一种富集厌氧氨氧化菌并提高菌活性的培养基的制作方法

1.本发明属于环境微生物、污水治理领域，具体涉及一种富集厌氧氨氧化菌并提高菌活性的培养基。


背景技术：

2.水环境中氮元素富集会导致水体富营养化，对人体、水生生物健康产生不利影响。面对水体氮素污染带来的严重危害以及严苛的出水水质标准与相关法规,高氨氮废水治理问题日趋尖锐。与传统的生物脱氮工艺相比，厌氧氨氧化工艺以其经济、高效、节能特点，备受国内外研究关注，是一项具有广泛应用前景的新型生物脱氮技术。然而，厌氧氨氧化菌属于化能自养菌，倍增时间长，生长缓慢，且厌氧氨氧化菌易受到外界环境如：温度、ph、溶解氧、金属离子、碳氮比等因素的影响，使得厌氧氨氧化工艺启动时间长，进而制约了其实际工程应用。因此，提高厌氧氨氧化菌的活性，缩短厌氧氨氧化工艺的启动时间迫在眉睫。
3.目前，为了促进厌氧氨氧化菌的活性和增长速率，国内外研究主要集中在通过物化方法如投加金属离子、电磁场、超声或石墨烯等以促进厌氧氨氧化菌的富集。本发明通过调控厌氧氨氧化菌培养基中的ca
2
和mg
2
浓度，实现厌氧氨氧化菌的活性提高及工艺的稳定运行。该发明从培养基质角度探究提高厌氧氨氧化菌活性的最佳ca
2
和mg
2
浓度组合，以期为厌氧氨氧化工艺的应用提供理论基础，在构建合理的全球氮物质循环方面具有重要生态环境意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的是，有效解决厌氧氨氧化工艺启动周期长的不足，通过调控培养基质中ca
2
和mg
2
浓度，提供一种富集厌氧氨氧化菌并提高菌活性的培养基。
5.本发明的技术方案如下：
6.一种富集厌氧氨氧化菌并提高菌活性的培养基，包括步骤如下：
7.1)配制厌氧氨氧化菌的富集培养基；
8.2)对配制好的培养基采用99％的高纯度氮气曝气；
9.3)通过蠕动泵将培养基进入到厌氧氨氧化反应器中；
10.4)通过连续内循环使培养基质与厌氧氨氧化污泥充分混合；
11.5)每天检测进出水水质，连续培养完成后采用分子生物学技术检测功能菌群结构及丰度。
12.根据本发明优选的，所述步骤1)中，培养基质中氨态氮和亚硝酸盐氮浓度适中，摩尔比为1:132；
13.根据本发明优选的，所述步骤1)中，培养基质中，ca
2
和mg
2
浓度分别为98mg/l和30mg/l；
14.根据本发明优选的，所述步骤1)中，培养基质中，其他进水基质包括：khco3(500mg/l),kh2po4(27mg/l),fe2so4(2.5mg/l)；
15.根据本发明优选的，所述步骤1)中，培养基质中，微量元素i包括：feso4·
7h2o(5g/l),edta(5g/l)；
16.根据本发明优选的，所述步骤1)中，微量元素ii包括：edta(15g/l),h3bo3(0.011g/l),mncl2·
4h2o(0.99g/l)；cuso4·
5h2o(0.25g/l),znso4·
7h2o(0.43g/l),nicl2·
6h2o(0.19g/l),na2moo4·
2h2o(0.22g/l),cocl2·
6h2o(0.24g/l),naseo4·
10h2o(0.21g/l)；
17.根据本发明优选的，所述步骤1)中，培养基质中，ph为7.5；
18.根据本发明优选的，所述步骤2)中，高纯度氮气曝气时间为10-30分钟；
19.根据本发明优选的，所述步骤3)中，反应器为uasb反应器或sbr等培养厌氧氨氧化常用反应器；
20.根据本发明优选的，所述步骤3)中，反应器水力停留时间为10-36小时；
21.根据本发明优选的，所述步骤3)中，反应温度为33-35℃；
22.根据本发明优选的，所述步骤3)中，厌氧氨氧化活性污泥浓度为4000-4500mg/l；
23.根据本发明优选的，所述步骤4)中，反应器中采用蠕动泵控制内循环，实现培养基质与厌氧氨氧化活性污泥的充分混合；
24.根据本发明优选的，所述步骤5)中，分子生物学技术可具体为，dna提取、pcr扩增、16srrna测序、宏基因组测序等。
25.本发明的技术特点及优点：
26.1、本发明从厌氧氨氧化菌的培养基质角度，通过调控培养基中ca
2
和mg
2
浓度，提供了一种提高厌氧氨氧化菌群活性的方法，实现了厌氧氨氧化工艺的稳定运行和高效脱氮。
27.2、本发明通过提高厌氧氨氧化菌的活性，与对照组相比大大缩短了厌氧氨氧化工艺的启动时间，具有节约能耗、降低成本的优点。
附图说明
28.图1为实施例得到的r1反应器(a)脱氮性能和(b)属水平上氮代谢相关的细菌丰度；
29.图2为实施例得到的r2反应器(a)脱氮性能和(b)属水平上氮代谢相关的细菌丰度与r1对比；
30.图3为实施例得到的r3反应器(a)脱氮性能和(b)属水平上氮代谢相关的细菌丰度与r1对比；
31.图4为实施例得到的r4反应器(a)脱氮性能和(b)属水平上氮代谢相关的细菌丰度与r1对比；
32.图5为实施例得到的r5反应器(a)脱氮性能和(b)属水平上氮代谢相关的细菌丰度与r1对比。
具体实施方式
33.下面结合实施例详述本发明。为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明，但本发明并不局限于这些实施例。实施例所述反应器为uasb反应器，实际应用中不限于uasb反应器，实施例中r1反应器为对照组。
34.实施例1：
35.(1)配置ca
2
和mg
2
浓度分别为49mg/l和30mg/l的厌氧氨氧化培养基。培养基中氨氮和亚硝酸盐浓度为100和132mg/l，其他基质包括：khco3(500mg/l),kh2po4(27mg/l),fe2so4(2.5mg/l)，微量元素溶液i(1.5ml/l)和微量元素溶液ii(1.5ml/l)；
36.(2)对所述培养基进行高纯度氮气曝气，曝气时间为20分钟；
37.(3)从稳定运行一年以上的厌氧氨氧化反应器中收集厌氧氨氧化污泥作为接种污泥，接种污泥中优势厌氧氨氧化菌属为candidatusbrocadia；
38.(4)接种污泥经磷酸缓冲液3次淋洗后，分别取400ml污泥接种至r1反应器中；
39.(5)将所述反应器ph调至7.5，反应器反应温度为33-35℃；
40.(6)对所述反应器连续监测进出水质。如图1a，经81d运行反应器能够实现稳定的脱氮性能，但是tn去除率为63.75％；
41.(7)采用分子生物学技术对所述r1反应器菌群结构进行测定，其中脱氮菌群属水平丰度如图1b，厌氧氨氧化菌属candidatusbrocadia和candidatuskuenenia分别为0.12和0.02％。
42.实施例2:
43.(1)配置含有mg
2
浓度为30mg/l，不添加ca
2
的厌氧氨氧化培养基。培养基中氨氮和亚硝酸盐浓度为100和132mg/l，其他基质包括：khco3(500mg/l),kh2po4(27mg/l),fe2so4(2.5mg/l)，微量元素溶液i(1.5ml/l)和微量元素溶液ii(1.5ml/l)；
44.(2)对所述培养基进行高纯度氮气曝气，曝气时间为20分钟；
45.(3)从稳定运行一年以上的厌氧氨氧化反应器中收集厌氧氨氧化污泥作为接种污泥，接种污泥中优势厌氧氨氧化菌属为candidatusbrocadia；
46.(4)接种污泥经磷酸缓冲液3次淋洗后，分别取400ml污泥接种至r2反应器中；
47.(5)将所述反应器ph调至7.5，反应器反应温度为33-35℃；
48.(6)对所述反应器连续监测进出水质，如图2a，与r1相比，r2反应器对于nh
4 -n的去除效率明显下降，且反应器脱氮性能不稳定，tn去除率在4.20-44.69％之间波动；
49.(7)采用分子生物学技术对所述r2反应器菌群结构进行测定，并与r1反应器进行对比，厌氧氨氧化菌属candidatuskuenenia丰度为0.13％，candidatusbrocadia丰度降为0，厌氧氨氧化菌群丰度降低。
50.实施例3：
51.(1)配置含有ca
2
和mg
2
浓度分别为49和60mg/l的厌氧氨氧化培养基。培养基中氨氮和亚硝酸盐浓度为100和132mg/l，其他基质包括：khco3(500mg/l),kh2po4(27mg/l),fe2so4(2.5mg/l)，微量元素溶液i(1.5ml/l)和微量元素溶液ii(1.5ml/l)；
52.(2)对所述培养基进行高纯度氮气曝气，曝气时间为20分钟；
53.(3)从稳定运行一年以上的厌氧氨氧化反应器中收集厌氧氨氧化污泥作为接种污泥，接种污泥中优势厌氧氨氧化菌属为candidatusbrocadia；
54.(4)接种污泥经磷酸缓冲液3次淋洗后，分别取400ml污泥接种至反应器r3中；
55.(5)将所述反应器ph调至7.5，反应器反应温度为33-35℃；
56.(6)对所述反应器连续监测进出水质，如图3a，与r1相比，厌氧氨氧化反应器tn去除率在16.5-57.2％之间波动，r3反应器脱氮能力逐渐下降。
57.(7)采用分子生物学技术对所述r3反应器菌群结构进行测定，并与r1反应器进行对比，厌氧氨氧化菌属candidatusbrocadia和candidatuskuenenia丰度分别为0.13和0.03％，厌氧氨氧化菌群丰度丰度没有变化。
58.实施例4：
59.(1)配置ca2浓度为49mg/l不添加mg
2
的厌氧氨氧化培养基。培养基中氨氮和亚硝酸盐浓度为100和132mg/l，其他基质包括：khco3(500mg/l),kh2po4(27mg/l),fe2so4(2.5mg/l)，微量元素溶液i(1.5ml/l)和微量元素溶液ii(1.5ml/l)；
60.(2)对所述培养基进行高纯度氮气曝气，曝气时间为20分钟；
61.(3)从稳定运行一年以上的厌氧氨氧化反应器中收集厌氧氨氧化污泥作为接种污泥，接种污泥中优势厌氧氨氧化菌属为candidatusbrocadia；
62.(4)接种污泥经磷酸缓冲液3次淋洗后，分别取400ml污泥接种至培养反应器r4中；
63.(5)将所述反应器ph调至7.5，反应器反应温度为33-35℃；
64.(6)对所述反应器连续监测进出水质，如图4a，总氮的浓度在108.53-400.00mg/l，tn去除率在22.08％-80.24％之间波动，与r1相比，r4反应器稳定性较差；
65.(7)采用分子生物学技术对所述r4反应器菌群结构进行测定(图4b)，并与r1反应器进行对比，厌氧氨氧化菌属candidatusbrocadia丰度降为0.02％，candidatuskuenenia丰度降低为0，厌氧氨氧化菌群丰度降低。
66.实施例5：
67.(1)配置ca
2
和mg
2
浓度分别为98mg/l和30mg/l的厌氧氨氧化培养基。培养基中氨氮和亚硝酸盐浓度为100和132mg/l，其他基质包括：khco3(500mg/l),kh2po4(27mg/l),fe2so4(2.5mg/l)，微量元素溶液i(1.5ml/l)和微量元素溶液ii(1.5ml/l)；
68.(2)对所述培养基进行高纯度氮气曝气，曝气时间为20分钟；
69.(3)从稳定运行一年以上的厌氧氨氧化反应器中收集厌氧氨氧化污泥作为接种污泥，接种污泥中优势厌氧氨氧化菌属为candidatusbrocadia；
70.(4)接种污泥经磷酸缓冲液3次淋洗后，分别取400ml污泥接种至培养反应器r5中；
71.(5)将所述反应器ph调至7.5，反应器反应温度为33-35℃；
72.(6)对所述反应器连续监测进出水质，如图5a，而随着ca
2
浓度的升高，厌氧氨氧化反应器对氮素的去除效率逐渐增高，反应器脱氮性能在运行第20d就能达到稳定。当ca
2
浓度为98mg/l同时mg
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的浓度为30mg/l时，厌氧氨氧化过程最先稳定并实现较好的脱氮性能，反应器中nh
4
和no
2-去除率为100％，总氮(tn)去除率提高并稳定在86.8％；
73.(7)采用分子生物学技术对所述r5个反应器中菌群结构和丰度进行测试，与r1进行相比，如图5b所示，微生物群落随着ca
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和mg
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的浓度的变化而改变。当ca
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和mg
2
浓度分别为98mg/l和30mg/l时，r5反应器中厌氧氨氧化菌属水平的candidatubrocadia和candidatuskuenenia丰度分别提到至0.62和0.05％，厌氧氨氧化菌群丰度明显提高，在此培养基下，能够快速实现厌氧氨氧化菌的富集。