一种超临界流体色谱分离方法及装置与流程

1.本技术涉及色谱技术领域，具体涉及一种超临界流体色谱分离方法及装置。


背景技术：

2.近年来，以环境友好的亚临界/超临界二氧化碳(sc-co2)为流动相的超临界流体色谱(supercritical fluid chromatography，sfc)被认为是一种绿色环保，高效快速的分离技术。与液相色谱(liquid chromatography，lc)相比，sfc具有更快的流速(大约是lc的3倍)，更高的分离通量以及更低的有机溶剂消耗。特别是制备型sfc，因分离条件温和，分离快速，后处理简便，在样品纯化方面有着一定的优势。
3.然而，样品的溶解一直是sfc分离的难点问题。sfc的流动相由超临界co2和一定比例的改性剂组成。样品大多数溶解在改性剂中，其强度和粘度与sfc流动相不匹配，常导致谱带展宽，分离度下降，重复性变差。这个问题在制备sfc上更为突出，甚至样品会在进样后有析出再溶解的过程，导致色谱峰严重失真。另外，在分离复杂样品时，杂质的干扰常常成为sfc高效分离的阻碍。复杂样品的极性分布范围较广，增加了样品溶解的难度，而且有些杂质在sfc上不易洗脱，也给分离造成了困扰。综上所述，迫切需要开发一种同时解决制备sfc中进样溶剂不匹配和杂质干扰问题的方法。


技术实现要素：

4.本技术提供一种超临界流体色谱分离方法及装置，可以一步实现样品的提取、前处理、上样和分离。
5.本技术提供一种超临界流体色谱分离方法，包括：将样品放置于预分离装置中；将预分离装置的一端与色谱柱柱前管路连接，预分离装置的另一端与超临界流体制备色谱柱连接；以超临界二氧化碳作为提取溶剂，对样品进行预分离，将预分离后目标组分加载至超临界流体制备色谱柱；将色谱柱柱前管路连接至所述超临界流体制备色谱柱；以超临界二氧化碳和改性剂为流动相，分离目标组分。
6.可选的，在本技术的一些实施例中，预分离包括提取、前处理和上样。
7.可选的，在本技术的一些实施例中，样品与色谱填料混合后放置于预分离装置中。
8.可选的，在本技术的一些实施例中，提取溶剂还包括改性剂，改性剂占超临界二氧化碳与改性剂总流量的0～10％。
9.可选的，在本技术的一些实施例中，改性剂包括甲醇、乙醇、异丙醇或乙腈中的至少一种。
10.可选的，在本技术的一些实施例中，色谱填料包括硅胶基质填料或大孔树脂填料。
11.可选的，在本技术的一些实施例中，色谱填料的粒径范围可以为10～60μm，也可以为20～50μm，还可以为30～40μm。
12.可选的，在本技术的一些实施例中，样品包括白花蛇舌草或高良姜或其提取物。
13.可选的，在本技术的一些实施例中，样品和色谱填料的质量比可以为1:(1.5～
10)，也可以为1:(2～9)，还可以为1:(3～8)。
14.可选的，在本技术的一些实施例中，在预分离的条件中，超临界二氧化碳的流速范围可以为5～50ml/min，也可以为10～40ml/min，还可以为20～30ml/min。
15.可选的，在本技术的一些实施例中，在预分离的条件中，背压范围可以为100～150bar，也可以为110～140bar，还可以为120～130bar。
16.可选的，在本技术的一些实施例中，在预分离的条件中，萃取的时间范围可以为10～20分钟，也可以为11～19分钟，还可以为12～18分钟。
17.可选的，在本技术的一些实施例中，混合的步骤包括：将样品溶解于溶剂中，加入色谱填料，研磨后去除溶剂。
18.可选的，在本技术的一些实施例中，分离目标组分的步骤包括：在超临界流体制备色谱柱上以等度或梯度条件进行洗脱，分离目标组分。
19.可选的，在本技术的一些实施例中，超临界流体制备色谱柱的直径范围为10～30mm，超临界流体制备色谱柱的直径可以为10mm、20mm、30mm。
20.可选的，在本技术的一些实施例中，超临界流体制备色谱柱的长度范围为150～250mm，超临界流体制备色谱柱的长度可以为150mm或250mm。
21.可选的，在本技术的一些实施例中，超临界流体制备色谱柱的流速范围可以为10～200ml/min，也可以为20～150ml/min，还可以为50～100ml/min。
22.可选的，在本技术的一些实施例中，超临界流体制备色谱柱的上样量可以为1～1000mg，也可以为10～500mg，还可以为50～100mg。
23.可选的，在本技术的一些实施例中，超临界流体制备色谱柱对目标组分的保留能力大于预分离所用的色谱填料。
24.相应的，本技术还提供一种超临界流体色谱装置，包括色谱柱柱前管路、超临界流体制备色谱柱和检测器，超临界流体色谱装置还包括预分离装置；预分离装置在实现提取、前处理和上样功能时，预分离装置的一端与色谱柱柱前管路连接，预分离装置的另一端与超临界流体制备色谱柱连接；预分离装置在完成提取、前处理和上样功能时，预分离装置的连接断开，色谱柱柱前管路与超临界流体制备色谱柱连接，开始目标组分的分离。
25.可选的，在本技术的一些实施例中，预分离装置的两端设有连接孔。
26.可选的，在本技术的一些实施例中，预分离装置耐压范围可以为300～400bar，也可以为310～390bar，还可以为320～380bar。
27.可选的，在本技术的一些实施例中，预分离装置为不锈钢高密封装置。
28.本技术通过对sfc样品一步式预处理和分离，具有以下有益效果：
29.1)co2不仅是预分离装置中的提取溶剂，同时也是sfc的上样溶剂，并且与sfc的流动相相匹配。因此，解决了制备sfc中样品溶解试剂的强度和粘度与sfc流动相不匹配，造成峰展宽的问题。
30.2)将样品与色谱填料混合是基于色谱填料的吸附特性，在提取过程中将非目标组分保留在色谱填料上，从而实现了目标组分的选择性提取，消除了杂质对后续sfc分离的干扰。而且色谱填料的加入起到了分散样品，改善样品与溶剂的接触，避免co2流过混合物时产生沟流的作用。
31.3)在提取和前处理的同时实现目标组分的连续上样，一步实现样品提取、前处理、
上样和分离，操作便捷。
附图说明
32.为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
33.图1是超临界流体色谱装置示意图；
34.图2是超临界流体色谱分离方法示意图；
35.图3是实施例一中样品的sfc色谱图；
36.图4是对比例中样品以液体进样的sfc色谱图；
具体实施方式
37.下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
38.本技术提供一种超临界流体色谱分离方法及装置。以下分别进行详细说明。需说明的是，以下实施例的描述顺序不作为对实施例优选顺序的限定。
39.本技术中，超临界二氧化碳指一种介于液态和气态之间的二氧化碳，它是处于临界温度(31.06℃)和临界压力(7.39mpa)即临界点及以上时，液态跟气态的界面突然消失，形成的一种新的状态，兼具气体的高渗透性和液体的高溶解性，而且还有新的性质，例如超临界二氧化碳黏度较低，自扩散系数大等。
40.本技术实施例提供一种超临界流体色谱装置，如图1所示，包括色谱柱柱前管路1、预分离装置2、超临界流体制备色谱柱3和检测器4；预分离装置2的入口端接入色谱柱柱前管路1，预分离装置2的出口端与超临界流体制备色谱柱3的柱前端连接，超临界流体制备色谱柱3的柱后端接入检测器4前的管路。
41.在本技术的一些实施例中，超临界流体制备色谱柱3可以为半制备型或制备型色谱柱，色谱柱的直径为10～30mm，流速范围为10～200ml/min，上样量为1～1000mg；而常规使用的分析型sfc柱，直径为4.6mm，流速范围为2～4ml/min，上样量小于1mg，本技术采用的超临界流体制备色谱柱3无论流速范围还是上样量，均显著高于常规的分析型sfc柱，本技术采用超临界流体制备色谱柱，不仅能一步实现样品提取、上样、富集和分离，且分离样品规模大。
42.本技术中，样品置于预分离装置2中进行前处理，前处理可以是萃取或是其它样品预分离方法。预分离装置2为高密封、高耐压装置。其规格为5～25ml，预分离装置2中可加入最高可达10g的样品量，预分离装置2的流速为5～50ml/min。本技术中预分离装置可处理样品量较大，且本技术可选择不同的样品前处理方式，与本技术的装置配合使用，均可实现超临界流体制备色谱柱分离前样品的大规模前处理和固体上样，从而实现了目标组分的选择性提取，消除了杂质对后续sfc分离的干扰。
43.本技术实施例还提供一种超临界流体色谱分离方法，如图2所示，包括：
44.s1：将样品5与色谱填料6进行混合，样品5和色谱填料6的质量比范围为1:(1.5～10)，将样品5或样品5与色谱填料6的混合物装入预分离装置2中，预分离装置2的两端填充适量脱脂棉；
45.s2：将预分离装置2的入口端接入色谱柱柱前管路1，预分离装置2的出口端与超临界流体制备色谱柱3的柱前端连接，超临界流体制备色谱柱3的柱后端接入检测器4前的管路；
46.s3：萃取加上样：以如下条件萃取，超临界co2流速范围为5～50ml/min，背压范围为100～150bar，萃取时间范围为10～20min，连续萃取预分离装置2中的目标组分并加载至超临界流体制备色谱柱3；
47.s4：萃取结束后，切换到sfc通路，即将色谱柱柱1前管路接入超临界流体制备色谱柱3的柱前端，加入改性剂，在超临界流体制备色谱柱3上进行目标组分分离。
48.在本技术的一些实施例中，色谱填料包括硅胶基质填料和大孔树脂填料，包括但不局限于硅胶键合十八烷基(c18)、硅胶键合辛烷基(c8)、硅胶、阳离子交换填料(scx)、阴离子交换填料(sax)、scx-c18混合填料、sax-c18混合填料中的任意规格填料；利用色谱填料的吸附特性，将非目标组分牢固地保留在色谱填料上而不易被提取出来，从而实现了目标组分的选择性提取。
49.在本技术的一些实施例中，样品与色谱填料混合均匀按照如下方法制备而得：称取适量样品于研钵中，加入少量乙醇溶解样品。随后，向溶液中加入色谱填料，两者的质量比范围为1:(1.5～10)，研磨均匀后，挥干溶剂。
50.在本技术的一些实施例中，超临界流体制备色谱柱对目标组分的保留能力要强于预分离装置中与样品混合的色谱填料。超临界流体制备色谱柱筛选按照如下进行：在sfc分析型色谱柱上模拟萃取条件，保证目标组分在该条件下不被洗脱。
51.在本技术的一些实施例中，在完成萃取步骤后，切换到sfc通路，加入改性剂，在超临界流体制备色谱柱上以等度或梯度条件进行洗脱，完成目标组分分离。等度条件洗脱是指在样品组分的分析周期中，流动相的组成比例和流速恒定不变的洗脱方式；梯度洗脱是指在同一个分析周期中，按一定程度不断改变流动相的浓度配比。
52.在本技术的一些实施例中，改性剂包括甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈的任意一种或其混合溶剂。
53.下面结合具体实施例进行说明。
54.实施例一、
55.本实施例所采用的材料及材料规格如下：
56.样品：白花蛇舌草经95％乙醇提取再水沉后的沉淀物；
57.色谱填料：c18(40μm,100a)；
58.预分离装置规格：5ml；
59.超临界流体制备色谱柱规格：250
×
10mm i.d.,10μm。
60.本实施例的超临界流体色谱分离方法包括如下步骤：
61.s1:样品及色谱填料混合物的制备
62.称取白花蛇舌草药材干燥粉末(100g)，加入8倍料液比的95％乙醇(800ml)回流提
取两次，每次1小时。合并2次提取液，用旋转蒸发仪减压浓缩至20ml，得墨绿色提取物。在搅拌条件下向提取物中缓慢加入100ml水，4℃下静置24h后，沉淀物即为白花蛇舌草样品。
63.称取白花蛇舌草样品1.0g样品于研钵中，加入少量乙醇溶解样品。随后，向溶液中加入2.0g c18(40μm,100a)色谱填料，研磨均匀后，挥干溶剂，得到样品及色谱填料混合物。
64.s2:装置连接：称取330mg的样品及色谱填料混合物装入5ml预分离装置中，预分离装置的两端填充适量脱脂棉。预分离装置的入口端接入色谱柱柱前管路，预分离装置出口端与xamide半制备柱(250
×
10mm i.d.,10μm)的柱前端连接，xamide半制备柱的柱后端接入检测器前的管路。
65.s3:萃取与上样：在co2流速15ml/min，背压150bar，萃取时间10min条件下，连续不断预分离装置中的目标组分并加载至xamide半制备柱。
66.s4：sfc分离：萃取和上样完成后，切换至sfc管路，开始目标组分的分离。色谱条件如下：xamide半制备柱(250
×
10mm i.d.,10μm)，流动相为食品级co2(a)，改性剂为制备级甲醇(b)，0-5min,0-4％b，5-15min，4-10％b，15-21min，10-15％b。流速：15ml/min，背压：140bar，检测波长：254nm，sfc分离结果如图3所示。由图3可知，目标组分在xamide半制备柱上保留时间适中，且展现出良好的分离能力和色谱峰形。
67.实施例二、
68.本实施例所采用的材料及材料规格如下：
69.样品：白花蛇舌草经95％乙醇提取再水沉后的沉淀物；
70.色谱填料：c18(40μm,100a)；
71.预分离装置规格：5ml；
72.超临界流体制备色谱柱规格：250
×
20mm i.d.,10μm。
73.本实施例的超临界流体色谱分离方法包括如下步骤：
74.s1:样品及色谱填料混合物的制备
75.白花蛇舌草样品的制备方法同实施例一。
76.称取白花蛇舌草样品1.0g样品于研钵中，加入少量乙醇溶解样品。随后，向溶液中加入3.0g c18(40μm,100a)色谱填料，研磨均匀后，挥干溶剂，制备得到样品及色谱填料混合物。
77.s2:装置连接：称取1.0g的样品及色谱填料混合物装入5ml预分离装置中，预分离装置的两端填充适量脱脂棉。预分离装置的入口端接入色谱柱柱前管路，预分离装置出口端与xamide制备柱(250
×
20mm i.d.,10μm)的柱前端连接，xamide制备柱的柱后端接入检测器前的管路。
78.s3:萃取与上样：在co2流速30ml/min，背压150bar，萃取时间15min条件下，连续不断预分离装置中的目标组分并加载至xamide制备柱。
79.s4：sfc分离：萃取和上样完成后，切换至sfc管路，进行目标组分分离。色谱条件包括：xamide制备柱(250
×
20mm i.d.,10μm)，流动相为食品级co2(a)，改性剂为制备级甲醇(b)，0-5min，0-4％b，5-15min，4-10％b，15-21min，10-15％b。流速：53ml/min，背压：150bar，检测波长：254nm。
80.本实施例分离的目标组分在xamide半制备柱上保留时间适中，且展现出良好的分离能力和色谱峰形。
81.实施例三、
82.本实施例所采用的材料及材料规格如下：
83.样品：白花蛇舌草经95％乙醇提取再水沉后的沉淀物；
84.色谱填料：c8(40μm,100a)；
85.预分离装置规格：25ml；
86.超临界流体制备色谱柱规格：250
×
30mm i.d.,10μm。
87.本实施例的超临界流体色谱分离方法包括如下步骤：
88.s1:样品及色谱填料混合物的制备
89.白花蛇舌草样品的制备方法同实施例一。
90.称取白花蛇舌草样品2.0g于研钵中，加入少量乙醇溶解样品。随后，向溶液中加入8.0g c8(40μm,100a)色谱填料，研磨均匀后，挥干溶剂，制备得到样品及色谱填料混合物。
91.s2:装置连接：称取10.0g的样品及色谱填料混合物装入25ml预分离装置中，预分离装置的两端填充适量脱脂棉。预分离装置的入口端接入色谱柱柱前管路，预分离装置出口端与xamide制备柱(250
×
30mm i.d.,10μm)的柱前端连接，xamide制备柱的柱后端接入检测器前的管路。
92.s3:萃取与上样：在co2流速50ml/min，背压120bar，萃取时间15min条件下，连续不断预分离装置中的目标组分并加载至xamide制备柱。
93.s4：sfc分离：萃取和上样完成后，切换至sfc管路，进行目标组分分离。sfc色谱条件包括：xamide制备柱(250
×
30mm i.d.,10μm)，流动相为食品级co2(a)，改性剂为制备级甲醇(b)，0-5min，0-4％b，5-15min，4-11％b，15-21min，11-16％b。流速：100ml/min，背压：140bar，检测波长：254nm。本实施例分离的目标组分在xamide半制备柱上保留时间适中，且展现出良好的分离能力和色谱峰形。
94.实施例四、
95.本实施例所采用的材料及材料规格如下：
96.样品：高良姜干燥粉末；
97.色谱填料：硅胶(40μm,100a)；
98.预分离装置规格：5ml；
99.超临界流体制备色谱柱规格：150
×
20mm i.d.,5μm。
100.本实施例的超临界流体色谱分离方法包括如下步骤：
101.s1:样品及色谱填料混合物的制备
102.称取高良姜干燥粉末2.0g于研钵中，加入少量乙醇溶解样品。随后，向溶液中加入3.0g硅胶(40μm,100a)色谱填料，研磨均匀后，挥干溶剂，制备得到样品及色谱填料混合物。
103.s2:装置连接：称取300mg的样品及色谱填料混合物装入5ml预分离装置中，预分离装置的两端填充适量脱脂棉。预分离装置的入口端接入色谱柱柱前管路，预分离装置出口端与xamide制备柱(150
×
20mm i.d.,5μm)的柱前端连接，xamide制备柱的柱后端接入制备sfc系统检测器前的管路。
104.s3:萃取与上样：在co2流速30ml/min，背压150bar，萃取时间10min条件下，连续不断预分离装置中的目标组分并加载至diol制备柱。
105.s4：sfc分离：萃取和上样完成后，切换至sfc管路，进行目标组分分离。sfc制备色
谱条件为：diol制备柱(150
×
20mm i.d.,5μm)，流动相为食品级co2(a)，改性剂为制备级乙醇(b)，0-10min，0-15％b，10-15min，15-20％b。流速：50ml/min，背压：150bar，检测波长：254nm。
106.本实施例分离的目标组分在diol制备柱上保留能力适中，展现出了良好的分离能力与色谱峰形。
107.对比例采用传统的液体进样方法进行超临界流体色谱，而未采用本技术的一步式样品预处理和分离方法。
108.对比例所采用的材料及材料规格如下：
109.样品：白花蛇舌草经95％乙醇提取再水沉后的沉淀物；
110.色谱填料：c18(40μm,100a)；
111.预分离装置规格：5ml；
112.超临界流体制备色谱柱规格：250
×
10mm i.d.,10μm。
113.对比例的超临界流体色谱分离方法包括如下步骤：
114.s1：样品及色谱填料混合物的制备：白花蛇舌草样品及色谱填料混合物的制备同实施例一；
115.s2：装置连接：称取330mg样品及色谱填料混合物装入5ml预分离装置中，预分离装置的两端填充适量脱脂棉。预分离装置的入口端接入色谱柱柱前管路，预分离装置出口端接入检测器前的管路；
116.s3：萃取：在co2流速15ml/min，背压150bar，萃取时间10min，补偿泵流速10ml/min，补偿液为制备级乙醇条件下，连续不断预分离装置中的目标组分并收集至馏分罐中；
117.s4：上样：收集的目标组分浓缩至无液体，加入3ml的乙醇-正己烷混合溶液(正己烷/乙醇＝4/1(v/v)))重溶，正己烷加入是为了尽可能减小溶剂强度；采用传统液体方式进样；
118.s5：sfc分离：切换至sfc管路，开始目标组分的分离。色谱条件如下：xamide半制备柱(250
×
10mm i.d.,10μm)，流动相为食品级co2(a)，改性剂为制备级甲醇(b)，0-5min,6-6％b，5-15min，6-10％b，15-21min，10-15％b。流速：15ml/min，背压：140bar，检测波长：254nm，sfc分离结果如图4所示。由图4可知，色谱峰严重失真，分离效果较差。
119.本技术提供一种超临界流体色谱分离方法及装置用于一步式样品预处理和分离，该方法在超临界流体制备色谱柱前端加入预分离装置，将样品或样品与色谱填料混合后放入预分离装置中，在超临界条件下对目标组分进行连续预分离并加载至超临界流体制备色谱柱，预分离和上样完成后，切换到sfc通路进行分离。能够解决超临界流体色谱中样品溶解试剂的强度和粘度与流动相不匹配的问题，消除杂质对超临界流体色谱分离的干扰。
120.以上对本技术所提供的一种超临界流体色谱分离方法及装置进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本技术的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本技术的方法及其核心思想；同时，对于本领域的技术人员，依据本技术的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本技术的限制。