检测恩镰孢菌素化学发光试剂盒及其应用的制作方法

1.本发明属于食品安全检测领域，具体涉及一种检测恩镰孢菌素的化学发光试剂盒及其应用。


背景技术：

2.恩镰孢菌素(enniatins,enns)主要是由镰刀菌的某些菌种侵染小麦、大麦、黑麦和燕麦等谷物后，在潮湿和低温条件下产生的真菌毒素。enns是一类结构相似的真菌毒素，首先在尖孢镰刀菌(f.oxysporum)中发现，随后在锐顶镰刀菌(f.acuminatum)、燕麦镰刀菌(f.avenaceum)和木贼镰刀菌(f.equiseti)中发现。到目前为止，一经发现20多种enns的类似物，但仅4种enns[恩镰孢菌素a(ena)、恩镰孢菌素a1(ena1)、恩镰孢菌素b(enb)、恩镰孢菌素b1(enb1)]常在食品和饲料中检测到。
[0003]
enns为典型的环状六酯肽类化合物，含有可变的羟基酸残基和n-甲基氨基酸残基。enns在n-甲基氨基酸残基上具有不同的脂肪族氨基酸残基。这些残基通过肽键或者分子内脂键链接形成六元环状缩酯肽结构。四种enns的化学性质见表1。
[0004]
表1、恩镰孢菌素的化学性质
[0005][0006]
恩镰孢菌素enns的主要毒性作用与他们的离子载体抑制特性相关。enns能提高阳离子穿过细胞膜的能力，有次干扰正常生理水平下细胞的阳离子水平、影响细胞膜的电化学梯度，而产生毒性反应，如细胞内钙离子浓度增加后，激活了钙依赖的内切酶活性而出现典型的凋亡特征。国内相关恩镰孢菌素enns毒性的研究较少，据国外同类研究结果表明，在enns的作用下，人结肠癌细胞caco-2内出现活性氧浓度上升和通过降低线粒体膜电位诱导线粒体依赖的细胞凋亡现象。
[0007]
恩镰孢菌素enns在不同国家的污染情况。恩镰孢菌素在不同的国家都发现谷物中有污染的情况。uhlig调查了2000-2002年挪威产的73份燕麦、75份大麦和80份小麦共计228份样品中的4中恩镰孢菌素enns的污染状况；结果发现恩镰孢菌素b(enb)检出率为100％(228/228)，enb1检出率94％(214/228)，ena1检出率67％(153/228)，ena检出率25％(58/228)。sorensen等在2005-2006年丹麦收获的80份玉米和玉米青储饲料中检出了恩镰孢菌素enns，其中enb检出率89％最高含量988ug/kg。除此之外，在突尼斯、意大利、摩洛哥、西班牙等地的小麦、玉米、大米样本中均检出了恩镰孢菌素enns。yoshinari在日本市场上抽检
了163份小麦样本，检测发现61％的进口小麦粉和58％的的日本国产小麦粉存在呕吐毒素don和恩镰孢菌素的协同污染。
[0008]
韩小敏等从北京、安徽、宁夏等省市采集市售玉米及其制品、小麦及其制品检测其中的恩镰孢菌素发现，19份玉米及其制品中均检出恩镰孢菌素ena,ena1和enb1，平均含量分别为0.06ug/kg，0.21ug/kg和0.09ug/kg。17份小麦及其制品中均检出4中enns，含量分别为ena3.57，ena10.89，enb14.13和enb1 15.10ug/kg。其中一份来自宁夏小麦样品中enb和enb1的含量高达111.95和71.66ug/kg。
[0009]
目前，基于液液萃取或者固相萃取的高效液相色谱hplc配合光电二极管阵列检测器dad(hplc-dad)是常用的检测食品中恩镰孢菌素enns的方法。但是，由于单纯的色谱分析法存在特异性不强，灵敏度不高等缺点，其应用越来越受到限制。近年来，基于hplc与质谱联用技术开发的高效液相色谱-串联质谱(hplc-ms/ms)法和高效液相色谱-高分辨率质谱法(hplc-hrms)已经被广泛用于食品中真菌毒素的检测。该方法结合了色谱优越的分离性能与质谱的定性能力，明显提高了检测的灵敏度和特异性，似的分析方法具有检出限低、能获得待测化合物分子结构信息等优点，已经成为分析食品中恩镰孢菌素enns的很好的手段。
[0010]
韩小敏等建立了基于我国小麦和玉米样本的高效液相色谱-串联质谱(hplc-ms/ms)检测恩镰孢菌素的方法。该方法将小麦或者玉米样本经过粉碎-提取-固相萃取净化后，用高效液相色谱-串联质谱法检测，hplc-ms/ms，加标回收率可以到90-140％，线性范围可以达到enb 0.01-1200ug/kg,日内和日间精密度rsd分别为0.2％-6.9％和1.9％-13.5％。韩小敏等发表的工作是我国对于恩镰孢菌素检测方法比较全面和权威的。
[0011]
利用hplc-ms/ms方法可以对样本中的恩镰孢菌素进行精确的分析，但是这一方法的缺点在于：
[0012]
1.需要大型的精密分析设备，包括高效液相色谱，质谱仪等，基层的实验室没有能力配备；
[0013]
2.需要一个复杂和耗时较长的样本前处理过程；
[0014]
3.样本检测通量较低，一次只能检测一个样本；
[0015]
4.需要熟练的技术人员，精密仪器的操作需要人员培训，更重要的，检测数据的分析需要熟练的科研技术人员，一般的基层技术员难以达到这个要求。
[0016]
目前尚未检索到检测恩镰孢菌素的化学发光检测试剂盒上市，也未检索到相关的专利和文章。
[0017]
在真菌毒素检测领域，应用化学发光检测方法已经有描述，在专利cn201710496313.4中描述了一种化学发光检测婴幼儿米粉中的黄曲霉毒素b1的方法，该方法采用吖啶酯标记黄曲霉毒素抗原，读取吖啶酯产生的荧光信号，来检测黄曲霉毒素b1。该方法描述吖啶酯产生的荧光信号是固定的，信号强度是依赖所标记的抗原量多少来确定。
[0018]
专利cn201810537383.4中描述了一种利用功能核酸和化学发光材料制备化学发光传感器检测赭曲霉毒素a(ota)的方法。首先，该方法利用的是功能核酸，也就是dna片段，通过加入核酶(dnazyme)，linker和血红素，反应形成一个ota核酸适配体-lingker-g四具体/血红素dnazyme的复合结构，在这反应中加入发光底物鲁米诺，利用赭曲霉毒素ota使上述复合结构的改变，促使发光底物发光，从而达到检测的目的。
[0019]
在专利cn202010377848.1描述了一种化学发光检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇(呕吐毒素don)的方法，该方法同样利用了能够识别don的核酸适配体，然后设计了don适配体的互补dna序列，该序列以铂铜合金(ptcu)作为修饰，利用铂铜合金(ptcu)可以催化鲁米诺的化学发光反应进行检测。
[0020]
综上所述，尚未发现化学发光方法检测恩镰孢菌素的文献和专利。


技术实现要素：

[0021]
本发明要解决的问题是提供一种化学发光的恩镰孢菌素检测试剂盒，满足基层对于样本中恩镰孢菌素快速检测的需求。
[0022]
为了解决上述技术问题，本发明提供一种快速、高通量的恩镰孢菌素磁微粒化学发光检测试剂盒，包括下列试剂：1)恩镰孢菌素enns(enniatins enns)校准品；2)恩镰孢菌素衍生物磁珠连接物；3)酶结合物；4)化学发光底物；5)清洗液。
[0023]
作为本发明试剂盒的改进：恩镰孢菌素校准品为经过定值(浓度值)的恩镰孢菌素enns。
[0024]
作为本发明试剂盒的进一步改进：恩镰孢菌素的校准品可以为恩镰孢菌素a/a1/b/b1其中任意一种，或者几种的混合。
[0025]
作为本发明试剂盒的进一步改进：恩镰孢菌素的磁珠连接物试剂，主要是指的恩镰孢菌素偶联的磁珠连接物。
[0026]
作为本发明试剂盒的进一步改进：所述的磁珠粒径为1μm-5μm，其中优选2μm-4μm；磁珠修饰基团包含但不限于氨基、羧基、巯基、nhs等，其中优选nhs修饰。
[0027]
作为本发明试剂盒的进一步改进：恩镰孢菌素的衍生物指的是恩镰孢菌素通过化学合成偶联到大分子蛋白上合成的；大分子蛋白包括但不限于牛血清白蛋白、卵清蛋白、匙蓝蛋白等。其中，优选卵清蛋白。
[0028]
作为本发明试剂盒的进一步改进：酶结合物的主要成分是碱性磷酸酶标记的恩镰孢菌素单克隆抗体；恩镰孢菌素的单克隆抗体特征为，此单克隆抗体能够识别常见的四种恩镰孢菌素，分别为恩镰孢菌素a(ena)、恩镰孢菌素a1(ena1)、恩镰孢菌素b(enb)、恩镰孢菌素b1(enb1)。
[0029]
作为本发明试剂盒的进一步改进：恩镰孢菌素的单克隆抗体制备过程如下：
[0030]
步骤一：恩镰孢菌素免疫原的合成，将恩镰孢菌素与载体蛋白牛血清白蛋白(bsa)进行共价偶联；
[0031]
步骤二：动物免疫，将恩镰孢菌素合成抗原bsa-enns免疫小鼠，初次免疫后加强两次，共三次免疫；
[0032]
步骤三：细胞融合及筛选，取抗体效价较高的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，用选择性培养基进行细胞筛选；用间接elisa方法检测细胞培养上清。选择能与四种恩镰孢菌素：恩镰孢菌素a(ena)、恩镰孢菌素a1(ena1)、恩镰孢菌素b(enb)、恩镰孢菌素b1(enb1)都有交叉的抗体细胞株；
[0033]
步骤四：腹水制备和纯化，选择稳定分泌抗体的细胞株，采用体内诱生腹水方法制备单克隆抗体，利用proteina/g柱纯化腹水中的单克隆抗体。
[0034]
作为本发明试剂盒的进一步改进：化学发光底物的主要成分是3-(2-螺旋金刚
烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(amppd)。
[0035]
作为本发明试剂盒的进一步改进：恩镰孢菌素的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
[0036]
步骤一：配制恩镰孢菌素校准品；
[0037]
步骤二：制备恩镰孢菌素磁珠连接物，并将磁珠连接物稀释到一定浓度，制备连接物试剂；
[0038]
步骤三：制备酶结合物试剂，将酶结合物稀释到一定浓度，；
[0039]
步骤四：配制化学发光底物；
[0040]
步骤五：配制清洗液。
[0041]
作为本发明试剂盒的进一步改进：
[0042]
步骤一所描述的校准品的配制，包括：
[0043]
1)校准品缓冲液，缓冲液为ph 7-7.5的10mmol/l的tris缓冲液，含有万分之1-5的proclin-300.
[0044]
2)将恩镰孢菌素纯品溶解，配制成为1ug/ml的储液，随后依次稀释成为2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、200ng/ml，加上0点，共8个校准品梯度。
[0045]
步骤二所描述的恩联保菌的磁珠连接物的制备，包括：
[0046]
1)取10％的磁珠加入到离心管中，磁性分离去除上清；
[0047]
2)加入无水乙醇，混合均匀磁性分离去除上清(重复3次)；
[0048]
3)恩镰孢菌素-卵清蛋白偶联物(enns-ova)用含nacl的ph5.5-7.0的2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)缓冲液溶解。mes缓冲液浓度在0.1mol/l-0.3mol/l，其中，优选0.1mol/l。mes缓冲液ph优选ph6.0。nacl浓度在0.1-0.2mol/l之间。
[0049]
4)将上述处理过的磁珠加入到上述恩镰孢菌素-卵清蛋白偶联物(enns-ova)溶液中，混合反应，磁性分离去除上清。反应温度在20-25℃，反应时间控制在2-3h。
[0050]
5)加入封闭液，封闭反应，反应后磁性分离去除上清。封闭液为含有牛血清白蛋白(bsa)的mes缓冲液；mes缓冲液浓度在0.1mol/l-0.3mol/l，其中，优选0.1mol/l；mes缓冲液ph优选ph5.0-6.0；nacl浓度在0.1-0.2mol/l之间，bsa浓度为0.1-0.2％；封闭反应温度在20-25℃，反应时间控制在2-3h；
[0051]
6)加入清洗缓冲液清洗3-5次，磁性分离去除上清。清洗缓冲液为10-100mmol/l的tris-cl缓冲液，优选50mmol/l，其中含有0.1-0.2mol/l的nacl，ph在7.0-7.5之间。
[0052]
7)将制备好的恩镰孢菌素磁珠连接物保存于储存缓冲液中，储存缓冲液为10-100mmol/l的磷酸缓冲液pbs，ph在7.0-7.5之间，并且含有0.1-0.2％的牛血清白蛋白和防腐剂。
[0053]
步骤三所描述的酶结合物的制备，包括：
[0054]
1)将碱性磷酸酶akp和抗体溶液混合后，用透析缓冲液透析，中间换液3次。碱性磷酸酶akp的量为1-5mg，抗体量为1-5mg，其中优选比例为碱性磷酸酶：抗体为2:1；透析缓冲液为10mmol/l的磷酸缓冲液pbs，透析缓冲液的ph为ph7.0-7.5；透析温度优选2-4℃，透析时间优选16-20h。
[0055]
2)加入一定浓度的戊二醛反应，反应后用透析缓冲液透析，其中换液3次。戊二醛的浓度优选2％-5％，加入体积优选10-20ul，反应温度优选20-25℃，反应时间优选1-2h；透
析缓冲液的ph为ph7.0-7.5；透析温度优选2-4℃，透析时间优选16-20h。
[0056]
3)换用5-10mmol/l的ph7.5-8.0的tris-hcl缓冲液透析，透析温度优选2-4℃，透析时间优选16-20h，期间换液3次。
[0057]
4)取出标记抗体放于抗体储存缓冲液中，储存缓冲液为10-100mmol/l的tris缓冲液，ph在7.0-7.5之间，并且含有0.1-0.2％的牛血清白蛋白和防腐剂；得恩镰孢菌素抗体-碱性磷酸酶结合物。
[0058]
步骤四所描述的化学发光底物的配制，其中3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(amppd)浓度为1-2mmol/l，含十六烷基三甲基氯化铵(ctac)0.01-0.1mmol/l，ph在9.0-9.5。
[0059]
步骤五所描述的清洗液，为10-50mmol/l的tris缓冲液，含0.1-0.2％的tween-20，ph7.5-8.0。
[0060]
本发明还同时提供了一种恩镰孢菌素化学发光试剂盒的应用，检测不同样本中的四种恩镰孢菌素的总量。
[0061]
作为本发明试剂盒应用的改进，四种恩镰孢菌素包括：恩镰孢菌素a(ena)、恩镰孢菌素a1(ena1)、恩镰孢菌素b(enb)、恩镰孢菌素b1(enb1)。所述的样本包括但不限于小麦及其小麦制品、玉米及其玉米制品和大米及大米制品等。
[0062]
本发明与背景技术所述的现有技术存在以下区别：
[0063]
1、本发明采用的是化学发光底物，利用酶催化底物产生发光信号，与cn201710496313.4在原理上有根本的不同。
[0064]
2、在本发明中，利用的是经典的抗原抗体反应，在此基础上抗体通过免疫磁珠的形式提高捕获效率，然后通过酶标抗原促使化学发光底物产生发光信号。与cn201810537383.4在原理上有本质的不同。
[0065]
3、本发明与cn202010377848.1的抗原抗体反应及酶促化学发光反应原理截然不同。
[0066]
综上所述，本发明描述的方法与目前流行的hplc-ms/ms方法相比较，二者针对的是不同的检测场景和检测需求。本发明主要针对现场和基层的快速检测需求，适合基层技术员快速掌握。而hplc-ms/ms方法适合在中心实验室对样本中的恩镰孢菌素做出精确的分类和计量。
[0067]
综上，目前常用的技术是液相色谱-质谱仪的联用技术；虽然检测准确，但是效率较低，前处理时间很长。设备价格昂贵，不适合大量样本中恩镰孢菌素污染的筛查，以及恩镰孢菌素的现场检测。本发明与现有的恩镰孢菌素检测方法相比，更侧重于现场检测，主要用于现场大量样本中的恩镰孢菌素的筛查。如果配合全自动的化学发光仪等设备，能完成大量样本的自动化筛查。
[0068]
本发明的有益效果：
[0069]
与原有方法相比，本发明主要具有以下优势：
[0070]
1.它通量较高，一次可以最多检测96个样本，而目前常用的hplc-ms/ms方法一次只能检测一个样本。
[0071]
2.操作相对简单，具有基本的酶联免疫分析技术的人员经过培训都能够操作。
[0072]
3.不需要大型的精密设备。
[0073]
4.检测的灵敏度和特异性较高；本发明是针对基层恩镰孢菌素检测需求，能够满足基层的快速检测要求。
[0074]
5.本发明的恩镰孢菌素的单克隆抗体，能识别四种不同的恩镰孢菌素亚型。即，能交叉识别四种恩镰孢菌素，并且交叉率较高。
[0075]
综上，本发明的试剂盒将恩镰孢菌素偶联磁珠技术与化学发光技术相结合，具有高灵敏度。磁珠的引入扩大的有效反应体积，提高了反应效率。反应处于均相反应体系当中，增加了反应的重复性。并且该发明描述的方法还适用于于自动化设备。
附图说明
[0076]
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
[0077]
图1为恩镰孢菌素b化学结构；
[0078]
图2为恩镰孢菌素单克隆抗体sds-page电泳图谱；
[0079]
图3为恩镰孢菌素a化学结构；
[0080]
图4为恩镰孢菌素a1化学结构；
[0081]
图5为恩镰孢菌素b1化学结构。
具体实施方式
[0082]
下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0083]
本发明中，没有明确告知的均为截留分子量10000的透析袋。
[0084]
实施例1、恩镰孢菌素单克隆抗体的制备，可参考常规单克隆抗体法进行，具体为依次进行以下步骤：
[0085]
1、恩镰孢菌素免疫原的合成：
[0086]
用碳二亚胺法(dcc法)将恩镰孢菌素benb与载体蛋白bsa进行偶联，恩镰孢菌素benb为以下任一：恩镰孢菌素a(ena)、恩镰孢菌素a1(ena1)、恩镰孢菌素b(enb)、恩镰孢菌素b1(enb1)；
[0087]
1)、将载体蛋白牛血清白蛋白bsa溶解在ph4～7含有0.05～1m nacl的0.1～1m的mes缓冲液中，终浓度为2～15mg/ml，得载体蛋白牛血清白蛋白溶液；
[0088]
所述ph4～7含有0.05～1m nacl的0.1～1m的mes缓冲液为：在0.1～1m的mes缓冲液(ph4～7)中加入nacl直至浓度为0.05～1m。
[0089]
最终优选条件ph6的0.25m的mes缓冲液，含有终浓度为0.5m的nacl；以下同；
[0090]
2)、将待偶联的抗原恩镰孢菌素benb溶解在含有0.05～1m nacl的0.1～1m的mes缓冲液(ph＝4～7)，终浓度为1～10mg/ml，得待偶联抗原恩镰孢菌素溶液；
[0091]
3)、按照步骤2)所得的待偶联抗原恩镰孢菌素溶液：步骤1)所得的载体蛋白牛血清白蛋白溶液＝1～10:1(v/v)的体积比，将两者混合，然后加入二甲基亚砜dmso至浓度为0.1％～1％(体积％)；得混合液；
[0092]
4)、将n,n'-二环己基碳二亚胺(dcc)用0.1～1m的mes缓冲液(ph＝4～7)溶解，至终浓度为1～10mg/m，得dcc溶液；
[0093]
5)、按照步骤3)所得的混合液：步骤4)所得的dcc溶液＝1:1的体积比，将2者搅拌混匀，得混合物；
[0094]
将所述混合物室温反应2～16小时，然后经过常规的凝胶层析，得到牛血清白蛋白-恩镰孢菌素b的偶联产物(bsa-enb)。
[0095]
6)、将步骤5)所得的偶联产物用pbs溶液(0.01mol/l，ph 7.2)于4℃条件下透析至液体颜色澄清(截留分子量10000)，将所得的截留液3 000r/min离心10min去沉淀；
[0096]
7)、利用步骤6)所得的去沉淀后的截留液按照常规的免疫原制备法进行，最终获得恩镰孢菌素免疫原bsa-enns(即，恩镰孢菌素合成抗原bsa-enns)。
[0097]
2、动物免疫：
[0098]
将步骤1所得的恩镰孢菌素合成抗原bsa-enns与等体积量的弗氏完全佐剂混合后完全乳化，对8周龄balb/c雌性小鼠进行皮下多点注射，200mg/只。
[0099]
二、三免时改用弗氏不完全佐剂进行乳化(即，将步骤1所得的恩镰孢菌素合成抗原bsa-enns与等体积量的弗氏不完全佐剂混合后乳化)，皮下多点免疫，100mg/只，每隔两周免疫一次。三免两周后眼眶采血测定抗体效价(抗体效价评价采用常规的elisa方法)，细胞融合前3天腹腔注射抗原afb1-bsa进行加强免疫，100μg/只。
[0100]
3、细胞融合及筛选：
[0101]
取步骤2所得的血清抗体效价较高的小鼠的脾细胞与瘤细胞进行细胞融合，先后用含hat和ht的细胞培养基对融合后的细胞进行筛选。当96孔细胞板内长出细胞集落并占据30％板内面积时，取杂交瘤细胞上清进行间接elisa检测，以p/n》2.1为阳性筛选出阳性杂交瘤细胞。
[0102]
选择能与四种恩镰孢菌素：恩镰孢菌素a(ena)、恩镰孢菌素a1(ena1)、恩镰孢菌素b(enb)、恩镰孢菌素b1(enb1)都有交叉的抗体细胞株。
[0103]
经过至少4次有限稀释和克隆筛选获得了稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，扩大培养并冻存。
[0104]
4、腹水制备和纯化：
[0105]
选择步骤3所得的稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，采用小鼠体内诱生腹水的方法制备单克隆抗体。8-10周龄的balb/c雌性小鼠一周前用无菌液体石蜡预处理，每只腹腔注射0.5ml。当杂交瘤细胞处于对数生长期时，将其注射至小鼠腹腔内，7d后采集腹水。用protien a/g抗体纯化柱纯化离心处理过的腹水，利用sds-page对纯化效果进行鉴定。
[0106]
抗体纯化结果见图2。根据图2可得知，本发明已经得到了纯度较高的，满足恩镰孢菌素检测的单克隆抗体
‑‑‑
恩镰孢菌素单克隆抗体。
[0107]
实施例2：恩镰孢菌素化学发光试剂盒的制备
[0108]
1、配制恩镰孢菌素校准品：
[0109]
1)校准品缓冲液配制：称取5gtris碱、9gnacl、0.6g proclin-300加入900ml纯化水，用柠檬酸将ph调至ph7.2，加入5g兔血清白蛋白，纯化水定容至1000ml，用0.22um的滤膜过滤后作为校准品缓冲液在2-8℃保存。
[0110]
2)将恩镰孢菌素benb纯品用二甲基亚砜dmso溶解，配制成为1ug/ml的储液，随后用校准品缓冲液稀释成为2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、200ng/ml，加上0点，共8个校准品梯度。
[0111]
2、制备恩镰孢菌素磁珠连接物
[0112]
1)取500ul 10％(v/v)的磁珠加入到2ml离心管中，磁性分离去除上清；
[0113]
2)加入1ml无水乙醇，混合均匀磁性分离去除上清(重复3次)；
[0114]
3)恩镰孢菌素-卵清蛋白偶联物(enns-ova)在含0.15mol/l nac的mes缓冲液中溶解，得偶联物(enns-ova)终浓度为1mg/ml的偶联物溶液；
[0115]
含0.15mol/l nacl的mes缓冲液为在0.1mol/l，ph6.0的mes缓冲液中加入nacl至浓度为0.15mol/l，mes为2-(n-吗啉代)乙磺酸。
[0116]
enns-ova的制备方法如下：
[0117]
步骤一，将载体蛋白卵清蛋白ova溶解在ph6含有0.5m nacl的0.5m的mes缓冲液中，终浓度为2～15mg/ml，得载体蛋白卵清蛋白溶液；
[0118]
步骤二，将待偶联的抗原恩镰孢菌素benb溶解在含有0.05～1m nacl的0.1～1m的mes缓冲液(ph＝4-7)，终浓度为1～10mg/ml，得待偶联抗原恩镰孢菌素溶液；
[0119]
步骤三，将n,n'-二环己基碳二亚胺(dcc)用0.1m～1m的mes缓冲液溶解，至终浓度为1-10mg/m，得dcc溶液；
[0120]
步骤四、将步骤二所得的待偶联抗原恩镰孢菌素溶液、步骤三所得的dcc溶液按照1:1的体积比混合，将所述混合物室温反应2～16小时，得到偶联产物；
[0121]
4)将500ul偶联物溶液加入到步骤2)所得的磁珠中。在25℃，混合反应2h。磁性分离后去除上清液。
[0122]
5)在步骤4)所得的磁珠中加入封闭液3-5ml，封闭反应，封闭液为含有0.1％牛血清白蛋白(bsa)1mol/l mes缓冲液，ph优选ph6.0，温度在25℃，封闭反应2h。反应后磁性分离去除上清。
[0123]
6)加入清洗缓冲液清洗3次(每次清洗缓冲液的用量为3-5ml)，清洗缓冲液为50mmol/ltris-cl缓冲液，ph7.2。磁性分离去除上清。
[0124]
7)将制备好的恩镰孢菌素磁珠连接物保存于储存缓冲液中，储存缓冲液为10mmol/l的磷酸缓冲液pbs，ph7.2，并且含有0.1％的牛血清白蛋白和0.02％的叠氮钠。
[0125]
储存缓冲液为：在1l pbs磷酸盐缓冲液(10mmol/l，ph7.2)中加入1g的牛血清白蛋白和0.2g的叠氮钠。
[0126]
3.制备酶结合物试剂(该试剂用于将酶结合物稀释到一定浓度)；
[0127]
1)将5mg碱性磷酸酶akp加入1ml(2mg/ml)抗体溶液混合后，用透析缓冲液，4℃用截留分子量10000的透析袋透析16h。中间换液3次。透析缓冲液为10mmol/l的磷酸缓冲液pbs，ph7.2；
[0128]
所述抗体溶液是将实施例1制备所得的恩镰孢菌素单克隆抗体，用20mmol/l的ph 8.0的tris.cl缓冲液稀释到2mg/ml。
[0129]
2)加入浓度为2.5％戊二醛20ul，25℃反应2h，反应后用ph7.2的pbs透析缓冲液，4℃透析16h其中换液3次。
[0130]
3)换用10mmol/l的ph8.0的tris-hcl缓冲液，4℃，透析时间优选16，期间换液3次。透析过后透析袋中的溶液为标记好的抗体。
[0131]
4)取出标记抗体放于抗体储存缓冲液中，储存缓冲液为10mmol/l的tris缓冲液，ph在7.2，并且含有0.1％的牛血清白蛋白和0.02％的叠氮钠；得恩镰孢菌素抗体-碱性磷酸
酶结合物。
[0132]
4、配制化学发光底物：
[0133]
称取3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(amppd)0.5g、三羟甲基氨基甲烷(tris)18g、氯化钠(nacl)100g、含十六烷基三甲基氯化铵(ctac)0.02g，纯化水定容至1000ml，调整化学发光底物溶液ph值为9.4，4℃保存。
[0134]
5、配制清洗液：
[0135]
称取1g三羟甲基氨基甲烷(tris)、8.5g氯化钠(nacl)加入900ml纯化水，搅拌至充分溶解，加入1mltween-20，搅拌溶解。调整ph至ph7.8，定容到1000ml。
[0136]
6、将上述个组分分装，组成成品试剂盒。
[0137]
实施例3：利用本发明的试剂盒检测小麦样本中的恩镰孢菌素含量
[0138]
利用本发明的试剂盒测试小麦样本中加标回收的效率，测试本试剂盒的精密度和准确度。
[0139]
准确度指的是测定值与真实值之间的符合程度，试剂盒准确度常常用回收率表示；精密度指的是可重复性，指的是测试同一样本时的变异，常用变异系数表示。
[0140]
检测步骤包括：
[0141]
1.称取50g小麦样本，小钢磨高速粉碎(能过200目的筛)；
[0142]
2.按照1μg/kg，10μg/kg和100μg/kg的终浓度，将恩镰孢菌素b标准品溶液加入至步骤1所得的粉碎后的小麦样本中；
[0143]
3.取5g步骤2所得物加入40％甲醇20ml，剧烈震荡5min，4000rpm离心5min；
[0144]
4.取上清液用去离子水按照1:5(v/v)比例稀释，此即为待检样本；每个待检样本取3个重复，进行检测；
[0145]
5.取化学发光微孔板板条，在微孔中，分别加入50ul待检样本或者恩镰孢菌素b标准品；
[0146]
6.在微孔板中加入50ul磁分离试剂；
[0147]
7.在微孔板中加入40ul恩镰孢菌素-碱性磷酸酶结合物；
[0148]
8.微孔板混匀30秒，在37℃反应30分钟；
[0149]
9.将微孔板放置在磁力架上静置1分钟，去掉上清；
[0150]
10.在微孔板中加入清洗液200ul，混匀30秒，放置磁力架上，去除上清，重复此过程3次。
[0151]
11.加入化学发光底物液(化学发光底物溶液)50ul，混匀，室温反应5分钟；
[0152]
12.在化学发光读数仪中进行读数；
[0153]
13.根据已知校准品的浓度与读数值计算得到回归方程，据此计算样品中的恩镰孢菌素含量。
[0154]
14.样品加标回收率的计算公式如下：
[0155]
回收率＝(检测得到的恩廉孢毒素含量/加标的恩廉孢毒素含量)
×
100％
[0156]
变异系数＝标准差/平均数
×
100％。
[0157]
结果如表2所示：可以看出，不同恩镰孢菌素的加标回收率在97％-116％，变异系数在5.4％-12％之间。
[0158]
表2、恩镰孢菌素试剂盒精密度和准确度测试
[0159]
添加浓度(μg/kg)实测浓度(ng/kg)回收率(％)变异系数(％)11.16116121010.21029.610097975.4
[0160]
实施例4：参照实施例3所述方法，利用本发明的试剂盒检测小麦样本中的恩镰孢菌素含量时的交叉反应率
[0161]
交叉反应率指的是本发明的恩镰孢菌素试剂盒识别几种不同的恩镰孢菌素的能力，以交叉反应率指示。
[0162]
检测步骤包括：
[0163]
1.称取200g小麦样本，小钢磨高速粉碎；
[0164]
2.按照50g每份，分成四份按照10μg/kg的终浓度加入四种恩镰孢菌素的标准品溶液，包括恩镰孢菌素a、恩镰孢菌素a1、恩镰孢菌素b和恩镰孢菌素b1；
[0165]
3.取5g粉碎后的样品，加入40％甲醇25ml，剧烈震荡5min，4000rpm离心5min；
[0166]
4.取上清液用去离子水按照1:5(v/v)比例稀释，此即为待检样本；每个待检样本取3个重复，进行检测；
[0167]
5.取化学发光微孔板板条，在微孔中，分别加入50ul样本或者标准品；
[0168]
6.在微孔板中加入50ul磁分离试剂；
[0169]
7.在微孔板中加入40ul恩镰孢菌素-碱性磷酸酶结合物；
[0170]
8.微孔板混匀30秒，在37℃反应30分钟；
[0171]
9.将微孔板放置在磁力架上静置1分钟，去掉上清；
[0172]
10.在微孔板中加入清洗液200ul，混匀30秒，放置磁力架上，去除上清，重复此过程3次；
[0173]
11.加入化学发光底物液50ul，混匀，室温反应5分钟；
[0174]
12.在化学发光读数仪中进行读数；
[0175]
13.根据已知校准品的浓度与读数值计算得到回归方程，据此计算样品中的恩镰孢菌素含量；
[0176]
14.以恩镰孢菌素b为100％，其它恩镰孢菌素的测量值与其比较，计算交叉反应率。
[0177]
检测后可知，本试剂盒与四种恩镰孢菌素的交叉反应率如下：
[0178]
恩镰孢菌素a 73％
[0179]
恩镰孢菌素a1 82％
[0180]
恩镰孢菌素b 100％
[0181]
恩镰孢菌素b1 102％。
[0182]
交叉反应率＝该型别标准品检测值/恩镰孢菌素b的检测值
×
100％。
[0183]
实施例5：本发明试剂盒的检测限及线性范围检
[0184]
检测步骤包括：
[0185]
1.取市售的恩镰孢菌素b标准品，稀释至浓度为200ng/ml；
[0186]
2.将200ng/ml的恩镰孢菌素b溶液，倍比稀释得到浓度为：
[0187]
200ng/ml，100ng/ml，50ng/ml，25ng/ml，12.5ng/ml，6.25ng/ml，3.125ng/ml，
1.5625ng/ml，0.78125ng/ml，0.390625ng/ml，0.1953125ng/ml，0.09765625ng/ml，0.048828125ng/ml，0.024414063ng/ml，0.012207031ng/ml，0.006103516ng/ml，0.003051758ng/ml，0.001525879ng/ml的一系列恩镰孢菌素标准品溶液；以及一个阴性对照，阴性对照取三个重复，阴性对照为不含恩镰孢菌素的溶液；
[0188]
3.取化学发光微孔板板条，在微孔中，分别加入50ul样本上述制备好的标准品；
[0189]
4.在微孔板中加入50ul磁分离试剂；
[0190]
5.在微孔板中加入40ul恩镰孢菌素-碱性磷酸酶结合物；
[0191]
6.微孔板混匀30秒，在37℃反应30分钟；
[0192]
7.将微孔板放置在磁力架上静置1分钟，去掉上清；
[0193]
8.在微孔板中加入清洗液200ul，混匀30秒，放置磁力架上，去除上清，重复此过程3次；
[0194]
9.加入化学发光底物液50ul，混匀，室温反应5分钟；
[0195]
10.在化学发光读数仪中进行读数；
[0196]
11.根据已知校准品的浓度与读数值计算得到标准曲线和回归方程；
[0197]
回归方程为y＝0.219x 0.553
[0198]
检测限lod按照通用的fbi方法计算，检测限lod为0.006ng/ml，定量范围为0.01ng/ml-25ng/ml。
[0199]
对比实验：本发明的试剂盒与当前恩镰孢菌素通用检测方法的比较
[0200]
对比的检测方法为高效液相色谱-串联质谱的检测方法，是目前比较公认的检测恩镰孢菌素的方法。方法参照文献韩小敏等中国食品卫生杂志2017年第29卷第6期。
[0201]
检测方法包括：
[0202]
1.称取100g小麦样本，小钢磨高速粉碎(过200目筛)；
[0203]
2.按照1μg/kg，10μg/kg和100μg/kg的终浓度加入恩镰孢菌素b标准品溶液(市售的恩镰孢菌素b标准品溶液，按照所述比例加入到样品中去)；
[0204]
3.将步骤2加标后的样本，分两份，分别按照不同的检测方法操作：
[0205]
方法一.本发明所指的试剂盒方法
[0206]
操作如下：
[0207]
1)取5g粉碎后的样品(步骤2的产物)加入40％甲醇20ml，剧烈震荡5min，4000rpm离心5min；
[0208]
2)取上清液用去离子水按照1:5(v/v)比例稀释，此即为待检样本；每个待检样本取3个重复，进行检测；
[0209]
3)取化学发光微孔板板条，在微孔中，分别加入50ul待检样本或者标准品(校准品)；
[0210]
4)在微孔板中加入50ul磁分离试剂；
[0211]
5)在微孔板中加入40ul恩镰孢菌素-碱性磷酸酶结合物(酶结合物)；
[0212]
6)微孔板混匀30秒，在37℃反应30分钟；
[0213]
7)将微孔板放置在磁力架上静置1分钟，去掉上清；
[0214]
8)在微孔板中加入清洗液200ul，混匀30秒，放置磁力架上，去除上清，重复此过程3次；
[0215]
9)加入化学发光底物液50ul，混匀，室温反应5分钟；
[0216]
10)在化学发光读数仪中进行读数；
[0217]
11)根据已知校准品的浓度与读数值计算得到回归方程，据此计算样品中的恩镰孢菌素含量；
[0218]
12)样品加标回收率的计算公式如下：
[0219]
回收率＝(检测得到的恩廉孢毒素含量/加标的恩廉孢毒素含量)
×
100％
[0220]
变异系数＝标准差/平均数
×
100％。
[0221]
13)记录整个操作的时间。
[0222]
方法二高效液相色谱-串联质谱法
[0223]
操作步骤如下：
[0224]
1)样本提取
[0225]
称取5.0g样品(精确至0.01g)于50ml刻度离心管中，加入40ml样品提取液(乙腈∶水＝85∶15，v/v)，加盖密封后涡旋混匀60s；
[0226]
180r/min振荡提取30min后，室温静置20min；
[0227]
准确移取10ml上清液于另一50ml刻度离心管，加入20ml水进行稀释，加盖密封并涡旋混匀60s，室温静置20min备用。
[0228]
2)样本净化:
[0229]
spe柱用3ml甲醇预先活化；
[0230]
spe柱用3ml水活化；
[0231]
取4ml最终稀释后的样品提取液全部通过上述spe柱；
[0232]
上述spe柱用3ml 10％乙腈水溶液淋洗；
[0233]
上述spe柱用3ml 50％乙腈水溶液淋洗并抽干；
[0234]
上述spe柱最后用2ml 90％乙腈水溶液洗脱毒素，抽干spe柱并收集洗脱液，涡旋混匀后备用。
[0235]
3)仪器检测
[0236]
仪器条件
[0237]
质谱:选择电喷雾正离子扫描(esi )、多反应监测(mrm)模式，驻留时间为200ms，离子源参数如下：
[0238]
参数正离子模式
[0239]
气帘气/kpa 206
[0240]
碰撞气/kpa 中速
[0241]
离子化电压/v 5 500
[0242]
去溶剂温度/℃ 550
[0243]
雾化气/kpa 552
[0244]
辅助加热气/kpa 552
[0245]
注:气帘气、雾化气、辅助加热气分别为30、80、80psi
[0246]
色谱:色谱柱:waters acquity uplc behc18柱(2.1mm
×
50mm，1.7μm)，
[0247]
柱温35℃，样品室温度15℃，
[0248]
进样体积5μl，流速0.2ml/min。
[0249]
流动相a为含2mmol/l乙酸铵的水溶液，流动相b为乙腈。
[0250]
梯度洗脱程序:0～2min 100％a，
[0251]
2～3min 100％a～40％a，
[0252]
3～19min 40％a ～30％a，
[0253]
19～20min 30％a～100％a，
[0254]
20～20.1min 100％a。
[0255]
结果计算。
[0256]
加标回收率(％)＝峰面积(加标样品)/峰面积(基质匹配标准品)
×
100％
[0257]
4.结果：
[0258]
4.1回收率比较：
[0259]
两种方法加标回收率结果对比见表3
[0260]
表3、不同方法检测恩镰孢菌素的加标回收率比较
[0261][0262][0263]
从上述结果可以看出，就加标回收率而言，本发明的方法与目前常用的方法基本相当，本发明试剂盒的加标回收率要更优于目前的方法。但二者都在可接受的范围内(80-120％)。
[0264]
4.2检测时间比较
[0265]
4.2.1单个样本检测时间比较
[0266]
高效液相色谱-串联质谱法：
[0267]
样本前处理的时间约为120min，高效液相色谱-串联质谱检测的时间约为30-40min。因此，单个样本的总体操作时间超过150min。
[0268]
本发明所述的试剂盒方法：
[0269]
样本前处理时间约10min，检测时间约40min，单个样本总体操作时间约为50min。
[0270]
4.2.2多个样本检测时间比较：
[0271]
按照处理80个样本计算。
[0272]
高效液相色谱-串联质谱法：
[0273]
单个样本前处理时间为120min，因为高效液相色谱-串联质谱法的样品前处理需要通过spe柱净化，不易实现并行操作，因此样本前处理时间需要叠加。80个样本前处理需要9600min；
[0274]
高效液相色谱-串联质谱法检测时间，因为检测只能是一个样本一个样本按照顺序检测，因此检测时间为2400min-3200min；
[0275]
80个样本总体检测时间为12000min-12800min，约为200h-213h。
[0276]
本发明的试剂盒：
[0277]
样本前处理时间：
[0278]
单个样本的处理时间为10min，如果通过并行操作，则80个样本处理时间为10min，如果不通过并行操作，则总体时间为800min。
[0279]
检测时间：
[0280]
由于本发明所述的试剂盒可以通过市售的96孔板实现多样本平行检测，因此80个样本的检测时间为40min。
[0281]
总体的检测时间：
[0282]
样本前处理加上检测时间，80个样本共需要50-840min，最多需要840min，也就是14小时。
[0283]
综上所述，如果同时检测80个样本，高效液相色谱-串联质谱法的检测试剂为200h-213h，而本发明所述的试剂盒的检测所需要的时间为14小时。时间优势非常明显。
[0284]
如果样本量扩大，时间优势会更加明显。
[0285]
发明人在发明过程中，还进行过如下对比：
[0286]
对比例1-1、将实施例2中的稳定剂nacl的浓度由0.15mol/l改成0.075mol/l，其余等同于实施例2。
[0287]
对比例1-2、将实施例2中的稳定剂nacl的浓度由0.15mol/l改成0.3mol/l，其余等同于实施例2。
[0288]
对比例2-1、将实施例2中的加入“2.5％戊二醛20ul”改成1.25％戊二醛20ul”，其余等同于实施例2。
[0289]
对比例2-2、将实施例2中的加入“2.5％戊二醛20ul”改成2.5％戊二醛20ul”，其余等同于实施例2。
[0290]
针对恩镰孢菌素a、恩镰孢菌素a1、恩镰孢菌素b、恩镰孢菌素b1，上述4个案例的交叉反应率均不如本发明，最高交叉反应率仅为约70％。
[0291]
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。