一种仿生三维层级微纳结构集成微装置及制备与应用的制作方法

1.本发明属于仿生结构技术领域，更具体地，涉及一种仿生三维层级微纳结构集成微装置及制备与应用。


背景技术：

2.仿生学是研究生物系统的结构和性质以为工程技术提供新的设计思想及工作原理的科学。仿生技术通过对各种生物系统所具有的功能原理和作用机理作为生物模型进行研究，最后实现新的技术设计并制造出更好的新型仪器、机械等。
3.与此同时，循环肿瘤细胞(ctc)的有效捕获和释放对于ctc相关的癌症诊断和后续分析是另一个研究热点。从复杂的外周血标本中分离和富集含量极低的ctc是一个巨大的挑战，因此，迫切需要发展快速、高效、便捷的细胞捕获技术。目前，许多研究报道了纳米结构衬底可以提高ctc的捕获效率，但构建三维微纳结构微装置以简单方式增强ctc捕获和高效释放的研究却很少。受大自然的启发，壁虎脚、玫瑰花瓣、贝壳、蝴蝶翅膀等多层次的自然结构可以作为模板构建仿生微纳米结构表面，提高ctc的捕获效率。


技术实现要素：

4.本发明解决了现有技术中从标本中分离和富集含量较低的细胞、细菌、病毒和外泌体存在技术难度，提供了一种玫瑰花瓣模板法制备具有三维层级微纳结构微装置的简便方法。该方法加工过程简单，不需要昂贵的大型仪器，易于操作。利用该方法制作的微装置可以用于细胞或其他病原体的分离和捕获。
5.根据本发明第一方面，提供了利用花瓣模板法制备具有三维层级微纳结构微装置的方法，包括以下步骤：
6.(1)将玫瑰花瓣内壁上的三维微纳结构复制到聚合物表面，得到含有玫瑰花瓣三维微纳结构的聚合物；
7.(2)在步骤(1)得到的含有玫瑰花瓣三维微纳结构的聚合物进行亲水处理，然后在三维微纳结构表面原位生长氧化物纳米粒子，所述氧化物纳米粒子用于增强三维微纳结构的表面粗糙度，即得到具有三维层级微纳结构微装置。
8.优选地，步骤(1)的具体制备过程为：
9.(1-1)将玫瑰花瓣粘贴在培养皿上，玫瑰花瓣的外壁朝下，内壁朝上；
10.(1-2)采用原位反应成型法，将液态预聚物倒在培养皿中，预聚物固化后，将聚合物脱模成型；
11.(1-3)将成型的聚合物烘干，使玫瑰花瓣脆化，并取下花瓣，即得到含有玫瑰花瓣三维微纳结构的聚合物。
12.优选地，所述聚合物为弹性体聚合物或热塑性聚合物；
13.优选地，所述弹性体聚合物为聚二甲基硅氧烷；所述热塑性聚合物为聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯或聚苯乙烯。
14.优选地，所述玫瑰花瓣为红玫瑰花瓣或粉玫瑰花瓣。
15.优选地，所述氧化物纳米材料为zno、mno2或tio2。
16.根据本发明另一方面，提供了任一所述方法制备得到的具有三维层级微纳结构微装置。
17.根据本发明另一方面，提供了所述的具有三维层级微纳结构微装置用于捕获细胞、细菌、病毒或外泌体的应用。
18.优选地，所述细胞为循环肿瘤细胞。
19.优选地，所述应用具体为：在所述微装置上偶联适配体，所述适配体的碱基序列如seq id no:1所示，所述适配体能够捕获循环肿瘤细胞。
20.优选地，所述偶联具体为：在所述微装置的氧化物纳米粒子表面非特异性吸附生物素-牛血清白蛋白，从而反应上链霉亲和素，进而将生物素-适配体与链霉亲和素连接，从而将适配体偶联在所述微装置上。
21.总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
22.(1)本发明仅通过仿生的方法实现了花瓣模板法制备的具有三维微纳结构(优选为三维层级zno微纳结构)微装置的制作，此装置加工制作过程及方法简单，成本低，微装置的大小可控，具有原位性。利用这微装置，能够很容易地实现生物活性分子的修饰，从而达到对细胞(如ctc细胞)或其他病原体的识别捕获。
23.(2)本发明用花瓣作为模板，通过原位反应成型法复制出玫瑰花瓣的表面结构，同时在聚合物表面原位生长氧化物纳米粒子以提高表面的粗糙度，提供更多的捕获位点，并且将聚合物组固定在48孔板里，构建简单的生物微装置。
24.(3)玫瑰花瓣具有半球形微乳头结构(20～30μm)，同时，如玫瑰花瓣上有一些纳米级的褶皱，有利于细胞伪足的粘附。这种结构可以用pdms和其他材料复制，用于细胞(如ctc细胞)的捕获。在玫瑰花瓣衍生的基底上包覆一层薄的纳米材料，不仅可以保持与细胞(如ctc细胞)最大接触的三维层次结构，还可以提供粗糙的表面和更多的靶标分子识别结合位点。通过拓扑尺寸识别和目标分子识别的协同作用，可以大大提高细胞(如ctc细胞)捕获效率。
附图说明
25.图1为玫瑰花瓣的电镜图。
26.图2为玫瑰花瓣衍生的pdms模板。
27.图3为zno修饰的pdms模板切成直径为1.1cm的圆柱体，粘在孔板里。
28.图4为本发明利用花瓣模板法制备具有三维层级微纳结构微装置的方法流程示意图。
29.图5为用sa-cy3验证biotin-bsa修饰的稳定性，图为pbst洗1、2、3、4、5、6、8、10次后的荧光强度的变化。
30.图6为用与epcam适配体互补的荧光修饰的dna序列验证epcam适配体的成功修饰；其中a图为不加epcam适配体的空白组，b图为加了epcam适配体的实验组。
31.图7为mcf-7细胞捕获，hela细胞(圆圈)作为对照细胞验证材料的专一性。其中
hela细胞加入1
×
105个，mcf-7细胞加入1
×
104个。
32.图8为不同数量mcf-7细胞的捕获效率。
33.图9为样品捕获细胞的免疫荧光染色。
具体实施方式
34.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
35.本发明利用花瓣模板法制备具有三维层级微纳结构微装置的方法，采用如下步骤：
36.(1)用双面胶将花瓣粘在培养皿上，花瓣外壁朝下，内壁朝上；
37.(2)采用原位反应成型法，将液态预聚物倒在培养皿上，反应固化后，脱模成型，成型的聚合物在75℃条件下烘3min，使花瓣脆化；
38.(3)用胶带将聚合物表面的花瓣粘掉，即合成了具有花瓣三维微纳结构的聚合物模板；
39.(4)在聚合物模板表面原位生长纳米材料(氧化锌)，将含有氧化锌纳米材料的聚合物模板切成适合孔板大小的圆柱形，通过液态的预聚物将圆柱形的纳米粒子修饰的聚合物模板固定在孔板里。
40.一些实施例中，花瓣可以选择红玫瑰和粉玫瑰或其它含有类似微纳结构的花瓣。
41.一些实施例中，聚合物材料为弹性体聚合物聚二甲基硅氧烷(pdms)或热塑性材料聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚碳酸酯(pc)、聚苯乙烯(ps)等。
42.一些实施例中，原位生长的纳米材料可以是不同形貌的zno、mno2、tio2等纳米材料。
43.一些实施例中，根据不同的应用，可以选择不用规格的孔板。
44.一些实施例中，还可以针对孕妇早期胎儿细胞畸形的筛查。
45.一些实施例中，捕获对象包括细菌、病毒、外泌体等病原体标志物。
46.一些实施例中，捕获对象的释放的方式包括：ph释放，toe-hold介导的链置换释放、dna酶切释放、gsh切断二硫键释放、光照可控释放等。
47.实施例1
48.下面通过实例对玫瑰花瓣模板法制备的具有三维微纳结构(层级zno微纳结构)微装置的制作方法及其应用作详细的说明。
49.图4为本发明利用花瓣模板法制备具有三维层级微纳结构微装置的方法流程示意图。其中，1为玫瑰花瓣，2为pdms预聚体，3为玫瑰花瓣衍生的pdms模板，4为zno，5为zno修饰的pdms模板，6为zno修饰的pdms模板切成直径为1.1cm的圆柱体，7为epcam适配体，8为epcam适配体修饰pdms模板，9为epcam阳性的癌细胞，10为epcam阳性的癌细胞捕获在epcam适配体修饰pdms模板上。
50.具体为以下步骤：
51.(1)用双面胶将玫瑰花瓣粘在培养皿上，玫瑰花瓣外壁朝下，内壁朝上。
52.(2)采用原位反相成型法，调节一个质量配比为10：1(rtv615a：b)的pdms的预聚物，将预聚物倒在培养皿上，室温放置24小时，反应固化后，脱模成型，成型的pdms在75℃条件下烘3min，使玫瑰花瓣脆化。
53.(3)用胶带将pdms表面的玫瑰花瓣粘掉，即合成了具有玫瑰花瓣3d微纳结构的pdms模板。图1为玫瑰花瓣的电镜图，图2为玫瑰花瓣衍生的pdms模板。
54.(4)pdms模板用plasma处理70s(亲水处理)，将处理后的pdms模板泡在5mm的kmno4溶液中30min，用水洗净后，将kmno4处理后的pdms模板泡在zno种子液(0.05m醋酸锌，2％氨水，5％乙醇胺)中110℃反应7min，然后用超纯水将pdms表面洗成中性。
55.(5)将合成好zno的pdms模板切成直径为1.1cm的圆柱形，通过液态的pdms将圆柱形的zno装载的pdms模板固定在48孔板里，备用；图3为zno修饰的pdms模板切成直径为1.1cm的圆柱体，粘在孔板里。
56.(6)通过在zno修饰的pdms模板上非特异性吸附biotin-bsa，从而反应上sa，进而将biotin-epcam适配体(5
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biotin-ttt ttt ttt-tca ctacag agg ttg cgt ctg tcc cac gtt gtc atg ggg ggt tgg cct g-3’)修饰在pdms模板表面，达到特异性捕获epcam阳性癌细胞(循环肿瘤细胞)的目的。
57.图5为用sa-cy3验证biotin-bsa修饰的稳定性，图为pbst洗1、2、3、4、5、6、8、10次后的荧光强度的变化。(具体方法为：zno上修饰完biotin-bsa，用荧光物质cy3标记的sa与biotin结合，用加了0.05％吐温20的磷酸缓冲液(pbst)清洗表面1、2、3、4、5、6、8、10次，期间用荧光显微镜观察荧光强度的变化)。由图5可知，经过pbst洗10次后，荧光强度几乎没有变化，说明bsa-biotin牢固的吸附在zno上。
58.图6为用与epcam适配体互补的荧光修饰的dna序列验证epcam适配体的成功修饰；其中a图为不加epcam适配体的空白组，b图为加了epcam适配体的实验组。(具体方法为：用tamra荧光标记的与epcam适配体互补的dna链与epcam适配体互补配对，空白组没有加biotin-epcam,则荧光物质不会结合在表面，实验组有biotin-epcam适配体，则荧光物质会结合在表面，从而产生荧光信号)。由图6可知，a图空白组没有荧光信号的产生，b图实验组有荧光信号的产生，说明epcam适配体偶联成功。
59.图7为mcf-7细胞捕获，hela细胞(圆圈)作为对照细胞验证材料的专一性。其中hela细胞加入1
×
105个，mcf-7细胞加入1
×
104个。(具体方法为：适配体修饰好了之后，混合加入阳性的细胞(mcf-7细胞，提前用钙黄绿素染成绿色荧光)和阴性的细胞(hela细胞，提前用4,6-二氨基－2－苯基吲哚(dapi)染成蓝色荧光)，然后用pbst将未捕获的细胞洗净后，在荧光显微镜下看细胞的捕获情况)。由图7可知，在大量hela细胞的干扰下，微装置可以选择性的捕获mcf-7细胞。
60.图8为不同数量mcf-7细胞的捕获效率。(具体方法为：适配体修饰好了之后，分别加入10、50、100、1000个提前用钙黄绿素染成绿色荧光的mcf-7细胞，捕获完成后，通过荧光显微镜看捕获到的细胞个数，从而可以计算出微装置对mcf-7细胞的捕获效率)。由图8可知，在细胞数量很少的情况下(10个)，其捕获效率可以达到90.5％。
61.图9为样品捕获细胞的免疫荧光染色。(具体方法为：细胞完成捕获后，先用4％多聚甲醛固定细胞，再用曲拉通100增加细胞膜的通透性，接着用牛血清白蛋白封闭，然后用dapi给细胞核染色、别藻青蛋白标记的cd45抗体给白细胞膜染色，异硫氰酸荧光素标记的
ck19抗体给癌细胞膜染色)。由图9可知，在实际血样的捕获中，成功的发现了癌细胞(dapi、ck19阳性，cd45阴性)和白细胞(dapi、cd45阳性，ck19阴性)。
62.本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。