一种免疫细胞玻璃化冻存保护液及其冻存方法与流程

1.本发明涉及生物细胞技术领域，尤其涉及一种免疫细胞玻璃化冻存保护液及其冻存方法。


背景技术：

2.免疫细胞疗法是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法，它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，以激发、增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。
3.细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于零下196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。传统的方法，细胞冻存时向培养基中加入保护剂
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终浓度5％，15％的甘油或二甲基亚砜(dmso)，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。为了降低冻存过程中对细胞的伤害并提升细胞的存活率，国内外对免疫细胞冻存保护液进行了大量研究。
4.中国发明专利cn105123671a公开了一种细胞冻存液，使用人血白蛋白可以替代胎牛血清在冻存中发挥的作用同时添加了非必须氨基酸、维生素c和香菇多糖以保证复苏后细胞增殖活力不受影响，而葡萄糖和丙二醇可替代二甲基亚砜的保护作用，保证细胞在接近冰点时胞内水分不会结晶；中国发明专利cn106665559a公开了一种免疫细胞冻存液，包含：dmso；hsa；血浆，以还加入白酒草皂苷r和培养基。该冻存液能够有效保存免疫细胞，并且保存时间长，细胞复苏后恢复能力强，细胞回收率高；中国发明专利cn106942200a公开了一种冻存保护液，在基础培养基加入胎牛血清、人血清白蛋白、二甲基亚砜、乙二醇、甲酰胺和葡萄糖。该冻存保护液可以进行玻璃化冻存优势：细胞复苏率达到90％以上，存活率达到85％以上；中国发明专利cn108142412a公开了一种冻存保护液，该冻存液，包括基础培养基、葡萄糖、丙二醇、乙酰胺、右旋糖酐、羟乙基淀粉、葡萄糖、肝素钠、珍珠草提取液和卡介菌复合多糖；该冻存液可保证复苏后细胞增殖活力不受影响，保证细胞在接近冰点时胞内水分不会结晶；中国发明专利cn110495447a公开了一种冻存保护液，在基础培养基rpmi 1640培养液中加入聚乙烯醇、二甲基亚砜、丙三醇、乙二醇、葡萄糖、胎牛血清和人血清白蛋白。
5.为了进一步提升免疫细胞的复苏率和存活率，本发明提出了一种免疫细胞玻璃化冻存保护液及其冻存方法。


技术实现要素：

6.基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种免疫细胞玻璃化冻存保护液。
7.本发明的技术方案如下：
8.一种免疫细胞玻璃化冻存保护液，由以下成分组成：培养液、聚乙烯醇、二甲基亚砜、丙三醇、乙二醇、葡萄糖、人血白蛋白、黄酮并木脂素类化合物和蚕丝素低聚肽粉。
9.优选的，所述的免疫细胞玻璃化冻存保护液，各原料的含量如下：聚乙烯醇1.5-2.5v/v％、二甲基亚砜0.5-1.0v/v％、丙三醇3-6v/v％、乙二醇7-12v/v％、葡萄糖3-5w/v％、人血白蛋白0.5-0.8w/v％、黄酮并木脂素类化合物15-25mg/ml、蚕丝素低聚肽粉30-50mg/ml，余量为培养液。
10.优选的，所述的培养液为dmem/f12培养液。
11.优选的，所述的黄酮并木脂素类化合物提取自垂穗披碱草。
12.进一步优选的，所述的黄酮并木脂素类化合物的化学式为：
[0013][0014]
优选的，所述的蚕丝素低聚肽粉提取自蚕茧。具体的提取方法参考中国发明专利cn107099570a的实施例1。
[0015]
采用以上免疫细胞玻璃化冻存保护液冻存免疫细胞的方法，包括以下步骤：将免疫细胞加入冻存液中，然后将温度降至零下20-零下25℃冻存1-2h，然后以3-5℃/h的速率降温至零下80℃冻存过夜，最后转移至液氮中保存，即可。
[0016]
优选的，所述的免疫细胞的冻存密度为8-15
×
106个/ml。
[0017]
所述的免疫细胞包括但不限于：t细胞、nk细胞、单个核细胞、dc细胞、γδt细胞、car-t细胞。
[0018]
本发明的有益之处在于：
[0019]
1、本发明的免疫细胞玻璃化冻存保护液，将二甲基亚砜的含量降低至0.5-1.0v/v％、可以有效降低其对细胞的伤害，有利于细胞复苏。
[0020]
2、本发明的免疫细胞玻璃化冻存保护液中加入了植物提取物黄酮并木脂素类化合物和蚕茧提取物蚕丝素低聚肽粉，两者共同使用，具有协同效果，可以显著提升免疫细胞的复苏率和存活率。
具体实施方式
[0021]
实施例1
[0022]
一种免疫细胞玻璃化冻存保护液，各原料的含量如下：聚乙烯醇1.8v/v％、二甲基亚砜0.7v/v％、丙三醇4.5v/v％、乙二醇8.5v/v％、葡萄糖3.2w/v％、人血白蛋白0.7w/v％、黄酮并木脂素类化合物18mg/ml、蚕丝素低聚肽粉45mg/ml，余量为培养液。
[0023]
所述的培养液为dmem/f12培养液。
[0024]
所述的黄酮并木脂素类化合物提取自垂穗披碱草；所述的黄酮并木脂素类化合物的化学式为：
[0025][0026]
所述的蚕丝素低聚肽粉提取自蚕茧。具体的提取方法参考中国发明专利cn107099570a的实施例1。
[0027]
实施例2
[0028]
一种免疫细胞玻璃化冻存保护液，各原料的含量如下：聚乙烯醇2.5v/v％、二甲基亚砜0.5v/v％、丙三醇6v/v％、乙二醇7v/v％、葡萄糖5w/v％、人血白蛋白0.5w/v％、黄酮并木脂素类化合物25mg/ml、蚕丝素低聚肽粉30mg/ml，余量为培养液。
[0029]
所述的培养液为dmem/f12培养液。
[0030]
所述的黄酮并木脂素类化合物提取自垂穗披碱草。
[0031]
所述的黄酮并木脂素类化合物的化学式为：
[0032][0033]
所述的蚕丝素低聚肽粉提取自蚕茧。具体的提取方法参考中国发明专利cn107099570a的实施例1。
[0034]
实施例3
[0035]
一种免疫细胞玻璃化冻存保护液，各原料的含量如下：聚乙烯醇1.5v/v％、二甲基亚砜1.0v/v％、丙三醇3v/v％、乙二醇12v/v％、葡萄糖3w/v％、人血白蛋白0.8w/v％、黄酮并木脂素类化合物15mg/ml、蚕丝素低聚肽粉50mg/ml，余量为培养液。
[0036]
所述的培养液为dmem/f12培养液。
[0037]
所述的黄酮并木脂素类化合物提取自垂穗披碱草。
[0038]
所述的黄酮并木脂素类化合物的化学式为：
[0039][0040][0041]
所述的蚕丝素低聚肽粉提取自蚕茧。具体的提取方法参考中国发明专利cn107099570a的实施例1。
[0042]
对比例1
[0043]
一种免疫细胞玻璃化冻存保护液，各原料的含量如下：聚乙烯醇1.8v/v％、二甲基亚砜0.7v/v％、丙三醇4.5v/v％、乙二醇8.5v/v％、葡萄糖3.2w/v％、人血白蛋白0.7w/v％、蚕丝素低聚肽粉45mg/ml，余量为培养液。
[0044]
所述的培养液为dmem/f12培养液。
[0045]
所述的蚕丝素低聚肽粉提取自蚕茧。具体的提取方法参考中国发明专利cn107099570a的实施例1。
[0046]
对比例2
[0047]
一种免疫细胞玻璃化冻存保护液，各原料的含量如下：聚乙烯醇1.8v/v％、二甲基亚砜0.7v/v％、丙三醇4.5v/v％、乙二醇8.5v/v％、葡萄糖3.2w/v％、人血白蛋白0.7w/v％、黄酮并木脂素类化合物18mg/ml，余量为培养液。
[0048]
所述的培养液为dmem/f12培养液。
[0049]
所述的黄酮并木脂素类化合物提取自垂穗披碱草；所述的黄酮并木脂素类化合物的化学式为：
[0050][0051]
对比例3
[0052]
一种免疫细胞玻璃化冻存保护液，各原料的含量如下：聚乙烯醇1.8v/v％、二甲基亚砜0.7v/v％、丙三醇4.5v/v％、乙二醇8.5v/v％、葡萄糖3.2w/v％、人血白蛋白0.7w/v％，余量为培养液。
[0053]
所述的培养液为dmem/f12培养液。
[0054]
测试例
[0055]
以下的定量数据，设置年龄相近的三位不同的男志愿者进行重复实验，结果取平均值。
[0056]
采用以上免疫细胞玻璃化冻存保护液冻存免疫细胞的方法，包括以下步骤：
[0057]
a抽取健康志愿者外周血350ml，缓慢加入装有淋巴细胞分离液的离心管中，500g离心20分钟，吸取白膜层细胞；用pbs洗涤两遍，计数；
[0058]
b根据计数结果，分别用实施例1-3和对比例1-3配制好、预冷的冻存液悬浮pbmc细胞，使得细胞密度在1
×
107个/ml，将细胞转移至冻存袋；
[0059]
c然后将温度降至零下20-零下25℃冻存1-2h，然后以4℃/h的速率降温至零下80℃冻存过夜，最后转移至液氮中保存，即可。
[0060]
6个月后放入37℃水浴复苏，细胞计数仪检测细胞复苏率，台盼蓝染色检测存活率，结果如表1所示。
[0061]
表1：玻璃化冻存的免疫细胞复苏结果；
[0062][0063][0064]
由以上测试数据可以知道，本发明的免疫细胞玻璃化冻存保护液对免疫细胞具有非常好的冻存效果。
[0065]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。