一种同时测定血液中FT3和FT4的试剂盒及方法与流程

一种同时测定血液中ft3和ft4的试剂盒及方法
技术领域
1.本发明属于激素检测技术领域，具体地，涉及一种同时测定血液中ft3和ft4的试剂盒及方法。


背景技术：

2.甲状腺是一个内分泌腺体，分泌甲状腺激素，对机体产生广泛而强烈的生理作用。三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine,t3)和甲状腺素(thyroxine,t4)是两种主要的甲状腺激素，可以促进个体生长发育，增加机体基础代谢率，提高糖、脂肪、蛋白质的氧化分解，增大耗氧、增强产热效应，此外，甲状腺激素还对中枢神经系统、心血管系统、消化系统等具有重要的生理作用。血液中约10％的t3和t4来自甲状腺，其余约90％的t3是由t4在外周组织中脱碘代谢后产生。在血液循环中，t3和t4以结合态和游离态两种形式存在，其中，绝大部分可逆性的结合在血浆蛋白上(主要为甲状腺结合球蛋白(分子量约为54k)、甲状腺素结合前白蛋白(分子量约为55k)和白蛋白(分子量约为66k))，仅极微量的t3(约0.3％)和t4(约0.03％)呈现游离状态。游离型t3(free t3，ft3)和游离型t4(free t4，ft4)可以通过细胞膜进入靶组织细胞，与细胞内的受体结合，发挥其生物学作用，是甲状腺激素发生生理效应的真正活性部分，可以确切地反应人体真实的甲状腺功能状态，而且ft3和ft4可以作用于垂体，反馈性地调节促甲状腺激素的分泌。而结合型的甲状腺激素没有生物学作用的。此外，总t3和总t4的水平会随血浆蛋白的浓度或结合力的变化而发生改变，而ft3和ft4的水平不受其影响，依然可以准确地反映机体甲状腺的功能状态。ft3和ft4分泌量的增加或减少均可导致甲状腺功能失调，引起内分泌代谢紊乱，因此，准确测定人体ft3和ft4，对诊断治疗甲状腺疾病具有重要意义。
3.目前，临床上多采用传统的放射免疫分析法、酶联免疫吸附法、化学发光法测定血清中ft3和ft4，如中国专利申请公布号cn110286237a，发明名称为“甲功五项化学发光检测试剂盒”，公开了一种甲功五项化学发光检测试剂盒，检测试剂盒包括包被的微孔反应板、生物素标记物、碱性磷酸酶标记物、校准品、发光底物液和清洗液；所述生物素标记物包括t4抗原衍生物生物素标记物、t3抗原衍生物生物素标记物、tsh抗体生物素标记物、t4单克隆抗体生物素标记物和t3单克隆抗体生物素标记物；所述碱性磷酸酶标记物包括t4抗原衍生物碱性磷酸酶标记物、t3抗原衍生物碱性磷酸酶标记物、tsh配对抗体碱性磷酸酶标记物、t4单克隆抗体碱性磷酸酶标记物和t3单克隆抗体碱性磷酸酶标记物；所述校准品包括总四碘甲状腺原氨酸校准品、总三碘甲状腺原氨酸校准品、tsh校准品、ft4校准品和ft3校准品，该方案能同时检测五项甲功指标。但操作复杂、特异性低、批间差异大、灵敏度低、动态范围窄，难以满足临床对ft3和ft4的检测要求。
4.鉴于以上所述对血清中ft3和ft4提取、快速检测及检测精准和检测限更低的需求，需要一种操作简单方便、无需衍生化处理、样本前处理耗时短、所需样本体积小、灵敏度高、特异性好、准确度高的ft3和ft4检测方法。


技术实现要素：

5.1、要解决的问题
6.针对现有技术中ft3和ft4检测时所需样本体积大、样品需要衍生化处理、检测耗时长、检测精确度不高，且操作复杂、特异性低、批间差异大、灵敏度低、动态范围窄的技术问题，本技术提供一种同时测定血液中ft3和ft4的试剂盒，包括超滤装置、缓冲液、ft3和ft4混合校准品、ft3和ft4混合质控品、ft3和ft4混合稳定同位素内标液，本方案操作简便、特异性高、批间差异小、灵敏度高、动态范围宽，可满足临床对ft3和ft4检测。本技术还提供了一种同时测定血液中ft3和ft4的方法，所需样本体积小、无需衍生化处理、灵敏度高、检测限低，使检测步骤简化。
7.2、技术方案
8.为达到上述目的，提供的技术方案为：
9.本发明的一种同时测定血液中ft3和ft4的试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：超滤装置，缓冲液，ft3和ft4混合校准品，ft3和ft4混合质控品，ft3和ft4混合稳定同位素内标液。
10.进一步的，所述超滤装置的截留分子量≤50k。优选的，所述截留分子量为3k、5k、10k或30k。当截留分子量为30k时，可以得到最短的超滤时间且可以最大限度避免结合蛋白质的漏出。
11.进一步的，所述缓冲液采用4-羟乙基哌嗪乙磺酸和氢氧化钠的缓冲体系。
12.进一步的，所述缓冲体系还可添加氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、尿素、氯化钙中的一种或几种。所选可添加的物质，可以进一步稳定血清样本ph值和离子强度，以提高超滤效果。
13.进一步的，所述ft3和ft4混合校准品包括六个浓度梯度，ft3的浓度分别为40、20、10、4、2、1pg/ml，对应的ft4的浓度分别为160、80、40、16、8、4pg/ml；
14.所述ft3和ft4混合质控品包括两个浓度梯度，ft3的浓度为2或10pg/ml，对应的ft4的浓度为8或40pg/ml。
15.进一步的，所述ft3和ft4混合稳定同位素内标液中包含
13c6-ft3和
13c6-ft4，所述
13c6-ft3的浓度为5ng/ml，所述
13c6-ft4的浓度为20ng/ml。
16.一种同时测定血液中ft3和ft4的方法，使用所述的试剂盒，包括如下步骤：
17.在血清标本中加入缓冲液，得血清标本缓冲液混合液；
18.使用超滤装置将所述血清标本缓冲液混合液中的ft3和ft4，与结合型三碘甲状腺原氨酸和甲状腺素分离，得超滤液；
19.在所述超滤液中加入ft3和ft4混合稳定同位素内标液，离心，取上清液进行高效液相色谱串联质谱测定，得到ft3和ft4的含量。
20.进一步的，所述高效液相色谱条件为：
21.22.所述流动相a：0.1％甲酸水溶液；
23.所述流动相b：含0.1％甲酸的甲醇溶液；
24.色谱柱：反相色谱柱；柱温：30～60℃；流速：0.3～0.8ml/min；
25.所述质谱条件为：
[0026][0027]
离子源：电喷雾离子源，正离子模式；扫描模式：多反应监测mrm模式。
[0028]
进一步的，所述ft3和ft4的含量计算方法为：
[0029]
以ft3和ft4混合校准品的浓度为横坐标，以ft3和ft4混合校准品与对应内标物测得峰面积的比值为纵坐标，建立校准曲线和回归方程；根据测得血清标本中ft3和ft4与内标物峰面积比值，代入线性回归方程，计算血清标本中ft3和ft4的浓度。
[0030]
3、有益效果
[0031]
采用本发明提供的技术方案，与已有的公知技术相比，具有如下有益效果：
[0032]
(1)本发明的一种同时测定血液中ft3和ft4的试剂盒，样品不需要衍生化处理，所需的样品体积仅为100μl，使用超滤装置分离出游离的ft3和ft4，效率更好。前述步骤提取出的纯度高的ft3和ft4，经高效液相色谱串联质谱法分析，其特异性高，干扰低的特点可以来提高检测结果的灵敏度，从而使定量下限做的更低。本技术的试剂盒包括超滤装置、缓冲液、ft3和ft4混合校准品、ft3和ft4混合质控品、ft3和ft4混合稳定同位素内标液，本方案操作简便、特异性高、批间差异小、灵敏度高、动态范围宽，可满足临床对ft3和ft4检测。
[0033]
(2)本发明的一种同时测定血液中ft3和ft4的方法，采用一步超滤法将血中ft3和ft4与结合型t3和t4分离，通过高效液相色谱串联质谱检测，计算血中ft3和ft4的浓度。相比现有技术，操作简单(一步处理)、特异性高、灵敏度好。可同时测定ft3和ft4，满足临床对血中ft3和ft4检测需求。本技术ft3和ft4的定量下限分别为1pg/ml和4pg/ml，其s/n≥10，cv≤20％，相对偏差在
±
20％之内。在线性范围内，ft3(1～40pg/ml)和ft4(4～160pg/ml)的相关系数r≥0.99，最低点浓度校准品相对偏差在
±
20％之内，其余浓度点校准品的相对偏差在
±
15％之内。低值和高值混合质控品的日内和日间精密度cv≤15％。低值和高值混合质控品的日内和日间准确度(相对偏差)在
±
15％之间。低值和高值混合质控品的回收率在85～115％之间。
4、附图说明
[0034]
图1是ft3的校准曲线；
[0035]
图2是ft4的校准曲线；
[0036]
图3是校准品中典型的ft3和ft4 lc-ms/ms色谱图。
5、具体实施方式
[0037]
为进一步了解本发明的内容，结合实施例对本发明作详细描述。
[0038]
实施例1
[0039]
本实施例的一种同时测定血液中ft3和ft4的试剂盒，所述试剂盒包括以下组份：
[0040]
表1同时测定血液中ft3和ft4的试剂盒的组份
[0041][0042][0043]
本实施例中，其中，组份1的超滤装置的截留分子量为50k。
[0044]
组份2缓冲液配制包含：12.570g 4-羟乙基哌嗪乙磺酸和0.900g氢氧化钠，溶解于1l的纯化水中，摇晃、超声混匀；取15ml上述缓冲液装入干净棕色玻璃瓶中，用封口膜封闭。
[0045]
组份3～8为不同浓度ft3和ft4混合校准品，用于绘制校准曲线，其中，ft3校准品浓度为40、20、10、4、2、1pg/ml，ft4的校准品浓度为160、80、40、16、8、4pg/ml。
[0046]
组份9和10为ft3和ft4的混合低值和高值质控品，其中，ft3质控品浓度为2、10pg/ml，ft4质控品浓度为8、40pg/ml。
[0047]
组份11为ft3和ft4混合稳定同位素内标液，采用稳定同位素
13c6-ft3和
13c6-ft4为内标，其中，
13c6-ft3的浓度5ng/ml，
13c6-ft4的浓度为20ng/ml。
[0048]
组份12为试剂盒说明书。
[0049]
本实施例的试剂盒，仅需100μl血清样本即可达到同时检测ft3和ft4浓度的目的，仅采用一步超滤法即可准确测定血中极低浓度(约1～300pg/ml)的ft3和ft4含量，与现有检测ft3和ft4技术相比，本实施例的试剂盒操作简单、灵敏准确、可同时测定ft3和ft4，可用于临床血中ft3和ft4的常规检测。
[0050]
实施例2
[0051]
本实施例的一种同时测定血液中ft3和ft4的试剂盒，基本同实施例1，所不同的是，组分2中添加氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、尿素、氯化钙。
[0052]
具体配制包含：12.570g 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、5.265g氯化钠、0.224g磷酸二氢钾、0.275g七水硫酸镁、0.300g尿素、0.275g二水氯化钙，溶解于1l的纯化水中，摇晃、超声混匀；取15ml上述缓冲液装入干净棕色玻璃瓶中，用封口膜封闭。
[0053]
本实施例增加额外的组分，增强了缓冲液的ph缓冲能力和离子强度，使不同临床血清标本超滤效果的平行性较实施例1增加5～10％，即不同临床血清标本在使用本试剂盒
可以得到更稳定和更好的一致性结果。
[0054]
实施例3
[0055]
本实施例的一种同时测定血液中ft3和ft4的试剂盒，基本同实施例2，所不同的是，超滤装置的截留分子量为3k。
[0056]
实施例4
[0057]
本实施例的一种同时测定血液中ft3和ft4的试剂盒，基本同实施例2，所不同的是，超滤装置的截留分子量为30k。
[0058]
本实施例与实施例2和实施例3相比，超滤装置的截留分子量为30k，超滤1h可以得到100μl的超滤液，满足后续标本处理的检测量需求。
[0059]
相对应的，实施例2的超滤装置的截留分子量为50k，仅需超滤45min即可得到100μl超滤液，但按照后续样本处理方法处理超滤液，得到溶液中的ft3和ft4的浓度高于超滤装置截留分子量为3、5、10、30k的标本的浓度。即存在结合蛋白漏出的风险，这是由于超滤装置的截留分子量为50k与主要的甲状腺激素结合蛋白分子量相近，如甲状腺结合球蛋白(分子量约为54k)、甲状腺素结合前白蛋白(分子量约为55k)，白蛋白(分子量约为66k)，在操作不当或者超滤装置的批间差异时，容易发生结合蛋白漏出，导致超滤液中除含有ft3和ft4外，还存在小部分的结合型t3和结合型t4，最终导致ft3和ft4的浓度增加。
[0060]
相对应的，实施例3的超滤装置的截留分子量为3k，超滤1h仅得到40μl的超滤液，如需得到100μl超滤液，则需要延长超滤时间，此外随着超滤过程，3k超滤装置的超滤面被多肽、蛋白或其他颗粒覆盖面积和厚度越来越大，导致超滤效率越来越低，甚至无法超滤出超滤液。
[0061]
因此，当截留分子量为30k时，可以得到最短的超滤时间且可以最大限度避免结合蛋白质的漏出。
[0062]
实施例5
[0063]
本实施例的一种同时测定血液中ft3和ft4的方法，使用实施例1～实施例4的试剂盒，包括如下步骤：
[0064]
1.样本前处理：
[0065]
1.1.上样：分别在100μl血清标本、100μl ft3和ft4混合校准品、100μl ft3和ft4混合质控品中加入100μl缓冲液，静置5min，将上述液体加到超滤装置中。
[0066]
1.2.超滤：于25℃、1800g离心1h，得超滤液。
[0067]
1.3.加内标：取100μl超滤液，加入100μl内标液。
[0068]
1.4.混匀：涡旋振荡3min。
[0069]
1.5.离心：4℃、12000rpm离心10min。
[0070]
1.6.检测：取150μl上清液于96孔进样板或进样小瓶，进行液相色谱串联质谱分析。
[0071]
2.高效液相色谱串联质谱检测：
[0072]
2.1.高效液相色谱条件:
[0073]
色谱柱：acquity uplc beh c18(2.1
×
50mm，1.7μm)。
[0074]
柱温：30℃。
[0075]
流速：0.3ml/min。
[0076]
流动相a(水相)：0.1％甲酸水溶液。
[0077]
流动相b(有机相)：0.1％甲酸的甲醇溶液。
[0078]
采用梯度洗脱，梯度如下表：
[0079]
表2高效液相色谱参数
[0080][0081]
2.2质谱条件：
[0082]
离子源参数：正离子模式，毛细管电压：5500v，离子源温度：550℃，离子源雾化气：50psi，离子源加热辅助器：50psi，气帘气：30psi
[0083]
扫描模式：多反应监测。
[0084]
具体参数如下表：
[0085]
表3质谱参数
[0086][0087]
注：*为定量离子。
[0088]
3.内标法计算：
[0089]
采用内标法定量，以系列混合校准品中ft3和ft4的浓度为横坐标(x)，以校准品与对应内标物测得峰面积的比值为纵坐标(y)，建立校准曲线和回归方程；根据测得血清标本中ft3和ft4与内标物峰面积比值，代入线性回归方程，计算血清标本中ft3和ft4的浓度。
[0090]
本实施例的方法检测结果如下：
[0091]
1.定量下限：ft3和ft4的定量下限分别为1pg/ml和4pg/ml，其s/n≥10，cv≤20％，相对偏差在
±
20％之内。
[0092]
2.校准曲线：在线性范围内，ft3(1～40pg/ml)和ft4(4～160pg/ml)的相关系数r≥0.99，最低点浓度校准品相对偏差在
±
20％之内，其余浓度点校准品的相对偏差在
±
15％之内。
[0093]
3.精密度试验：低值和高值混合质控品的日内和日间精密度cv≤15％。
[0094]
4.准确度：低值和高值混合质控品的日内和日间准确度(相对偏差)在
±
15％之间。
[0095]
5.加样回收率：低值和高值混合质控品的回收率在85～115％之间。
[0096]
实施例6
[0097]
本实施例的一种同时测定血液中ft3和ft4的方法，基本同实施例5，所不同的是，色谱条件中，柱温：60℃；流速：0.8ml/min。
[0098]
实施例7
[0099]
本实施例的一种同时测定血液中ft3和ft4的方法，基本同实施例5，所不同的是，色谱条件中，柱温：50℃；流速：0.4ml/min。
[0100]
本实施例与实施例5和实施例6相比，柱温为50℃、流速为0.4ml/min，以实施例4的试剂盒为例，得到ft3和ft4的保留时间分别为2.4min和2.5min，校准曲线如图1和2所示，lc-ms/ms色谱图如图3所示。
[0101]
相对应的，实施例5的柱温为30℃，流速为0.3ml/min，可以得到类似实施例7的结果，但是ft3和ft4的保留时间延长0.8min，即相当于每一个标本的分析时间增加0.8min。即相对于实施例5，实施例7每天理论上可以增加额外的60个血清标本测试。
[0102]
相对应的，实施例6的柱温为60℃，流速为0.8ml/min，可以得到类似实施例7的结果，但是ft3和ft4的保留时间缩短1.3min，分析时间缩短导致通量增加。但是，因增加流速导致柱压增加明显，严重减少柱寿命，同时较短的出峰时间，会使更多的共流出物干扰ft3和ft4的检测。即，相对于实施例6，实施例7可以得到更佳的色谱柱使用寿命，以及更少的检测干扰，进而得到更准确的测定结果。
[0103]
以上所述实施例仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。