针对感染期间的致病性免疫激活细胞的疫苗的制作方法

1.在本发明中，申请人提供了一种预防或治疗有此需要的受试者中的感染性疾病的新方法。具体地，所述方法包括施用组合、药物组合、药物或试剂盒(kit-of-parts)，其包含含有对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗的第一部分，任选地，含有干扰素α阻断剂的第二部分，和含有iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂的第三部分。


背景技术：

2.在最初发现人类免疫缺陷病毒(hiv)是导致获得性免疫缺陷综合征(aids)的原因后不久，已确定极少数感染hiv的患者在数十年内一直保持不患aids。这些所谓的hiv精英控制者(elite controller，ec)通常具有相对较高的cd4
t细胞计数，并且能够在不存在任何抗逆转录病毒治疗(art)的情况下在较长时间内保持临床上检测不到的血浆hiv-1rna水平(hiv rna《50个拷贝/ml)。近年来，已经进行了广泛的研究来定义这些罕见个体控制hiv的机制。
3.有趣的是，ec状态表明t细胞的低激活特征和独特的mhc-1b/e限制性cd8
t细胞群体的存在能够抑制致病性hiv抗原呈递cd4
t细胞的早期激活(lu等人(2016)front.immunol.7:134)。此外，siv疫苗学领域的最新进展也强调了mhc-1b/e限制性cd8
t细胞应答在控制恒河猴(rhesus macaque)中siv感染中的作用(hansen等人(2013)science24；340(6135):1237874；hansen等人(2016)science；351(6274),714-20；lu等人(2012)cell rep.2(6),1736-46；andrieu等人(2014)front immunol.5:297)。这些观察提出了开发hiv疫苗的替代策略。
4.事实上，由于cd4
t细胞的激活状态也是体内增殖性hiv感染的先决条件，并且因此在休眠(quiescent)cd4
t细胞中的复制基本上是非生产性的并且通常是无效的，已假设通过干扰cd4
t细胞激活来抑制病毒复制是可能的。因此，一些研究小组已试图使用诱导mhc-1b/e限制性cd8

细胞的疫苗来抑制病毒特异性cd4
t细胞激活。
5.例如，andrieu等人已经开发出一种能够在猕猴中诱导mhc-1b/e限制性cd8
t细胞的疫苗。这个疫苗由灭活的猿猴免疫缺陷病毒(siv)颗粒与致耐受性(tolerogenic)佐剂，例如植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)组成。尽管这种疫苗策略在中国猕猴中有效地免疫并诱导了抑制性mhc-1b/e限制性cd8
t细胞，但用相同的佐剂化疫苗免疫的印度来源的猕猴并没有受到保护。
6.hansen等人通过修饰控制非常规t细胞初免(priming)的巨细胞病毒(cmv)载体决定因素，表明了独特地调整cd8
t细胞应答以最大化预防性或治疗性保护是可能的。具体地，发现了在恒河猴(rhesus macaque，rm)中使用此类表达siv蛋白的恒河猴巨细胞病毒载体诱导了针对siv的攻毒后无菌保护。然而，这种保护仅在50％的经疫苗接种的rm中有效。
7.在全球范围内，这些结果已将当前的范式从专注于预防性hiv疫苗的范式扩展到其中hiv/aids的免疫疗法可以成为抗击这一流行病的重要部分的范式。因此，除了预防性疫苗外，仍然需要一种有效的疗法来治疗与hiv-1共存的个体。
8.基于iii型干扰素(ifn-iii)新生物学特性的发现，本发明人提议改进现有的用于预防或治疗hiv和其他感染性疾病的疫苗(即，诱导抑制性mhc-1b/e限制性cd8
t细胞群体)策略。
9.具体地，申请人证明了iii型干扰素可以极大地增强现有的cd8抑制性疫苗。事实上，与i型干扰素相反，iii型干扰素似乎在先天抗病毒防御中具有更特殊的作用，并且不会抑制hiv感染后适应性免疫反应的启动。具体地，ifn-iii能够阻止或限制病毒复制而不抑制对hiv感染有应答的cd4
t细胞的增殖。
10.申请人进一步证明，干扰素α(ifn-α)的阻断物作为对cd8抑制性疫苗的补充可以增强iii型干扰素，并因此大大提高疫苗效力。事实上，ifn-α是一种反常的i型干扰素细胞因子，其能够阻止或限制病毒复制，同时促进有害的慢性免疫激活。由于慢性免疫激活是hiv复制所必需的，因此ifn-α可以在hiv感染期间发挥有害作用。此外，如发明人所证明的，ifn-α具有抑制cd4
t细胞增殖的抗增殖活性，并因此导致已感染患者中的免疫下降、病毒复制和aids。因此，通过ifn-α的阻断，申请人旨在增强iii型干扰素活性，从而促进较低的慢性免疫激活和cd4
t细胞的更好应答。
11.因此，在本发明中，申请人提供了一种预防或治疗有此需要的受试者中的感染性疾病的新方法，其包括向受试者施用：
12.1)对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗，
13.2)任选地，干扰素α阻断剂，和
14.3)iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂。


技术实现要素：

15.本发明涉及一种组合，其包含：
16.1)对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗，
17.2)任选地，干扰素-α阻断剂，和
18.3)iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂。
19.在一个实施方案中，干扰素-α阻断剂选自以下的组：中和循环α干扰素的药剂、阻断干扰素-α信号传导的药剂、耗减产生ifn-α的细胞的药剂和/或阻断ifn-α产生的药剂，其中中和循环α干扰素的药剂选自包含以下的组：包括antiferon的主动抗-ifn-α疫苗或包括抗-ifn-α抗体或抗-ifn-α超免疫血清(anti-ifn-αhyper-immune serum)的被动抗-ifn-α疫苗，其中干扰素-α信号传导的阻断剂选自抗i型干扰素r1或r2抗体的组或选自包括sosc1或芳烃受体的干扰素-α内源性调节剂，其中所述耗减产生ifn-α的细胞的药剂是耗减浆细胞样树突细胞(plasmacytoid dendritic cell，pdc)的药剂，并且其中所述阻断ifn-α产生的药剂是阻断pdc产生ifn-α的药剂。
20.在一个实施方案中，iii型干扰素包含至少一种选自ifn-λ1、ifn-λ2、ifn-λ3和ifn-λ4的组的ifn-λ，其中刺激iii型干扰素产生的药剂包含tlr配体、rig-i配体和/或mda5配体；并且其中刺激iii型干扰素产生的药剂也可以刺激i型干扰素产生。
21.本发明进一步涉及一种组合，其用于预防或治疗有此需要的受试者中的感染性疾病，其中所述组合包含：
22.1)对至少一种病原体特异性抗原特异的cd8疫苗，
tuberculosis)。
40.在一个实施方案中，感染性疾病相关抗原是病毒病原体特异性抗原，其中病毒病原体特异性抗原衍生自hiv或siv病原体，例如gag、env、rev、tat、nef、pol和/或vif抗原。
41.本发明进一步涉及一种产生呈递mhc-1b/e限制性肽的自体树突、自然杀伤或b细胞群体的离体方法，包括以下步骤：
42.1)任选地，使用抑制tap表达或活性的药剂降低不成熟的树突细胞、自然杀伤细胞或b细胞中的mhc-1a表达，
43.2)将hla-dr和/或mhc-lb/e限制性肽加载至不成熟的树突细胞、自然杀伤细胞或b细胞，和
44.3)使经加载的不成熟的树突细胞、自然杀伤细胞或b细胞成熟。
45.本发明进一步涉及一种用于产生自体mhc-1b/e限制性cd8
t细胞的离体方法，包括以下步骤：
46.1)在呈递mhc-1b/e限制性肽的树突、自然杀伤或b细胞群体存在下培养初始cd8
t细胞(cd8
t cell)，从而产生mhc-1b/e限制性cd8

t细胞；和
47.2)扩增mhc-lb/e限制性cd8
t细胞。
48.定义
49.在本发明中，下列术语具有以下含义：
[0050]-数字前面的“约”涵盖所述数字的值的正或负10％或更少。应当理解，术语“约”所指的值本身也是具体地且优选地公开的。
[0051]-如本文所用，术语“佐剂”是指帮助和增强药物或疫苗的药理作用，或增加免疫原性反应，包括cd8

免疫应答(例如，以高百分比的被感染性疾病治疗中使用的mhc-ib/e所限制的cd8
t细胞应答为特征的免疫应答)的化合物或化合物的组合。
[0052]-术语“施用”意指直接施用本发明的化合物或组合物，或施用前药(prodrug)、衍生物或类似物，其将在体内形成等价量的活性化合物或物质。例如，根据一个实施方案，通过任何有效途径向受试者施用药剂，例如包含有效量的含有外源抗原的hcmv载体的组合物的事实。示例性的施用途径包括但不限于注射(例如，皮下、肌内、皮内、腹膜内和静脉内)、经口、舌下、经直肠、经皮、鼻内、经阴道和吸入途径。
[0053]-术语“抗原”是指可以刺激动物中的抗体产生或t细胞应答的化合物、组合物或物质，包括被注射或吸收到动物体内的组合物。抗原与特定体液或细胞免疫的产物反应，包括由异源免疫原诱导的那些。术语“抗原”包括所有相关的抗原表位。“表位”或“抗原决定簇”是指b和/或t细胞对其作出响应的抗原上的位点。在一个实施方案中，当表位与mhc分子一起呈递时，t细胞对表位作出响应。表位可由连续氨基酸或通过蛋白三级折叠而并列的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丧失。表位通常包括具有独特空间构象的至少3个，并且更通常地，至少5个、约9个或约8-10个氨基酸。确定表位空间构象的方法包括例如x射线晶体学和二维核磁共振。在一些实施方案中，抗原是病原体特异性抗原。在本公开的上下文中，病原体特异性抗原是引发针对病原体的免疫应答和/或病原体(例如病毒、细菌、真菌或原生动物)所特有的抗原。
[0054]-对于活病毒或细菌来说，术语“减毒的(attenuated)”是指与野生型病毒或野生
型细菌相比，感染细胞或受试者的能力降低(例如，消除)和/或诱导或引起疾病的能力降低(例如，消除)的病毒或细菌。通常，减毒病毒或细菌在施用给具有免疫活性的受试者后保留至少一些引发免疫应答的能力。在一些情况下，减毒病毒或细菌能够引发保护性免疫应答，而不会引起任何感染迹象或症状。在一些实施方案中，减毒病毒或细菌在受试者中引起疾病的能力相对于野生型病毒或野生型细菌降低至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％或至少约90％。
[0055]-术语“cmv”(巨细胞病毒)是指疱疹病毒家族的β亚类的成员。cmv是一种大的(～230kb基因组)双链dna病毒，具有宿主范围特异性变体，例如mcmv(鼠类cmv)、rhcmv(恒河猴cmv)和hcmv(人cmv)。在本发明的上下文中，“rhcmv”是指恒河猴cmv的任何毒株、分离株或变体。在本发明的上下文中，“hcmv”是指人cmv的任何毒株、分离株或变体。
[0056]-术语“减少”是指降低某物的质量、数量或强度。例如，疗法(例如本文提供的方法)减少病原体的感染负荷或滴度，或与感染相关的一种或多种症状。
[0057]-术语“缺失”是指去除dna序列，该序列将被去除序列两侧的区域连接在一起。
[0058]-术语“表达”是指核酸翻译成蛋白，例如编码肿瘤特异性或病原体特异性抗原的mrna翻译成蛋白。
[0059]-术语“表达控制序列”是指调节与其有效连接的异源核酸序列的表达的核酸序列，例如剪接在cmv基因组中并编码与表达控制序列有效连接的抗原蛋白的异源多核苷酸的表达。当表达控制序列控制和调节核酸序列的转录和翻译(视情况)时，表达控制序列与核酸序列有效连接。因此，表达控制序列可以包括合适的启动子、增强子、转录终止子、蛋白编码基因前面的起始密码子(atg)、内含子的剪接信号以及维持该基因的正确阅读框以允许mrna的正确翻译，和终止密码子。术语“控制序列”旨在至少包括其存在可以影响表达的组分，并且还可以包括其存在是有利的其他组分，例如前导序列和融合配偶体序列。表达控制序列可以包括启动子。启动子是足以指导转录的最小序列。还包括足以使启动子依赖性基因表达为细胞类型特异性地、组织特异性地可控或可被外部信号或试剂诱导的那些启动子元件；此类元件可能位于基因的5'或3'区域。包括组成型和诱导型启动子(参见例如bitter等人,methods in enzymology 153:516-544,1987)。例如，在细菌系统中进行克隆时，可以使用诱导型启动子，例如噬菌体lambda的pl、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂合启动子)等。在一个实施方案中，当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可以使用衍生自哺乳动物细胞基因组(例如，金属硫蛋白启动子)或衍生自哺乳动物病毒(例如，逆转录病毒长末端重复序列；腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5k启动子)的启动子。通过重组dna或合成技术产生的启动子也可用于提供核酸序列的转录。可以将多核苷酸插入表达载体，包括病毒载体，其含有促进插入的基因序列在宿主中的有效转录的启动子序列。表达载体通常含有复制起点、启动子以及允许对转化细胞进行表型选择的特定核酸序列。
[0060]-术语“片段”是指显示至少一个有用表位的多肽的部分。短语“多肽的功能片段”是指保留片段所衍生自的多肽的活性或活性的可测量部分的所有多肽片段。片段的大小可以变化，例如，可以小到能够结合抗体分子的表位，大到能够参与细胞内表型变化的特征性诱导或编程的大多肽。表位是能够结合响应于与抗原接触而产生的免疫球蛋白的多肽区域。
[0061]-如本文所用，术语“异源的”是指衍生自不同来源或物种的异源多肽或多核苷酸
(例如，抗原或蛋白)。在本发明的一些实施方案中，异源序列来自与第二序列不同的遗传来源，例如病毒或其他生物。在具体的示例中，异源抗原不衍生自cmv。
[0062]-术语“免疫原性肽”(或“抗原肽”)是指包含等位基因特异性基序或其他序列(例如n末端重复序列)的肽，使得所述肽将结合mhc分子并诱导针对免疫原性肽衍生自的抗原的细胞毒性t淋巴细胞(“ctl”)应答或b细胞应答(例如抗体产生)。在一个实施方案中，使用序列基序或其他方法，例如本领域已知的神经网络(neural net)或多项式确定(polynomial determination)来鉴定免疫原性肽。通常，使用算法确定肽的“结合阈值”，以选择那些具有表明它们以特定亲和力结合的可能性高并且具有免疫原性的得分的肽。算法基于特定位置处的特定氨基酸对mhc结合的影响、特定位置处的特定氨基酸对抗体结合的影响，或包含基序的肽中的特定取代对结合的影响。在免疫原性肽的背景下，“保守性残基”是在肽的特定位置以比随机分布所预期的显著更高的频率出现的残基。在一个实施方案中，保守性残基是mhc结构可以提供与免疫原性肽的接触点的残基。
[0063]-术语“免疫”是指在暴露于免疫原性试剂时能够产生保护性应答的状态。保护性应答可以是抗体介导的或免疫细胞介导的，并且可以针对特定病原体或肿瘤抗原。免疫可以主动获得(例如通过暴露于天然的或在药物组合物中的免疫原性试剂)或被动获得(例如通过施用抗体或体外刺激和扩增的t细胞)。
[0064]-对于生物组分(例如，核酸分子、蛋白、细胞器或细胞)来说，术语“分离的”或“非天然存在的”是指从自然状态改变或移除的生物组分。例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，但与其天然状态下的共存物质部分或完全分离的相同的核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或肽可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境例如宿主细胞中。通常，分离的核酸或肽的制备物含有至少约80％纯、至少约85％纯、至少约90％纯、至少约95％纯、大于95％纯、大于约96％纯、大于约97％纯、大于约98％纯或大于约99％纯的核酸或肽。“非天然存在的”或已经被“分离的”核酸和蛋白包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸和蛋白以及化学合成的核酸。“分离的多肽”是已从其自然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的多肽。
[0065]-术语“个体”和“患者”在本文中可互换使用，并且是指动物，例如人类，其被提供使用本发明的药物组合物的治疗，包括预防性治疗。
[0066]-本文所用的术语“受试者”是指哺乳动物、灵长类动物和/或人类，并且包括所有哺乳动物，例如哺乳动物，例如非人灵长类动物(尤其是高等灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛、马。
[0067]-术语“突变”是指核酸或多肽序列与正常、共有或“野生型”序列的任何差异。突变体是包含突变的任何蛋白或核酸序列。此外，具有突变的细胞或生物体也可称为突变体。编码序列突变的一些类型包括点突变(单个核苷酸或氨基酸的差异)；沉默突变(不导致氨基酸变化的核苷酸差异)；缺失(缺失一个或多个核苷酸或氨基酸的差异，直至并包括基因的整个编码序列的缺失)；移码突变(其中不可被3整除的数量的核苷酸的缺失的差异导致氨基酸序列发生改变)。导致氨基酸中差异的突变也可称为氨基酸取代突变。氨基酸取代突变可以通过氨基酸序列中特定位置相对于野生型的氨基酸变化来描述。
[0068]-如本文所用，“失活性突变(inactivating mutation)”是病毒基因中最终导致病毒蛋白的功能降低或功能完全丧失的任何突变。
[0069]-术语“有效连接的”是指当将第一核酸序列置于与第二核酸序列的功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列有效连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列有效连接。通常，有效连接的dna序列是连续的，并且在必要时连接两个蛋白编码区，在同一阅读框中。
[0070]-术语“开放阅读框”(orf)是指编码氨基酸而不具有任何内部终止密码子的一系列核苷酸三联体(密码子)。这些序列通常可翻译成肽。
[0071]-如本文所用，术语“预防(prevent、preventing和prevention)”是指预防性措施，其中目的是减少受试者在给定时间段内发展病理状况或病症的几率。此类减少可以反映在例如受试者中病理状况或病症的至少一种症状的延迟发作上。
[0072]-术语“预防性(prophylactic)”是指向未表现出疾病迹象或仅表现出早期迹象的受试者施用的治疗，目的是降低发生病理的风险。具体地，受试者中hiv或siv感染的预防性治疗是指允许受试者成为精英控制者(elite controller，ec)的治疗，所述精英控制者即具有相对高的cd4
t细胞计数(例如，优于每微升500个cd4
t细胞)和/或在没有任何抗逆转录病毒治疗(art)的情况下长时间保持临床上检测不到的血浆hiv-1rna水平(例如，hiv rna《50个拷贝/ml)。
[0073]-术语“治疗性”是指向表现出疾病早期的或已建立的迹象的受试者施用的治疗。
[0074]-术语“治愈性”是指出于治愈疾病，即，使疾病的任何迹象消失或变得不可检测的目的向患有疾病的受试者施用的治疗。
[0075]-术语“多核苷酸”是指核糖核酸(rna)或脱氧核糖核酸(dna)的聚合物。多核苷酸由四个碱基组成；腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶/尿嘧啶(尿嘧啶用于rna中)。来自核酸的编码序列指示了由核酸编码的蛋白的序列。
[0076]
术语“蛋白”、“肽”、“多肽”和“氨基酸序列”在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸残基的聚合物。聚合物可以是线性或支化的，它可以包含修饰的氨基酸或氨基酸类似物，并且它可以被除氨基酸之外的化学部分中断。该术语还涵盖经过天然或干预修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记或生物活性组分缀合。
[0077]-术语“纯化的”不需要绝对的纯度；相反，它旨在作为一个相对术语。因此，例如，纯化的蛋白制备物是其中所指的蛋白比在细胞内或生产反应室(视情况而定)内的天然环境中的蛋白更纯的制备物。
[0078]-术语“重组的”是指具有非天然存在的序列或具有由两个另外分开的序列区段的人工组合制备的序列的核酸。这种人工组合可以通过化学合成，或更常见的通过对分离的核酸区段进行人工操作，例如通过基因工程技术来实现。
[0079]-术语“样品”或“生物样品”是指从受试者获得的生物样品，例如细胞、组织样品的液体。在一些情况下，生物样品含有基因组dna、rna(包括mrna和microrna)、蛋白或其组合。样品的示例包括但不限于唾液、血液、血清、尿液、脊髓液、组织活检物、手术标本、细胞(例如pbmc、白细胞、淋巴细胞或免疫系统的其他细胞)和尸检材料。
[0080]-术语“序列同一性”是指两个核酸序列之间，或两个氨基酸序列之间的相似性，其以序列之间的相似性表示，并且也称为序列同一性。序列同一性通常以同一性百分比(或相似性或同源性)来衡量；百分比越高，两个序列越相似。
[0081]
用于比较的序列比对方法是本领域公知的。多种程序和比对算法描述于：smith和waterman(adv.appl.math.2:482,1981)；needleman和wunsch(j.mol.biol.48:443,1970)；pearson和lipman(pnas usa 85:2444,1988)；higgins和sharp(gene,73:237-244,1988)；higgins和sharp(cabios 5:151-153,1989)；corpet等人(nuc.acids res.16:10881-10890,1988)；huang等人(comp.appls biosci.8:155-165,1992)；和pearson等人(meth.mol.biol.24:307-31,1994)。altschul等人(nature genet.,6:119-129,1994)详细介绍了序列比对方法和同源性计算。比对工具align(myers和miller,cabios4:11-17,1989)或lfasta(pearson和lipman,1988)可用于进行序列比较(internet1996,w.r.pearson和the university of virginia,fasta20u63版本2.0u63,发布日1996年12月)。align将整个序列相互比较，而lfasta比较局部相似的区域。这些比对工具及其各自的教程可在ncsa网站上找到。或者，对于大于约30个氨基酸的氨基酸序列的比较，可以使用设置为默认参数的默认blosum62矩阵来使用blast 2序列函数(空位存在成本为11，且每个残基空位成本为1)。当比对短肽(少于约30个氨基酸)时，应使用设置为默认参数的pam30矩阵来使用blast 2序列函数进行比对(开放空位9，延伸空位1罚分)。blast序列比较系统可以从例如ncbi网站获得；另参见altschul等人,j.mol.biol.215:403-410,1990；gish.&states,nature genet.3:266-272,1993；madden等人meth.enzymol.266:131-141,1996；altschul等人,nucleic acids res.25:3389-3402,1997；和zhang&madden,genome res.7:649-656,1997。
[0082]
蛋白的直系同源物的通常特征在于在使用设置为默认参数的align时，与特定蛋白的氨基酸序列的全长比对中计数为拥有大于75％的序列同一性。当通过这种方法评估时，与参考序列具有甚至更大相似性的蛋白将显示增加的同一性百分比，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％或至少98％的序列同一性。此外，可以在公开的肽的特定结构域的全长上比较序列同一性。
[0083]
当比较显著少于整个序列的序列同一性时，同源序列将通常在10-20个氨基酸的短窗口内具有至少80％的序列同一性，并且可能具有至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的序列同一性，取决于它们与参考序列的相似性。可以使用lfasta确定此类短窗口上的序列同一性；方法描述在ncsa网站。本领域技术人员将理解，提供这些序列同一性范围仅用于指导；获得超出所提供范围的非常重要的同源物是完全有可能的。
[0084]
然而，由于遗传密码的简并性，不显示高度同一性的核酸序列也可能编码相似的氨基酸序列。应当理解，可以使用这种简并性来改变核酸序列以产生各自编码基本上相同的蛋白的多个核酸序列。
[0085]-如本文所用，术语“治疗”是指改善疾病的体征或症状或病理状况的干预。例如，在hiv感染的情况下，hiv rna(病毒载量)和cd4 t淋巴细胞(cd4)细胞计数是抗逆转录病毒治疗(art)应答和hiv疾病进展的两个替代标志物，已用于管理和监测hiv感染数十年。因此，可以通过治疗前后“经治疗”的人类的血浆病毒rna载量来评估治疗效果，如果其降低了至少约10％、20％、30％、40％、50％，更优选至少约70％，还更优选至少约75％或80％或85％或90％或95％或98％或99％或甚至更多(99.5％、99.8％、99.9％、100％)，则认为治疗是有效的，和/或可以通过在治疗前后监测cd4细胞计数来评估治疗效果，如果cd4细胞的绝对计数增加至少约5％、10％、15％、20％、25％，更优选至少约30％，还更优选至少约35％或
40％或45％或50％或55％或60％或65％或甚至更多，则认为治疗是有效的。如本文所用，关于疾病、病理状况或症状的术语“治疗(treatment、treat和treating)”还指治疗的任何可观察到的有益效果。有益效果可以通过例如以下来证明：易感受试者中疾病的临床症状的延迟发作、疾病的一些或所有临床症状的严重性降低、疾病的进展更慢、疾病复发的次数降低、受试者的整体健康或幸福感的改善或通过本领域公知的对特定疾病特异的其他参数。治疗性治疗是在疾病的体征和症状已发展后向受试者施用的治疗。预防性治疗是对未表现出疾病迹象或仅表现出早期迹象的受试者施用的治疗，目的是降低病理发展的风险。具体地，受试者中hiv或siv感染的预防性治疗是指允许受试者成为精英控制者(ec)的治疗，所述精英控制者(ec)即在不存在任何抗逆转录病毒治疗(art)的情况下长时间内具有相对高的cd4
t细胞计数(例如，高于每微升500个cd4
t细胞)和/或维持临床上检测不到的血浆hiv-1rna水平(例如，hiv rna《50个拷贝/ml)。预防性治疗是向患有疾病的受试者施用的治疗，目的是治愈疾病，即，使疾病的任何迹象消失或变得不可检测。
[0086]-术语“载体”可以包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包括一个或多个选择标记基因和本领域已知的其他遗传元件，包括指导核酸表达的启动子元件。载体可以是病毒载体，例如cmv载体。病毒载体可从野生型或减毒病毒构建，包括复制缺陷病毒。载体也可以是非病毒载体，包括本领域已知的任何质粒。
[0087]-术语“病毒”是指在活细胞内繁殖的微观感染性生物体。病毒基本上由被蛋白外壳(衣壳)包围的核酸核心(病毒基因组)组成，并且具有仅在活细胞内复制的能力。“病毒复制”是通过至少一个病毒生命周期的发生来产生额外的病毒颗粒。病毒可以破坏宿主细胞的正常功能，导致细胞以病毒决定的方式运转。例如，病毒感染可以导致细胞产生细胞因子或对细胞因子作出响应，而未感染的细胞通常不会这样做。术语“溶解性(lytic)”或“急性”病毒感染是指其中病毒基因组经复制和表达，产生生产病毒衣壳所必需的多肽的病毒感染。成熟的病毒颗粒离开宿主细胞，导致细胞裂解。或者，特定的病毒种类也可以进入“溶原性”或“潜伏性”感染。在潜伏的建立中，病毒基因组被复制，但衣壳蛋白不会产生并被组装成病毒颗粒。
[0088]-如本文所用，术语“microrna”或“mirna”是指参与基因表达控制的一类主要的生物分子。例如，在人类心脏、肝脏或脑中，mirna在组织特化或细胞谱系决定中发挥作用。此外，mirna影响多个过程，包括早期发育、细胞增殖和细胞死亡，以及细胞凋亡和脂肪代谢。大量的mirna基因、多样的表达模式和丰富的潜在mirna靶标表明mirna可以是遗传多样性的重要来源。
[0089]
成熟mirna通常是18-25个核苷酸的非编码rna，其调节包括与mirna互补的序列的mrna的表达。已知这些小rna分子通过调节mrna的稳定性和/或翻译来控制基因表达。例如，mirna与靶标mrna的3'utr结合并抑制翻译。mirna还可以与靶标mrna结合并通过rnai通路介导基因沉默。mirna还可以通过引起染色质凝聚来调节基因表达。
[0090]
mirna通过与mirna识别元件(mre)结合来沉默一个或多个特定mrna分子的翻译，所述mirna识别元件定义为在mrna转录物上某处与mirna直接碱基配对并与其相互作用的任何序列。通常，mre存在于mrna的3'非翻译区(utr)，但它也可以存在于编码序列或5'utr中。mre不需要与mirna完美互补，其通常仅具有数个碱基与mirna互补，并且通常在这些互补碱基中含有一个或多个错配。mre可以是能够被mirna充分结合的任何序列，使得与mre有
效连接的基因(例如对于体内生长必不可少或增强的cmv基因)的翻译被mirna沉默机制例如risc所抑制。
具体实施方式
[0091]
本发明涉及一种预防或治疗有此需要的受试者中的感染性疾病的方法，包括向受试者施用：
[0092]
1)对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗，
[0093]
2)干扰素α阻断剂，和/或
[0094]
3)iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂。
[0095]
在一个实施方案中，所述方法包括向受试者施用1)对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗，2)干扰素α阻断剂，和3)iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂。
[0096]
在另一个实施方案中，所述方法包括向受试者施用1)对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗和2)干扰素α阻断剂。
[0097]
在另一个实施方案中，所述方法包括向受试者施用1)对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗和3)iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂。
[0098]
在一些实施方案中，所述方法是预防性治疗的方法或治愈性治疗的方法。
[0099]
在一个具体实施方案中，所述方法是预防性方法并且包括向受试者施用1)对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗，2)干扰素α阻断剂，和3)iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂。
[0100]
本发明进一步涉及一种组合，其用作药物，其中所述组合包含：
[0101]
1)对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗，
[0102]
2)干扰素α阻断剂，和/或
[0103]
3)iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂。
[0104]
本发明还涉及用于预防或治疗有此需要的受试者中的感染性疾病的组合，其中所述组合包含：
[0105]
1)对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗，
[0106]
2)干扰素α阻断剂，和/或
[0107]
3)iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂。
[0108]
在一个实施方案中，使用的组合包含1)对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗，2)干扰素α阻断剂，和3)iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂。
[0109]
在一个实施方案中，使用的组合包含1)对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗和2)干扰素α阻断剂。
[0110]
在一个实施方案中，使用的组合包含1)对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗和3)iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂。
[0111]
在一个具体的实施方案中，所述组合将被预防性地使用并且包含1)对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗，2)干扰素α阻断剂，和3)iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂。
[0112]
本发明进一步涉及用于预防或治疗有此需要的受试者中的感染性疾病的试剂盒，
其中所述试剂盒包含至少2个部分，并且包含：
[0113]
1)包含对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗的第一部分，
[0114]
2)任选地，包含干扰素-α阻断剂的第二部分，和
[0115]
3)包含iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂的第三部分。
[0116]
如本文所用，术语“疫苗”是指可以施用给哺乳动物例如人类以赋予对疾病或其他病理状况的免疫，例如被动或主动免疫的免疫原性产品或组合物。疫苗可预防性或治疗性(防治性或治愈性地)使用。因此，疫苗可用于降低发生疾病(例如感染)的可能性或降低疾病或病况的症状的严重程度、限制疾病或病况(例如感染)的进展或限制疾病或病况的复发。
[0117]
在一个实施方案中，cd8疫苗是预防性(preventive)疫苗。在另一个实施方案中，cd8疫苗是治疗性(therapeutic)疫苗。如本文所用，治疗性疫苗可以是防治性(prophylactic)疫苗或治愈性(curative)疫苗。在一些实施方案中，cd8疫苗是防治性疫苗。在其他实施方案中，cd8疫苗是治愈性疫苗。
[0118]
在一个实施方案中，cd8疫苗诱导对至少一种感染性疾病相关抗原的免疫耐受。在一个实施方案中，cd8疫苗因此对至少一种感染性疾病相关抗原特异。
[0119]
如本文所用，术语“免疫耐受”和“ts”是同义词。免疫耐受是免疫系统识别抗原并产生通常与其他免疫修饰相关的对随后遇到相同抗原时的无反应性(anergy)的生理能力。在本发明中，免疫耐受的主要特征在于cd8
t细胞的活性，其抑制呈递至少一种感染性疾病相关抗原的cd4
t细胞的激活。整体而言，每当一种或几种感染性疾病相关抗原参与cd4
t细胞(其呈递衍生自感染性疾病相关抗原的表位)的特异性激活时，由本发明所述的cd8疫苗产生的mhc-1b/e-限制性cd8
t细胞可以引起对cd4
t细胞激活的特异性抑制/预防。
[0120]
在一个实施方案中，本发明的cd8疫苗引发抑制剂mhc-1b/e限制性cd8
t细胞。在另一个实施方案中，本发明的cd8疫苗包含抑制剂mhc-1b/e限制性cd8
t细胞或基本上由其组成。
[0121]
如本文所用，对于细胞群体，“基本上由
……
组成”意指抑制剂mhc-1b/e限制性cd8
t细胞群体是所述组合物中仅有的一种具有生物活性的治疗剂或药剂。
[0122]
在一个实施方案中，抑制剂mhc-1b/e限制性cd8
t细胞通过离体或体内诱导丧失hla-1a的树突细胞、自然杀伤细胞或b细胞来产生。
[0123]
在一个实施方案中，抑制剂mhc-1b/e限制性cd8
t细胞是细胞溶解性cd8
t细胞。在一个实施方案中，抑制剂mhc-1b/e限制性cd8
t细胞是非细胞溶解性cd8
t细胞。
[0124]
在一个实施方案中，cd8疫苗是主动疫苗。在另一个实施方案中，cd8疫苗是被动疫苗。
[0125]
如本文所用，术语“主动疫苗(active vaccine)”是指诱导主动免疫的疫苗，且指使身体暴露于抗原以产生适应性免疫应答的过程：反应需要数天/数周才能产生，但可以持续长时间—甚至终生。“被动疫苗(passive vaccine)”诱导被动免疫，且指提供例如抗体或细胞以防止感染的过程；它提供即时但短暂的保护—数周至数月。
[0126]
在一些实施方案中，cd8疫苗包含抑制剂mhc-1b/e限制性cd8
t细胞。
[0127]
在一些实施方案中，cd8疫苗是引发抑制剂mhc-1b/e-限制性cd8
t细胞的疫苗，所述疫苗选自由以下组成的组：
[0128]-主动疫苗，其是包含至少一种病原体特异性抗原的活病毒载体，其中活病毒载体选自由巨细胞病毒、慢病毒、痘苗病毒、腺病毒和质粒组成的组；
[0129]-主动疫苗，其包含至少一种病原体特异性抗原和至少一种非致病性细菌，优选至少一种减毒或灭活的致病性细菌；
[0130]-主动疫苗，其是呈递至少一种mhc-1b/e限制性抗原和至少一种mhc-ii限制性抗原的离体产生的树突细胞、自然杀伤细胞或b细胞群体，并且其中mhc-1b/e限制性抗原是病原体特异性抗原；
[0131]-被动疫苗，其是体外产生的自体mhc-1b/e限制性cd8
t细胞群体，识别mhc-1b/e限制性病原体特异性抗原。
[0132]
根据本发明的一个实施方案，cd8疫苗是包含至少一种感染性疾病相关抗原的活病毒载体。
[0133]
在一个实施方案中，上文所述的活病毒载体是主动疫苗。
[0134]
在一个实施方案中，上文所述的活病毒载体选自巨细胞病毒、慢病毒、痘苗病毒、腺病毒和质粒的组。
[0135]
在一个实施方案中，上文所述的活病毒载体是选自重组巨细胞病毒、重组慢病毒、重组痘苗病毒、重组腺病毒和重组质粒的组的重组载体。
[0136]
根据一个实施方案，活病毒载体是重组痘苗病毒。重组痘苗病毒已经从不同的痘苗病毒毒株中产生。例如，已开发出多种用作重组疫苗开发中的底物的高度减毒、宿主限制性、非复制或复制性差的痘病毒毒株，包括正痘病毒(orthopoxvirus)、改良型安卡拉痘苗(modified vaccinia ankara，mva)、nyvac、禽痘病毒(avipoxvirus)、alvac和trovac。
[0137]
根据本发明的一个实施方案，cd8疫苗是cmv载体。
[0138]
在一个实施方案中，cmv载体是主动疫苗。
[0139]
在一个实施方案中，cmv载体包含编码至少一种感染性疾病相关抗原的核酸序列。在一个具体的实施方案中，cmv载体包含编码至少一种人类免疫缺陷病毒(hiv)抗原的核酸序列。
[0140]
在一个实施方案中，cd8疫苗是表达至少一种感染性疾病相关抗原的重组cmv，其中所述抗原是异源抗原。因此，在一个实施方案中，感染性疾病相关抗原可以衍生自任何不在cmv中天然表达的蛋白。
[0141]
在一个实施方案中，cmv载体不表达活性ul128和ul130蛋白或其直系同源物。
[0142]
如本文所用，术语“直系同源物”是指感染其他物种的cmv的同源基因。
[0143]
在一个实施方案中，cmv载体不表达活性ul146和ul147蛋白或其直系同源物。
[0144]
在一个实施方案中，cmv载体表达至少一种活性ul40蛋白，和/或至少一种活性us27蛋白，和/或至少一种活性us28蛋白。在一个实施方案中，至少一种活性ul40蛋白、至少一种活性us27和至少一种活性us28蛋白可以是ul40、us27和us28的直系同源物或同源物。
[0145]
在一些实施例中，由于编码ul128、ul130、ul146或ul147或其直系同源物的核酸序列中存在突变，cmv载体不表达活性ul128、ul130、ul146或ul147蛋白。
[0146]
如本文所用，术语“突变”可指导致活性ul128、ul130、ul146或ul147蛋白缺乏表达的任何突变。此类突变可包括点突变、移码突变、少于编码蛋白的所有序列的缺失(截短突变)、或编码蛋白的所有核酸序列的缺失、或任何其他突变。例如，包含所述突变的cmv描述
在wo2014138209中，其通过引用以其整体并入本文。
[0147]
在进一步的实施例中，载体不表达活性ul128、ul130、ul146或ul147蛋白或其直系同源物，因为载体中存在包含反义或rnai序列(sirna或mirna)的核酸序列，其抑制ul128、ul130、ul146或ul147蛋白或其直系同源物的表达。
[0148]
在一个实施方案中，突变和/或反义和/或rnai可以以任何组合使用以产生缺乏活性ul128、ul130、ul146或ul147或其直系同源物的cmv载体。
[0149]
在一个实施方案中，cmv载体包含所有上述修饰并且进一步包含用作mirna应答元件(mre)的核酸序列，其在由内皮细胞表达的mirna的存在下沉默表达。
[0150]
如本文所用，术语“mirna应答元件”或“mre”是指在mrna转录物上某处与mirna直接碱基配对并与其相互作用的任何序列。因此，mirna可以通过与mirna识别元件(mre)结合来沉默一种或多种特定mrna分子的翻译。通常，mre存在于mrna的3'非翻译区(utr)，但它也可以存在于编码序列或5'utr中。mre不一定与mirna完全互补，通常仅具有数个与mirna互补的碱基，并且通常在这些互补碱基中含有一个或多个错配。mre可以是能够被mirna充分结合从而翻译与mre有效连接的基因的任何序列。此类基因的示例包括但不限于ie2和ul79基因，或其直系同源物，或对体内生长必不可少或增强其的任何cmv基因。例如，在wo201875591中描述了包含所述mre的cmv，其通过引用以其全文并入本文。
[0151]
在一个实施方案中，mre可以是在由内皮细胞表达的mirna的存在下沉默表达的任何mirna识别元件。在一个实施方案中，载体的mre在mir-126-3p、mir-130a、mir-210、mir-221/222、mir-378、mir-296和mir-328的一个或多个的存在下沉默表达。
[0152]
在一个实施方案中，mre在mir-126-3p的存在下沉默表达。
[0153]
在一个实施方案中，mre在mir-126-3p的存在下沉默ul122(ie2)和ul79的表达。
[0154]
本领域技术人员可以从文献中选择经验证的、推定的或突变的mre序列，其将被预测在内皮细胞或骨髓细胞例如巨噬细胞中表达的mirna存在下诱导沉默。然后本领域技术人员可以获得表达构建体，其中报告基因(例如荧光蛋白、酶或其他报告基因)具有由启动子例如组成型活性启动子或细胞特异性启动子驱动的表达。然后可以将mre序列引入表达构建体中。可以将表达构建体转染到合适的细胞中，并且用感兴趣的mirna转染细胞。报告基因的表达缺失表明mre在mirna的存在下使基因表达沉默。
[0155]
在一个实施方案中，cmv载体包含编码至少一种感染性疾病相关抗原的第一核酸序列，并且不表达活性ul128、ul130、ul146和ul147蛋白或其直系同源物，并且表达至少一种活性ul40、us27和/或us28蛋白或其直系同源物。
[0156]
在另一个实施方案中，cmv载体包含编码至少一种感染性疾病相关抗原的第一核酸序列，任选地包含与对于cmv生长必不可少或增强cmv生长的cmv基因有效连接的第一microrna识别元件(mre)的第二核酸序列，其中mre在由内皮谱系细胞表达的microrna的存在下沉默表达，并且不表达活性ul128、ul130、ul146和ul147蛋白或其直系同源物，并且表达至少一种活性ul40、us27和/或us28蛋白或其直系同源物。
[0157]
在一个实施方案中，cmv载体可包含本领域已知的额外失活突变以提供不同的免疫应答，例如失活性us11突变或失活性ul82(pp71)突变，或任何其他失活性突变。
[0158]
在一个实施方案中，cmv载体还可以在编码本领域已知对于体内病毒传播(即，从细胞到细胞的传播)必不可少或增强其的病毒蛋白的一个或多个病毒基因中包含至少一个
失活性突变。此类失活性突变可来自点突变、移码突变、截短突变或编码病毒蛋白的所有核酸序列的缺失。失活性突变包括病毒基因中最终导致病毒蛋白的功能降低或功能完全丧失的任何突变。
[0159]
在一个实施方案中，本文所述的cmv载体可包含可防止宿主间传播的突变，从而使病毒无法感染免疫受损的或其他可能因cmv感染而面临并发症的受试者。在另一个实施方案中，本文所述的cmv载体还可包含导致免疫显性和非免疫显性表位的呈递以及非经典mhc限制的突变。此类cmv突变描述在例如美国专利公开2013-0136768；2014-0141038；和pct申请公开wo 2014/138209中，其全部通过引用并入本文。
[0160]
在一个实施方案中，本文所述的cmv载体中的突变不影响该载体再次感染先前已感染cmv的受试者的能力。因此，在一个实施方案中，cmv载体能够重复感染生物体。
[0161]
在一个实施方案中，cmv载体是人cmv(hcmv)或恒河猴cmv(rhcmv)载体。
[0162]
在一个实施方案中，本文公开的cmv载体可以通过将包含编码感染性疾病相关抗原的序列的dna插入cmv基因组的必需或非必需区域来制备。
[0163]
在一个实施方案中，感染性疾病相关抗原是cmv的异源抗原。
[0164]
在一个实施方案中，所述方法可以进一步包括从cmv基因组中删除一个或多个区域。在一个实施方案中，所述方法可以包括体内重组。因此，所述方法可以包括在存在包含侧翼是与cmv基因组部分同源的dna序列的异源dna的供体dna的情况下在细胞相容培养基中用cmv dna转染细胞，由此将异源dna引入cmv基因组中，并然后任选地回收通过体内重组修饰的cmv。
[0165]
在一个实施方案中，所述方法还可以包括切割cmv dna以获得切割的cmv dna，将异源dna与切割的cmv dna连接以获得杂合cmv-异源dna，用所述杂合cmv-异源dna转染细胞，并然后任选地回收通过异源dna的存在修饰的cmv。由于包括了体内重组，因此所述方法还提供了包含并非天然存在于cmv中的编码非cmv原有的多肽的供体dna的质粒，所述供体dna位于cmv dna区段内，该区段将另外与cmv基因组的必需或非必需区域共线(co-linear)，使得来自cmv必需或非必需区域的dna位于供体dna的侧翼。当需要时，可以将异源dna插入cmv中以产生导致此dna的稳定整合及其表达的任何方向的重组cmv。
[0166]
在一个实施方案中，重组cmv载体中编码感染性疾病相关抗原的dna还可包括启动子。启动子可以来自任何来源，例如疱疹病毒，包括内源性cmv启动子，例如hcmv、rhcmv、鼠cmv(mcmv)或其他cmv启动子。启动子也可以是非病毒启动子，例如ef1a启动子。启动子可以是截短的转录活性启动子，其包含由病毒提供的反式激活蛋白反式激活的区域和由其衍生截短的转录活性启动子的全长启动子的最小启动子区域。启动子可以包含对应于最小启动子的dna序列和上游调节序列的结合。最小启动子包含cap位点和tata盒(关于基本转录水平的最小序列；未调节的转录水平)；“上游调节序列”包含一个或多个上游元件和一个或多个增强子序列。此外，术语“截短的”表示全长启动子不完全存在，即，全长启动子的一些部分已被去除。并且，截短的启动子可以衍生自疱疹病毒，例如mcmv或hcmv，例如hcmv-ie或mcmv-ie。基于碱基对，全长启动子的大小可以减少最多40％，甚至最多90％。启动子也可以是修饰的非病毒启动子。关于hcmv启动子，参考美国专利号5,168,062和5,385,839，其通过引用并入本文。关于用质粒dna转染细胞进行表达，参考feigner等人(1994),j.biol.chem.269,2550-2561，其通过引用并入本文。并且，关于直接注射质粒dna作为一种
针对多种感染性疾病的简单且有效的疫苗接种方法，参考ulmer等人(1993),science.259:1745-49，其通过引用并入本文。因此，可以通过直接注射载体dna来使用载体落在本发明的范围内。
[0167]
还公开了可以被插入包含截短的转录活性启动子的重组病毒或质粒中的表达盒。所述表达盒可以进一步包括功能性截短的聚腺苷酸化信号；例如经截短但仍然具有功能性的sv40多聚腺苷酸化信号。考虑到大自然提供了更大的信号，截短的聚腺苷酸化信号具有功能性确实令人惊讶。截短的聚腺苷酸化信号解决了重组病毒(例如cmv)的插入大小限制问题。表达盒还可以包括与其插入的病毒或系统异源的dna；并且此dna可以是本文所述的异源dna。
[0168]
为了在载体中表达所公开的感染性疾病相关抗原，所述感染性疾病相关抗原的蛋白编码序列应该与指导该蛋白转录和翻译的调节或核酸控制序列“有效连接”。
[0169]
根据本发明的另一个实施方案，cd8疫苗包含至少一种感染性疾病相关抗原和非致病性细菌。
[0170]
在一个实施方案中，cd8疫苗包含至少一种感染性疾病相关抗原和至少一种非致病性细菌。
[0171]
在一个实施方案中，包含至少一种感染性疾病相关抗原和非致病性细菌的cd8疫苗是主动疫苗。
[0172]
如本文所用，术语“非致病性细菌(non-pathogenic bacterium)”是指通常不在哺乳动物，优选人类中诱发任何病理的细菌。
[0173]
在一个实施方案中，非致病性细菌是活的。
[0174]
在一个实施方案中，本文所述的非致病性细菌是共生细菌。
[0175]
如本文所用，术语“共生细菌(commensal bacterium)”或指微生物，其存在于被上皮细胞覆盖的体表并暴露于外部环境(例如，胃肠道和呼吸道、阴道、皮肤等)。在归因于肠道共生细菌的众多提出的健康益处中，它们与宿主免疫系统相互作用的能力现已得到充分证明。共生细菌是技术人员公知的。非限制性示例包括芽孢杆菌属(bacillus sp.)(例如，凝结芽孢杆菌(b.coagulans))、乳杆菌属(lactobacillus sp.)、动物双歧杆菌(bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(bifidobacterium infantis)、长双歧杆菌(bifidobacterium longum)、两歧双歧杆菌(bifidobacterium bifidum)、乳酸双歧杆菌(bifidobacterium lactis)、埃希氏大肠杆菌(escherichia coli)、嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)、保加利亚乳杆菌(lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(lactobacillus casei)、副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)、约氏乳杆菌(lactobacillus johnsonii)、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)、罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)、短乳杆菌(lactobacillus brevis)、加氏乳杆菌(lactobacillus gasseri)、唾液乳杆菌(lactobacillus salivarius)、唾液乳杆菌水杨素亚种(lactobacillus salivarius salicinius)、德氏乳杆菌(lactobacillus delbureckii)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillus delbureckii bulgaricus)、德氏乳杆菌乳酸亚种(lactobacillus delbureckii lactis)、乳酸乳球菌(lactococcus lactis)、嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)等。
[0176]
在一个实施方案中，共生细菌选自由以下组成的组：嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、乳酸乳球菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌。
[0177]
在一个实施方案中，共生细菌是乳杆菌属，优选植物乳杆菌。
[0178]
在另一个实施方案中，共生细菌是乳杆菌属，优选鼠李糖乳杆菌。
[0179]
在一个实施方案中，可以使用非致病性细菌，例如两种或更多种共生细菌的组合。
[0180]
在另一个实施方案中，本文所述的非致病性细菌选自减毒或灭活的致病性细菌。
[0181]
如本文所用，术语“致病性细菌”是指在人类中诱导病理的细菌。这样的细菌是技术人员公知的，并且包括李斯特菌种(listeria species)(例如，单核细胞增生李斯特菌(listeria monocytogenes))、棒状杆菌种(corynebacterium species)、分枝杆菌种(mycobacterium species)、红球菌种(rhococcus species)、真细菌种(eubacteria species)、博德特氏菌种(bortadella species)和诺卡氏菌种(nocardia species)以及其他。优选地，致病性细菌选自分枝杆菌种，且更优选为牛分枝杆菌(mycobacterium bovis)。
[0182]
如本文所用，术语“减毒的致病性细菌”是指由于一个或多个突变或一种或多种减毒处理(例如，化学处理和/或在特定培养基上的连续传代)从而与它们的野生型对应物相比毒力较低的细菌。此类减毒的致病性细菌是本领域技术人员公知的。减毒的致病性细菌的非限制性示例包括减毒的鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)和分枝杆菌。制备此类灭活的致病性细菌的方法属于本领域公知常识的一部分。作为此类方法的示例，可以引用噬菌体介导的裂解、化学灭活例如福尔马林处理、热灭活、物理灭活例如冻干(例如，扩展冷冻干燥(extended freeze drying))或u.v或伽马辐照或微波暴露，或其任何组合。
[0183]
在一个实施例中，本文所述的非致病性细菌可以是重组的或非重组的。
[0184]
在一个实施方案中，本文所述的减毒的致病性细菌是致病性细菌例如bcg的减毒衍生物。在一个实施方案中，所述致病性细菌的减毒衍生物对应于表达或产生至少一种hiv蛋白的重组鼠伤寒沙门氏菌或重组分枝杆菌(例如，bcg)。在另一个实施方案中，所述致病性细菌的衍生物不表达任何hiv蛋白。
[0185]
在一个实施方案中，本文所述的非致病性细菌用作cd8疫苗的致耐受性佐剂。因此，在一个实施方案中，非致病性细菌是致耐受性佐剂。
[0186]
如本文所用，术语“致耐受性佐剂(tolerogenic adjuvant)”是一种实体，当通过粘膜或皮内或上皮内途径与下文定义的合适的感染性疾病相关抗原一起施用时，其将诱导并且将优选维持对抗原的免疫耐受状态，从而能够治疗人类的感染性疾病感染。
[0187]
在一个实施方案中，致耐受性佐剂在与感染性疾病相关抗原组合时诱导或维持对病毒抗原的免疫耐受性，从而治疗相关感染性疾病。
[0188]
在一个实施方案中，非致病性细菌，尤其是益生菌(probiotics)和共生细菌，可以用作本发明上下文中的致耐受性佐剂。
[0189]
在一个具体的实施方案中，乳杆菌属，优选植物乳杆菌和/或鼠李糖乳杆菌，可以用作本发明上下文中的致耐受性佐剂。
[0190]
在一个实施方案中，非致病性细菌，例如两种或更多种共生细菌的组合，可以用作本发明的上下文中的致耐受性佐剂。
[0191]
在另一个实施方案中，代替减毒或除减毒之外还，可以将本文所述的致病性细菌
灭活以用作本发明上下文中的致耐受性佐剂，但减毒的致病性细菌也可在灭活后使用。
[0192]
在一些实施方案中，包含非致病性细菌或减毒的致病性细菌的致耐受性佐剂进一步包含益生元(prebiotic)。
[0193]
如本文所用，“益生元”是诱导某些细菌生长或活性的物质。益生元具有不同的性质，包括例如糖类，例如寡糖和多糖。
[0194]
任何益生元均可与本文所述的非致病性细菌或减毒的致病性细菌组合使用。
[0195]
在一些实施方案中，致耐受性佐剂包含至少一种选自由以下组成的组的益生元：果寡糖(fructooligosaccharide，fos)、半乳寡糖(galactooligosaccharide，gos)、菊粉(inulin)、反式半乳寡糖(trans-galactooligosaccharide，tos)、beneo synergy 1(syn1)、寡果糖-菊粉(oligofructose-inulin)、乳果糖(lactulose)、燕麦纤维(oat fibera)、发芽大麦(germinated barley)、水解的瓜尔胶(hydrolyzed guar guma)、抗性淀粉(resistant starcha)、车前草(plantago ovataa)、β-葡聚糖(beta glucana)和果胶(pectina)。
[0196]
根据本发明的另一个实施方案，cd8疫苗是离体产生的呈递mhc-ii和mhc-1b/e限制性抗原的树突、自然杀伤或b细胞群体。
[0197]
在一个实施方案中，离体产生的呈递mhc-ii和mhc-1b/e限制性抗原的树突、自然杀伤或b细胞群体是主动疫苗。
[0198]
在一个实施方案中，mhc-1b/e限制性抗原是感染性疾病相关病原体特异性抗原。
[0199]
在一个实施方案中，感染性疾病相关抗原或病原体特异性抗原是hiv或siv衍生的mhcib/e结合抗原。
[0200]
在一个实施方案中，本文所述的hiv衍生的mhcib/e结合抗原选自seq id no:1至seq id no:4的组。
[0201]
在一个实施方案中，hiv衍生的mhcib/e结合抗原具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：序列rmyspvsil(seq id no:1)、序列peiviydym(seq id no:2)、序列talsegatp(seq id no:3)和序列rirtwkslv(seq id no:4)。
[0202]
在一些实施方案中，mhc-ii限制性肽或抗原是hla-dr限制性肽或抗原。hla-dr限制性肽的示例包括例如具有以下序列之一的hla-dr结合抗原：qgqmvhqaisprtln(seq id no:7)(gag p24)、geiykrwiilglnki(seq id no:8)(gag p24)、krwiilglnkivrmy(seq id no:9)(gag p24)或frkytaftipsinne(seq id no:10)(pol rt)。
[0203]
在一个实施方案中，hla-dr-限制肽衍生自hiv，优选衍生自hiv-1。
[0204]
在一个实施方案中，hla-dr限制性肽是具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的hiv衍生的hla-dr结合抗原：序列qgqmvhqaisprtln(seq id no:7)(gag p24)、序列geiykrwiilglnki(seq id no:8)(gag p24)、序列krwiilglnkivrmy(seq id no:9)(gag p24)和序列frkytaftipsinne(seq id no:10)(pol rt)。
[0205]
在一个实施方案中，呈递mhc-ii和mhc-1b/e限性制肽的树突、自然杀伤或b细胞群体是同种异体细胞群体。在一个优选的实施方案中，呈递mhc-ii和mhc-1b/e限制性肽的树突、自然杀伤或b细胞群体是自体细胞群体。
[0206]
如本文所用，“同种异体细胞(allogeneic cell)”是指从一个受试者(供体)分离并注入另一受试者(接受体或宿主)的细胞。
[0207]
如本文所用，“自体细胞(autologous cell)”是指被分离并注回同一受试者(接受体或宿主)的细胞。
[0208]
本发明因此还涉及用于产生呈递mhc-ii和mhc-1b/e限制性肽的树突、自然杀伤或b细胞群体的离体方法。
[0209]
在一个实施方案中，用于产生呈递mhc-ii和mhc-1b/e限制性肽的树突、自然杀伤或b细胞群体的离体方法包括：
[0210]
a.任选地，使用抑制tap表达或活性的试剂降低不成熟的树突细胞、自然杀伤细胞或b细胞中的mhc-1a表达，
[0211]
b.将hla-dr和/或mhc-1b/e限制性肽加载到不成熟的树突细胞，和
[0212]
c.使加载的不成熟的树突细胞、自然杀伤细胞或b细胞成熟。
[0213]
在一个实施方案中，不成熟的树突细胞由单核细胞树突细胞前体(mo-dc)前体产生。
[0214]
如本文所用，术语“单核细胞树突细胞前体”是指单核细胞和其他骨髓前体(例如，髓样前体)。这些细胞可以分离自它们所在的任何组织，尤其是淋巴组织，例如脾脏、骨髓、淋巴结和胸腺。单核细胞树突细胞前体可以从脐带血分离。单核细胞树突细胞前体也可以通过本领域公知的任何技术从外周血单核细胞或骨髓样品中分离。单核细胞树突状细胞前体也可以从冷冻样品分离。从以上提供的各种来源(包括血液和骨髓)分离mo-dc前体和不成熟的树突细胞的方法可以通过多种途径实现。通常，从个体收集细胞群体并富集mo-dc前体。例如，包含mo-dc前体的混合细胞群体可以通过白细胞去除术(leukapheresis)、单采术(apheresis)、密度离心、差异裂解(differential lysis)、过滤、抗体淘选(antibody panning)(例如，流式细胞术、正或负选择)或制备血沉棕黄层(buffy coat)从外周血中获得。在一个实施方案中，mo-dc前体是未激活的，因此，在一个实施方案中，所选择的方法必须不激活mo-dc前体。例如，如果选择抗体淘选来富集细胞群体的前体，则所选择的抗体必须不会激活细胞(例如，通过诱导钙离子的流入，其可能是由于抗体结合的表面上的分子交联而导致的结果)。通常，在抗体淘选时，使用消除巨噬细胞、b细胞、自然杀伤细胞、t细胞等的抗体。抗体还可用于正选择表达cd14的单核细胞样细胞。
[0215]
在一个实施方案中，mo-dc前体和不成熟的树突细胞可以从自体pbmc(外周血单核细胞)获得。在一个实施方案中，mo-dc前体和不成熟的树突细胞可以从自体组织获得。在一个实施方案中，mo-dc前体和不成熟的树突细胞可以从hla匹配的健康个体获得。
[0216]
在一个实施方案中，不成熟的树突细胞可以从诱导多能干细胞(ips)获得。在一个实施方案中，不成熟的树突细胞可以从cd34

树突细胞前体获得。在一个实施方案中，不成熟的树突细胞可以从人类树突细胞系获得。在一个实施方案中，不成熟的树突细胞可以从cd34

树突细胞前体细胞系获得。可用于产生不成熟的树突细胞的细胞系的非限制性示例是cd34

人类急性髓性白血病细胞系(mutz-3)，参见，例如，masterson等人,(2002)blood,100:701-703。
[0217]
在另一个实施方案中，mo-dc前体和不成熟的树突细胞可以从hla匹配的健康个体获得，用于转化为不成熟的树突细胞、成熟、激活和施用给有此需要的hla匹配的受试者。
[0218]
在一个实施方案中，将从未激活的mo-dc前体或cd34

树突细胞前体富集的细胞群体离体或体外培养以进行分化、成熟和/或扩增。
[0219]
简言之，离体分化通常包括在一种或多种分化剂的存在下培养mo-dc前体或cd34

树突细胞前体，或包含未激活的mo-dc前体或cd34

树突细胞前体的细胞群体。此类试剂通常包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、白细胞介素4(il-4)、白细胞介素6(il-6)、白细胞介素3(il-3)、干细胞因子(scf)、fms相关酪氨酸激酶3配体(flt3-l)或其组合。此类试剂可以单独使用或组合使用。例如，gm-csf可以单独使用或与一种或多种细胞因子组合使用，例如il-4、il-6、il-3、sc和/或flt3-l。在一个实施方案中，未激活的mo-dc前体或cd34

树突细胞前体被分化以形成能够诱导大量t细胞的激活和增殖的不成熟的树突细胞。
[0220]
产生和维持不成熟的树突细胞前体的合适培养条件是本领域公知的。此类培养基包括但不限于rpmi 1640、dmem、x-vivo和补充细胞因子的类似产品。培养基可以补充有血清、氨基酸、维生素、二价阳离子等，以促进细胞分化为树突细胞。在一个实施方案中，树突细胞前体可以在无血清培养基中培养。此类培养条件可以任选地排除任何动物源性产品。通常，将gm-csf以约2至约200ng/ml，或通常为20ng/ml的gm-csf的浓度添加到培养基中，将il-4以约2至约200ng/ml，或通常为20ng/ml的il-4的浓度添加到培养基中。将il-6以约2至约200ng/ml，或通常为20ng/ml的il-6的浓度添加到培养基中。将il-3以约2至约200ng/ml，或通常为20ng/ml的il-3的浓度添加到培养基中，将scf以约10至约1000ng/ml，或通常为100ng/ml的scf的浓度添加到培养基中，并且将flt3-l以约10至约1000ng/ml，或通常为100ng/ml的flt3-l的浓度添加到培养基中。当经分化以形成不成熟的树突细胞时，前体通常表现出在不成熟的树突细胞中见到的细胞表面蛋白的典型表达模式，例如，细胞通常是cd14-、hla-dr

、cd11c

、cd83-并表达低水平的cd86。实施例2中描述了生产不成熟的树突细胞前体的非限制性示例。在这个阶段，不成熟的树突细胞能够通过专门的摄取机制来捕获可溶性抗原。
[0221]
在一个实施方案中，mhc-1a在不成熟的树突细胞中或在树突细胞中的表达被抑制tap表达或活性的试剂降低。
[0222]
根据一个实施方案，不成熟的树突细胞或树突细胞在其表面表达水平降低的主要组织相容性1a类(mhc-1a)分子。根据一个实施方案，不成熟的树突细胞或树突细胞在其表面不表达主要组织相容性1a类(mhc-1a)。
[0223]“mhc 1a类呈递”是指通过hla-a、hla-b和/或hla-c分子进行的“经典”呈递，而mhc ib类呈递是指通过hla-e、hla-f、hla-g和/或hla-h分子进行的“非经典”抗原呈递。
[0224]
抑制mhc-1a分子表达的方法是公知的。例如，tap转运蛋白(与抗原加工相关的转运蛋白)的抑制导致mhc-1a分子的表达降低，从而促进hla-e分子在树突细胞表面的表达。
[0225]
抑制内质网中的tap转运蛋白的示例性方法包括但不限于crispr-cas-9技术、沉默rna、用来自cmv(巨细胞病毒)的ul-10病毒蛋白转染的dc或使用病毒蛋白。
[0226]
沉默tap表达的病毒基因或蛋白的示例包括但不限于hsv-1icp47蛋白、水痘病毒ul49.5蛋白、巨细胞病毒us6蛋白或γ疱疹病毒ebv bnlf2a蛋白、hiv nef蛋白。
[0227]
另一种方法是使用化学产品抑制mhc 1a类分子的表达，而不改变致耐受性dc表面的hla-e表达。化学产品的示例包括但不限于5'-甲基-5'-硫腺苷(5
’‑
methyl-5
’‑
thioadenosine)或来普霉素b(leptomycin b)。
[0228]
在一个实施方案中，tap抑制剂是从含有来自bhv-1的ul49.5基因的pgem4z载体合
成的rna。
[0229]
在一个实施方案中，可以通过电穿孔将tap抑制剂有效地引入不成熟的树突细胞中。在另一个实施方案中，可以通过转染将tap抑制剂有效地引入不成熟的树突细胞中。
[0230]
mhc-1a的耗减(depletion)可以通过本领域已知的方法监测。例如，抗体还可用于监测不成熟的树突细胞或树突细胞是否为mhc-1a-/低
。
[0231]
在一个实施方案中，可以在至少一种预定抗原的存在下将不成熟的树突细胞或树突细胞加载(或脉冲(pulsed))。在一个实施方案中，mhc-1a在不成熟的树突细胞或树突细胞中的表达先前已被降低。在另一个实施方案中，mhc-1a在不成熟的树突细胞中的表达先前没有被降低。
[0232]
在一个实施方案中，不成熟的树突细胞或树突细胞呈递与hla-dr和/或mhc-1b/e分子特异性结合的肽或抗原。因此，在一个实施方案中，可以通过在成熟之前、之后或期间通过使不成熟的树突细胞或树突细胞与预定肽或抗原接触来将不成熟的树突加载(或脉冲)。在一个实施方案中，mhc-1a耗减的不成熟的树突细胞或树突细胞呈递与hla-dr和/或mhc-1b/e分子特异性结合的肽或抗原。因此，在一个实施方案中，可以通过在成熟之前、之后或期间通过使不成熟的树突细胞或树突细胞与预定肽或抗原接触来将mhc-1a耗减的不成熟的树突加载(或脉冲)。
[0233]
用于本发明的合适的预定抗原可包括任何感染性疾病相关抗原。感染性疾病相关抗原在下文中描述并且包括例如hiv或siv mhc-ib/e肽或抗原。
[0234]
使树突细胞与抗原接触的方法是本领域通常已知的(参见steel和nutman,j.immunol.160:351-60(1998)；tao等人,j.immunol.158:4237-44(1997)；dozmorov和miller,cell immunol.178:187-96(1997)；inaba等人,jexp med.166:182-94(1987)；macatonia等人,j exp med.169:1255-64(1989)；de bruijn等人,eur.j.immunol.22:3013-20(1992)；其公开内容通过引用并入本文)。通常，通过本发明的方法获得的不成熟的树突不成熟细胞可以在预定抗原的存在下在合适的培养条件下进行培养，如上所述。任选地，不成熟的树突细胞可以在含或不含gm-csf和/或成熟剂的典型树突细胞培养基中与预定抗原混合。在用抗原培养至少约10分钟至约2天后，可去除抗原并向培养基补充成熟剂。也可以将gm-csf和其他细胞因子(例如，il-4)添加到培养基中。
[0235]
在一个实施方案中，不成熟的树突细胞或树突细胞可以用编码mhc-1b/e分子的质粒转染。在另一个实施方案中，不成熟的树突细胞或树突细胞可以用编码肽-mhc-lb/e复合物的质粒转染。
[0236]
在一个实施方案中，不成熟的树突细胞(任选地，mhc-1a被耗减且先前已被加载)可以用成熟剂来成熟。
[0237]
在一个实施方案中，可以使不成熟的树突细胞成熟以形成成熟的树突细胞。成熟的树突细胞失去摄取抗原的能力，且细胞显示出共刺激细胞表面分子的表达上调并分泌各种细胞因子。例如，成熟的树突细胞可以表达更高水平的hla-dr和/或mhc-1b/e抗原，并且通常被鉴定为mhc-1a-/low
、cd80

、cd83

和cd86

。更多的mhc表达导致dc表面上的抗原密度增加，而共刺激分子cd80和cd86的上调通过共刺激分子的对应物(例如，t细胞上的cd28)来增强t细胞激活信号。
[0238]
制备成熟树突细胞的方法是本领域公知的。例如，不成熟的树突细胞可以通过使
不成熟的树突细胞与有效量或浓度的树突细胞成熟剂接触而成熟。树突细胞成熟剂可包括，例如，bcg、ifnγ、lps、tnfα、il-1β、il-6、pge2、poly i:c、tlr7/8-配体或其组合。
[0239]
例如，通常使不成熟的dc与有效量的lps接触约1小时至约48小时，优选24小时。不成熟的树突细胞可以在合适的成熟培养条件下培养和成熟。合适的组织培养基包括rpmi 1640、dmem、x-vivo等。组织培养基可以补充有氨基酸、维生素、细胞因子例如gm-csf、二价阳离子等，以促进细胞成熟。
[0240]
出于示例性目的，树突细胞可以在il-1β、il-6、pge2、tnf-α、lps、poly i:c的存在下成熟。通常，一般使用约2ng/ml的il-1β、30ng/ml的il-6、1μg/ml的pge2、10ng/ml的tnf-α、250ng/ml的lps、150ng/ml的poly i:c。
[0241]
树突细胞的成熟可以通过本领域已知的用于树突细胞的方法来监测。细胞表面标志物可以在本领域熟知的测定法，例如流式细胞术、免疫组织化学等中检测。还可以监测细胞的细胞因子产生(例如，通过elisa、另一种免疫测定或通过使用寡核苷酸阵列)。本发明的成熟dc也失去了摄取抗原的能力，其可以通过本领域普通技术人员熟知的摄取测定法进行分析。
[0242]
因此，本发明还涉及通过如上所述的离体方法可获得或获得的呈递mhc-ii和mhc-1b/e限制性肽的成熟的树突细胞群体。
[0243]
除了树突细胞之外，还可以使用其他免疫细胞类型来获得呈递mhc-ii和mhc-1b/e限制性肽或抗原的成熟免疫细胞群体。
[0244]
在一个实施方案中，cd8疫苗是主动疫苗，其是离体产生的呈递至少一种mhc-1b/e限制性抗原和至少一种mhc-ii限制性抗原的自然杀伤细胞群体。
[0245]
在一个实施方案中，自然杀伤细胞是k562细胞系。
[0246]
在一些实施方案中，自然杀伤细胞经修饰以表达mhc-1b/e。
[0247]
在另一个实施方案中，cd8疫苗是主动疫苗，其是离体产生的呈递至少一种mhc-1b/e限制性抗原和至少一种mhc-ii限制性抗原的天然b群体。
[0248]
在一个实施方案中，b细胞是细胞系。
[0249]
在一些实施方案中，b细胞经修饰以表达mhc-1b/e。
[0250]
因此，本发明还涉及通过如上所述的离体方法可获得或获得的呈递mhc-ii和mhc-1b/e限制性肽的成熟的自然杀伤细胞群体。
[0251]
本发明还涉及通过如上所述的离体方法可获得或获得的呈递mhc-ii和mhc-1b/e限制性肽的成熟b细胞群体。
[0252]
根据本发明的另一个实施方案，cd8疫苗是离体产生的mhc-1b/e限制性cd8
t细胞群体。
[0253]
在一个实施方案中，离体产生的mhc-1b/e限制性cd8
t细胞群体是被动疫苗。
[0254]
在一个实施方案中，mhc-1b/e限制性cd8
t细胞群体识别mhc-1b/e限制性感染性疾病相关抗原。
[0255]
本发明因此还涉及一种用于产生mhc-1b/e限制性cd8
t细胞群体的离体方法。
[0256]
在一个实施方案中，产生mhc-1b/e限制性cd8
t细胞群体的离体方法包括：
[0257]
a.在呈递mhc-1b/e-限制性肽从而能够产生mhc-1b/e-限制性cd8
t细胞的树突、自然杀伤或b细胞群体的存在下培养初始cd8
t细胞，和
[0258]
b.扩增mhc-lb/e限制性cd8
t细胞。
[0259]
在一个实施方案中，将cd8
t细胞，优选初始cd8
t细胞，通过本领域公知的任何技术从血液样品中分离。在一个实施方案中，将cd8
t细胞，优选初始cd8
t细胞，通过流式细胞术从pbmc(外周血单核细胞)中分离。在一个实施方案中，cd8
t细胞，优选初始cd8
t细胞，可以从冷冻的pbmc中分离。在一个实施方案中，cd8
t细胞是同种异体t细胞，优选同种异体初始t细胞。在另一个实施方案中，cd8
t细胞是自体t细胞，优选自体初始t细胞。t细胞分离或纯化可以通过正或负选择来实现，包括但不限于使用针对cd8、cd56、cd57、cd45ro、cd45ra、ccr7等的抗体。例如，初始cd8
t细胞分离可以在一步或两步程序中进行。两步程序可以包括第一步，其中通过耗减非初始t细胞来富集初始t细胞，和第二步，其中用cd8抗体标记富集的初始t细胞用于随后的正选择。
[0260]
在一个实施方案中，将cd8
t细胞，优选初始cd8
t细胞，更优选自体初始cd8
t细胞，在刺激剂的存在下用肽或抗原脉冲的树突细胞(例如，用mhc-ib/e抗原脉冲的致耐受性树突细胞)进行刺激。刺激后，可以洗涤细胞，例如用pbs洗涤，并且可以用抗cd8抗体对其进行染色，并使用mhc肽五聚物对其进行分选。将纯化的cd8
t细胞富集，并可用于以下激活步骤。
[0261]
在一个实施方案中，cd8
t细胞，优选初始cd8
t细胞，更优选自体初始cd8
t细胞与呈递mhc-lb/e-限制性肽的树突细胞共孵育。在一个实施方案中，所述呈递mhc-lb/e-限制性肽的树突细胞也呈递mhc-ii限制性肽。
[0262]
在一个实施方案中，树突细胞在其表面不表达mhc-1a分子。在一个实施方案中，树突细胞在其表面表达少于50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％的mhc-1a分子(即，相对于在树突细胞表面表达的所有mhc分子)。在一个实施方案中，树突细胞在其表面表达至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的mhc-1b分子。在一个实施方案中，树突细胞在其表面仅表达mhc-1b分子。
[0263]
在一个实施方案中，树突细胞在其表面表达mhc-ii分子。在一个实施方案中，树突细胞在其表面表达mhc-ii分子和mhc-ib分子。
[0264]
在一个实施方案中，将cd8
t细胞，优选初始cd8
t细胞，更优选自体初始cd8
t细胞，与上文所述的致耐受性树突细胞接触。因此，在培养结束时，t细胞是抑制剂mhc-1b/e限制性cd8
t细胞并且可以诱导免疫耐受。
[0265]
在一个实施方案中，用于产生本发明的mhc-1b/e限制性cd8
t细胞的培养进行至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天或更多天。在一个实施方案中，用于产生本发明的mhc-1b/e限制性cd8
t细胞的培养进行至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周或更多周。在一个实施方案中，用于产生本发明的mhc-1b/e限制性cd8
t细胞的培养进行至少1个月、至少2个月、至少3个月或更多个月。
[0266]
在一个实施方案中，在本文所述的用于产生自体mhc-1b/e限制性cd8

t细胞群体的方法中使用mhc-ib/e自然杀伤细胞或mhc-ib/e b细胞代替mhc-ib/e树突细胞。
[0267]
在一个实施方案中，离体产生的mhc-1b/e限制性cd8
t细胞群体基于它们与特定hla-e抗原或肽(例如，特定四聚体)结合的能力通过流式细胞术分离。
[0268]
在一个实施方案中，然后将由此获得的分离的mhc-1b/e限制性cd8

t细胞群体通过将这些细胞在至少一种t细胞激活剂的存在下进行培养来离体扩增。t细胞激活剂的示例
antigen)。
[0280]
在一个实施方案中，本文所述的病原体特异性抗原可以由有利地包含在合适的重组微生物中的病毒核酸序列的表达产生。在一个实施方案中，所述重组微生物是cmv，优选如上文所述的cmv载体。在另一个实施方案中，所述重组微生物是细菌，优选与上文所述的非致病性细菌不同的细菌。
[0281]
在一个实施方案中，本文所述的病原体特异性抗原可以是密码子优化的。许多病毒，包括hiv和其他慢病毒，使用大量稀有密码子，并且通过改变这些密码子为对应于目标受试者(例如，人类)中常用的密码子，能够实现抗原的增强表达。例如，hiv蛋白中使用的稀有密码子可以突变为在高度表达的人类基因中频繁出现的那些(andre等人(1998)j virol 72,1497-1503)。
[0282]
在一个实施方案中，本文所述的病原体特异性抗原可以是含有来自不同病原体株的序列片段的共有序列或嵌合抗原(mosaic antigen)。
[0283]
在一个实施方案中，本文所述的颗粒抗原是病毒抗原。
[0284]
在一个实施方案中，颗粒抗原选自病毒颗粒、重组病毒颗粒、病毒样颗粒、重组病毒颗粒、在其表面呈递一种或多种病毒肽或表位的聚合物微粒、缀合病毒蛋白(conjugate viral protein)和多联体病毒蛋白(concatemer viral protein)。
[0285]
在一个实施方案中，本文所述的颗粒抗原可以是一种或多种病毒蛋白或肽，重组的或非重组的，且以缀合物或多联体的形式存在。
[0286]
在一个实施方案中，本文所述的病原体特异性抗原可以衍生自人类免疫缺陷病毒(hiv)、猴免疫缺陷病毒(siv)、单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、乳头瘤病毒、疟原虫(plasmodium parasite)和结核分枝杆菌。
[0287]
在一个实施方案中，本文所述的病原体特异性抗原是hiv或siv抗原。在一个实施方案中，hiv或siv抗原选自由任意hiv或siv毒株组成的组。
[0288]
在一个实施方案中，hiv或siv抗原选自由gag、tat、pol、vif、nef和env抗原组成的组。
[0289]
在一个实施方案中，本文所述的病原体特异性抗原衍生自来自受感染细胞的免疫原性凋亡小体(apoptotic body)或衍生自组织裂解物。
[0290]
受感染的细胞可能衍生自组织活检或循环受感染细胞的扩增。所述受感染的细胞可以被病毒、细菌、寄生生物体或蠕虫生物体感染。
[0291]
来自受感染细胞的免疫原性凋亡小体可以例如通过包括多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、伊达比星(idarubicin)和米托蒽醌(mitoxanthrone)的蒽环类药物(anthracycline)；经奥沙利铂(oxaliplatin)、uvc、uvb或辐照处理的释放凋亡小体的受感染细胞来获得。
[0292]
组织裂解物的示例包括但不限于淋巴结、滑液或炎性组织裂解物。
[0293]
在一个实施方案中，本文所述的病原体特异性抗原是来自hiv或siv来源的抗原。
[0294]
在一个实施方案中，免疫原性体(immunogenic body)获得自hiv感染的cd4
t细胞。
[0295]
在一个实施方案中，本文所述的病原体特异性抗原是来自hiv来源的抗原。
[0296]
在一个实施方案中，本文所述的病原体特异性抗原是hiv抗原。
[0297]
归因于由突变、重组、插入和/或缺失导致的hiv基因组中的巨大可变性，已将hiv分类为多个组、亚组、类型、亚型和基因型。有两个主要的hiv组(hiv-1和hiv-2)和许多亚组，因为hiv基因组持续变异。各组和各亚组之间的主要区别与病毒包膜有关。将hiv-1分类为主要组(main group，m)，将所述m组分成至少九个遗传上不同的亚型。这些是亚型a、b、c、d、f、g、h、j和k。还存在由先前亚型的体内重组产生的许多其他亚型(例如，crf)。在一个实施方案中，hiv抗原与特定的hiv组、亚组、类型、亚型或多种亚型的组合有关。
[0298]
在一个实施方案中，hiv病毒是hiv-1或hiv-2，优选hiv-1。在另一个实施方案中，hiv-1病毒来自m组和亚型b(hxb2)。
[0299]
在一个实施方案中，hiv抗原是灭活的完整hiv病毒。
[0300]
如本文所用，“灭活的完整hiv”意指已灭活且不再具有感染性的完整hiv颗粒。
[0301]
在一个实施方案中，hiv抗原是自体hiv抗原。在另一个实施方案中，hiv抗原不是自体hiv抗原。在一个实施方案中，hiv抗原由灭活的自体hiv病毒制成。
[0302]
如本文所用，“由灭活的自体hiv病毒制成的抗原”是指包含感染待治疗的人类并且被合适地灭活以安全地治疗性施用给人类的hiv病毒或由其组成的抗原。因此，在实践中，为了制备本发明的疫苗组合物，从待治疗的人类中，更具体地从所述人类的cd4
t细胞中分离hiv病毒。将如此分离的hiv病毒进行培养和灭活。
[0303]
在一个实施方案中，hiv抗原选自由hiv gag、hiv env、hiv rev、hiv tat、hiv nef、hiv pol和hiv vif组成的组。
[0304]
在一个实施方案中，hiv抗原包含hiv gag、hiv env、hiv rev、hiv tat、hiv nef、hiv pol和hiv vif蛋白的一个或多个表位。
[0305]
在一个实施方案中，hiv抗原包含至少hiv gag和/或hiv pol蛋白。或者或另外，所述衍生自hiv病毒的抗原可包含由gag编码的一种或多种蛋白，例如衣壳蛋白(p24)和基质蛋白(p1)，和/或由pol编码的一种或多种蛋白，例如整合酶(integrase)、逆转录酶和蛋白酶。
[0306]
在一个实施方案中，本文所述的病原体特异性抗原是mhcib/e结合抗原。在一个实施方案中，病原体特异性抗原是mhcib/e结合肽。
[0307]
在一个实施方案中，本文所述的病原体特异性抗原是hiv或siv衍生的mhcib/e结合肽。在一个实施方案中，病原体特异性抗原是hiv或siv衍生的mhcib/e结合抗原。
[0308]
在一个实施方案中，本文所述的hiv衍生的mhcib/e结合抗原选自seq id no:1至seq id no:4的组。在一个实施方案中，hiv衍生的mhcib/e结合肽选自seq id no:1至seq id no:4的组。
[0309]
在一个实施方案中，hiv衍生的mhcib/e结合抗原具有氨基酸序列rmyspvsil(seq id no:1)。在一个实施方案中，hiv衍生的mhcib/e结合抗原具有氨基酸序列peiviydym(seq id no:2)。在一个实施方案中，hiv衍生的mhcib/e结合抗原具有氨基酸序列talsegatp(seq id no:3)。在一个实施方案中，hiv衍生的mhcib/e结合抗原具有氨基酸序列rirtwkslv(seq id no:4)。
[0310]
如本文所用，术语“α干扰素”(ifn-α)或“干扰素-α”是指由9号染色体上的簇编码并全部与相同的ifn受体结合的超过20个相关但不同的成员的家族。其中，ifn-α2具有3种重组变体(α2a、α2b、α2c)，这取决于细胞来源，而ifn-α2b是人类基因组中的主要变体。有证
据表明，每个亚型对ifnar具有不同的结合能力，调节靶细胞中的信号转导事件和生物学效应。
[0311]
在一个实施方案中，本文所述的干扰素-α阻断剂是中和循环ifn-α的药剂和/或阻断ifn-α信号传导的药剂，和/或耗减产生ifn-α的细胞的药剂，和/或阻断ifn-α产生的药剂。
[0312]
在一个实施方案中，本文所述的干扰素-α阻断剂包含至少一种选自以下的药剂：中和循环ifn-α的药剂和/或阻断ifn-α信号传导的药剂，和/或耗减产生ifn-α的细胞的药剂，和/或阻断ifn-α产生的药剂。
[0313]
在一个实施方案中，中和循环ifn-α的药剂和/或阻断ifn-α信号传导的药剂，和/或耗减产生ifn-α的细胞的药剂，和/或阻断ifn-α产生的药剂是ifn-α拮抗剂。
[0314]
在一些实施方案中，其中干扰素-α阻断剂选自由以下组成的组：中和循环α干扰素的药剂、阻断干扰素-α信号传导的药剂、耗减产生ifn-α的细胞的药剂和/或阻断ifn-α产生的药剂，其中中和循环α干扰素的药剂选自包含主动抗-ifn-α疫苗(包括antiferon)或被动抗-ifn-α疫苗(包括抗-ifn-α抗体或抗-ifn-α超免疫血清)的组，其中干扰素-α信号传导的阻断剂选自抗i型干扰素r1或r2抗体的组或选自干扰素-α内源性调节剂(包括sosc1或芳烃受体)，其中耗减产生ifn-α的细胞的药剂是耗减浆细胞样树突细胞(plasmacytoid dendritic cell，pdc)的药剂，并且其中阻断ifn-α产生的药剂是阻断pdc产生ifn-α的药剂。
[0315]
在一些实施方案中，干扰素-α阻断剂是中和循环α干扰素的药剂，其选自由主动抗-ifn-α疫苗(包括antiferon)或被动抗-ifn-α疫苗(包括抗-ifn-α抗体或抗-ifn-α超免疫血清)组成的组，并且其中干扰素-α信号传导的阻断剂选自由抗i型干扰素r1或r2抗体、sosc1和芳烃受体组成的组。
[0316]
如本文所用，术语“α干扰素拮抗剂”是指干扰或抑制ifn-α生物活性的物质。如本文所用，“ifn-α生物活性”是指由于ifn-α与其受体ifnar(ifnar1/ifnar2异二聚体)结合而产生的任何活性。例如，此类结合能够激活jak-stat信号传导级联，并触发包括jak、tyk2、stat蛋白在内的许多蛋白的酪氨酸磷酸化。因此，干扰素的信号传导阻断剂可以中和inf-α与其受体的固定和/或阻断由ifn-α与其受体结合诱导的信号传导级联。在一些实施方案中，ifn-α拮抗剂选自主动抗-ifn-α疫苗(例如，antiferon)或被动抗-ifn-α疫苗(例如，抗-ifn-α抗体或抗-ifn-α超免疫血清)的组。参见例如等人(2018).cytokine growth factor rev 40:99-112。
[0317]
在一个实施方案中，本文所述的中和循环ifn-α的药剂是ifn-α配体抑制剂。
[0318]
在一个实施方案中，中和循环ifn-α的药剂是抗-ifn-α抗体。抗-ifn-α抗体的示例包括但不限于西法木单抗(sifalimumab)、隆利组单抗(rontalizumab)、mmha-1克隆、mmha-2克隆、mmha-6克隆、mmha-8克隆、mmha-9克隆、mmha-11克隆、mmha-13克隆和mmha-17克隆。
[0319]
在一个实施方案中，中和循环ifn-α的药剂是抗ifn-α超免疫血清。
[0320]
在一个实施方案中，本文所述的中和循环ifn-α的药剂是antiferon，例如ifn-α-kinoid。
[0321]
在一个实施方案中，中和循环干扰素α的药剂是结合ifn-α的可溶性受体。
[0322]
在一个实施方案中，中和循环ifn-α的药剂不中和循环iii型干扰素。
[0323]
在一个实施方案中，本文所述的阻断ifn-α信号传导的药剂是ifnar拮抗剂。
[0324]
在一个实施方案中，阻断ifn-α信号传导的药剂是ifnar1拮抗剂。在另一个实施方案中，阻断ifn-α信号传导的药剂是ifnar2拮抗剂。
[0325]
在一个实施方案中，阻断ifn-α信号传导的药剂是与ifnar1或ifnar2结合的抗体。
[0326]
在一个实施方案中，阻断ifn-α信号传导的药剂是拮抗i型ifn信号传导通路的药剂。
[0327]
在一个实施方案中，阻断ifn-α信号传导的药剂可以是i型ifn信号传导通路的抑制剂。i型ifn信号传导通路抑制剂是本领域公知的，并且包括而不限于jak1/2抑制剂和stat抑制剂。因此，在一个实施方案中，阻断ifn-α信号传导的药剂选自jak1/2抑制剂和stat抑制剂。jak1/2抑制剂的非限制性示例包括鲁索替尼(ruxolitinib)、托法替尼(tofacitinib)和巴瑞替尼(baricitinib)。
[0328]
在一个实施方案中，阻断ifn-α信号传导的药剂可以是i型ifn信号传导通路的内源性负调节剂。内源性负调节剂是本领域公知的，并且包括而不限于socs1/3、foxo3、芳烃受体(ahr)或其他负调节剂。因此，在一个实施方案中，阻断干扰素信号传导的药剂选自socs1/3、foxo3或芳烃受体(ahr)。
[0329]
在一个实施方案中，阻断ifn-α信号传导的药剂是pas化的(pasylated)拮抗剂。i型ifn的pasy化的拮抗剂是本领域已知的，参见例如nganou-makamdop等人(2018).plos pathog 14(8):e1007246。
[0330]
在一个实施方案中，本文所述的ifn-α拮抗剂是耗减产生ifn-α的细胞的药剂。
[0331]
如本文所用，术语“产生ifn-α的细胞”是指产生ifn-α的任何细胞。具体地，浆细胞样树突细胞(pdc)是ifn-α的主要生产者是本领域公知的。因此，在一个实施方案中，耗减产生ifn-α的细胞的药剂会耗减pdc。
[0332]
在一个实施方案中，耗减产生ifn-α的细胞的药剂是抗体。在一个实施方案中，抗体耗减pdc，例如抗cd123抗体(即，抗il-3ra)。
[0333]
在一个实施方案中，本文所述的ifn-α拮抗剂是阻断ifn-α产生的药剂。
[0334]
在一个实施方案中，阻断ifn-α产生的药剂是抗体。在一个实施方案中，抗体阻断pdc产生ifn-α。所述抗体可以是例如抗bdca2(血液dc抗原2(blood dc antigen 2))抗体。
[0335]
在一个实施方案中，阻断干扰素信号传导的药剂不阻断iii型干扰素信号传导。
[0336]
在一些实施方案中，干扰素-α阻断剂选自由以下组成的组：
[0337]-抗-ifn-α抗体，优选西法木单抗、隆利组单抗、mmha-1克隆、mmha-2克隆、mmha-6克隆、mmha-8克隆、mmha-9克隆、mmha-11克隆、mmha-13克隆或mmha-17克隆，
[0338]-抗ifn-α超免疫血清，
[0339]-antiferon，优选ifn-α-kinoid，
[0340]-结合ifn-α的可溶性受体，
[0341]-ifnarl或ifnar2拮抗剂，优选与ifnarl或ifnar2结合的抗体，
[0342]-选自stat抑制剂和jak1/2抑制剂的i型ifn信号传导通路抑制剂，例如鲁索替尼、托法替尼或巴瑞替尼，
[0343]-i型ifn信号传导通路的内源性负调节剂，选自socs1/3、foxo3、芳烃受体(ahr)或另一种负调节剂，
[0344]-pas化的拮抗剂，
[0345]-耗减pdc的抗体，优选抗cd123(即，抗il-3ra)抗体，
[0346]-阻断pdc产生ifn-α的抗体，优选抗bdca2(blood dc antigen 2)抗体。
[0347]
如本文所用，术语“iii型干扰素”，也称为干扰素-λ(ifn-λ)，是指天然存在的和/或重组的iii型干扰素-λ家族的细胞因子。人类中有四种ifn-λ成员，ifn-λ1/il-29、ifn-λ2/il-28a、ifn-λ3/il-28b、ifn-λ4。
[0348]
在一个实施方案中，iii型干扰素是ifn-λ。
[0349]
在一个实施方案中，ifn-λ包含至少一种ifn-λ亚型(例如，ifn-λ1、ifn
‑‑
λ2、ifn-λ3、ifn-λ4)。
[0350]
在一个实施方案中，ifn-λ选自ifn-λ1、ifn-λ2、ifn-λ3、ifn-λ4或其组合的组。
[0351]
在一个实施方案中，人ifn-λ1具有以下登录号np_742152.1。在一个实施方案中，人ifn-λ2具有以下登录号np_742150.1。在一个实施方案中，人ifn-λ3具有以下登录号np_001333866.1(同种型1)或np_742151.2(同种型2)。在一个实施方案中，人ifn-λ4具有以下登录号np_001263183.2。
[0352]
在一个实施方案中，干扰素-λ是ifn-λ1。在一个实施方案中，干扰素-λ是ifn-λ2。在一个实施方案中，干扰素-λ是ifn-λ3。在一个实施方案中，干扰素-λ是ifn-λ4。
[0353]
在一个实施方案中，对干扰素-λ进行化学修饰以改善某些特性，例如血清半衰期。在一个实施方案中，本发明的干扰素-λ是聚乙二醇化的(pegylated)(即，干扰素-λ共价连接至聚(乙二醇)等)。产生聚乙二醇化的蛋白的方法是本领域公知的，参见例如chapman a等人,2002,advanced drug delivery reviews 54:531-545。
[0354]
在一个实施方案中，干扰素-λ是ifn-λ1的功能模拟物。在一个实施方案中，干扰素-λ是ifn-λ2的功能模拟物。在一个实施方案中，干扰素-λ是ifn-λ3的功能模拟物。在一个实施方案中，干扰素-λ是ifn-λ4的功能模拟物。
[0355]
如本文所用，术语“功能模拟物(functional mimetic)”意指具有与天然存在的蛋白相同或相似的生物学效应的分子。例如，干扰素-λ功能模拟物可以激活干扰素-λ受体并驱动ifn刺激基因的转录。
[0356]
在一个实施方案中，干扰素-λ功能模拟物是ifn-λ1的片段。在一个实施方案中，干扰素-λ功能模拟物是ifn-λ2的片段。在一个实施方案中，干扰素-λ功能模拟物是ifn-λ3的片段。在一个实施方案中，干扰素-λ功能模拟物是ifn-λ4的片段。
[0357]
在一个实施方案中，干扰素-λ功能模拟物是抗体。此类干扰素-λ功能模拟抗体可以引发与天然存在的蛋白相同或相似的生物学效应。例如，抗体可以与干扰素-λ受体上的表位结合，激活受体信号传导并驱动ifn刺激基因的转录。干扰素-λ的异二聚体受体复合物(ifnlr)包含ifnlr1(ifnlra，il-28ra)和il10r2(il-10rb)。ifnlr1赋予配体特异性并使受体组装能够进行，而il10r2为il-10家族成员共有，并且是信号传导所必需的。
[0358]
在一个实施方案中，干扰素-λ衍生物是小分子化学实体(例如，分子量小于900道尔顿的化学实体)。筛选化学文库以鉴定可能是潜在候选药物的小分子化学实体的方法是本领域已知的。例如，可以在配体-受体结合测定中测试化学文库。
[0359]
在一个实施方案中，刺激iii型干扰素产生的药剂是刺激模式识别受体(pattern-recognition receptor，prr)的药剂。
[0360]
在一个实施方案中，刺激iii型干扰素产生的药剂是刺激模式识别受体(prr)的药剂。
[0361]“模式识别受体(pattern-recognition receptor)”主要包括toll样受体(tlr)、nod样受体(nlr)、rig-1样受体(rlr)和c型凝集素受体(clr)。它们识别不同的微生物标签(microbial signature)或宿主衍生的危险信号并触发免疫应答，例如干扰素的产生。
[0362]
在一个实施方案中，刺激iii型干扰素产生的剂包括toll样受体(tlr)配体(例如，tlr3、tlr5、tlr7/8和tlr9)、rig-1配体和mda-5配体。
[0363]
在一个实施方案中，刺激iii型干扰素产生的药剂包括poly i:c、cpg和/或tat蛋白。
[0364]
在一个实施方案中，刺激iii型干扰素产生的药剂也可以诱导i型干扰素的产生。
[0365]
本发明进一步涉及一种组合，其包含：
[0366]
1)包含对本文所述的至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗的第一部分，
[0367]
2)任选地，包含本文所述的干扰素-α阻断剂的第二部分，和
[0368]
3)包含本文所述的iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂的第三部分。
[0369]
本发明还涉及一种包含至少2个部分的试剂盒：
[0370]
1)包含对本文所述的至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗的第一部分，
[0371]
2)任选地，包含本文所述的干扰素-α阻断剂的第二部分，和
[0372]
3)包含本文所述的iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂的第三部分。
[0373]
在一个实施方案中，对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗包含在组合物中。
[0374]
在一个实施方案中，所述组合物基本上由对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗组成。
[0375]
如本文所用，对于组合物来说，“基本上由
……
组成”意指cd8疫苗是所述组合物中仅有的一种治疗剂或具有生物活性的药剂。
[0376]
在一个实施方案中，所述组合物是药物组合物并且进一步包含至少一种药学上可接受的赋形剂。
[0377]
如本文所用，术语“赋形剂”是指任何和所有常规溶剂、分散介质、填充剂、固体载体、水溶液、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。通常，赋形剂的性质将取决于所采用的特定施用方式。例如，肠胃外制剂通常包含可注射流体，其包括药学上和生理学上可接受的流体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等作为媒介物。对于固体组合物(例如粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体载体可以包括例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学上的中性载体之外，待施用的药物组合物可含有少量无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和ph缓冲剂等，例如乙酸钠或山梨醇单月桂酸酯(sorbitan monolaurate)。对于人类施用，制剂应满足监管机构(例如fda办公室或ema)所要求的无菌、热原性、一般安全性和纯度标准。在一个实施方案中，赋形剂是佐剂、稳定剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、抗生素、有机或无机酸或其盐、糖类、醇类、抗氧化剂、稀释剂、溶剂、填充剂、粘合剂、吸附剂、缓冲剂、螯合剂、润滑剂、着色剂或任何其他组分。
[0378]“药学上可接受的”意指药物组合物的成分彼此相容并且对其施用给的受试者无
害。药学上可接受的赋形剂的示例包括但不限于水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等或其组合。
[0379]
可用于本发明的药物组合的药学上可接受的赋形剂包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白例如人血清白蛋白、缓冲物质例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质(例如羧甲基纤维素钠)、聚乙二醇、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
[0380]
在一个实施方案中，所述组合物是疫苗组合物。在一个实施方案中，所述疫苗组合物进一步包含至少一种佐剂。
[0381]
在一个实施方案中，对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗包含在药物中。
[0382]
在一个实施方案中，当根据本发明的cd8疫苗包含感染性疾病相关抗原和非致病性细菌时，感染性疾病相关抗原和非致病性细菌是作为混合物包含在药物组合物的两个分离且不同的组分。在另一个实施方案中，当根据本发明的cd8疫苗包含感染性疾病相关抗原和非致病性细菌时，感染性疾病相关抗原和非致病性细菌是包含在药物组合物中的相同组分。
[0383]
在一个实施方案中，cd8疫苗是组合物、药物组合物或药物，其中cd8疫苗与递送媒介物缀合。
[0384]
在一个实施方案中，cd8疫苗包含至少一种感染性疾病相关抗原和非致病性细菌，其中至少一种感染性疾病相关抗原和/或非致病性细菌与递送媒介物缀合。在一个实施方案中，至少一种感染性疾病相关抗原与递送媒介物缀合。在一个实施方案中，非致病性细菌与递送媒介物缀合。在一个实施方案中，至少一种感染性疾病相关抗原和非致病性细菌与递送媒介物缀合。
[0385]
术语“缀合的(conjugated)”意指感染性疾病相关抗原和/或非致病性细菌物理性或化学性地偶联、粘附、吸收或封装到递送媒介物上。缀合的示例包括但不限于共价连接和静电络合(electrostatic complexation)。术语“复合的”、“与
……
复合”和“缀合的”在本文中可互换使用。在一个实施方案中，将多于一种拷贝或类型的感染性疾病相关抗原与递送媒介物缀合。在一个实施方案中，将多于一种拷贝或类型的非致病性细菌与递送媒介物缀合。
[0386]
递送媒介物是本领域公知的。例如，递送媒介物可以选自阳离子脂质、脂质体、cochleate、病毒体、免疫刺激复合物微粒、微球、纳米球、单层囊泡(luv)、多层囊泡、乳脂体(emulsome)和聚阳离子肽、lipoplexe、polyplexe、lipopolyplexe、油包水(w/o)乳剂、水包油(o/w)乳剂、水包油包水(w/o/w)多重乳剂、微乳剂、纳米乳剂、胶束、树枝状聚合物(dendrimer)、病毒体、病毒样颗粒、聚合物纳米颗粒(例如纳米珠、纳米球或纳米胶囊)、聚合物微粒(例如微球或微胶囊)、壳聚糖、聚(乳酸)(pla)聚合物、聚(乳酸-共-乙交酯)(plga)聚合物、环糊精、泡囊(niosome)或和任选地，药学上可接受的载体。在一个实施方案中，递送媒介物是适于经口施用、注射、局部施用或直肠施用的形式。
[0387]
在一个实施方案中，cd8疫苗与纳米颗粒，例如纳米珠、纳米球或纳米胶囊缀合。优
选地，纳米颗粒的直径在50和300nm之间，更优选在70和200nm之间，甚至更优选在100和150nm之间。
[0388]
微折叠细胞(microfold cell)(或m细胞)发现于小肠中派尔集结(peyer'spatch)的肠道相关淋巴组织(gut-associated lymphoid tissue，galt)和胃肠道其他部位的粘膜相关淋巴组织(mucosa-associated lymphoid tissue，malt)中。已知这些细胞能启动粘膜免疫应答。
[0389]
在一些实施方案中，递送媒介物被增强向m细胞的递送的分子(例如凝集素或肽)包被或与其缀合。
[0390]
m细胞在顶表面(apical surface)表达特定的碳水化合物部分(α-l-岩藻糖)。凝集素亚型，例如荆豆凝集素1(ulex europaeus agglutinin 1，uea-1)和橙黄网孢盘菌(aleuria aurantia)，已显示出它们对m细胞上的α-l-岩藻糖的高度特异性。因此，在一些实施方案中，递送媒介物被至少一种选自荆豆凝集素1(uea-1)和橙黄网孢盘菌的凝集素包被或与其缀合。
[0391]
m细胞还表达密封蛋白(claudin)4和tm4sf3。还可以使用利用对密封蛋白4具有高亲和力的表面缀合肽，例如ctgksc(seq id no:11)、lrvg(seq id no:12)或cksthplsc(cks9)(seq id no:13)的递送系统。因此，在一些实施方案中，递送媒介物被至少一种选自ctgksc(seq id no:11)、lrvg(seq id no:12)和cksthplsc(cks9)(seq id no:13)的肽包被或与其缀合。
[0392]
在一个实施方案中，干扰素-α阻断剂包含在组合物中。在一个实施方案中，所述组合物包含至少一种选自以下的干扰素-α阻断剂：中和循环α干扰素的药剂，和/或阻断干扰素-α信号传导的药剂，和/或耗减产生ifn-α的细胞的药剂，和/或阻断ifn-α产生的药剂。
[0393]
在一个实施方案中，所述组合物基本上由中和循环α干扰素的药剂组成。在一个实施方案中，所述组合物基本上由阻断ifn-α信号传导的药剂组成。在一个实施方案中，所述组合物基本上由耗减产生ifn-α的细胞的药剂组成。在一个实施方案中，所述组合物基本上由阻断ifn-α产生的药剂组成。
[0394]
在一个实施方案中，所述组合物是药物组合物并且进一步包含至少一种药学上可接受的赋形剂。
[0395]
在一个实施方案中，干扰素-α阻断剂包含在药物中。
[0396]
在一个实施方案中，所述药物包含至少一种选自以下的干扰素-α阻断剂：中和循环α干扰素的药剂，和/或阻断干扰素-α信号传导的药剂，和/或耗减产生ifn-α的细胞的药剂，和/或阻断ifn-α产生的药剂。
[0397]
在一个实施方案中，中和循环α干扰素的药剂包含在药物中。在一个实施例中，阻断干扰素-α信号传导的药剂包含在药物中。在一个实施方案中，耗减产生ifn-α的细胞的药剂包含在药物中。在一个实施方案中，阻断ifn-α产生的药剂包含在药物中。
[0398]
在一个实施方案中，iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂包含在组合物中。
[0399]
在一个实施方案中，所述组合物基本上由iii型干扰素组成。在一个实施方案中，所述组合物基本上由刺激iii型干扰素产生的药剂组成。在一个实施方案中，所述组合物基本上由iii型干扰素和刺激iii型干扰素产生的药剂组成。
[0400]
在一个实施方案中，所述组合物是药物组合物并且进一步包含至少一种药学上可接受的赋形剂。
[0401]
在一个实施方案中，iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂包含在药物中。
[0402]
在一个实施方案中，iii型干扰素包含在药物中。在一个实施方案中，刺激iii型干扰素产生的药剂包含在药物中。在一个实施方案中，iii型干扰素和刺激iii型干扰素产生的药剂包含在药物中。
[0403]
本发明的另一个目的是包含以下的组合的药物组合物：1)上文所述的对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗，2)任选地，干扰素-α阻断剂，和3)iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂，并且其进一步包含至少一种药学上可接受的赋形剂，或如上文所述的试剂盒，用于治疗有此需要的受试者中的感染性疾病。
[0404]
本发明的另一个目的是包含以下的组合的药物：1)上文所述的对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗，2)任选地，干扰素-α阻断剂，和3)iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂，或如上文所述的药物组合，或如上文所述的试剂盒，用于治疗有此需要的受试者中的感染性疾病。
[0405]
如上文所述，根据本发明的本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒将相对于彼此同时、分开或顺序施用。
[0406]
在一个实施方案中，根据本发明，本发明的组合中的1)对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗，2)干扰素-α阻断剂，和/或3)iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂将相对于彼此同时、分开或顺序施用。
[0407]
根据一个实施方案，根据本发明的1)对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗，2)干扰素-α阻断剂，和/或3)iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂、其组合或药物组合、药物或试剂盒将被配制用于向受试者施用。
[0408]
在一个实施方案中，根据本发明的1)对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗，2)干扰素-α阻断剂，和/或3)iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂、其组合或药物组合或药物可以经口、胃内、肠胃外、局部、通过吸入喷雾、经直肠、经鼻、经颊、经包皮、经阴道或通过植入的库(implanted reservoir)来施用。
[0409]
在一个实施方案中，经口施用包括粘膜施用。“粘膜施用(mucosal administration)”是向粘膜表面，例如舌下、气管、支气管、咽、食道、胃的黏膜和十二指肠、小肠和大肠的粘膜，包括直肠粘膜的递送。还优选地，粘膜表面是指消化粘膜(digestive mucosa)。
[0410]
在一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒的每一部分的施用可以通过相同的施用途径或通过不同的施用途径进行。
[0411]
在一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒是适于经口或胃内施用的形式。因此，在一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒向受试者经口或胃内施用，例如作为粉末、片剂、胶囊等或作为配制为延释(extended release)或缓释(sustained release)的片剂。
[0412]
适于经口或胃内施用的形式的示例包括但不限于液体、糊剂或固体组合物，且更具体地，片剂、配制为延释或缓释的片剂、胶囊、丸剂、糖衣丸、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮
液等。
[0413]
在一个实施方案中，上文所述的对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗是适于经口或胃内施用的形式。因此，在一个实施方案中，上文所述的对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗将经口或胃内施用给受试者，例如作为胶囊或作为片剂。
[0414]
在另一个实施方案中，如上文所述的干扰素-α阻断剂是适于经口或胃内施用的形式。因此，在一个实施方案中，如上文所述的干扰素-α阻断剂将经口或胃内施用给受试者，例如作为胶囊或作为片剂。
[0415]
在另一个实施方案中，如上文所述的iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂是适于经口或胃内施用的形式。因此，在一个实施方案中，如上文所述的iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂将经口或胃内施用给受试者，例如作为胶囊或作为片剂。
[0416]
在一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒是适于肠胃外施用的形式。
[0417]
在另一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒是适于注射，例如静脉内、皮下、肌内、腹膜内、皮内、透皮注射或输注的形式。因此，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒将通过静脉内、肌内、腹膜内、胸膜内、皮下、透皮注射或输注向受试者注射。
[0418]
在另一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒是适于注射，例如静脉内、肌内、腹膜内注射或输注的形式。因此，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒将通过静脉内、肌内、腹膜内注射或输注向受试者注射。
[0419]
根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒的无菌可注射形式可以是溶液或水性悬浮液或油性悬浮液。这些悬浮液可以根据本领域已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌可注射制备物也可以是无毒的药学上可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液。可以采用的可接受的媒介物和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，通常采用无菌的不挥发油作为溶剂或悬浮介质。为了这个目的，可以采用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸，例如油酸及其甘油酯衍生物，可用于制备可注射物，因为它们是天然的药学上可接受的油，例如橄榄油或蓖麻油，尤其是它们的聚氧乙烯化形式。这些油溶液或悬浮液还可以含有长链醇稀释剂或分散剂，例如羧甲基纤维素或类似的分散剂，它们通常用于包括乳剂和悬浮液在内的药学上可接受的剂型的制剂中。其他常用的表面活性剂，例如tween、span和其他乳化剂或生物利用度增强剂(其通常用于制备药学上可接受的固体、液体或其他剂型)，也可用于制剂目的。
[0420]
在一个实施方案中，上文所述的对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗处于适于肠胃外施用和/或注射的形式。因此，在另一个实施方案中，上文所述的对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗将通过静脉内、肌内、腹膜内、胸膜内、皮下、透皮注射或输注(优选通过静脉注射)肠胃外施用和/或注射给受试者。
[0421]
在另一个实施方案中，上文所述的干扰素-α阻断剂是适于肠胃外施用和/或注射的形式。因此，在另一个实施方案中，上文所述的干扰素-α阻断剂通过静脉内、肌内、腹膜内、胸膜内、皮下、透皮注射或输注(优选通过静脉注射)肠胃外施用和/或注射给受试者。
[0422]
在另一个实施方案中，上文所述的iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药
剂是适于肠胃外施用和/或注射的形式。因此，在另一个实施方案中，上文所述的iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂将通过静脉内、肌内、腹膜内、胸膜内、皮下、透皮注射或输注(优选通过静脉注射)肠胃外施用和/或注射给受试者。
[0423]
在另一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒是适于局部施用的形式。因此，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒将局部施用。
[0424]
适用于局部施用的形式的示例包括但不限于液体、糊剂或固体组合物，并且更具体地，水溶液、滴剂、分散剂、喷雾剂、微胶囊、微粒或纳米颗粒、聚合物贴剂或控释贴剂等。
[0425]
在另一个实施方案中，上文所述的对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗是适于局部施用的形式。因此，根据本发明的如上所述的对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗将局部施用。
[0426]
在另一个实施方案中，上文所述的干扰素-α阻断剂是适于局部施用的形式。因此，上文所述的药剂干扰素-α阻断剂将局部施用。
[0427]
在另一个实施方案中，上文所述的iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂是适于局部施用的形式。因此，根据本发明的如上所述的对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗将局部施用。
[0428]
在另一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒是适于经直肠施用的形式。因此，在一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒将经直肠施用。
[0429]
适于经直肠施用的形式的示例包括但不限于栓剂、微型灌肠剂、灌肠剂、凝胶、直肠泡沫剂、乳膏剂、软膏剂等。
[0430]
在另一个实施方案中，上文所述的对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗是适于经直肠施用的形式。因此，在一个实施方案中，上文所述的对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗将经直肠施用。
[0431]
在另一个实施方案中，上文所述的干扰素-α阻断剂是适于经直肠施用的形式。因此，在一个实施方案中，上文所述的干扰素-α阻断剂将经直肠施用。
[0432]
在另一个实施方案中，上文所述的iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂是适于经直肠施用的形式。因此，在一个实施方案中，iii型干扰素和/或上文所述的刺激iii型干扰素产生的药剂将经直肠施用。
[0433]
在一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒包含1)对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗，2)任选地，干扰素-α阻断剂，和3)iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂，它们全部是适于肠胃外施用和/或注射的形式。
[0434]
在一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒包含1)对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗，2)任选地，干扰素-α阻断剂，和3)iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂，它们全部是适于经口施用的形式。
[0435]
在另一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒包含1)对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗，其是适于经口施用的形式，和2)任选地，干扰素-α阻断剂，和3)iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂，其是适于肠胃外施用和/或注射的形式。
[0436]
在另一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒包含1)对至少
一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗，其是适于经口施用的形式，和2)任选地，干扰素-α阻断剂，和3)iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂，其是适于肠胃外施用和/或注射的形式。
[0437]
在另一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒包含1)对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗，其是适于经直肠施用的形式，和2)任选地，干扰素-α阻断剂，和3)iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂，其是适于肠胃外施用和/或注射的形式。
[0438]
在另一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒包含1)对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗，其是适于经阴道施用的形式，和2)任选地，干扰素-α阻断剂，和3)iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂，其是适于肠胃外施用和/或注射的形式。
[0439]
如上文所述，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒的每一部分的施用可以同时、分开或顺序进行。
[0440]
在一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒包含含有对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗的第一部分，任选地包含干扰素-α阻断剂的第二部分，以及包含iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂的第三部分，它们全部在相同的时间施用一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次。
[0441]
在本发明的一个实施方案中，组合、药物组合或试剂盒的第一部分将在组合、药物组合或试剂盒的第二部分和第三部分之前施用一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次。
[0442]
在本发明的另一个实施方案中，组合、药物组合或试剂盒的第二部分将在组合、药物组合或部分试剂盒的第一部分和第三部分之前施用一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次。
[0443]
在本发明的另一个实施方案中，组合、药物组合或试剂盒的第三部分将在组合、药物组合或试剂盒的第一部分和第二部分之前施用一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次。
[0444]
在本发明的一个实施方案中，组合、药物组合或试剂盒的第一部分和第二部分将在组合、药物组合或试剂盒的第三部分之前施用一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次。
[0445]
在本发明的另一个实施方案中，组合、药物组合或试剂盒的第一部分和第三部分将在组合、药物组合或试剂盒的第二部分之前施用一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次。
[0446]
在本发明的另一个实施方案中，组合、药物组合或试剂盒的第二部分和第三部分将在组合、药物组合或试剂盒的第一部分和第二部分之前施用一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次。
[0447]
在本发明的一个实施方案中，组合、药物组合或试剂盒的第一部分和第二部分将在相同的时间施用一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次。
[0448]
在本发明的一个实施方案中，组合、药物组合或试剂盒的第一部分和第三部分将在相同的时间施用一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次。
[0449]
在本发明的一个实施方案中，组合、药物组合或试剂盒的第二部分和第三部分将在相同的时间施用一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次。
[0450]
在本发明的一个实施方案中，组合、药物组合或试剂盒的第一部分将在组合、药物组合或试剂盒的第二部分之前施用一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次，并且第二部分将在组合、药物组合或试剂盒的第三部分之前施用一次、两次、三次或更多次。
[0451]
在本发明的另一个实施方案中，组合、药物组合或试剂盒的第二部分将在组合、药物组合或试剂盒的第一部分之前施用一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次，并且第一部分将在组合、药物组合或试剂盒的第三部分之前施用一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次。
[0452]
在本发明的一个实施方案中，组合、药物组合或试剂盒的第二部分将在组合、药物组合或试剂盒的第三部分之前施用一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次，并且第三部分将在组合、药物组合或试剂盒的第一部分之前施用一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次。
[0453]
在本发明的一个实施方案中，组合、药物组合或试剂盒的第三部分将在组合、药物组合或试剂盒的第一部分之前施用一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次，并且第一部分将在组合、药物组合或试剂盒的第二部分之前施用一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次。
[0454]
在本发明的一个实施方案中，组合、药物组合或试剂盒的第三部分将在组合、药物组合或试剂盒的第二部分之前施用一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次，并且第二部分将在组合、药物组合或试剂盒的第一部分之前施用一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次。
[0455]
在另一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒包含含有对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗的第一部分，任选地包含干扰素-α阻断剂的第二部分，以及包含iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂的第三部分，它们全部在相同的时间每天施用一次，持续1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或更多天。
[0456]
在一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒包含含有对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗的第一部分，任选地包含干扰素-α阻断剂的第二部分，以及包含iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂的第三部分，它们全部在相同的时间每月施用一次，持续1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月或更多个月。
[0457]
在一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒包含含有对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗的第一部分，任选地包含干扰素-α阻断剂的第二部分，以及包含iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂的第三部分，它们全部在相同的时间每年施用一次，持续1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或更多年。
[0458]
在一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒的每一部分的施用可以在相同的时间或在不同的时间进行。
[0459]
本发明的另一个目的是一种预防或治疗受试者中的感染性疾病的方法，包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的：
[0460]
1)对至少一种感染性疾病相关抗原特异的cd8疫苗，
[0461]
2)任选地，干扰素-α阻断剂，和
[0462]
3)iii型干扰素和/或刺激iii型干扰素产生的药剂。
[0463]
根据一个实施方案，上文所述的组合、药物组合、药物或试剂盒的第一部分的治疗有效剂量将与上文所述的组合、药物组合、药物或试剂盒的第二部分的治疗有效剂量和上文所述的组合、药物组合、药物或试剂盒的第三部分的治疗有效剂量组合施用，用于治疗有此需要的受试者中的感染性疾病。因此，在一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒包含上文所述的第一部分的治疗有效剂量和上文所述的第二部分的治疗有效剂量和上文所述的第三部分的治疗有效剂量。
[0464]
根据一个实施方案，上文所述的组合、药物组合、药物或试剂盒的第一部分的治疗有效剂量将与上文所述的组合、药物组合、药物或试剂盒的第二部分的治疗有效剂量组合施用，用于治疗有此需要的受试者中的感染性疾病。因此，在一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒包含上文所述的第一部分的治疗有效剂量和上文所述的第二部分的治疗有效剂量。
[0465]
根据一个实施方案，上文所述的组合、药物组合、药物或试剂盒的第一部分的治疗有效剂量将与上文所述的组合、药物组合、药物或试剂盒的第三部分的治疗有效剂量组合施用，用于治疗有此需要的受试者中的感染性疾病。因此，在一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒包含上文所述的第一部分的治疗有效剂量和上文所述的第三部分的治疗有效剂量。
[0466]
在一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒的每一部分的施用可以根据初免/加强模式进行。因此，本发明还包括多种初免-加强方案。
[0467]
在一个实施方案中，初免/加强模式包括以下施用步骤：
[0468]-一次或多次初次免疫，其中所述加强免疫包含：第一部分的治疗有效剂量、第二部分的治疗有效剂量和/或第三部分的治疗有效剂量，和
[0469]-一次或多次加强免疫。
[0470]
在初免/加强方案中，根据本发明的组合的每个部分的组合物对于每次免疫可以相同或不同，并且根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒的每个部分的组合物类型、途径和制剂也可以变化。例如，如果表达载体用于初免和加强步骤，它可以是相同的或不同的类型(例如，dna或细菌或病毒表达载体)。例如，一种有用的初免-加强方案提供至少两次初次免疫，间隔两周，然后是最后一次初次免疫后的至少一次加强免疫(例如，在4-5周和/或8-9周)。对于本领域技术人员来说，使用本公开的dna、细菌和病毒表达载体或细菌以提供初免和加强方案所涵盖的多种排列和组合也应该是显而易见的。例如，cmv载体可以在表达衍生自相同或不同病原体的不同抗原时重复使用。
[0471]
在一个实施方案中，加强免疫步骤包括施用非感染剂量的siv或hiv，或减毒的siv或hiv(例如，耗减蛋白nef的hiv或siv)。在一个实施方案中，加强免疫是适于经口、经直肠或经阴道施用的形式。
[0472]
减毒的siv或hiv病毒是本领域公知的。所述减毒病毒的非限制性示例是蛋白nef耗减的hiv或siv(参见，例如，giorgi等人,j med primatol.1996jun；25(3):186-91)。
[0473]
在一些实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒的第二部分和/
或第三部分将以与第一部分分开的时间和施用途径施用。
[0474]
在一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒的第一部分将施用至少2次(例如，在第0天和第14天)。在另一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒的第二部分和/或第三部分将在第一部分施用前施用至少2次(例如，在第-7和-3天)，且施用后至少9次(例如，在第3、11、38、45、52、59、66、73和80天)。
[0475]
在一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒的第一部分将施用至少7次(例如，在第0、1、3、7、28和29天)。在另一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒的第二部分和/或第三部分将在第一部分施用前施用(例如，在第-3、0、28和29天)，且至少再1次(例如，在第57天)。
[0476]
在一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒的第一部分将在初免和加强步骤期间施用至少7次(例如，在第0、1、2、3、5天进行初免，在第28和29天进行第一次加强)。根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒的第二部分将在初免和第一次加强步骤期间(例如，从第0天到第40天)施用至少一次，并在根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒的第一部分的最后施用后施用至少一次。根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒的第三部分将在根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒的第一部分的每次施用前0天、1天、2天或3天施用。
[0477]
在一个实施方案中，初免/加强模式包括施用siv或hiv或减毒的siv或hiv的非感染性剂量(例如，在第60天)的步骤。
[0478]
应当理解，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒中的第一部分的总每日用量、第二部分的总每日用量和第三部分的总每日用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。用于任何特定受试者的具体剂量将取决于多种因素，例如要治疗的感染性疾病；受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食，以及医学领域公知的类似因素。因此，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒可以一次或多次施用给受试者。优选地，在根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒的单独施用之间存在设定的时间间隔。尽管这个间隔因每个受试者而异，但其通常为1天至数周，并且通常为1天、2天、4天、6天或8天，或1周、2周、4周、6周或8周。在本发明的一个实施方案中，间隔通常为1至6周。在本发明的一个实施方案中，间隔较长，有利地为约10周、12周、14周、16周、18周、20周、22周、24周、26周、28周、30周、32周、34周、36周、38周、40周、42周、44周、46周、48周、50周、52周、54周、56周、58周、60周、62周、64周、66周、68周、70周或80周。在一个实施方案中，施用方案通常具有根据本发明的3个不同部分的1至20次施用，但可以是少至一次或二次或四次或八次或十次。在另一个实施方案中，施用方案是一年一次、两年一次或其他长间隔(5-10年)。
[0479]
在一个实施方案中，受试者是哺乳动物、灵长类动物，优选人类。
[0480]
作为示例，当根据本发明的药物组合、药物或试剂盒的第一部分包含如上文所述的cmv载体时，并且当待治疗的受试者是哺乳动物、灵长类动物或人类时，所述cmv载体的治疗有效剂量范围可以从几微克至几百微克(例如，每次施用5至500μg)。cmv载体可以以任何合适的量施用以在这些剂量水平下实现表达。在非限制性示例中，cmv载体可以以每次施用至少101、102、103、104、105、106、107或108pfu的量施用。因此，cmv载体可以以每次施用至少101pfu，或约101pfu至约108pfu的范围施用。cmv载体可以是冻干的(在施用时重悬)或可以在溶液中。
[0481]
在一个实施方案中，向受试者施用的如上文所述的cmv载体的量为至少101、102、103、104、105、106、107或108pfu。在一个实施方案中，如上文所述，每次施用所施用的cmv载体的量的范围为约101至约108，优选约102至约107，更优选约103至约106，且甚至更优选约104至约105，包括这些范围内的所有整数值。在一个实施方案中，每日向受试者施用的如上文所述的cmv载体的每日量是至少每日101、每日102、每日103、每日104、每日105、每日106、每日107或每日108pfu。在一个实施方案中，每日施用的如上文所述的cmv载体的每日量的范围为每日约101至约108，优选每日约102至约107，更优选每日约103至约106，且甚至更优选每日约104至约105，包括这些范围内的所有整数值。在一个实施方案中，向受试者施用的如上文所述的cmv载体的量为至少101、102、103、104、105、106、107或108个病毒/kg体重。
[0482]
作为示例，当根据本发明的药物组合、药物或试剂盒的第一部分包含如上文所述的至少一种感染性疾病相关抗原和非致病性细菌时，并且当待治疗的受试者是人类时，所述非致病性细菌(即，乳杆菌属或植物乳杆菌)的治疗有效剂量的范围可以是每次施用约101至约10
18
cfu，并且所述感染性疾病相关抗原(即，灭活的siv或hiv病毒)的治疗有效剂量的范围可以是每次施用约101至约10
14
个病毒。
[0483]
在一个实施方案中，向受试者施用的如上文所述的非致病性细菌的量为至少101、102、103、104、105、106、107、108、109、10
10
、10
11
、10
12
、10
13
或10
14
cfu。在一个实施方案中，每次施用所施用的如上文所述的非致病性细菌的量的范围为约101至约10
18
，优选约102至约10
16
，更优选约104至约10
14
，且甚至更优选约106至约10
12
，包括这些范围内的所有整数值。在一个实施方案中，每日向受试者施用的如上文所述的非致病性细菌的每日量为至少每日101、每日102、每日103、每日104、每日105、每日106、每日107、每日108、每日109、每日10
10
、每日10
11
、每日10
12
、每日10
13
、每日10
14
、每日10
15
、每日10
16
、每日10
17
、每日10
18
cfu。在一个实施方案中，每日施用的如上文所述的非致病性细菌的每日量的范围为每日约101至约10
18
，优选每日约102至约10
16
，更优选每日约104至约10
14
，且甚至更优选每日约106至约10
12
，包括这些范围内的所有整数值。在一个实施方案中，向受试者施用的如上文所述的非致病性细菌的量为至少101、102、103、104、105、106、107、108、109、10
10
、10
11
、10
12
、10
13
或10
14
个细菌/kg体重。
[0484]
在一个实施方案中，向受试者施用的如上文所述的灭活siv或hiv病毒的量为至少101、102、103、104、105、106、107、108、109、10
10
、10
11
、10
12
、10
13
或10
14
个病毒。在一个实施方案中，每次施用所施用的如上文所述的灭活siv或hiv病毒的量的范围为约101至约10
18
，优选约102至约10
16
，更优选约104至约10
14
，且甚至更优选约106至约10
12
，包括这些范围内的所有整数值。在一个实施方案中，每日向受试者施用的如上文所述的灭活siv或hiv病毒的每日量为至少每日101、每日102、每日103、每日104、每日105、每日106、每日107、每日108、每日109、每日10
10
、每日10
11
、每日10
12
、每日10
13
、每日10
14
、每日10
15
、每日10
16
、每日10
17
、每日10
18
个病毒。在一个实施方案中，每日施用的如上文所述的灭活siv或hiv病毒的每日量的范围为每日约101至约10
18
，优选每日约102至约10
16
，更优选每日约104至约10
14
，且甚至更优选每日约106至约10
12
，包括这些范围内的所有整数值。在一个实施方案中，向受试者施用的如上文所述的灭活siv或hiv病毒的量为至少101、102、103、104、105、106、107、108、109、10
10
、10
11
、10
12
、10
13
或10
14
个病毒/kg体重。
[0485]
在一个实施方案中，受试者是哺乳动物、灵长类动物，优选人类，并且根据本发明
的组合、药物组合、药物或试剂盒的第一部分的所述治疗有效剂量是将以一次、两次、三次或更多次施用或一次、两次、三次或更多次注射来施用的每日剂量。
[0486]
在一个实施方案中，受试者是哺乳动物、灵长类动物，优选人类，并且根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒的第二部分的所述治疗有效剂量是将以一次、两次、三次或更多次施用或一次、两次、三次或更多次注射来施用的每日剂量。
[0487]
在一个实施方案中，受试者是哺乳动物、灵长类动物，优选人类，并且根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒的第三部分的所述治疗有效剂量是将以一次、两次、三次或更多次施用或一次、两次、三次或更多次注射来施用的每日剂量。
[0488]
根据本发明，单独使用如上文所述的组合、药物组合、药物或试剂盒。
[0489]
因此，在一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒单独使用并且包含如上文所述的第一部分的治疗有效剂量和如上文所述的第二部分的治疗有效剂量和如上文所述的第三部分的治疗有效剂量。在一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒单独使用并且包含如上文所述的第一部分的治疗有效剂量和如上文所述的第二部分的治疗有效剂量。在另一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒单独使用并且包含如上文所述的第一部分的治疗有效剂量和如上文所述的第三部分的治疗有效剂量。
[0490]
在一个实施方案中，如上文所述的本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒与至少一种其它治疗剂组合使用。
[0491]
此类施用可以是同时的、分开的或顺序的。对于同时施用，可以视情况将药剂作为一种组合物或作为分开的组合物来施用。其他治疗剂通常与待治疗的病症相关。
[0492]
因此，在一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒包含如上文所述的第一部分的治疗有效剂量和如上文所述的第二部分的治疗有效剂量和如上文所述的第三部分的治疗有效剂量，并且与至少一种其它治疗剂组合使用。在一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒包含如上文所述的第一部分的治疗有效剂量和如上文所述的第二部分的治疗有效剂量，并且与至少一种其它治疗剂组合使用。在另一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒包含如上文所述的第一部分的治疗有效剂量和如上文所述的第三部分的治疗有效剂量，并且与至少一种其它治疗剂组合使用。
[0493]
在一个实施方案中，其它治疗剂是抗逆转录病毒疗法(antiretroviral therapy，art)。
[0494]
如本文所用，术语“抗逆转录病毒疗法”或“高活性抗逆转录病毒疗法”是指抗逆转录病毒(arv)药物的任何组合，以最大化抑制hiv病毒(例如，减少病毒载量、减少hiv增殖......)，并阻止hiv疾病的进展。存在多类hiv药物，例如，非核苷逆转录酶抑制剂(non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor，nnrti)、核苷逆转录酶抑制剂(nucleoside reverse transcriptase inhibitor，nrti)、附着后抑制剂(post-attachment inhibitor)、蛋白酶抑制剂(protease inhibitor，pi)、ccr5拮抗剂、整合酶链转移抑制剂(integrase strand transfer inhibitor，insti)、融合抑制剂(fusion inhibitor)。通常，初始治疗方案通常包括与第三种活性抗逆转录病毒药物(可以属于insti、nnrti或pi类)组合的两种ntri。它们有时可以包括加强剂(booster)，其可以是可比
司他(cobicistat，tybost)或利托那韦(ritonavir，norvir)。
[0495]
在一个实施方案中，如上文所述的组合、药物组合、药物或试剂盒与抗逆转录病毒疗法(art)组合使用。
[0496]
因此，在一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒包含如上文所述的第一部分的治疗有效剂量和如上文所述的第二部分的治疗有效剂量和如上文所述的第三部分的治疗有效剂量，并与抗逆转录病毒疗法组合使用。在一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒包含如上文所述的第一部分的治疗有效剂量和如上文所述的第二部分的治疗有效剂量，并与抗逆转录病毒疗法组合使用。在另一个实施方案中，根据本发明的组合、药物组合、药物或试剂盒包含如上文所述的第一部分的治疗有效剂量和如上文所述的第三部分的治疗有效剂量，并与抗逆转录病毒疗法组合使用。
[0497]
根据本发明，如上文所述的组合、药物组合、药物或试剂盒用于预防或治疗有此需要的受试者中的感染性疾病。
[0498]
如本文所用，术语“感染性疾病”是指由病原体，例如真菌、寄生虫、原生动物、细菌或病毒引起的疾病。“感染性疾病”的示例包括但不限于流感病毒感染、猴痘病毒感染、西尼罗河病毒感染、基孔肯雅病毒(chikungunya virus)感染、埃博拉病毒感染、丙型肝炎病毒感染、脊髓灰质炎病毒感染、登革热、获得性免疫缺陷综合症(aids)或猴免疫缺陷病毒(siv)感染和重组rhcmv或hcmv载体编码来自hiv或siv的抗原、皮肤疣(skin wart)、生殖器疣(genital wart)、呼吸道乳头瘤病(respiratory papillomatosis)、疟疾、埃博拉出血热、结核病、疱疹病(例如，生殖器疱疹、水痘或带状疱疹、传染性单核细胞增多症)、结核病感染(由结核分枝杆菌引起)、伤寒感染或发热(由伤寒沙门氏菌引起)。
[0499]
在一个实施方案中，要预防或治疗的感染性疾病优选为获得性免疫缺陷综合征(aids)、人类免疫缺陷病毒(hiv)感染或猴免疫缺陷病毒(siv)感染。
[0500]
在一个实施方案中，要预防或治疗的感染性疾病是获得性免疫缺陷综合征(aids)。
[0501]
在一些实施方案中，如上文所述的组合、药物组合、药物或试剂盒用于预防性治疗或治愈性治疗有此需要的受试者中的感染性疾病。
[0502]
附图简要说明
[0503]
图1：i型和iii型干扰素的抗病毒活性。(a)hepg2中的isg表达。将hepg2细胞用ifnα2a或ifnλ1-4(10ng/ml)处理。刺激4h后，使用qrt-pcr检测干扰素诱导的基因ifit1、mx1和oasl的mrna水平，且通过与未处理的细胞对照比较的2-δδct
方法并使用内源s14 mrna水平进行标准化来计算倍数变化。(b)i型和iii型ifn对emcv的抗病毒活性。在用emcv攻毒前24h，将ifnα2a或ifnλ1/2/3/4(10ng/ml)添加到hepg2细胞中。用emcv感染后48，用生物测定法测定细胞的活力。a570值与细胞活力成正比，并且因此与相应ifn的抗病毒活性成正比。没有病毒攻毒的ifn-α治疗用作细胞活力的基线。
[0504]
图2：i型和iii型干扰素对cd4
t细胞的抗增殖活性。在不存在(对照)或存在10ng/ml的ifn-α2a或ifnλ1或ifnλ2或ifnλ3或ifnλ4的情况下，在96个圆底微孔中用同种异体poly i:c成熟dc来刺激cfse染色的cd4
t细胞(10x104/孔)5天。当指明时，添加抗干扰素i型受体抗体。通过流式细胞术评估cfse稀释的百分比。
[0505]
图3：ifn-α2a而非ifn-iii型诱导cd4
t细胞中的isg表达。cd4
t细胞用ifnα2a或
ifnλ1/2/3/4(10ng/ml)处理。刺激4h后，使用qrt-pcr检测干扰素诱导的基因ifit1、mx1和oasl的mrna水平，且通过与未处理的细胞对照比较的2-δδct
方法并使用内源s14 mrna水平进行标准化来计算倍数变化。
[0506]
图4：ifn-α2a而非ifn-iii型刺激cd4
t细胞中的stat1磷酸化。将cd4
t细胞用10ng ml-1
的ifn-λ1、ifn-λ2、ifn-λ3、ifn-λ4或ifn-α2a刺激20分钟，或不刺激(对照)。将pstat1的增加评估为诱导相对于基线水平的比例(mfi倍数变化＝mfi细胞因子刺激的/mfi未处理的细胞)。
[0507]
图5：ifn-α2a而非ifn-iii型增加cd3/cd28刺激的cd4
t细胞中的cd38表达。在存在δcd3-饲养细胞(4x104/孔)和板结合的抗cd3 mab(2μg/ml)、可溶性抗cd28 mab(2μg/ml)以及增加剂量的ifn-α2a或iii型ifn的情况下，在96个圆底微孔中培养cfse染色的cd4
t细胞(4x104/孔)。在培养结束时通过流式细胞术在cd3

7-aad-cfse

刺激的cd4
t细胞中测量cd38中值荧光强度(mfi)。
[0508]
图6：受加载肽(peptide-loaded)的m-dc限制的肽特异性cd8 hla-e的产生和扩增。将tap抑制的mdc用肽(10μm，持续1h)进行脉冲，并与自体初始cd8
t细胞以1:10的比例共培养。在第0天和最后一次刺激后一周通过流式细胞术分析使用mhc-肽五聚物来监测肽阳性cd8
t细胞。数据表示为cd8
t细胞中四聚物阳性细胞的百分比。
[0509]
图7：在猕猴中使用rhcmv/siv载体的免疫方案的示意图。
[0510]
图8：在猕猴中使用灭活siv和活植物乳杆菌的经口免疫方案的示意图。
[0511]
图9：在blt小鼠中使用灭活siv和活植物乳杆菌的经口免疫方案的示意图。
[0512]
图10：感染hiv-1的受试者中cm cd8
t细胞分布和血清ifn-α水平的比较以及ifn-α在人类hiv-1感染中的关键致病作用。(a)感染hiv-1的受试者中cm cd8
t细胞分布的比较；(b)感染hiv-1的受试者中血清ifn-α水平的比较；(c)未治疗的hiv患者(ec和pre-cart组)中cd8

cm频率和血清ifn-α水平之间的关系。
[0513]
图11：在猕猴中使用灭活siv和活植物乳杆菌的经口免疫方案的示意图。
[0514]
图12：在bslt小鼠中使用灭活siv和活植物乳杆菌的经口免疫方案的示意图。
[0515]
实施例
[0516]
通过以下实施例进一步说明本发明。
[0517]
实施例1：i型和iii型干扰素对先天性和适应性免疫应答的影响
[0518]
材料与方法
[0519]
人类细胞系
[0520]
hcc hepg2和正常肾上皮vero细胞系从atcc获得。细胞在补充有10％热灭活胎牛血清、2mm l-谷氨酰胺、1％青霉素和链霉素溶液，缺氧(hypoxia)2％的达尔伯克改良伊格尔氏培养基(dulbecco’s modified eagle medium)中生长。癌细胞系生长至70-100％汇合度，随后最多传代5次，并且然后新鲜解冻。利用accutase将细胞脱壁，重悬于含fbs的培养基中并利用离心(300g，3min)收集。细胞数利用台盼蓝测定。
[0521]
人类血液样品
[0522]
来自etablissementdu sang(efs，巴黎)的健康个体的血液样品。使用标准程序收集血细胞。
[0523]
细胞纯化和培养
[0524]
通过在ficoll-hypaque(pharmacia)上进行密度梯度离心来分离外周血单核细胞(pbmc)。pbmc可用作新鲜细胞或冷冻储存在液氮中。t细胞亚群和t细胞耗减的辅助细胞(δcd3细胞)从新鲜或冷冻的pbmc中分离。t细胞耗减的辅助细胞(δcd3细胞)通过与抗cd3包被的dynabeads(dynal biotech)孵育从pbmc中通过负选择分离，并在3000rad下进行辐照(称为δcd3-饲养细胞)。使用cd4
t细胞分离试剂盒(miltenyi biotec)从pbmc中负选择cd4
t细胞，产生纯度为96
–
99％的cd4
t细胞群体。t细胞亚群在补充有5％svf、100iu/ml青霉素/链霉素、1mm丙酮酸钠、1mm非必需氨基酸、glutamax和10mm hepes(imdm-5培养基)，缺氧2％的imdm中培养。
[0525]
细胞的冷冻和解冻
[0526]
细胞在含有10％dmso的fbs中冷冻。将冻存管(cryo tube)置于coolcell(biocision)冷冻容器中并在-80℃下孵育。2天后，将试管转移到液氮中并储存直至需要。通过将冻存管置于37℃水浴中约30秒来进行细胞解冻。接下来，将细胞悬浮液与等体积的预热培养基混合，并且随后转移到含有相同培养基的falcon离心管中。通过离心(300g，3min)将细胞沉淀以除去dmso。将细胞沉淀重悬于细胞培养基中。
[0527]
用于isg检测的实时pcr
[0528]
将hepg2细胞以每孔2
×
105个细胞的密度接种在12孔板中并孵育24h。然后，添加含有指定干扰素的新鲜培养基。将细胞孵育4小时，并且然后裂解，并根据制造商的说明使用提取试剂盒(qiagen)来纯化rna。使用primescript rt reagent试剂盒(takara)进行cdna的合成。使用power sybr green pcr master mix(applied biosystems)在lightcycler 480仪器(roche)上进行定量pcr。每个反应以100μl的总体积一式两份进行。使用primer3或primerv3.0软件(applied biosystems)将引物设计为跨内含子(intron-spanning)。为了测定针对ifn刺激的细胞转录应答，根据已发表的研究ifn刺激的pbmc中的转录应答的结果(参见，例如，waddell等人(2010)plos one.5(3):e97532)，选择了3个isg靶标mxi、oasl和isg15。对于基因诱导测定，使用δδct方法计算倍数变化值。参考基因s14的ct值的几何平均值用作参考值。
[0529]
病毒生产
[0530]
使用的emcv病毒(fa毒株)在vero细胞的单层上生长以完成细胞病变效应或直至所有细胞都受到感染影响(通过显微镜确定)，并通过两个循环的冷冻和解冻来制备，然后以5,000xg离心30分钟以去除细胞碎片。
[0531]
抗病毒测定
[0532]
对hepg2细胞进行抗病毒测定，将其以1.5x104的密度接种在96孔板中的补充有10％fcs的dmem中并静置。在用emcv攻毒之前，将细胞与指定剂量的ifn孵育24小时。将细胞与病毒孵育48小时。在每个步骤之间去除培养基。通过基于脱氢酶系统的生物测定来分析细胞的活力；完整细胞中的这个系统会将底物mtt转化为甲臜(蓝色)，其转而可以通过分光光度法进行测量。简言之，向细胞提供mtt并孵育2小时。向细胞添加提取缓冲液(含有6％至11％十二烷基硫酸钠和45％n,n-二甲基甲酰胺)，并且然后将细胞在37℃下孵育过夜。随后，采用提取缓冲液作为空白探针来测定570nm处的吸光度。a570与抗病毒活性直接成正比。
[0533]
流式细胞术分析
[0534]
cd3
t细胞染色：抗cd4(sk3)-apc、抗cd3(ucht1)-fitc、抗cd8(rpa-t8)-bv421来自becton dickinson。使用在含有3％fbs、2mm edta的pbs(facs缓冲液)中稀释的ab的混合物将细胞针对表面标志物进行染色(在4℃下于黑暗中30min)。
[0535]
stat1信号传导分析：根据制造商的说明(bd bio-sciences,san jose,ca)使用bd phosflow技术在cd4
t细胞中对stat1磷酸化(pstat1)进行流式细胞术分析。将cd4
t细胞通过与i型和iii型干扰素在37℃下孵育20min来刺激或不处理。通过使用bd phosflow lyse/fix buffer(bd biosciences)进行固定来停止激活，并使用bd perm buffer iii(bd biosciences)将细胞透化。用识别特定磷酸化stat酪氨酸的抗体：p-stat1(y701)-pe将细胞染色。在多参数免疫分型实验中，将细胞用抗cd3-fitc和7-aad同时染色。将pstat1的增加测定为诱导相对于基线水平的比例(mfi倍数变化＝mfi细胞因子刺激的/mfi未处理的细胞)。
[0536]
cfse染色：使用1μm cfse(celltrace细胞增殖试剂盒；molecular probes/invitrogen)在pbs中以1.107个细胞/ml的浓度将cd4
t细胞在37℃下染色8min。将细胞用含有10％fbs的rpmi-1640培养基洗涤2次以停止标记反应。然后将细胞以所需浓度重悬，并随后用于增殖测定。
[0537]
7-aad染色：使用7-aad测定法确定经刺激的cfse标记的cd4
t的细胞凋亡。简言之，将培养的细胞用20μg/ml核染料7-氨基-放线菌素d(7-aad；sigma-aldrich,st-quentin fallavier，法国)在4℃下染色30分钟。fsc/7-aad点图将活细胞(fsc
高
/7-aad-)与凋亡(fsc
高
/7-aad

)细胞和凋亡小体(fsc
低
/7-aad

)和碎片(fsc
低
/7-aad-)区分开。将活细胞鉴定为cd3

7-aad-fsc

细胞。
[0538]
对每个染色组合使用合适的同种型对照ab。使用bd facsdiva 8.0.1软件(becton dickinson)在bd lsr fortessa流式细胞仪上采集样品。结果以百分比(％)或平均荧光强度(mfi)表示。
[0539]
功能性测定
[0540]
t细胞增殖：用cfse稀释测定来评估t细胞增殖。对于cfse稀释测定，在共培养完成时，收获经刺激的cfse标记的cd4
t细胞，用抗cd3mab和7-aad共染色，并且通过流式细胞术确定门控的cd3

7-aad-细胞中增殖细胞的百分比(定义为cfse低级分)。
[0541]
t细胞激活：cd38表达的cd38中值荧光强度(mfi)在培养结束时通过流式细胞术在cd3

7-aad-cfse

刺激的cd4
t细胞中测量。
[0542]
cd4
t细胞多克隆刺激：cfse染色的cd4
t细胞(5x104/孔)在δcd3-饲养细胞(1x105/孔)和板结合的抗cd3抗体(2μg/ml)、可溶性抗cd28 mab(2μg/ml)的存在下在96个圆底微孔中培养。通过流式细胞术使用如上所述的cfse稀释测定法对cd4
t细胞增殖进行评估。在不同量的重组细胞因子的存在下刺激细胞。
[0543]
同种异体混合淋巴细胞反应：在同种异体成熟dc的存在下，在96个圆底微孔中培养cfse染色的cd4
t细胞(5x104/孔)。通过流式细胞术使用如上所述的cfse稀释测定来测定同种异体激活的cd4
t细胞增殖。在不同量的重组细胞因子的存在下刺激细胞。
[0544]
stat1磷酸化分析：将cd4
t细胞用ifn-λ1、ifn-λ2、ifn-λ3、ifn-λ4或ifn-a2a(10ng/ml)刺激20min，或不刺激(对照)。如上所述，通过流式细胞术评估磷酸化stat1水平。
[0545]
结果
[0546]
i型干扰素(ifn-α/β)和最近确定的iii型干扰素(ifn-λ)作为抵御病毒感染的第一道防线，并调节先天性和适应性免疫应答的发展。iii型ifn最初被确定为与i型ifn平行作用的新的配体-受体系统，但随后的研究为每个ifn家族的不同作用提供了越来越多的证据。
[0547]
本发明人旨在评估i型和iii型干扰素对先天性(抗病毒)和适应性免疫应答(cd4
t细胞增殖)的影响。
[0548]
i型和iii型的抗病毒活性
[0549]
通过qpcr分析i型和iii型干扰素诱导干扰素刺激的基因(interferon-stimulated gene，isg)的表达的能力。
[0550]
简言之，在用ifn-α2a、ifnλ1、ifnλ2、ifnλ3或ifnλ4处理4小时的hepg2细胞中测试i型和iii型的抗病毒活性。然后通过qpcr检测公知的干扰素刺激的基因(isg)mx1、ifit1和oasl的诱导。
[0551]
如图1a所示，所有五种干扰素均清楚地诱导了所有三种isg。
[0552]
由于所研究的isg在功能上与抗病毒防御相关，发明人进一步评估了两种ifn保护hepg2细胞免受emcv诱导的细胞病变效应的能力。
[0553]
简言之，将细胞接种在96孔微量滴定板中，并用指定量的ifn处理24h，并然后用emcv攻毒20h。通过mtt染色测定法测量细胞存活。
[0554]
如图1b所示，iii型ifn和ifn-α2a具有内在的细胞抗病毒活性，并且能够充分保护受到emcv攻毒的hepg2细胞。
[0555]
i型和iii型干扰素针对cd4
t细胞增殖的抗增殖活性
[0556]
在混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction，mlr)测定中评估了i型ifn和iii型ifn对响应于多克隆或同种异体刺激的cd4
t细胞增殖的影响。
[0557]
简言之，首先将cfse标记的cd4
t细胞在不同剂量的ifn的存在下用poly i:c成熟同种异体树突细胞进行刺激。在激活后5天，分析cfse荧光稀释。
[0558]
如图2所示，ifn-α2a抑制经刺激的cd4
t细胞的增殖，而iii型ifn不表现抑制其增殖的能力。值得注意的是，当在存在抗干扰素i型受体抗体的情况下进行mlr时，cd4
t细胞表现出更大的增殖。因此，i型ifn而非iii型ifn抑制同种异体激活的cd4
t细胞的增殖。
[0559]
此外，对ifn处理的cd4
t细胞中的干扰素诱导的基因(isg)ifit1、mx1和oasl的mrna水平的分析证实，cd4
t细胞对iii型干扰素缺乏敏感性或敏感性最低。
[0560]
事实上，如图3所示，isg仅在用ifn-α2a刺激的cd4
t细胞中被诱导。因此，ifn-α2a而非iii型ifn诱导cd4
t细胞中的isg表达。
[0561]
因为jak-stat1/2通路是isg转录的主要调节子，本发明人分析了cd4

t细胞内的stat1蛋白响应于i型ifn或iii型干扰素的磷酸化水平。
[0562]
如图4所示，仅ifn-α2a能够刺激cd4
t细胞内的stat1磷酸化。因此，ifn-α2a而非iii型ifn诱导cd4
t细胞中stat1的酪氨酸磷酸化。
[0563]
i型和iii型干扰素存在下的慢性免疫激活的诱导。
[0564]
由于慢性免疫激活已被认为是感染hiv-1的受试者中疾病进展的重要推动者，因此可以通过测量cd4
t细胞表面的激活标志物的表达来监测疾病进展。因此，发明人通过流式细胞术评估了两种ifn增加经刺激的cd4
t细胞上的cd38表达的能力。
[0565]
如图5所示，仅ifn-α2a能够增强cd38在经刺激的cd4
t细胞上的表达。
[0566]
总的来说，这些离体实验显示，尽管与ifn-α一样显示抗病毒活性，但iii型干扰素与免疫抑制性ifn-α相比，对cd4
t细胞的激活和增殖没有影响。事实上，iii型干扰素不像ifn-α2a那样抑制适应性免疫反应的启动。
[0567]
总之，尽管i型和iii型干扰素由相同的病毒刺激因子诱导并表现出相似的特征谱(signature profile)，但它们的生物活性似乎不是多余的，而是互补的。事实上，在病毒感染后，在免疫应答的先天阶段期间，iii型干扰素在粘膜部位发挥其抗病毒作用，而ifn-α在整个生物体中更系统地发挥作用。此外，随后的适应性免疫反应在其起始水平通过ifn-α在激活的cd4
t细胞上的免疫抑制作用而受到抑制。
[0568]
实施例2：抗原(ag)特异性cd8

hla-e限制性t细胞的离体产生和扩增
[0569]
材料与方法
[0570]
人类血液样品
[0571]
来自etablissementdu sang(efs，巴黎)的健康个体的血液样品。使用标准程序收集血细胞。
[0572]
细胞纯化和培养
[0573]
通过在ficoll-hypaque(pharmacia)上进行密度梯度离心来分离外周血单核细胞(pbmc)。pbmc可用作新鲜细胞或冷冻储存在液氮中。t细胞亚群和t细胞耗减的辅助细胞(δcd3细胞)从新鲜或冷冻的pbmc中分离。t细胞耗减的辅助细胞(δcd3细胞)通过将pbmc与抗cd3包被的dynabeads(dynal biotech)一起孵育以进行负选择来分离，并将其在3000rad(称为δcd3-饲养细胞)下进行辐照。使用macs系统通过负选择从pbmc中分离初始cd8
t细胞。cd14

单核细胞使用macs系统通过正选择从pbmc中分离。将t细胞亚群在补充有5％svf、100iu/ml青霉素/链霉素、1mm丙酮酸钠、1mm非必需氨基酸、glutamax和10mm hepes(imdm-5培养基)，缺氧2％的imdm中培养。
[0574]
细胞的冷冻和解冻
[0575]
细胞在含有10％dmso的fbs中冷冻。将冻存管置于coolcell(biocision)冷冻容器中并在-80℃下孵育。2天后，将试管转移到液氮中并储存直至需要。通过将冻存管置于37℃水浴中约30秒来进行细胞解冻。接下来，将细胞悬浮液与等体积的预热培养基混合，并且随后转移到含有相同培养基的falcon离心管中。通过离心(300g，3min)将细胞沉淀以除去dmso。将细胞沉淀重悬于细胞培养基中。
[0576]
树突细胞生成
[0577]
将单核细胞在il-4(20ng/ml)和gm-csf(20ng/ml)的存在下在补充有10％热灭活胎牛血清、2mm l-谷氨酰胺、1％青霉素和链霉素溶液(rpmi培养基)的rpmi中培养。在第6天，将dc在不同的混合物(cocktail)中成熟过夜：a(il-1β(2ng/ml)il-6(30ng/ml)、pge2(1microg/ml)和tnf-α(10ng/ml)、lps 250ng/ml、poly i:c(150ng/ml)。
[0578]
体外生成tap抑制的刺激细胞用于mlr测定
[0579]
将如上所述获得的成熟dc用20μg合成自含有来自bhv-1的ul49.5基因的pgem4z载体的rna进行电穿孔(参见，例如，lampen等人(2010)j immunol.185(11):6508-17)。
[0580]
人ag特异性cd8 t细胞(hla-e限制性的)诱导和扩增
[0581]
将tap抑制的成熟dc(tap-mdc)用50μg/ml合成肽进行脉冲。然后将dc与初始cd8 t
细胞以1:10的比例混合。开始培养后立即添加il-21(30ng/ml)。3天后，更换一半培养基，并添加30ng/ml il-21、20ng/ml白介素15(il-15)和500ng/ml可溶性fc融合的il15-受体α(sil15ra-fc，r&dsystems)。共培养10天后，在il-21、il-15和fc融合的il15-受体α的存在下，用肽脉冲的tap抑制的成熟dc再次刺激t细胞。在第二次刺激后1天添加il-2(50iu/ml)和il-7(10ng/ml)，以进一步促进激活的ag特异性t细胞的扩增。t细胞的肽特异性扩增通过流式细胞术分析使用mhc肽五聚物进行监测。
[0582]
流式细胞术分析
[0583]
将t细胞转移到每个v底96孔板中，洗涤(300g，2min)并在含有相应肽-mhc五聚物(1:10，proimmune)的100μl facs缓冲液(pbs，3％fbs，2mm edta)中在4℃下染色1小时。将细胞在facs缓冲液中洗涤3次并进行流式细胞术分析。
[0584]
每个染色组合使用合适的同种型对照ab。使用bd facsdiva 8.0.1软件(becton dickinson)在bd lsr fortessa流式细胞仪上采集样品。结果以百分比(％)或平均荧光强度(mfi)表示。
[0585]
结果
[0586]
siv疫苗学领域的最新进展突显了mhc-1b/e限制性cd8
t细胞应答控制恒河猴中siv感染的作用，从而提高hla-e限制性cd8
t细胞的过继转移有助于控制hiv-1感染的可能性。因此，发明人建立了一种实验程序，以产生和扩增针对由hla-e呈递的肽(用作hla-e肽)、cmv ul40衍生肽(vmaprtlil，seq id no:5)和作为刺激细胞的tap抑制的成熟dc的自体cd8
t细胞系。vmaprtlvl-hla-e五聚物(vmaprtlvl，seq id no:6)的使用允许评估特异性t细胞扩增。
[0587]
如图6所示，经过两轮刺激后，培养物中72％的cd8
t细胞为四聚物阳性，表明本发明人已开发出一种促进hla-e限制性的ag特异性cd8
t细胞扩增和生成的培养系统。
[0588]
此类离体扩增的细胞材料本身代表了过继性t细胞治疗活性原理的示例。实施例3：使用重组rhcmv/siv载体的针对猕猴中siv的预防性疫苗图7是猕猴中免疫方案的示意图。
[0589]
免疫方案(dna疫苗接种)
[0590]
cd8疫苗组合物是适于肌内施用的形式并包含rhcmv/siv载体(参见hansen等人(2013)science 24；340(6135):1237874；hansen等人(2016)science；351(6274))。中国恒河猴在第0天和第14天接受2次所述cd8疫苗组合物的肌内(i.m.)注射。
[0591]
在第-7、-3、3、11、38、45、52、59、66、73和80天，猕猴接受干扰素λ1(50-100μg)和/或抗干扰素α抗体(pbl，100μg/kg)的(i.p.)注射。
[0592]
攻毒前
[0593]
任选地，猕猴接受siv或减毒的siv(例如，蛋白nef耗减的siv)的非感染性剂量的直肠内注射。
[0594]
攻毒
[0595]
在第45、52、59、66、73和80天，猕猴接受sivmac 239的次优剂量的直肠内注射。
[0596]
将siv感染的获得确定为血浆病毒载量》30个拷贝eq/ml和/或对siv vif(即，未包含在rhcmv/siv载体中的抗原)的免疫反应的发展。
[0597]
实施例4：使用灭活siv和活植物乳杆菌的针对猕猴中siv的预防性疫苗
[0598]
图8是猕猴中经口免疫方案的示意图。
[0599]
经口初次免疫方案
[0600]
cd8疫苗组合物是适于胃内施用的形式，并包含：在麦芽糖糊精(20％)溶液中的4x107个拷贝/ml的灭活siv和3x10
9 cfu/ml的活植物乳杆菌。中国恒河猴在第0、1、3、5、7和28、29天接受30ml所述cd8疫苗组合物，并随后每30分钟接受25ml的相同组合物，持续3小时。
[0601]
在第-3天和第0、28和29天的每个系列免疫之前，猕猴根据如下文所述的方案接受不同试剂组合的(i.p.)注射：
[0602]-方案1：无
[0603]-方案2：poly i:c(100μg/kg)和干扰素λ1(50-100μg)
[0604]-方案3：多克隆抗ifn-α抗体(pbl，100μg/kg)和poly i:c(100μg/kg)
[0605]-方案4：多克隆抗ifn-α抗体(pbl，100μg/kg)、poly i:c(100μg/kg)和干扰素λ1(50-100μg)
[0606]
在第57天，猕猴接受多克隆抗ifn-α抗体(pbl，100μg/kg)、poly i:c(100μg/kg)和/或干扰素λ1(50-100μg)的注射。
[0607]
加强免疫(攻毒前)
[0608]
在第60天，猕猴接受siv或减毒siv(例如，蛋白nef耗减的siv)的非感染性剂量的直肠内注射。
[0609]
免疫应答分析
[0610]
在第25、57和80天分析抗siv免疫应答。抗siv免疫应答的分析包括对以下的监测：
[0611]-血浆siv igm/igg/iga抗体滴度，和/或
[0612]-siv gag特异性cd8
t细胞和cd8
t细胞介导的抗病毒活性。
[0613]
攻毒
[0614]
在第90天，仅当观察到抗siv特异性cd8

抑制性t细胞(如本发明所述)时，猕猴才接受siv的感染性剂量的直肠内注射。
[0615]
攻毒后，每两周监测一次抗siv免疫应答和血浆病毒血症。
[0616]
实施例5：针对blt小鼠中hiv的预防性疫苗
[0617]
图9是blt小鼠中经口免疫方案的示意图。
[0618]
blt小鼠是用于研究hiv感染的有价值的人源化模型。事实上，blt小鼠重现了人类免疫的重要方面，包括t细胞免疫(marshall e.karpel等人,curr opin virol.2015aug；13:75
–
80)。
[0619]
经口免疫方案
[0620]
cd8疫苗组合物是适于胃内施用的形式，并包含：在麦芽糖糊精(20％)溶液中的4x107个拷贝/ml的灭活hiv-1和3x10
9 cfu/ml的活植物乳杆菌。blt小鼠在第0、1、3、5、7和28、29天接受0.2ml所述cd8疫苗组合物，并然后每30分钟接受0.2ml的相同组合物，持续3小时。
[0621]
在第-3天和第0、28和29天的每个系列免疫之前，blt小鼠根据如下文所述的方案接受不同试剂组合的(i.p.)注射：
[0622]-方案1：无
[0623]-方案2：poly i:c(100μg/kg)和干扰素λ1(50-100μg)
[0624]-方案3：多克隆抗ifn-α抗体(pbl，100μg/kg)和poly i:c(100μg/kg)
[0625]-方案4：多克隆抗ifn-α抗体(pbl，100μg/kg)、poly i:c(100μg/kg)和干扰素λ1(50-100μg)
[0626]
在第57天，blt小鼠接受多克隆抗ifn-α抗体(pbl，100μg/kg)、poly i:c(100μg/kg)和/或干扰素λ1(50-100μg)的注射。
[0627]
加强免疫(攻毒前)
[0628]
在第60天，blt小鼠接受hiv-1或减毒hiv-1(例如，蛋白nef耗减的hiv-1)的非感染性剂量的直肠内注射。
[0629]
免疫应答分析
[0630]
在第25、57和80天分析抗hiv免疫应答。抗hiv免疫应答的分析包括对以下的监测：
[0631]-血浆hiv igm/igg/iga抗体滴度，和/或
[0632]-hiv gag特异性cd8
t细胞和cd8
t细胞介导的抗病毒活性。
[0633]
攻毒
[0634]
在第90天，仅当观察到抗hiv特异性cd8

抑制性t细胞(如本发明所述)时，blt小鼠才接受hiv的感染性剂量的直肠内注射。
[0635]
攻毒后，每两周监测一次抗hiv免疫应答和血浆病毒血症。
[0636]
实施例6：使用k562细胞系的hla-e＊01033转染的衍生物对抗原(ag)特异性cd8 hla-e限制性t细胞进行离体生成和扩增
[0637]
材料与方法
[0638]
人类血液样品
[0639]
来自etablissementdu sang(efs，巴黎)的健康个体的血液样品。使用标准程序收集血细胞。
[0640]
细胞纯化和培养
[0641]
通过在ficoll-hypaque(pharmacia)上进行密度梯度离心来分离外周血单核细胞(pbmc)。pbmc用作新鲜细胞或冷冻储存在液氮中。使用macs系统通过负选择从pbmc中分离初始cd8 t细胞。t细胞亚群在补充有5％svf、100iu/ml青霉素/链霉素、1mm丙酮酸钠、1mm非必需氨基酸、glutamax和10mm hepes(imdm-5培养基)，缺氧2％的imdm中培养。
[0642]
将k562(k562/hla-e)细胞系的hla-e*01033转染的衍生物维持在0.4mg/ml g-418(calbiochem，san diego，ca)存在下的补充有10％胎牛血清、2mm l-谷氨酰胺、25mm hepes和抗生素的rpmi 1640培养基(lonza，basel，瑞士)中。当用作抗原呈递细胞时，经脉冲的k562/hla-e细胞系在80000rad下进行辐照。
[0643]
肽-hla分子结合测定
[0644]
使用k562(k562/hla-e)细胞系的hla-e*01033转染的衍生物通过hla-e稳定化测定来评估肽结合。简言之，将细胞以1x106个细胞/ml重悬于无血清培养基中。在合适的情况下，添加肽(见表1)。在26℃下孵育过夜后，用pbs洗涤细胞以去除游离肽。接下来，在用抗hla-e mab染色后监测hla表面表达。在facscalibur细胞仪(bd biosciences)上进行分析。结果表示为用抗hla-e mab染色的细胞的mfi。
[0645]
肽特异性hla-e限制性cd8
t细胞系的生成和扩增
[0646]
初始cd8
t在作为抗原呈递细胞的受辐照的k562/hla-e细胞系(0.5x106/ml)的存在下培养，所述k562/hla-e细胞系在补充有il-21(30ng/ml)的完全培养基中用合适的肽(10μg)进行脉冲。3天后，更换一半培养基并添加30ng/ml il-21、20ng/ml白介素15(il-15)和500ng/ml可溶性fc融合的il15-受体α(sil15ra-fc，r&d systems)。10天后，使用经相应肽脉冲的经辐照的k562/hla-e细胞在il-21、il-15和fc融合的il15-受体α的存在下进行再次刺激。在第二次刺激后1天，添加il-2(50iu/ml)和il-7(10ng/ml)，以进一步促进激活的ag特异性t细胞的扩增。然后，每周对培养物进行刺激，持续4-10周。使用细胞毒性测定通过流式细胞术分析来监测t细胞的肽特异性扩增。
[0647]
细胞毒性测定
[0648]
使用基于细胞的流式细胞术测定来测量离体产生的肽特异性hla-e限制性cd8 t细胞系的特异性细胞毒性活性。简言之，在存在或不存在合成肽的情况下将cfse标记的靶标在26℃下孵育过夜(k562/hla-e)，并与cd8 t细胞系以不同比例(10:1和1:1)共培养5小时。还测定了对照管(没有cd8 t细胞系的靶细胞)以确定自发性细胞死亡。共培养5小时后，将细胞用7-aad染色。对于数据分析，通过7-aad的摄取来检查cfse阳性靶细胞的细胞死亡。将cfse和7-aad双阳性细胞考虑为死靶细胞。随后使用以下等式计算特异性细胞毒活性的百分比：
[0649]
细胞毒性(％)＝靶细胞死亡-自发性死亡x100-自发性死亡x100
[0650]
结果
[0651]
肽加载后k562细胞系上的hla-e表达
[0652]
如通过流式细胞术所评估的，未转染的k562细胞不显示hla-e的表面表达，在不存在肽加载的情况下的hla-e转染的k562也是如此(参见表1)。使用来自不同来源的特异性hla-e肽在26℃下将k562/hla-e脉冲过夜后，诱导了hla-e表面表达(参见表1)。
[0653]
表1：肽-hla分子结合测定
[0654][0655]
使用细胞毒性测定检测抗原特异性hla-e限制性cd8 t细胞
[0656]
看到长期刺激培养物中的细胞增殖，发明人想要使用细胞毒性测定来评估它们的特异性功能活性。经k562/hla-e肽脉冲的细胞诱导抗原特异性cd8 t细胞系的激活和扩增，因为已增殖的细胞对候选抗原表现出高细胞毒性应答，而对无关抗原没有显著活性(参见表2)。
[0657]
表2：扩增的cd8 t细胞的特异性细胞毒活性
[0658][0659]
实施例7：ifn-α在人类hiv-1感染中的关键致病作用
[0660]
材料与方法
[0661]
将冷冻保存的pbmc在含有10％胎牛血清(fbs)的rpmi 1640中解冻，并在facs缓冲液中洗涤。通过与活力标志物(来自invitrogen的amcyan live-dead试剂盒)和与cd3、cd4、cd8、cd45ra、ccr7缀合的抗体一起孵育，对106个细胞进行表型染色。随后，洗涤细胞，用4％多聚甲醛固定5分钟，洗涤，并用aurora细胞仪(cytek)采集。
[0662]
冷冻血清在4℃下解冻，并在4℃下以4000g离心10分钟。使用高灵敏度技术(数字elisa技术)(quanterix)测量ifn-α血清浓度。
[0663]
结果
[0664]
感染hiv-1的受试者的中央记忆型(central memory，cm)cd8 t细胞分布比较
[0665]
在长期感染hiv-1的受试者的研究中，研究了以下组：
[0666]
(i)在不存在组合抗逆转录病毒疗法治疗(c-art)的情况下天然抑制hiv-1的精英控制者(ec)
[0667]
(ii)cart治疗前(cart前)和cart治疗后(cart后)的非控制者，以及
[0668]
(iii)一组年龄匹配的健康供体(hd)受试者。
[0669]
在每个受试者组中评估了cd8 t细胞区室(compartment)中cm群体的相对频率。
[0670]
定义这个亚群的门控策略如下。简言之，定义了独态(singlet)细胞，然后对淋巴细胞和活细胞进行门控。在活细胞中，鉴定了cd3 t淋巴细胞，然后定义了cd8 亚群体。随后，分析了cd8 t淋巴细胞中cd45ra和ccr7的表达。中央记忆型t细胞(tcm)是cd45ra-ccr7 。
[0671]
图10a显示，cm cd8 细胞的水平在cart前的非控制者中比在其他组中更低。此外，组合抗逆转录病毒疗法(cart)导致cm cd8 细胞增加。
[0672]
感染hiv-1的受试者中血清ifn-α水平的比较
[0673]
在4个组中测定了血清ifn-α水平。图10b显示，与治疗后相比，非控制者患者在治疗前的血清ifn-α水平显著更高。
[0674]
ifn-a与未经治疗的感染hiv的患者中的cm cd8

细胞百分比呈负相关
[0675]
在感染hiv的患者(ec cart前患者)的群体中，本发明人探索了cm cd8

细胞水平与血清ifn-α水平之间的潜在相关性。在这个研究中，cm cd8 细胞频率与血清ifn-α水平之间存在显著负相关(spearman相关r＝-0,667；p《0.005)。这反映了ifn-α对次级器官(secondary organ)中t细胞增殖的关键致病作用(见图10c)。
[0676]
实施例8：使用灭活siv和活植物乳杆菌的针对猕猴中siv的预防性疫苗
[0677]
这个方案包括下述两个步骤。
[0678]
图11是步骤1的方案计划的示意图。
[0679]
步骤1：确定在恒河猴(rm)中诱导病毒特异性cd8 抑制性t细胞的最有效方案
[0680]
免疫方案基于对中国恒河猴进行的实验工作，其描述在lu等人(2012)cell rep.2(6),1736-46中。
[0681]
这个方案包括三个步骤：
[0682]
1)使用含有灭活sivmac239的制备物作为激活原理和活植物乳杆菌(lp)作为佐剂的经口初免，
[0683]
2)使用相同制备物的经口加强，以及
[0684]
3)使用活病毒的非感染性剂量的直肠内加强。
[0685]
包括8只雄性rm，2只为中国来源且6只为印度来源。
[0686]
连续5天进行经口初次免疫。每天向猴子胃内施用在麦芽糖糊精(20％)溶液中含有4x107个拷贝/ml的灭活siv和3x109cfu/ml的活lp的30ml制备物。然后它们每30分钟胃内接受25ml相同的制备物，持续3小时。
[0687]
在第28天和第29天，并且如有必要，在第60天和第61天，进行经口加强免疫。
[0688]
从第90天起以2周的间隔进行两次直肠内加强。经口初免的第-2天、第3天和每次经口加强前两天，即第26天，并且如有必要，在第58天和ir加强前一天，印度来源的猴子额外接受腹膜内(ip)注射poly i:c和λifn。
[0689]
根据在免疫期间何时添加抗ifnα抗体，将印度来源的6只rm分为两组(b和c)。对于b组，在第32天，并且如有必要，在第64天，每次ir加强前一天施用抗ifnα抗体。对于c组，仅在第一次ir加强后五天施用抗ifnα抗体。对于所有猕猴，在第50天，并且如有必要，在第80天和第126天监测病毒特异性cd8 抑制性t细胞的诱导。在ir加强后每周跟踪血浆病毒载量。
[0690]
步骤2：通过使用sivmac239进行经直肠攻毒来评估疫苗效力。
[0691]
仅对病毒特异性cd8 抑制性t细胞上升(mount)的猴子进行使用sivmac239(100,000tcid50)的高感染性剂量的直肠内攻毒。每周跟踪血浆病毒载量，持续6周。
[0692]
实施例9：针对bslt小鼠中hiv的预防性疫苗
[0693]
这个方案包括下述两个步骤。
[0694]
图12是步骤1的方案计划的示意图。
[0695]
步骤1：确定在bslt小鼠中诱导抗hiv-1特异性cd8 抑制性t细胞的最有效方案
[0696]
免疫方案基于对中国恒河猴进行的实验工作，其描述在lu等人(2012)cell rep.2(6),1736-46中。这个方案包括三个步骤：
[0697]
1)使用含有灭活hiv-1的制备物作为激活原理和活植物乳杆菌(lp)作为佐剂通过胃内途径进行经口初免；
[0698]
2)使用相同制备物通过胃内途径进行经口加强；
[0699]
3)使用活病毒的低剂量的直肠内加强。
[0700]
包括四个组(a、b、c和d)，每组10只小鼠。d组是监控攻毒有效性的对照组。这个d组的小鼠不接受免疫或用pbs免疫。
[0701]
通过胃内途径的经口初次免疫由每日经口摄取麦芽糖糊精(20％)溶液中的灭活hiv-1和活lp，持续超过5天来组成。每天，小鼠胃内接受相同的制备物，每30分钟3次，持续1小时。小鼠接受200mcl的制备物。
[0702]
在第28天和第29天，并且如有必要，在第60天和第61天施用胃内途径的经口加强免疫。
[0703]
在第90天和第104天以2周的间隔进行两次直肠内加强。在胃内途径的经口初免期间的第-2天、第3天和每次胃内途径的经口加强前两天，即第26天，并且如有必要，在第58天和ir加强前一天(第89天和第103天)，b组和c组额外接受了poly i:c和λifn(100-500mcl)的腹膜内注射。
[0704]
b组和c组的不同之处在于免疫期间何时添加抗ifnα抗体。对于b组，在胃内途径的经口加强期间的第32天，并且如有必要，在胃内途径的经口加强期间的第64天施用抗ifnα抗体。对于c组，仅在ir加强后五天施用抗ifnα抗体。对于所有小鼠，在第50天，并且如有必要，在第80天和第126天监测病毒特异性cd8 抑制性t细胞的诱导。在ir加强后每周跟踪血浆病毒载量。
[0705]
步骤2：通过使用hiv进行经直肠攻毒来评估疫苗效力。
[0706]
在最后一次抗ifnα抗体施用后两个月，仅对病毒特异性cd8 抑制性t细胞上升的小鼠进行使用hiv(100,000tcid50)的高感染性剂量的直肠内攻毒。每周跟踪血浆病毒载量，持续6周。