)特异性多肽的序列来源和比对信息
[0100]
经过质谱分析，多肽seq id no.10～11在太平洋鲑鱼(oncorhynchus keta)中有独立响应，且峰形好，强度高，在大西洋鲑鱼(salmo salar)和虹鳟鱼(oncorhynchus mykiss)中无响应。具体得，
[0101]
图10是多肽ahvseavansvr在太平洋鲑鱼中质谱图，其m/z为620.326。
[0102]
图11是多肽vgggtatltlpllak在太平洋鲑鱼中质谱图，其m/z为706.430。
[0103]
经过质谱分析，多肽seq id no.12～14在虹鳟鱼(oncorhynchus mykiss)中有独立响应，且峰形好，强度高，在大西洋鲑鱼(salmo salar)和太平洋鲑鱼(oncorhynchus keta)中无响应。具体的，
[0104]
图12是多肽atdfvvskpgtfk在虹鳟鱼中质谱图，其m/z为466.254。
[0105]
图13是多肽daapavagapgapisvk在虹鳟鱼中质谱图，其m/z为746.412。
[0106]
图14是多肽sageieeyqr在虹鳟鱼中质谱图，其m/z为591.275。
[0107]
实施例4，三文鱼样本处理及检测步骤
[0108]
1、样本前处理步骤：
[0109]
(1)取2g待测样品，加入20ml蛋白提取液(8m尿素 50mm碳酸氢铵)垂直震荡，离心取上清得蛋白粗提液。
[0110]
(2)取400μl上清液，加入8μl ddt(二硫苏糖醇，dithiothreitol)，在60℃下反应1h。
[0111]
(3)待温度降至室温后，加入40μl现配的iaa(碘代乙酰胺，iodoacetamide)，室温避光反应1小时。
[0112]
(4)选用10kda截留超滤离心管，12000r/min离心20min。取nh4hco3溶液冲洗膜上蛋白，重复3次。
[0113]
(5)按照酶的质量酶/底物质量比1:50加酶，37℃下酶解16h。
[0114]
(6)采用10kda滤膜12000r/min离心20min，收集下层肽段滤液于液相小瓶待测
[0115]
2、上机检测
[0116]
(1)采用ab sciex tripletof系统，具体的；
[0117]
流动相a：0.1％甲酸-水，
[0118]
流动相b：0.1％甲酸-乙腈，
[0119]
流速0.25ml/min，
[0120]
洗脱梯度：0～2min，5％b；2～27min，5～20％b；27～37min，20～35％b；37～39min，35～80％b；39～42min，80％b；42～46min，5％b。
[0121]
tof扫描范围：350～1500da，正离子模式，gs1：35，gs2：45，curtain gas：35，isvf：5500，tem：500，dp：100，ce：10。
[0122]
或(2)采用ab sciex 5500三重四极杆检测，具体的，
[0123]
流动相a：0.1％甲酸-水，
[0124]
流动相b：0.1％甲酸-乙腈，
[0125]
流速0.35ml/min。
[0126]
洗脱梯度：0～10min，10～10.5％b；10～10.5min，10.5～45％b；10.5～13min，45～95％b；13～13.1min，95～10％b；13.1～15min，10％。
[0127]
电喷雾离子源，正离子反应模式，检测方式：mrm，喷雾电压：5500v，离子传输管温度：575℃；雾化气压力：60psi，辅助加热气压力：50psi，气帘压力：35psi。
[0128]
质谱检测结果对比实施例2-4中的各条特异性多肽的质谱图谱图，出现响应实施例2-4任一所述质谱检测谱图时，即可判断该组织样本为相应种属三文鱼样本。
[0129]
经进一步鉴定，随机选取的一个三文鱼样本中，样品质谱分析符合虹鳟鱼特征肽段质谱图，在大西洋鲑鱼和太平洋鲑鱼中无响应，见图15，故样品为虹鳟鱼样品。
[0130]
经核实，上述鉴定结果与送样样本的种属一致。
[0131]
最后需要说明的的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用于限定本发明的保护范围。