快速构建抑郁症小鼠模型的方法与流程

1.本发明涉及疾病动物模型技术领域，尤其涉及一种快速构建抑郁症小鼠模型的方法。


背景技术：

2.抑郁症是一种常见的心理障碍疾病，是现代人心理疾病中最重要的类型，轻则消极孤寂，重则会有轻生的念头。然而抑郁症目前尚无效能高、起效快、停药后复发率低的药物，因此，寻找高效低副作用的抗抑郁药是急需解决的医学问题。在此过程中，抑郁症动物模型必不可少。
3.情绪障碍动物模型常用小鼠、大鼠以及非人灵长类，其中小鼠是最为常用的动物模型来源。目前小于抑郁症模型的造模方法主要有应激造模、手术造模、药物诱导造模等。应激造模依赖于应激环境，抑郁行为会随着应激环境的撤去而逐渐消失；手术造模死亡率较高，操作难度较大。药物诱导造模是目前应用最广泛的造模方法。但是，通过药物诱导的方式构建抑郁症小鼠模型所需的造模时间较长，降低了造模效率。


技术实现要素：

4.针对以上技术问题，本发明提供一种快速构建抑郁症小鼠模型的方法，该方法能够快速构建抑郁症小鼠模型，且操作便捷。
5.为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
6.第一方面，本发明实施例提供了一种快速构建抑郁症小鼠模型的方法，包括以下操作：
7.给小鼠注射甲基苯丙胺，每天给药4次，给药1～3天，给药期间保持所述小鼠出于28℃以上的环境中。
8.可选的，给药期间保持所述小鼠出于27～29℃的环境中。
9.优选地，注射甲基苯丙胺的方式为腹腔注射。
10.优选地，甲基苯丙胺的给药剂量为8～12mg/kg。
11.可选地，甲基苯丙胺的给药剂量为10mg/kg。
12.优选地，小鼠体重为20-22g，雄性，品系为c57bl/6小鼠。
13.第二方面，本发明实施例还提供了一种抑郁症小鼠模型，所述抑郁症小鼠模型由上述方法构建。
14.采用上述技术方案产生的有益效果在于：本发明实施例所提供的快速构建抑郁症小鼠模型的方法具有快速、便捷的优势，对筛选抑郁症药物的试验开展具有重要的意义。
附图说明
15.图1为检验例中实施例1、2组、常温等剂量1、2组、高温生理盐水1、2组、常温生理盐水1、2组小小鼠体温变化；
16.图2为检验例中实施例1、2组、常温等剂量1、2组、高温生理盐水1、2组、常温生理盐水1、2组小小鼠体重变化；
17.图3为检验例1中实施例1组、常温等剂量1组、高温生理盐水1组、常温生理盐水1组小鼠抑郁样行为差别；
18.图4为检验例1中实施例2组、常温等剂量2组、高温生理盐水2组、常温生理盐水2组小鼠抑郁样行为差别；
19.图5为检验例1中常温高剂量组小鼠抑郁样行为；
20.图6为检验例1中常温慢速给药1组小鼠抑郁样行为；
21.图7为检验例1中常温慢速给药2组小鼠抑郁样行为；
22.图8为检验例1中常温递增剂量组小鼠抑郁样行为
23.图9为检验例1中海马神经元高尔基染色照片，bar＝10μm；
24.图10为检验例1中nat和hat条件下meth处理后海马神经元树突棘数目的变化；
25.图11为检验例2中实施例组、常温等剂量组、高温生理盐水组、常温生理盐水组小鼠的mda、ldh和tnf-α、il-6水平变化；图中n代表常温(22
±
1℃)，h代表高温(28
±
1℃)；
26.图12为检验例3中实施例组、生理盐水组、氟西汀组小鼠抑郁样行为。
具体实施方式
27.为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
28.下述实施例中：甲基苯丙胺(meth)由中国北京市公安局提供，实验前溶于0.9％无菌生理盐水中；高尔基染色试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司，mda和ldh检测试剂盒购自北京雷根生物技术有限公司，tnf-α和il-6elisa试剂盒为武汉爱博泰克生物科技有限公司产品。
29.以下实施例所用小鼠为c57bl/6小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，小鼠体重为20-22g，雄性。
30.下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的其他材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
31.实施例1
32.本实施例提供了一种快速构建抑郁症小鼠模型的方法。
33.将小鼠置于28
±
1℃的环境中(湿度约60％，光照周期为7:00-19:00光照，19:00-7:00黑暗)，并开始以每次10mg/kg的给药剂量腹腔注射甲基苯丙胺，每天注射4次(每6h注射1次)，共注射1天。给药期间保持小鼠的饲养环境温度为28
±
1℃。
34.实施例2
35.本实施例提供了一种快速构建抑郁症小鼠模型的方法。
36.将小鼠置于28
±
1℃的环境中(湿度约60％，光照周期为7:00-19:00光照，19:00-7:00黑暗)，并开始以每次10mg/kg的给药剂量腹腔注射甲基苯丙胺，每天注射4次(每6h注射1次)，共注射3天。给药期间保持小鼠的饲养环境温度为28
±
1℃。
37.检验例1
38.1、实验动物
39.选择雄性c57bl/6小鼠(20-22g)，适应性饲养两周后分为正常环境温度(normal ambient temperature，nat)和高环境温度(high ambient temperature，hat)组，具体来说，分别为实施例1组(13只)，实施例2组(13只)，常温等剂量1组(15只)，常温等剂量2组(9只)，常温高剂量组(13只)，常温慢速给药1组(11只)，常温慢速给药2组(12只)，常温递增剂量组(10只)，常温生理盐水1组(15只)，常温生理盐水2组(10只)，高温生理盐水1组(15只)，高温生理盐水2组(12只)。各组小鼠均以相同的常规饲料饲养，自由饮食饮水，饲养环境的湿度约60％，光照周期为7:00-19:00光照，19:00-7:00黑暗。各组小鼠的处理方式为：
40.实施例1组：处理方式同实施例1；
41.实施例2组，处理方式同实施例2；
42.常温等剂量1组：将小鼠置于22
±
1℃的环境中，并开始以每次10mg/kg的给药剂量腹腔注射甲基苯丙胺，每天注射4次(每6h注射1次)，共注射1天。给药期间保持小鼠的饲养环境温度为22
±
1℃；
43.常温等剂量2组：将小鼠置于22
±
1℃的环境中，并开始以每次10mg/kg的给药剂量腹腔注射甲基苯丙胺，每天注射4次(每6h注射1次)，共注射3天。给药期间保持小鼠的饲养环境温度为22
±
1℃；
44.常温生理盐水1组：将小鼠置于22
±
1℃的环境中，并开始以每次10mg/kg的给药剂量腹腔注射生理盐水，每天注射4次(每6h注射1次)，共注射1天。给药期间保持小鼠的饲养环境温度为22
±
1℃；
45.常温生理盐水2组：将小鼠置于22
±
1℃的环境中，并开始以每次10mg/kg的给药剂量腹腔注射生理盐水，每天注射4次(每6h注射1次)，共注射3天。给药期间保持小鼠的饲养环境温度为22
±
1℃；
46.高温生理盐水1组：将小鼠置于28
±
1℃的环境中，并开始以每次10mg/kg的给药剂量腹腔注射生理盐水，每天注射4次(每6h注射1次)，共注射1天。给药期间保持小鼠的饲养环境温度为28
±
1℃；
47.高温生理盐水2组：将小鼠置于28
±
1℃的环境中，并开始以每次10mg/kg的给药剂量腹腔注射生理盐水，每天注射4次(每6h注射1次)，共注射3天。给药期间保持小鼠的饲养环境温度为28
±
1℃；
48.常温高剂量组：将小鼠置于22
±
1℃的环境中，并开始以每次15mg/kg的给药剂量腹腔注射甲基苯丙胺，每天注射4次(每6h注射1次)，共注射3天。给药期间保持小鼠的饲养环境温度为22
±
1℃；
49.常温慢速给药1组：将小鼠置于22
±
1℃的环境中，并开始以每次10mg/kg的给药剂量腹腔注射甲基苯丙胺，每天注射2次(每12h注射1次)，共注射7天。给药期间保持小鼠的饲养环境温度为22
±
1℃；
50.常温慢速给药2组：将小鼠置于22
±
1℃的环境中，并开始以每次10mg/kg的给药剂量腹腔注射甲基苯丙胺，每天注射2次(每12h注射1次)，共注射14天。给药期间保持小鼠的饲养环境温度为22
±
1℃；
51.常温递增剂量组：将小鼠置于22
±
1℃的环境中，并开始以2,2,5,5,5,5,10,10,10,10,15和15mg/kg的给药剂量腹腔注射甲基苯丙胺，每天注射4次(每6h注射1次)，共注射
3天。给药期间保持小鼠的饲养环境温度为22
±
1℃。
52.2、体温
53.测量第一天前两次给药后和首次给药24h后(1、3、24h)检测实施例1、2组、常温等剂量1、2组、高温生理盐水1、2组、常温生理盐水1、2组小鼠的基础体温，结果如图1所示。
54.由结果可见，高室温环境(28℃)可加剧meth诱导的高热。多因素方差分析(重复测量)显示meth处理对体温(f
1,54
＝57.29,p《0.001)和环境温度(f
1,54
＝15.06，p《0.001)有显著的主效应，meth处理与环境温度存在交互作用(f
1,54
＝5.68，p＝0.021)。
55.3、体重
56.记录给药前和首次给药后24h后实施例1、2组、常温等剂量1、2组、高温生理盐水1、2组、常温生理盐水1、2组小鼠的体重，结果如图2所示。
57.由结果可见，高室温环境(28℃)可加剧meth(10mg/kg
×
4次)诱导的体重减轻。双因素方差分析显示，meth处理(f
1,54
＝89.03,p《0.001)、环境温度(f
1,54
＝19.86，p《0.001)对体重丢失有显著的主效应和交互作用(f
1,54
＝17.01，p《0.001)；hrt条件下进行meth处理可引起更为严重的体重丢失(p《0.001，与nat组相比)。
58.4、抑郁样行为
59.于末次给药后7和14天开始进行小鼠行为学测试，采用自发活动、悬尾和强迫游泳测试小鼠抑郁样行为。
60.4.1自发活动实验(locomotion test，lmt)
61.lmt箱体由长、宽均为40cm的白色亚克力板制成，使用荷兰noldus视频跟踪软件记录并分析小鼠5min内在箱体中活动总距离。每次测试前用75％酒精进行清洁。
62.4.2悬尾实验(tail suspension test，tst)
63.tst箱体为20
×
20
×
35cm的白色方盒，距离盒子顶端3cm处有一个铁质挂钩，在鼠尾处粘贴胶带用于悬挂小鼠，时间为6min。使用荷兰noldus视频跟踪软件记录并分析最后5min的不动时间(悬吊时身体处于完全静止状态时间)。
64.4.3强迫游泳实验(forced swimming test，fst)
65.fst在直径10cm、高度23cm的透明树脂圆桶中进行，水深15cm，水温23～25℃。使用荷兰noldus视频跟踪软件记录并分析5min内的不动时间(除了防止身体下沉的必要动作以外，四肢或身体没有运动的状态时间)。每次测试前均更换桶中的水。
66.实施例1组、常温等剂量1组、高温生理盐水1组、常温生理盐水1组小鼠的结果如图3所示，实施例2组、常温等剂量2组、高温生理盐水2组、常温生理盐水2组小鼠的结果如图4所示。
67.由图3结果可见，nat条件下进行meth(10mg/kg
×
4)处理(即常温生理盐水1组)未能诱导小鼠出现抑郁样行为；而hat条件下给予相同剂量meth处理(即实施例1组)后，在末次给药7天后出现明显的抑郁样行为(tst：p《0.001；fst：p《0.001)，但14天后恢复正常(tst：p＝0.808；fst：p＝0.394)；lmt结果显示各组间小鼠的活动性无显著差异(p》0.05)。
68.增加meth暴露次数至三天(10mg/kg
×4×
3)后，图4结果显示nat条件下meth处理(即常温生理盐水2组)亦未能诱导抑郁样行为；而hat条件下进行meth处理(即实施例2组)可在末次给药7天后诱导小鼠出现明显的抑郁样行为(tst：p《0.001；fst：p《0.001)，并且持续至14天(tst：p《0.001；fst：p《0.001)；lmt结果显示各组间小鼠的活动性无显著差异(p》
0.05)
69.由以上结果可见，高室温环境(28℃)可明显加剧meth(10mg/kg
×
4次，1天或3天)诱导的抑郁样行为。
70.常温高剂量组(如图5所示，其中生理盐水表示常温生理盐水2组，meth表示常温高剂量组)，常温慢速给药1组(如图6所示，其中生理盐水表示常温生理盐水2组，meth表示常温慢速给药1组)，常温慢速给药2组(如图7所示，其中生理盐水表示常温生理盐水2组，meth表示常温慢速给药2组)，常温递增剂量组(如图8所示，其中生理盐水表示常温生理盐水2组，meth表示常温递增剂量组)均未产生抑郁样行为。但在慢性给药方案中，末次给药后7天的lmt显示活动总距离增加(p《0.001，图6、图7)
71.5、神经元突触可塑性改变
72.从实施例2组、常温等剂量2组、高温生理盐水2组、常温生理盐水2组中分别随机选择3只小鼠，麻醉后采用4％多聚甲醛灌流、取脑，高尔基染色步骤按照试剂盒说明书进行，通过显微镜观察树突棘密度，计数树突每10μm段内的树突棘数目。结果如图9～图10所示。
73.由图9结果可见，meth可诱导海马突触可塑性损伤，hat条件下meth处理导致的树突棘密度减少更严重(p＝0.027，与nat组相比)。
74.由图10结果可见，高室温环境(28℃)可加重小鼠海马神经元树突棘数量减少。双因素方差分析显示，meth处理(f
1,8
＝176.20，p《0.001)和环境温度(f
1,8
＝13.52，p＝0.006)对树突棘数目均有显著的主效应，但二者之间无交互作用(f
1,8
＝3.353，p＝0.104)。
75.检验例2
76.1、实验动物
77.选择雄性c57bl/6小鼠(20-22g)，适应性饲养两周后分为实施例组(18只)，常温等剂量组(18只)，常温生理盐水组(6只)，高温生理盐水组(6只)。各组小鼠均以相同的常规饲料饲养，自由饮食饮水，饲养环境的湿度约60％，光照周期为7:00-19:00光照，19:00-7:00黑暗。各组小鼠的处理方式为：
78.实施例组，处理方式同实施例2；
79.常温等剂量组：将小鼠置于22
±
1℃的环境中，并开始以每次10mg/kg的给药剂量腹腔注射甲基苯丙胺，每天注射4次(每6h注射1次)，共注射3天。给药期间保持小鼠的饲养环境温度为22
±
1℃；
80.常温生理盐水组：将小鼠置于22
±
1℃的环境中，并开始以每次10mg/kg的给药剂量腹腔注射生理盐水，每天注射4次(每6h注射1次)，共注射3天。给药期间保持小鼠的饲养环境温度为22
±
1℃。
81.高温生理盐水组：将小鼠置于28
±
1℃的环境中，并开始以每次10mg/kg的给药剂量腹腔注射生理盐水，每天注射4次(每6h注射1次)，共注射3天。给药期间保持小鼠的饲养环境温度为28
±
1℃；
82.2、mda、ldh和tnf-α、il-6水平
83.用tba法及酶联免疫吸附实验检测高温生理盐水组、常温生理盐水组小鼠的mda、ldh和tnf-α、il-6水平，以及实施例组、常温等剂量组小鼠在撤药第1天、7天、14天(每天各组用6只小鼠)的mda、ldh和tnf-α、il-6水平：meth处理结束后，小鼠断头处死，置于冰上，取脑分离海马组织，pbs清洗后用滤纸吸干水分，加入400ml pbs匀浆，离心后取上清液备用。
上清液中总蛋白浓度以及mda、ldh、il-6和tnf-a水平检测等操作步骤按照试剂盒说明书进行，通过总蛋白浓度对组织重量的差异进行校正。结果如图11所示。
84.由结果可见，hat条件下meth暴露可加剧meth诱导的mda、ldh、tnf-α和il-6水平升高，单因素方差分析显示各组间均存在显著差异(mda：f
3,20
＝115.50，p《0.001；ldh：f
3,20
＝50.66，p《0.001；tnf-α：f
3,20
＝73.14，p《0.001；il-6：f
3,20
＝81.24，p《0.001)。
85.检验例3
86.1、实验动物
87.选择雄性c57bl/6小鼠(20-22g)，适应性饲养两周后分为实施例组(6只)，生理盐水组(6只)，氟西汀组(6只)。各组小鼠均以相同的常规饲料饲养，自由饮食饮水，饲养环境的湿度约60％，光照周期为7:00-19:00光照，19:00-7:00黑暗。各组小鼠的处理方式为：
88.实施例组，处理方式同实施例2；给药后第7天进行行为学测试；
89.生理盐水组：将小鼠置于28
±
1℃的环境中，并开始以每次10mg/kg的给药剂量腹腔注射生理盐水，每天注射4次(每6h注射1次)，共注射3天。给药期间保持小鼠的饲养环境温度为28
±
1℃。给药后第7天进行行为学测试；
90.氟西汀组：将小鼠置于28
±
1℃的环境中，并开始以每次10mg/kg的给药剂量腹腔注射甲基苯丙胺，每天注射4次(每6h注射1次)，共注射3天。给药期间保持小鼠的饲养环境温度为28
±
1℃。然后进行氟西汀的灌胃给药(每次10mg/kg，1天1次，共6天)，给药结束后(即meth处理后第7天)进行行为学测试。
91.2、抑郁样行为
92.自发活动、悬尾和强迫游泳测试小鼠抑郁样行为测试方法同检验例1。
93.各组小鼠的结果如图12所示。
94.由图12结果可见，hat条件下进行meth处理(即实施例组)可在末次给药7天后诱导小鼠出现明显的抑郁样行为，经氟西汀治疗后抑郁样行为消失(tst：p《0.001；fst：p《0.001)；lmt结果显示各组间小鼠的活动性无显著差异(p》0.05)。
95.由以上结果可见，高室温环境(28℃)可明显加剧meth(10mg/kg
×
4次，1天或3天)诱导的抑郁样行为。
96.以上图1～图12对应的数据以平均值
±
均值标准误差x
±
sem表示，采用graphpad 8.0版本进行统计，采用方差分析(anova)进行多因素和多组间的数据比较，采用bonferroni法进行组间差异的比较；采用非配对t检验来检测两独立样本间的差异，以p＜0.05有显著性差异。
97.以上结果说明，本发明实施例所提供的快速构建抑郁症小鼠模型的方法能够快速获得理想的抑郁症小鼠模型。
98.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。