一种烟叶中原花青素含量的检测方法与流程

1.本发明涉及烟叶检测技术领域，具体涉及一种烟叶中原花青素含量的检测方法。


背景技术：

2.原花青素是植物中一类重要的酚类次生代谢产物，具有较强的抗氧化性，在植物的生物及非生物胁迫反应过程中，可以有效地清除活性氧自由基，减少活性氧自由基对于组织细胞的伤害，提高植物的抗逆性。研究发现在烟草植株中过表达茶叶中原花青素合成途径相关基因(csdfr,csanr)，能够显著提高转基因烟草的原花青素含量，同时提高转基因烟草清除活性氧自由基的能力，以及提高烟草叶片抵御斜纹贪夜蛾的能力(kumar et al.,2013)。
3.原花青素是由包括儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯和没食子酸等单体，以及这些单体通过c4-c6、c4-c8键结合而成的低聚体和高聚体等组成的混合物。目前，常用的分析方法有紫外分光光度法、高效液相色谱法和高效液相色谱－质谱法，但是这些分析方法测定茶叶中的原花青素都有较大的弊端，如紫外分光光度法只能测定原花青素的总成分，专属性不强；高效液相色谱法不能区分与原花青素结构类似的多酚类物质；由于烟叶基质较为复杂，高效液相色谱－质谱分析时存在基质干扰强，影响方法的准确性和灵敏度。目前，有关烟叶中原花青素的分析尚未见报道。
4.鉴于上述情况，有必要研究一种烟叶中原花青素含量的检测方法以解决上述技术问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种烟叶中原花青素含量的检测方法，旨在对烟叶原花青素中的儿茶素、表儿茶素、原花青素b1和原花青素b2进行准确、高灵敏度的检测。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.本发明提出一种烟叶中原花青素含量的检测方法，所述检测方法为可同时检测烟叶原花青素中的儿茶素、表儿茶素、原花青素b1和原花青素b2，具体包括以下步骤：
8.s1、样品预处理：将新鲜的烟叶样品放入研钵，加液氮研磨粉碎，将研磨好的样品转入冻干机进行冷冻干燥，得到待测样品，将待测样品置于冰箱保存待用；
9.s2、提取：称取步骤s1中的待测样品0.05g至离心管中，加入乙腈水溶液，超声提取20～30min后离心分离，得上清液；
10.s3、净化：移取步骤s2中的上清液至离心管中，加入分散吸附剂旋涡振荡2～5min，二次离心分离，得净化后的上清液；吸取净化后的上清液过0.22μm有机相滤膜后放入装有内插管的进样瓶中待检；
11.s4、原花青素的检测：利用超高效液相色谱-串联质谱法检测步骤s3中的待检样品。
12.优选地，所述步骤s4中利用超高效液相色谱-串联质谱检测时，所述超高效液相色
谱的色谱条件为：色谱柱：acquity uplc beh c18(10mm
×
2.1mm，1.7μm)；柱温：25℃；进样量：2μl；流速：0.35ml/min，流动相a：0.2％乙酸甲醇，流动相b：0.2％乙酸水，梯度洗脱：0～1min，5％a；1～3min，5％～25％a；3～5min：25％a；5～9min:25％～80％a；9～11min：80％a；11～11.1min:5％a；11.1～13min：5％a；
13.所述质谱检测的分析条件为：离子源：esi；扫描方式：负离子模式；气帘气压力：40psi；雾化气压力：60psi；辅助气压力：50psi；离子源温度：600℃；喷雾电压：-4000v，采用多反应监测mrm模式。
14.优选地，所述质谱检测的参数为：
[0015][0016]
优选地，所述步骤s4中利用超高效液相色谱-串联质谱法进行检测时，标准溶液的配制为：称取儿茶素、表儿茶素、原花青素b1和原花青素b2标准品至棕色容量瓶中，溶解后定容，用乙腈配制成1mg/ml的标准储备液，于-15～-25℃冰箱中避光保存待用。
[0017]
优选地，所述步骤s1中冰箱温度为4℃。
[0018]
优选地，所述步骤s2中的乙腈为80％的乙腈，加入量为1ml；所述离心分离为以5000～6000r/min离心3～5min。
[0019]
优选地，所述步骤s3中的二次离心分离为以5000～6000r/min离心分离3～5min。
[0020]
优选地，所述步骤s3中的移取的上清液为0.5～1.5ml，所述分散吸附剂为carbon分散吸附剂，加入量为25～100mg；所述内插管为250μl。
[0021]
综上所述，相比于现有技术，本发明的有益效果在于：
[0022]
1、本发明采用快速、简单、可靠的提取方法对烟草样品中原花青素进行提取，通过加入carbon分散吸附剂去除基质效应，采用高选择性、高灵敏度的超高效液相色谱法测定烟叶中原花青素的残留量；相比现有技术，本发明的检测方法具有样品处理简便、检测灵敏度和准确性更高的特点，能完全满足原花青素检测要求。
[0023]
2、本发明的检测方法简单易行，样品的提取步骤高效、安全、成本低，样品的净化步骤简单快速，净化效果及回收率高，通过在检测过程中对样品处理方法进行优化以及检测中色谱条件的控制，实现了烟草中原花青素的准确、高灵敏度检测。
[0024]
3、本发明的检测方法对烟叶中原花青素的单体和聚体分离效果好，采用多反应监测扫描，具有高选择性和高灵敏度，适用于烟叶中原花青素的准确检测。
附图说明
[0025]
图1为本发明的标准曲线图，其中a图为儿茶素、b图为表儿茶素、c图原花青素b1和d图为原花青素b2；
[0026]
图2为本发明4种原花青素标准品的总离子流图，其中1为原花青素b1、2为儿茶素、
3为原花青素b2、4为表儿茶素；
[0027]
图3为本发明烟叶样品中4种原花青素的总离子流图，其中1为原花青素b1、2为儿茶素、3为原花青素b2、4为表儿茶素；
[0028]
图4为本发明添加不同carbon分散吸附剂的净化效果图。
具体实施方式
[0029]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有开展创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围
[0030]
对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为授权说明书的一部分。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
[0031]
本具体实施方式提供的一种烟叶中原花青素含量的检测方法，可同时对烟叶原花青素中的儿茶素、表儿茶素、原花青素b1和原花青素b2进行准确、高灵敏度的检测，具体步骤为：
[0032]
s1、样品预处理：将新鲜的烟叶样品放入研钵，加液氮研磨粉碎，将研磨好的样品转入冻干机进行冷冻干燥，得到待测样品，将待测样品置于4℃冰箱保存待用；
[0033]
s2、提取：称取步骤s1中的待测样品0.05g至1.5ml离心管中，加入80％乙腈1ml，超声提取20～30min后，以5000～6000r/min离心分离3～5min，得上清液；
[0034]
s3、净化：移取步骤s2中的上清液0.5ml至1.5ml离心管中，加入25mgcarbon分散吸附剂旋涡振荡2～5min，以5000～6000r/min二次离心分离3～5min，得净化后的上清液；吸取净化后的上清液过0.22μm有机相滤膜后放入装有内插管的进样瓶中待检；
[0035]
s4、原花青素的检测：利用超高效液相色谱-串联质谱法检测步骤s3中的待检样品。
[0036]
本具体实施方式提供的烟叶中原花青素含量的检测方法，在步骤s4中，利用超高效液相色谱-串联质谱检测时，超高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱：acquityuplc beh c18(10mm
×
2.1mm，1.7μm)；柱温：25℃；进样量：2μl；流速：0.35ml/min，流动相a：0.2％乙酸甲醇，流动相b：0.2％乙酸水，梯度洗脱：0～1min，5％a；1～3min，5％～25％a；3～5min：25％a；5～9min:25％～80％a；9～11min：80％a；11～11.1min:5％a；11.1～13min：5％a；
[0037]
本具体实施方式提供的烟叶中原花青素含量的检测方法，在步骤s4中，利用质谱检测的分析条件为：离子源：esi；扫描方式：负离子模式；气帘气压力：40psi；雾化气压力：60psi；辅助气压力：50psi；离子源温度：600℃；喷雾电压：-4000v，采用多反应监测mrm模式。
[0038]
本具体实施方式提供的烟叶中原花青素含量的检测方法，在步骤s4中，质谱检测的采集参数如表1所示：
[0039]
表1
[0040][0041]
本具体实施方式提供的烟叶中原花青素含量的检测方法，在步骤s4中，利用超高效液相色谱-串联质谱法进行检测时，标准溶液的配制为：称取儿茶素、表儿茶素、原花青素b1和原花青素b2标准品至棕色容量瓶中，溶解后定容，用乙腈配制成1mg/ml的标准储备液，于-15～-25℃冰箱中避光保存待用。
[0042]
实施例2：
[0043]
本具体实施方式为实施例1检测方法获得的检测结果与分析
[0044]
(1)线性范围和检出限(标准曲线的制作)：
[0045]
用乙腈将原花青素标准储备液配分别制成0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5系列质量浓度的原花青素标准工作溶液，以峰面积对各浓度进行线性回归，得到标准曲线，标准曲线图如图1所示。如图1所示，标准曲线在4种原花青素浓度为0.01～0.5mg/l范围内呈良好线性，相关系数r2大于0.999，分别以3倍信噪比(s/n)来确定其检出限。儿茶素、表儿茶素、原花青素b1和原花青素b2的线性方程、相关系数、检出限如表2所示：
[0046]
表2
[0047][0048]
基于表2中的线性方程、相关系数和检出限，通过外标法定量得到
[0049]
从而通过计算获得烟叶中的儿茶素、表儿茶素、原花青素b1和原花青素b2的含量。
[0050]
(2)超高效液相色谱-串联质谱法检测
[0051]
使用超高效液相色谱-串联质谱对标准样品和待检烟叶样品进行检测得到各样品的总离子流图。儿茶素、表儿茶素、原花青素b1和原花青素b2标准品的总离子流图如图2所示；烟叶样品中儿茶素、表儿茶素、原花青素b1和原花青素b2素的总离子流图如图3所示。
[0052]
(3)回收试验：
[0053]
取实施例1中步骤s1中冻干后的烟叶样品，分别加入3种不同浓度的儿茶素、表儿茶素、原花青素b1和原花青素b2的标准品溶液，按上述方法进行前处理和上机检测。计算该方法下测定4种原花青素的方法回收率，确认本检测方法的有效性，回收率见表3。
[0054]
表3
[0055][0056][0057]
本发明的烟叶中4种原花青素含量的检测方法，通过将新鲜烟叶粉碎冻干后采用乙腈水进行提取，加入carbon分散吸附剂净化后进样分析，采用超高效液相色谱-串联质谱负离子多反应监测模式检测，外标法定量；结果表明，4种原花青素在0.001-0.5mg/l范围线性关系良好，相关系数(r2)大于0.999，检出限为0.01-0.04mg/kg，回收率为94.5％～111.2％。该检测方法样品前处理简单、快速，灵敏度、准确度和精密度较高，适用于烟叶中4种原花青素的检测。通过采取6个烟叶样品进行检测，检测方法如上述所示，烟叶样品检测结果如表4所示。
[0058]
表4
[0059]
[0060][0061]
实施例3：
[0062]
本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤s3中的移取的上清液为1ml；carbon分散吸附剂的加入量为75mg。
[0063]
实施例4：
[0064]
本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤s3中的移取的上清液为1.5ml；carbon分散吸附剂的加入量为100mg。
[0065]
添加不同carbon分散吸附剂的净化效果如图4所示，结果表明，加入量为25～100mg时，净化效果最佳。
[0066]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。