一种细菌采集检测一体化微流控荧光芯片及其应用的制作方法

1.本发明涉及物体表面细菌快速检测，具体涉及一种细菌采集检测一体化微流控荧光芯片及其应用。


背景技术：

2.物体表面细菌污染是食品厂、洁净室、急诊室管理等领域广泛关注的问题之一。由于表面是致病性细菌潜在的转移介质，而且部分空气中的细菌会沉降在物体表面，因此对物体表面细菌的检测已成为确定致病性细菌传播的一个非常有效的途径，具有十分重要的意义。表面细菌具有非均匀分布，含量低的特点，对其检测主要参照各行业标准，采用培养基接触采样或棉签擦涂采样，通过平板培养计数法测定物体表面的细菌。目前的检测方法存在采样效率低、耗时长等问题。因此，寻求表面细菌快速采集和检测的新方法极为迫切。
3.2013年microbes and environments的第28卷，第2期264~268页“日本实验舱“kibo”国际空间站细菌胶粘片监测（bacterial monitoring with adhesive sheet in the international space station
‑“
kibo”, the japanese experiment module）”，公开了一种由半透明的聚氨酯薄膜基材和不溶于水的丙烯酸粘合剂组成的细菌采集胶粘片，将其贴在待测表面采样，在胶粘片表面滴加荧光试剂自然晾干10-20 min后，在1000倍的显微镜下，对30多个点位的细菌数量计数，实现细菌的检测。该方法需要专门的检测人员，对非均匀分布表面菌的检测误差较大。专利“cn 1804602 a”公布的“表面清洁程度及微生物污染快速检测方法和装置”中，将采样棉签和三磷酸腺苷（atp）荧光检测所需的反应试剂集成为一个装置，采用棉签采样后，通过对细菌内atp进行生物荧光检测，实现表面细菌的快速检测，但该方法受表面残渣物质中的atp干扰，易于出现假阳性结果。专利“cn 19929907 a”公布的“适用于空间环境的表面微生物显色检测片及其制备方法”中，将含显色底物的固体培养基封装在可弯曲的底板上制成检测片，采用其接触表面采样后，通过培养和显色实现表面细菌的检测。该方法因检测片的存储条件而使其应用受到限制，也因需长时间培养而难以实现快检目标。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种采用微流控芯片来实现环境中固体表面细菌的快速采集和检测。在微流控芯片上，通过采用凝胶贴片实现表面细菌的采集，通过微流道设计实现微流体的控制，解决细菌样本的原位洗脱、转移和富集，进而通过原位标记实现被采集细菌在线荧光检测。
5.本发明的技术方案是一种细菌采集检测一体化微流控荧光芯片，包括凝胶贴片2和覆盖在凝胶贴片2上的盖片1；所述凝胶贴片2包括从上至下依次叠放的采样层3、滤膜层4、夹层5和基底支撑层6；所述采样层3从左至右依次设有采样区3-2、第二出液口3-3和第五出液口3-4；所述夹层5上设有位置对应与第二出液口3-3和第五出液口3-4的第三出液口5-1
和第四出液口5-2，第三出液口5-1和第四出液口5-2之间设有连接通道5-3；所述连接通道5-3为由夹层5下表面上凹且不贯穿夹层5上表面的槽状结构；所述盖片1从左到右依次设有洗脱液入口1-1、与采样区3-2位置对应的圆形通道1-2和树冠形混合通道1-3，圆形通道1-2和树冠形混合通道1-3连通；所述树冠形混合通道1-3的右端设有第一出液口1-4，第一出液口1-4与第二出液口3-3的位置相对应，所述圆形通道1-2和树冠形混合通道1-3为由盖片下表面上凹形成。
6.进一步的，所述采样区3-2为阵列微柱3-1组成的直径为2~10 mm的圆形区域，所述阵列微柱直径0.1 ~ 0.5 mm，柱间距为0.15 ~1 mm，高度为0.03~0.07 mm。
7.进一步的，所述洗脱液入口直径为3~10 mm，圆形通道直径为4~12 mm的。
8.具体的，所述树冠形混合通道1-3的每一条微通道均为宽0.02 ~0.1 mm，微通道间距为0.02 ~0.1 mm，通道高度为0.03~0.07 mm。
9.其中，所述连接通道5-3为宽度0.2 ~1 mm的微通道，通道高度为0.03~0.07 mm。
10.具体的，所述第二出液口3-3直径0.5 ~ 3 mm；第三出液口5-1直径为0.5 ~ 3 mm；所述第四出液口5-2直径0.75 ~2 mm。
11.其中，所述滤膜层4直径大于第三出液口5-1，直径4～8mm。
12.其中，所述基底支撑层6选择玻璃、聚对苯二甲酸乙二醇酯（pet）或聚甲基丙烯酸甲酯（pmma）为材料。
13.进一步的，所述滤膜层4的滤膜为聚碳酸酯、聚四氟乙烯或玻璃纤维。
14.具体的，所述采样层3选择玻璃、硅片或pdms为材料，采用紫外聚合法将温敏性pnipaam、复合pnipaam-聚乙二醇水凝胶、pvcl或复合pvcl-聚乙二醇凝胶材料改性微柱表面，制备温敏性凝胶微柱。
15.具体的，所述夹层5的材质为玻璃、硅片或pdms。
16.进一步的，所述盖片1以聚二甲基硅氧烷（pdms）为材料，通过mems加工技术制备得到含树冠形混合通道1-3的su8阳膜，将气泡除完的pdms浇注到su8阳膜上，置于60~100 ℃烘箱，固化30~90 min，将凝固的pdms从阳膜上剥离，在洗脱液入口位置打孔，即得到盖片。
17.本发明所述的基于凝胶贴片的细菌采集和转移一体化微流控荧光芯片如图1所示。该芯片集成了五个功能单元，洗脱液入液口、温敏性阵列微柱采样区、微流体混合通道、滤膜/检测区和出液口。所述微流控荧光芯片由盖片和凝胶贴片组合而成。使用时，与所设计的微流控荧光芯片匹配的还包括温控台、微泵和荧光显微镜或荧光光谱仪。所述温控台由铜片、帕尔贴、铝合金密尺散热片、散热风扇、温度传感器和控制器组等装成，用于微流控荧光芯片采样区的温度。所述微泵为市购，通过硅胶管与所述芯片的第五出液口连接，用于控制芯片流体通道中的洗脱液流速。通过荧光显微镜或荧光光谱仪对浓缩细菌的进行荧光检测。
18.实现本发明的技术方案是：本发明提出将细菌样本采集、转移、过滤浓缩、荧光标记及检测功能集成在微流控芯片上，用于表面细菌的快速高效检测。设计阵列微柱（微柱尺寸和间距）作为采样区，在其表面修饰温敏凝胶层，形成温敏性界面。具体如下：采用含烯丙基官能团的硅烷试剂修饰采样层，进而用紫外聚合法将温敏性pnipaam、复合pnipaam-聚乙二醇水凝胶、pvcl或复合pvcl-聚乙二醇凝胶材料改性微柱表面，获得温敏性微柱。使用中通过控制采样温度、压力和时间，实现细菌的高效采集和释放；通过荧光标记策略的设计、
结合微流体通道设计和滤膜集成，使用中通过控制温度，洗脱液流速和用量，实现细菌的转移、过滤浓缩、荧光标记；最终构建微流控荧光芯片用于细菌的检测。利用微流控荧光芯片，出液口衔接微流泵，辅以荧光显微镜和荧光光谱仪，建立一种表面细菌的采集及在线检测方法，实现表面细菌的快速检测。
19.本发明还提供了采用所述荧光芯片进行表面微生物检测的方法，包括如下步骤：步骤1、采集表面细菌：在待测物体表面滴加1~10 μl的含0.1~1%v/v吐温80的生理盐水溶液，将凝胶贴片的采样层表面与待测物体表面接触；步骤2、浓缩：将盖片与凝胶贴片组装得到微流控荧光芯片，将其置于显微镜载物台上，将出液口与微泵连接；加入洗脱液，开启微泵，在流量为50~300 μl/min，温度为0~30℃的条件下，完成细菌的荧光标记及在滤膜上的浓缩，所述洗脱液为含0.1~1%v/v吐温80的生理盐水溶液，每1ml洗脱液含有荧光试剂5~50 μl；步骤3、检测：采用显微镜对滤膜上浓缩的细菌进行荧光观测，通过荧光光谱仪扫描300 ~ 700 nm波长范围内的荧光信号，完成滤膜上细菌的检测。
20.具体的，步骤1中，施加采样压力0.5~10 n，按压采样0.5~3min，采样时控制凝胶贴片的温度为30~60℃。
21.进一步的，步骤2中，荧光试剂为sybr greenⅰ、sybr green
ꢀⅱ
或sybr gold中的至少一种。sybr系列荧光试剂自身不发荧光，或只有微弱的荧光，对细菌的dna或rna进行标记后发出荧光。
22.其中，步骤2中，洗脱液用量为100 ~ 2000 μl。
23.通过凝胶贴片与待测物表面接触，使细菌在采样区富集，然后盖上盖片，组合成为芯片。洗脱液入口加入洗脱液，第五出液口连接微泵。在微泵的作用下，洗脱液流经采样区，实现对待测细菌的洗脱，然后经树冠形混合通道进行混合，经第一出液口、第二出液口到达滤膜，实现细菌在滤膜的浓缩，洗脱液经第三出液口、第四出液口和第五出液口流出。这个过程实现了细菌的采集、洗脱、浓缩和荧光标记。然后将芯片置于显微镜上进行荧光扫描，即可实现对细菌的检测。
24.本发明采用上述技术方案，主要有以下效果：1. 本发明的微流控荧光芯片，将物体表面细菌的采集、浓缩、荧光标记与检测集成于一体，极大缩短了预处理的时间，并实现了在线检测，具有功能性强，效率高的特性，可用于表面细菌的快速高效检测。
25.2. 本发明的微流控荧光芯片，其采样区的阵列微柱结构设计，增大了采样区比表面积，同时温敏性凝胶界面的构建，使其具备了亲疏水状态的切换，可以实现表面细菌的高效采集和释放；盖片上的树冠型微通道实现了细菌和荧光试剂的混合标记；滤膜实现了细菌的浓缩；由此可以有效提高对物体表面细菌快速检测。
26.3. 本发明广泛应用于食品厂、医院、教室、卫生间等场合中物体表面细菌的检测。
附图说明
27.图1、基于凝胶贴片的细菌采集和转移一体化微流控荧光芯片的功能分区示意图。
28.图2、盖片仰视图。
29.图3、凝胶贴片结构示意图。
30.图4、（a）芯片富集细菌后微柱区荧光图，（b）洗脱细菌后微柱区荧光图，（c）洗脱后滤膜处荧光图。
31.图5、图1的垂直向的剖面图，图中箭头所示为样品流向。
32.图中标记：盖片1，采样贴片2，采样层3，滤膜层4，夹层5，基底支撑层6，洗脱液入口1-1，圆形通道1-2，树冠形混合通道1-3，第一出液口1-4，阵列微柱3-1，采样区3-2，第二出液口3-3，第五出液口3-5，第三出液口5-1，第四出液口5-2，连接通道5-3；洗脱液入口区7，洗脱液入口区、温敏性阵列微柱采样区、混合区、滤膜/荧光检测区和洗脱液出口区阵列微柱采样区8，混合区9，滤膜/荧光检测区10和洗脱液出口区11。
具体实施方式
33.实施例1 基于凝胶贴片的细菌采集和转移一体化微流控荧光芯片如图2～4所示，细菌采集检测一体化微流控荧光芯片包括凝胶贴片2和覆盖在凝胶贴片2上的盖片1；所述凝胶贴片2包括从上至下依次叠放的采样层3、滤膜层4、夹层5和基底支撑层6；所述采样层3从左至右依次设有采样区3-2、第二出液口3-3和第五出液口3-4；所述夹层5上设有位置对应与第二出液口3-3和第五出液口3-4的第三出液口5-1和第四出液口5-2，第三出液口5-1和第四出液口5-2之间设有连接通道5-3；所述连接通道5-3为由夹层5下表面上凹且不贯穿夹层5上表面的槽状结构；所述盖片1从左到右依次设有洗脱液入口1-1、与采样区3-2位置对应的圆形通道1-2和树冠形混合通道1-3；所述树冠形混合通道1-3的右端设有第一出液口1-4，第一出液口1-4与第二出液口3-3的位置相对应，所述树冠形混合通道1-3为由盖片下表面上凹形成。
34.进一步的，所述采样区3-2为阵列微柱3-1组成的直径为2~10 mm的圆形区域，所述阵列微柱直径0.1 ~ 0.5 mm，柱间距为0.15 ~1 mm，高度为0.03~0.07 mm。
35.具体制备过程如下：盖片材料采用pdms，通过mems加工技术制备得到含混合通道的su8阳膜，将pdms预聚体除气后浇注到su8阳膜上，置于75 ℃烘箱，固化60 min，将凝固的pdms从阳膜上剥离，在洗脱液入口位置打孔，即得到盖片。洗脱液入口直径为7 mm，避让区直径为6 mm。树冠形混合通道的每一微通道宽0.08 mm，通道高度为0.03 mm，通道尾端为第一出液口。
36.含温敏性阵列微柱的采样层选用pdms材料，制备方法同上。阵列微柱采样区直径为6 mm，衔接滤膜区的圆孔直径为1 mm。所述阵列微柱直径0.46 mm，柱心间距为0.78 mm，高度为0.03 mm。
37.滤膜为孔径为0.22μm的聚碳酸酯滤膜，将其裁剪成直径6 mm的圆片。
38.夹层材料为pdms。衔接滤膜区的圆孔直径为1mm，继而衔接宽度0.5 mm微通道，通道高度为0.05 mm，出液口直径1.5 mm。
39.基底支撑层为pet。
40.将温敏性阵列微柱采样层、滤膜层、含微通道和出液口的夹层以及pet通过plasma键合组装成凝胶贴片。凝胶贴片和盖片键合，即可得到本发明所提出微流控荧光芯片，如图1所示，形成了洗脱液入口区7、温敏性阵列微柱采样区8、混合区9、滤膜/荧光检测区10和洗脱液出口区11这5个区域。
41.实施例2 阵列微柱表面凝胶修饰层将含阵列微柱的pdms通过plasma处理，浸泡在10%的烯丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液中，2 h，纯水冲洗，至于45 ℃条件下干燥30 min。之后将其浸入异丙基丙烯酰胺（nipaam）的预聚体溶液中，将其至于0℃氛围中，距光源约10 cm处（约17 mw/cm2），采用紫外光引发聚合制备pnipaam凝胶，用乙醇和去离子水清洗除去未反应的试剂，烘干得到pnipaam修饰的温敏性阵列微柱采样层。
42.实施例3物体表面的金黄色葡萄球菌采集和测试对实施例1和实施例2中构建的基于凝胶贴片的细菌采集和转移一体化微流控荧光芯片进行应用测试。在抛光的无菌不锈钢片表面滴加20 μl的荧光试剂标记的金黄色葡萄球菌悬液（10
7 cfu/ml），自然风干，作为待测样本，向待测样本表面滴加10 μl洗脱液，将凝胶贴片的采样区贴在待测样本表面，控制温度40℃，施加500 g砝码等重的重物按压2 min，完成采样。将盖片和采样贴片贴合，出液口连通微流控蠕动泵，控制流速200 μl/min，温度25℃，入液口加入1.0 ml洗脱液（采用1%的吐温80溶液将sybr gold 5000
×
按照1:25000的体积比稀释得到洗脱液），对采集和释放金黄色葡萄球菌的微柱区进行荧光观测。
43.在抛光的无菌不锈钢片表面滴加20 μl的金黄色葡萄球菌悬液（10
6 cfu/ml），自然风干，作为待测样本，同时以无菌溶液作为对空白照组。向待测样本表面滴加10 μl洗脱液，将凝胶贴片的采样区贴在待测样本表面，控制温度40℃，施加500 g砝码等重的重物按压2 min，完成采样。将盖片和采样贴片贴合，出液口连通微流控蠕动泵，控制流速200 μl/min，温度25℃，入液口加入1.0 ml洗脱液（采用1%的吐温80溶液将sybr gold 5000
×
按照1︰25000的体积比稀释得到洗脱液），对采集区金黄色葡萄球菌进行浓缩和荧光标记。3次平行测试的结果显示，待测样本在微流控荧光芯片的检测区呈现出明显的荧光，在537 nm（537 nm为sybr gold标记金葡菌后的最佳发射波长）波长处的荧光强度为785
±
25，和空白对照组的荧光强度差值为539。