猪圆环病毒3型Cap重组蛋白、其编码基因及在ELISA抗体检测中的应用的制作方法

猪圆环病毒3型cap重组蛋白、其编码基因及在elisa抗体检测中的应用
1.本技术是申请号为“201910046124.6”、申请日为“2019年1月18日”、发明名称为“猪圆环病毒3型cap重组蛋白及其编码基因和应用”的发明创造的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及一种猪圆环病毒3型cap重组蛋白及编码该蛋白的基因，还涉及采用所得的猪圆环病毒3型cap重组蛋白进行pcv3间接elisa抗体检测的应用。


背景技术：

3.猪圆环病毒病由猪圆环病毒引起，猪圆环病毒(pcv)分为三个血清型，pcv1、pcv2以及pcv3。普遍认为pcv1对动物没有致病性。目前，病毒感染特性和致病性研究最清楚的是 pcv2，pcv2对养猪业造成的危害十分严重，可以引起圆环病毒相关疾病(pcvad)，造成免疫抑制。pcv2主要有两个阅读框：orf1和orf2，orf1表达rep蛋白和剪切体rep’，orf2编码病毒的cap蛋白，cap蛋白构成病毒核衣壳的主要成分，是病毒的主要结构蛋白，决定病毒的抗原性，还可以自我组装形成病毒样颗粒。orf2基因是疫苗开发和病原检测主要的靶蛋白，同时也是各亚型之间存在主要差异的基因。2016年美国学者rachel palinski等报道了一种新型病毒pcv3，随后该病毒在亚洲、美洲、欧洲等很多国家和地区出现。pcv3基因组长 2000bp，orf1编码rep蛋白，长度297aa(氨基酸)，orf2编码cap蛋白，长度214aa(氨基酸)。pcv3可以引起pdns，并且表现出与pcv2类似的繁殖障碍、多系统性炎症等症状。湛洋对pcv3 cap蛋白结构进行了分析，发现其与pcv2 cap蛋白结构不存在共同的线性表位。还有研究表明，pcv3 orf2基因和pcv2的orf2基因表现出较大的差异，同源性仅37％左右，因此预测，pcv2疫苗对pcv3可能没有交叉保护作用。
4.基于以上原因，目前pcv2疫苗以及pcv2的检测方法都不能直接适用于pcv3，需要针对 pcv3orf2基因的特异性研究适合它的检测方法和疫苗。临床上常使用血清学监测的方法了解抗体或者病原在动物体内的分布情况。间接免疫荧光实验和免疫过氧化物酶单层细胞试验操作复杂，成本昂贵，对设备要求高，不适用于临床大规模检测。elisa方法不仅可以简便地对猪群感染情况进行监测，还可以用于评价疫苗的免疫效果，在elisa方法中，包被抗原的浓度及纯度是影响检测结果敏感性和特异性的关键，因此研究pcv3 cap蛋白的可溶性表达及纯化，得到适合于pcv3检测的elisa方法具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的之一是提供一种猪圆环病毒3型cap重组蛋白的编码基因，该编码基因是将pcv3 orf2(开放式阅读框)基因的表达第1-120位氨基酸或第60-120位氨基酸的基因片段删除后得到的，该基因成功实现了猪圆环病毒3型cap重组蛋白的可溶性表达，即实现了 pcv3 cap重组蛋白的可溶性表达。
6.pcv orf2基因编码cap蛋白，cap蛋白是该病毒的重要结构蛋白，决定了病毒的抗
原性，是疫苗免疫靶向的主要抗原。大肠杆菌表达系统具有目的蛋白表达效率高、操作简单、成本低等特点，其缺点是目的基因性质容易影响载体的表达，特别是目的基因的跨膜区、信号肽，可能使目的蛋白无法表达。本发明经过研究，通过将疏水性较强、抗原性较弱的pcv3 orf2 基因的表达第1-120位氨基酸或第60-120位氨基酸的基因片段截短，实现了目的蛋白高效表达，而且，目的蛋白呈可溶性表达。目的蛋白基因的末端融合表达his标签，可利于采用镍柱亲和层析纯化目的蛋白。
7.进一步的，本发明猪圆环病毒3型cap重组蛋白的编码基因是将pcv3 orf2基因中表达第1-120位氨基酸片段或第60-120位氨基酸片段的基因片段删除而得。该猪圆环病毒3型 cap重组蛋白的编码基因具有如seq id no.1或seq id no.2所示的基因序列，seq id no.1 是表达截短第1-120位aa(氨基酸)片段的序列，seq id no.2是表达截短第60-120位aa 的序列。
8.进一步的，本发明还提供了一种重组质粒，该重组质粒含有上述的猪圆环病毒3型cap 重组蛋白的编码基因。优选的，该重组质粒是由上述猪圆环病毒3型cap重组蛋白的编码基因和pet32a载体重组而得。
9.本发明的另一目的是提供一种猪圆环病毒3型cap重组蛋白，该重组蛋白呈可溶性表达，可与his标签抗体结合，便于纯化和制备。该重组蛋白与猪圆环病毒3型cap蛋白相比缺少了第1-120位aa或缺少了第60-120位aa。
10.进一步的，该猪圆环病毒3型cap重组蛋白由上述重组质粒表达而得。具体的，是通过将上述重组质粒转化至rosseta感受态细胞，然后iptg(异丙基硫代半乳糖苷，isopropyl β-d-thiogalactoside)诱导表达而得。
11.进一步的，该猪圆环病毒3型cap重组蛋白的氨基酸序列如seq id no.3或seq id no.4 所示。其中，seq id no.3所示的氨基酸序列是缺失第1-120位aa的氨基酸序列，seq id no.4 所示的氨基酸序列是缺失第60-120位aa的氨基酸序列。
12.进一步的，纯化的猪圆环病毒3型cap重组蛋白的制备方法如下：
13.(1)将重组质粒转化至rosseta感受态细胞，挑取单菌落接种到5～10ml lb液体培养基中，37℃培养过夜；
14.(2)以1:100的体积比将步骤(1)培养得到的lb液体培养基接种到新的lb培养基中，当od
600
值达到0.6～0.8时，加入终浓度为1.0mmol/l的iptg，于37℃条件下培养4h，得培养液；
15.(3)将所得培养液离心，收集菌体，所得菌体使用pbs重悬后进行超声波裂解，离心收集上清液，即得猪圆环病毒3型cap重组蛋白；
16.(4)使用亲和层析的方法纯化所得猪圆环病毒3型cap重组蛋白，得纯化的猪圆环病毒 3型cap重组蛋白。
17.本发明的另一目的是提供一种pcv3猪多克隆抗体，该pcv3猪多克隆抗体按照下述方法制得：
18.(1)以纯化的猪圆环病毒3型cap重组蛋白为抗原，用其对猪进行免疫，每隔3周加强免疫一次；
19.(2)待猪血清中抗体的效价大于1:10000时取猪血，分离血清，将血清离心后取上清液，即为pcv3猪多克隆抗体。
20.进一步的，制备pcv3猪多克隆抗体时，猪圆环病毒3型cap重组蛋白(简称pcv3 cap 重组蛋白，下同)进行以下处理后再进行免疫：将纯化的猪圆环病毒3型cap重组蛋白先用 pbs稀释成2mg/ml，然后与等体积的isa-206佐剂混合后充分乳化，然后再对猪进行免疫。
21.进一步的，制备pcv3猪多克隆抗体时，每头猪的免疫剂量为1mg猪圆环病毒3型cap重组蛋白。
22.本发明的另一目的是提供一种pcv3间接elisa抗体检测试剂盒，该试剂盒包括包被上述pcv3 cap重组蛋白的酶标板。
23.本发明的另一目的是提供一种pcv3的间接elisa抗体检测方法，该方法包括采用纯化的pcv3 cap重组蛋白包被酶标板的步骤。
24.进一步的，pcv3 cap重组蛋白的包被浓度优选为4μg/ml；包被方式优选为：37℃包被 2h后4℃包被过夜。
25.进一步的，除了采用本发明特有的pcv3 cap重组蛋白包被酶标板外，所述间接elisa抗体检测方法的步骤均采用现有技术中常规的步骤，只是每一步骤所用的条件经过了本发明的优化。例如，本发明方法所用封闭液优选为5wt％脱脂乳、所用血清稀释倍数优选为1:100、酶标抗体稀释度优选为1:10000等。
26.本发明中相关术语的说明及解释
27.在本发明中，除非另有说明，否则所用的科学和技术名词具有本领域技术人员通常理解的含义。并且，本文中所用的、细胞培养、细胞转化、质粒重组、融合pcr的方法、免疫学实验、多克隆抗体制备方法、间接elisa抗体检测方法等技术都是本领域已经有报道的技术，其步骤可以采用现有技术中公开的常规步骤进行。同时，为了更好的理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
28.根据本发明，所述猪圆环病毒3型cap重组蛋白的编码基因指的是编码猪圆环病毒病3型 cap重组蛋白的基因，可以简称为编码基因、截短的3cap基因、pcv3 cap重组蛋白的编码基因。
29.根据本发明，所述猪圆环病毒3型cap重组蛋白指的是猪圆环病毒3型cap重组蛋白的编码基因可溶性表达所得的蛋白，可以简称为重组蛋白、3cap重组蛋白、cap重组蛋白、pcv3 cap重组蛋白。
30.根据本发明，所述pcv3猪多克隆抗体，指的是采用纯化的猪圆环病毒3型cap重组蛋白免疫猪所得的抗体，简称多克隆抗体。
31.本发明采用pcr方法将pcv3 cap基因中表达第1-120位aa或第60-120位aa的基因片段删除，得到了pcv3 cap重组蛋白的编码基因，将该编码基因克隆至大肠杆菌表达质粒 pet32a，构建获得重组质粒。该重组质粒再转化至rosseta感受态细胞，经iptg诱导表达，可以得到pcv3 cap重组蛋白。该蛋白呈可溶性表达，可与his标签抗体结合，采用亲和层析方法便于纯化。采用该重组蛋白对猪进行免疫，可以得到多克隆抗体，该多克隆抗体效价高，与pcv3有相似的抗原性。将pcv3 cap重组蛋白包被酶标板，建立了pcv3间接elisa抗体检测方法，该检测方法敏感性、特异性和重复性较好，采用该方法回溯性调查了2013～2017 年pcv3抗体在猪群中的分布情况，结果可见我国2013年～2017年pcv3抗体阳性率呈上升趋势，2017年，阳性率达75.9％，为该病防控提供了重要依据。
附图说明
32.图1为重组蛋白sds-page及western blot分析图；其中图1a为3cap/δ1-120重组蛋白的sds-page及western blot分析图，m为蛋白marker，1为整个重组大肠杆菌，2为重组菌裂解液上清，3为重组菌裂解液沉淀，4为大肠杆菌对照；图1b为3cap/δ60-120重组蛋白的sds-page及western blot分析图，m为蛋白marker，1为整个重组大肠杆菌，2为重组菌裂解液上清，3为重组菌裂解液沉淀，4为大肠杆菌对照。
33.图2为3cap/δ1-120重组蛋白的纯化图；其中，m为蛋白marker，1为未纯化的蛋白， 2为流穿蛋白，3-5为洗掉的蛋白，6为洗脱蛋白。
具体实施方式
34.下面通过附图和具体的实施方式对本发明进行进一步的解释和说明，并对本发明所得可溶性蛋白的免疫性能进行验证。下述说明仅是示例性的，并不对其保护范围进行限定。
35.实施例1
36.1材料与方法
37.1.1主要试剂与材料
38.大肠杆菌表达载体pet32a，大肠杆菌菌株e.coli dh5α、rosseta感受态细胞均由本实验室购置保存。各种限制性内切酶以及t4 dna连接酶购自诺唯赞生物公司；质粒提取试剂盒购自biomiga公司；dna胶回收试剂盒购自bioflux公司；spa-hrp、羊抗小鼠igg-hrp购自武汉博士德生物工程公司；小鼠抗his-tag标签单克隆抗体购自abmart；iptg购自大连宝生物工程有限公司；树脂ni sepharose 6fast flow(17-5318-01)由ge healthcare生产。其余化学试剂均为国产分析纯。其他下文提到但此处并无记载的质粒、细胞或试剂，均能从市场中购买得到。
39.参考血清：prrsv、prv、pcv2，csfv、hps、emcv和fmdv阳性血清，本实验室保存。pcv3 阴性血清和阳性血清，本实验室保存。
40.猪血清样品：2013～2017年猪临床血清3868份，来自山东、江苏、安徽、浙江、河南、山西、福建、四川、河北、上海共10个省市，保存于-20℃冰箱。
41.1.2基因合成与引物设计
42.1.2.1 cap基因截短
43.根据pcv3-us/mo2015(genbank:kx778720.1)cap的基因序列642bp,编码214个氨基酸，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成重组质粒pmd19t-3cap，作为基因扩增的模板。使用 protean软件对pcv3 cap蛋白的氨基酸序列进行抗原性和亲水性分析，结果显示，第1-120 位aa和60-120位aa的抗原性和亲水性较低，目的基因确定将cap基因中表达第1-120位氨基酸和60-120位氨基酸的基因片段分别删除，获得两个目的基因片段。定义截短1-120aa片段后的pcv3 cap基因为3cap/δ1-120基因，定义截短60-120aa片段后的pcv3 cap基因为 3cap/δ60-120基因，这两个基因片段表达得到的氨基酸序列分别为pcv3 cap蛋白截短1-120 位aa的氨基酸序列和pcv3 cap蛋白截短60-120位aa的氨基酸序列。
44.1.2.2引物设计
45.根据合成的cap基因模板设计3cap/δ1-120基因和3cap/δ60-120基因的引物，分
别在上下游引物中添加bamhi和xhoi两个酶切位点，3cap/δ1-120基因仅通过一次pcr扩增即可得到，3cap/δ60-120基因需要将截去60-120aa后的两个基因片段添加linker(ggatct) 序列然后使用融合pcr的方法进行连接得到。引物序列见表1。
46.表1 pcr引物序列
[0047][0048]
注：δ1-120-f表示3cap/δ1-120基因的上游引物，δ1-120-r表示3cap/δ1-120基因的下游引物，δ60-120f1表示截去60-120aa片段后得到的前一段基因的上游引物，δ60-120r1 表示截去60-120aa片段后得到的前一段基因的下游引物，δ60-120f2表示截去60-120aa 片段后得到的后一段基因的上游引物，δ60-120r2表示截去60-120aa片段后得到的后一段基因的下游引物。
[0049]
1.2重组表达质粒的构建
[0050]
以pmd19t-3cap为模板，以上述表1的引物为引物，扩增截短后的3cap基因，即 3cap/δ1-120基因和3cap/δ60-120基因。pcr扩增体系：2
×
taq mix 12.5μl，pmd19t-3cap 质粒1μl，上下游引物各1μl，ddh2o补至25μl。pcr反应条件：95℃预变性5min；95 ℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环；72℃10min。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。3cap/δ1-120基因一步扩增即可完成。3cap/δ60-120基因则需要分别扩增出前后两个片段1和片段2后，切胶回收扩增产物，再以等摩尔比的两个片段为模板，以片段1上游引物和片段2的下游引物进行融合pcr，得到3cap/δ60-120基因。
[0051]
pcr产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化，连接pmd19-t载体并于e.coli dh5α感受态细胞中进行扩繁，bamhi和xhoi双酶切阳性t载体，选取目的片段与pet-32a连接。将提取的重组质粒进行双酶切鉴定，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定正确后质粒送至生物公司测序。构建的重组质粒分别命名为pet-cap/δ1-120和pet-cap/δ60-120。
[0052]
1.3重组蛋白的诱导表达
[0053]
将重组质粒转化rosseta感受态细胞，挑取单菌落接种到5～10ml lb液体培养基中，37℃培养过夜，得菌液。以1:100的体积比将菌液接种到新的lb培养液中进行培养，当od
600
值达到0.6～0.8时，加入终浓度为1.0mmol/l的iptg，于37℃条件下培养4h，得重组rosseta，同时设立重组rosseta非诱导组和空载体rosseta诱导组作为对照。培养后，12000g离心 1min，收集菌体，使用400μl pbs重悬，超声波裂解细菌，离心收集上清，加入100μl 1
×
sds-page和western-blot检测，其中一抗为小鼠抗his-tag标签单克隆抗体(abmart)，室温孵育2h，用ecl化学发光液检测目的蛋白表达情况。
[0054]
1.4目的蛋白的纯化
[0055]
收集含有目的蛋白的样品，使用镍柱亲和层析的方法纯化蛋白，用由裂解缓冲液按梯度稀释的咪唑溶液进行纯化洗脱，并对产物进行sds-page鉴定，使用quantity one软件对蛋白纯化的结果进行分析，计算得到蛋白的纯度。
[0056]
1.5 pcv3猪阳性血清抗体制备
[0057]
1.5.1猪的免疫
[0058]
挑选血清中pcv3抗原检测和抗体检测均为阴性的猪，使用纯化的3cap/δ1-120蛋白免疫。免疫方法为：将纯化后的3cap/δ1-120蛋白用pbs稀释成2mg/ml，与等体积的isa-206 佐剂混合后充分乳化，然后对猪进行免疫，免疫剂量为1ml(1mg)/头，免疫方式为颈部肌肉注射。每隔3周加强免疫一次，每周前腔静脉采血，测定抗体效价。效价大于1:10000时杀猪取血，血液于37℃放置30min后4℃静置1h，析出的血清4000rpm 4℃离心5min，上清即为制备的pcv3多克隆抗体(即pcv3猪阳性血清抗体)。分装后-20℃保存。
[0059]
1.5.2 pcv3猪多克隆抗体效价测定
[0060]
以纯化的3cap/δ1-120蛋白(1μg/ml)为包被抗原，37℃孵育2h浓度包被elisa板， pbst洗涤3次(3min
·
次-1
，下同)后用5％的脱脂乳200μl/孔，37℃封闭2h，pbst洗涤3次，加入上述制备的pcv3多克隆抗体，100μl/孔，37℃作用1h，pbst洗涤3次，加入spa-hrp(1:10000)，100μl/孔，37℃作用45min，pbst洗涤3次后加入tmb显色底物，显色10min后加入终止液，酶标仪检测od450值。以s/n≥2.1判定为阳性，对应的最高稀释度为血清效价。
[0061]
1.6间接elisa方法的建立
[0062]
1.6.1 elisa操作步骤
[0063]
使用cbs将纯化的cap/δ1-120稀释为8μg/ml，再依次二倍比稀释至4μg/ml，37℃孵育2h后4℃过夜包被酶标板；用含有0.05wt％吐温的0.05m pbs(简称pbst，ph7.2)洗板 3次，每次5min；拍干后加入含5wt％脱脂乳的pbst封闭，200μl/孔，37℃，2h；pbst洗板；加入1:100稀释的阳性血清和阴性血清，100μl/孔，37℃，1h；pbst洗板；加入1:10000 稀释的hrp-spa，100μl/孔，37℃孵育1h；pbst洗板；加入tmb底物反应液，100μl/孔， 37℃底物反应10min；加入2m h2so4，50μl/孔，终止底物反应后读取od450值。以p/n≥2.1 判定为阳性，对应的最高稀释度为血清效价。或按下列各式计算其s/p值，s/p＝(样品值-阴性值)/(阳性值-阴性值)，判定标准为：当s/p≥0.46判为阳性，s/p＜0.33判为阴性，两者之间为可疑。
[0064]
1.6.2 pcv3抗体阴阳性血清的选择
[0065]
选择实验室保存的3份对pcv3抗原pcr检测结果为阳性的猪血清，作为阳性对照，选择一份实验室保存的pcv3抗原pcr检测结果为阴性的猪血清，作为阴性对照。
[0066]
1.6.3间接elisa方法反应条件的优化
[0067]
1.6.3.1抗原最佳包被浓度的选择
[0068]
以0.05mol/l的碳酸盐缓冲液(cbs，ph9.6)为抗原稀释液，分别以0.25μg/ml、 0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml、4.0μg/ml、8.0μg/ml的抗原浓度包被，其余方法同 1.6.1，p/n值最大的抗原浓度为最佳抗原包被浓度。
[0069]
1.6.3.2最佳抗原包被时间的选择
[0070]
以确定的最佳抗原包被浓度包被酶标板，包被方法分别为37℃2h、4℃过夜、37℃2h 后4℃过夜，其他步骤同1.6.1，p/n值最大的包被时间为最佳抗原包被时间。
[0071]
1.6.3.3最佳封闭液和封闭时间的选择
[0072]
以优化的包被方法包被酶标板，分别以1％bsa，5％脱脂乳和2％明胶进行封闭，其余条件同1.6.1，取p/n值最大的封闭液为最佳封闭液。使用最佳封闭液，分别于37℃封闭1h、2h、 3h，确定最佳封闭时间。
[0073]
1.6.3.4最佳血清稀释度和作用时间的选择
[0074]
分别将阴阳性血清做1:50、1:100、1:200、1:400稀释，进行间接elisa实验，其余条件同1.6.1，比较各组血清od450nm值和p/n值，p/n最大的稀释度为最佳血清稀释度。将血清按最佳稀释度稀释后，分别在37℃作用0.5h、1h、1.5h和2h，p/n最大的时间为最佳血清反应时间。
[0075]
1.6.3.5最佳酶标抗体稀释度和作用时间的选择
[0076]
分别将酶标物spa-hrp做1:10000，1:15000，1:20000和1:30000稀释，其余条件同1.6.1，比较各组血清od值和p/n值，p/n最大的稀释度为最佳酶标物稀释度。将酶标物按最佳稀释度稀释后，分别在37℃作用0.5h、1h、1.5h，p/n最大的作用时间为最佳酶标物作用时间。
[0077]
1.6.3.6最佳底物反应时间的选择
[0078]
以上述优化的最佳条件进行elisa实验，37℃分别底物反应5min，10min，15min，20min， 2mol/l h2so4终止底物反应，比较各组血清od值和p/n值，选p/n最大的时间为最佳底物反应时间。
[0079]
1.6.4临界值的确定
[0080]
检测30次标准阴阳性血清，得到阴性最高od450 n
max
＝0.23，平均值阳性最低p
min
＝0.93，平均值因此，实验成立的条件为c
p
≥0.93，cn≤0.23。
[0081]
随机挑取120份临床检测s/n＜2.1的血清，作为阴性血清。分别计算其s/p值，随机挑取120份临床检测s/n＜2.1的血清，作为阴性血清。分别计算其s/p值，即s/p＝(样品值-0.15)/(1.01-0.15)，求得s/p的平均值x＝0.080，标准差sd＝0.127，根据统计学规律，阳性临界
[0082]
1.6.5特异性试验
[0083]
选取prrsv、prv、pcv2、csfv、hps、emcv、fmdv以及pcv3抗体阳性、pcv3抗体阴性的血清各一份，使用上述各条件优化后的elisa方法进行检测。
[0084]
1.6.6敏感性实验
[0085]
使用1.6.2中的阴阳性血清，1：100稀释后再进行二倍比稀释，至1:12600，进行elsia 检测，检测结果为阳性的最高稀释倍数为elisa方法的敏感性。
[0086]
1.6.7重复性试验
[0087]
1.6.7.1批内重复试验
[0088]
选取4份pcv3抗体阳性的临床血清和2份pcv3抗体阴性血清，使用同一批纯化的 3cap/δ1-120蛋白包被板条，进行elisa实验，每份血清做3个重复，计算平均值，标准差以及变异系数。
[0089]
1.6.7.2批间重复试验
[0090]
选取4份pcv3抗体阳性的临床血清和2份阴性血清，使用三批不同批次纯化的 3cap/δ1-120蛋白包被的板条进行elisa检测，每份血清做3个重复，计算平均值，标准差以
及变异系数。
[0091]
1.6.8 pcv3抗体流行病学调查
[0092]
使用优化的间接elisa方法对本实验室保存的2013～2017年的3868份血清进行pcv3抗体的检测。这些血清样品来自山东、江苏、安徽、浙江、河南、山西、福建、四川、河北、上海共10个省市。
[0093]
优化的间接elisa方法为：使用cbs将纯化的cap/δ1-120稀释为8μg/ml，再依次二倍比稀释至4μg/ml，37℃孵育2h后4℃过夜包被酶标板；用含有0.05wt％吐温的0.05m pbs (简称pbst，ph7.2)洗板3次，每次5min；拍干后加入含5wt％脱脂乳的pbst封闭，200μl/ 孔，37℃，3h；pbst洗板；加入1:100稀释的待测血清，100μl/孔，37℃，1.5h；pbst洗板；加入1:10000稀释的hrp-spa，100μl/孔，37℃孵育1.5h；pbst洗板；加入tmb底物反应液，100μl/孔，37℃底物反应10min；加入2m h2so4，50μl/孔，终止底物反应后读取 od450值。同时，设置阳性对照和阴性对照。
[0094]
2结果
[0095]
2.1 3cap重组蛋白制备与鉴定
[0096]
2.1.1重组质粒构建与目的基因表达
[0097]
提取重组质粒，双酶切鉴定后基因测序鉴定，证明其含有目的基因。重组质粒命名为 pet-cap/δ1-120和pet-cap/δ60-120。将重组质粒转化rosseta感受态细胞，进行诱导表达，sds-page结果显示(图1)：pet-cap/δ1-120重组rosseta表达的目的蛋白大小约38kda (定义为3cap/δ1-120重组蛋白，简称为3cap/δ1-120蛋白)，pet-cap/δ60-120重组 rosseta表达的目的蛋白大小约48kda左右(定义为3cap/δ60-120重组蛋白，简称为 3cap/δ60-120蛋白)，与预期相符，表达形式均为可溶性表达。western blot结果表明，两个重组蛋白均可以与pcv3血清抗体(南京博全)发生反应，有清晰的特异性条带出现，表明两种重组蛋白均获得成功表达，其中pet-cap/δ1-120重组rosseta表达效率较高，用于后续进一步研究。
[0098]
2.1.2重组蛋白纯化
[0099]
选择pet-cap/δ1-120高效表达的3cap/δ1-120重组蛋白，采用亲和层析方法纯化，对结合缓冲液、洗涤液和洗脱液的咪唑浓度进行优化，结果为：300mm咪唑洗涤液可以较好的将杂蛋白除去，500mm咪唑的洗脱液洗脱目的蛋白效果最好(图2)。用quantity one软件对纯化的蛋白电泳图进行分析，计算得到纯化后蛋白纯度为93％。
[0100]
2.1.3重组蛋白抗原性
[0101]
将3cap/δ1-120重组蛋白免疫猪制备pcv3猪多克隆血清抗体，间接elisa试验结果如表2所示。以s/n≥2.1时判定为阳性，该抗体效价大于1:12800。
[0102]
表2 pcv3猪多克隆抗体效价测定
[0103]
[0104][0105]
2.2间接elisa方法的建立
[0106]
2.2.1间接elisa反应条件优化
[0107]
2.2.1.1抗原包被浓度及包被时间
[0108]
使用cbs将纯化的cap/δ1-120重组蛋白稀释为8μg/ml，再依次二倍比稀释至 0.25μg/ml，37℃2h后4℃过夜包被，采用pbst洗涤液洗涤3次，每次5min，加入5％的脱脂乳封闭液，200μl/孔，37℃封闭2h，去除封闭液；加入1:100稀释的猪血清，100μl/孔，同时，设定pcv3阳性血清和阴性血清对照，100μl/孔，37℃作用1h；按上述相同方法洗涤 3次；加入1:10000稀释的spa-hrp酶标物，100μl/孔，37℃作用1h；按上述相同方法洗涤 3次；加入tmb底物反应液(a液和b液等体积混匀)，100μl/孔，37℃作用10min；加入终止液2m h2so4，50μl/孔；测定od450nm的值。结果见表3。抗原浓度4μg/ml时p/n值最大，确定为最佳抗原包被浓度。
[0109]
表3抗原包被浓度优化
[0110][0111]
以4μg/ml蛋白浓度包被酶标板，包被时间分别为37℃2h、4℃过夜、37℃2h后4℃过夜，其余方法同上，进行elisa试验。结果如表4。选择p/n值最大的抗原包被时间37℃2h 后4℃过夜为最佳抗原包被时间。
[0112]
表4抗原包被时间优化
[0113][0114]
2.2.1.2封闭液的选择及封闭时间
[0115]
以优化的包被方法包被酶标板，分别用1％bsa，5％脱脂乳和2％明胶进行封闭，其余条件同1.6.1，结果如表5。可见5％脱脂乳是最好的封闭液。
[0116]
表5封闭液选择
[0117][0118]
按照优化的抗原包被浓度和包被时间，选择5％脱脂乳分别于37℃封闭1h，2h，3h，确定最佳封闭时间。结果如表6，37℃封闭3h时p/n最大，确定为最佳封闭时间。
[0119]
表6封闭时间优化
[0120]
[0121][0122]
2.2.1.3血清稀释度及作用时间
[0123]
使用优化的方法包被酶标板，将阴阳性血清分别做1:50、1:100、1:200和1:400倍稀释，进行elsia试验。结果如表7，确定1:100是最佳稀释倍数。
[0124]
表7血清稀释度优化
[0125][0126]
对血清作用时间进行优化，其余条件同上。结果如表8。可见37℃作用1.5h是最佳血清作用时间。
[0127]
表8血清作用时间优化
[0128]
[0129][0130]
2.2.1.4酶标抗体稀释度及作用时间
[0131]
分别将酶标二抗做1:10000，1:15000，1:20000和1:30000稀释，比较各组血清od值和 p/n值，结果见表9。酶标抗体1:10000稀释时p/n最大，确定为最佳酶标抗体稀释倍数。
[0132]
表9酶标抗体稀释度优化
[0133][0134]
设定酶标抗体作用时间分别为0.5h、1h、1.5h，进行elsia试验，结果如表10，酶标抗体作用时间1.5h p/n最大，确定为最佳作用时间。
[0135]
表10酶标抗体时间优化
[0136][0137]
2.2.1.5底物反应时间
[0138]
按上述优化的方法进行elisa试验，设置5min，10min，15min和20min四个底物反应时间。结果如表11，确定最佳底物反应时间为10min。
[0139]
表11底物作用时间优化
[0140][0141]
2.2.2阴阳性临界值的确定
[0142]
检测30次标准阴阳性血清，得到阴性最高od450 n
max
＝0.23，平均值阳性最低p
min
＝0.93，平均值因此，实验成立的条件为c
p
≥0.93，cn≤0.23。
[0143]
随机挑取120份临床检测s/n＜2.1的血清，作为阴性血清。分别计算其s/p值，随机挑取120份临床检测s/n＜2.1的血清，作为阴性血清。分别计算其s/p值，即s/p＝(样品值-0.15)/(1.01-0.15)，求得s/p的平均值标准差sd＝0.127，根据统计学规律，阳性临界
[0144]
因此，elisa方法的判定标准为：当s/p≥0.46判为阳性，s/p＜0.33判为阴性，两者之间为可疑。
[0145]
2.2.3特异性试验
[0146]
用elisa方法检测prrsv、prv、pcv2，csfv、hps、emcv、fmdv阳性血清和pcv3阴阳性血清，结果如表所示。可见建立的elisa方法只与pcv3抗体反应，和其他病原的抗体无交叉反应性，特异性好。
[0147]
表12特异性试验
[0148][0149][0150]
2.2.4敏感性试验
[0151]
标准阴阳性血清二倍比稀释后检测结果如表13所示，1:3200稀释时s/n》2.1,1:6400 稀释时s/n《2.1，可见elisa方法的敏感性为1:3200。
[0152]
表13敏感性试验
[0153] 1:1001:2001:4001:8001:16001:32001:64001:12800s1.51.331.180.820.550.330.140.11n0.140.080.080.080.070.080.070.07s/n10.7116.6314.7510.257.864.1321.57
[0154]
2.2.5重复性试验
[0155]
2.2.5.1批内重复试验
[0156]
选择4份阳性血清和2份阴性血清，每份血清做三个重复。计算od450的平均值(av)，标准差(sd)以及变异系数(cv)，结果如表14。可见变异系数平均值3.7％，说明此elisa方法具有较好的批内重复性。
[0157]
表14批内重复试验
[0158][0159]
2.2.5.2批间重复试验
[0160]
选择4份阳性血清和2份阴性血清，使用三个批次纯化的3cap/δ1-120重组蛋白包被酶标板进行elisa实验，计算od450的av，sd以及cv，结果如表15。可见变异系数平均值4.2％，说明此elisa方法具有较好的批间重复性。
[0161]
表15批内重复试验
[0162][0163]
2.3血清流行病学调查
[0164]
采用上述条件优化的elisa方法，检测3868份猪临床血清pcv3抗体，分别统计历年抗体阳性率，抗体在不同季节、地区以及猪群中的分布情况。
[0165]
2.3.1不同年份pcv3抗体检测结果
[0166]
统计结果见表16。从表中可以看出，pcv3抗体阳性率从2013年的7.5％上升至2017年的75.9％，抗体阳性率总体呈上升趋势。历年平均阳性率为34.4％。
[0167]
表16不同年份pcv3抗体检测结果
[0168]
时间样品数阳性数阳性率2013745567.5％2014704618.7％201581131939.3％201661421535.0％201781261675.9％总计3686126734.4％
[0169]
2.3.2不同猪群抗体检测结果
[0170]
对母猪、后备猪、公猪、育肥猪、保育猪和哺乳仔猪中的抗体阳性率进行统计，结果如表17，母猪、公猪和育肥猪中抗体阳性率较高，最高可达43％，哺乳仔猪抗体阳性率最低，为10.2％。表明抗体阳性率与日龄有一定联系。
[0171]
表17不同猪群pcv3抗体检测结果
[0172]
猪群样品数阳性数阳性率母猪127248938.4％后备猪42912729.6％公猪27912043.0％育肥猪75028938.5％
保育猪75922229.2％哺乳仔猪1972010.2％总计3686126734.4％
[0173]
2.3.3不同地区抗体检测结果
[0174]
将不同地区的血清样品分别进行统计，结果见表18，华南地区阳性率最高，达81.8％，其次为华中地区，阳性率为46.0％，华北地区阳性率最低为6.0％。
[0175]
表18不同地区pcv3抗体检测结果
[0176]
地区样品数阳性数阳性率华北13386.0％华东3139103733.0％华中32615046.0％华南887281.8％总计3686126734.4％
[0177]
2.3.4不同季节抗体检测结果
[0178]
将历年样品进行季节性分布统计，结果如表19所示，可见气温较高的夏季和秋季阳性率较高，说明pcv3分布可能有一定的季节性。
[0179]
表19不同地区pcv3抗体检测结果
[0180]
季节样品数阳性数阳性率春季112535731.7％夏季1716739.2％秋季173677844.8％冬季654659.9％总计3686126734.4％