β-人绒毛膜促性腺激素检测试剂盒及其制备方法与流程

1.本发明属于免疫检测领域，尤其是涉及一种β-人绒毛膜促性腺激素检测试剂盒及其制备方法。


背景技术：

2.人绒毛膜促性腺激素(hcg)是一种带有两个非共价键结合亚基的糖蛋白。其α亚基类似于黄体生成素(lh)、卵泡刺激素(fsh)、以及促甲状腺激素(tsh)的α亚基。人绒毛膜促性腺激素的β亚基不同于其他垂体糖蛋白激素，并且体现其独特的生物化学和免疫学特性。人绒毛膜促性腺激素由胎盘的细胞合成并能够维护孕期内的黄体功能，是一种很好的孕检标志物，在受孕后的一周就可以检测出来。
3.在孕期，人绒毛膜促性腺激素(hcg)水平以指数规律上升，并持续到末次月经后大约8到10周。在孕期的后期，大约受孕后12周时，由于胎盘开始产生类固醇激素，hcg的浓度开始降低。人绒毛膜促性腺激素值下降表示流产、宫外孕、妊毒症等。
4.目前临床实验室对人绒毛膜促性腺激素的检测，主要采用化学发光法和酶联免疫荧光法。临床和实验室常用的检测方法主要有酶联免疫法、免疫荧光法、化学发光法等。
5.在中国专利文献cn107677837a中，公开了一种β人绒毛膜促性腺激素检测试剂盒的制备方法，包括试剂r1和试剂r2的制备；试剂r1的制备包括：向mes缓冲液中添加叠氮钠、蔗糖、tween-80和peg-8000，制得试剂r1；试剂r2的制备包括：(1)向mes缓冲液中添加nacl、叠氮钠、牛血清蛋白、甘油，制得乳胶微球溶解试剂；(2)将β-人绒毛膜促性腺激素抗体包被到乳胶微球中，制得抗体胶乳；(3)将抗体胶乳离心去上清液，然后用乳胶微球溶解试剂溶解沉淀物，超声分散，制得试剂r2。
6.上述技术方案的β人绒毛膜促性腺激素检测试剂盒检测效果不是很理想，究其原因，和试剂种类的选择以及含量有密切关系。


技术实现要素：

7.本发明要解决的技术问题是提供一种β-人绒毛膜促性腺激素检测试剂盒，能够提高睾酮检测的准确度，抗干扰性好，稳定性好。
8.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，该β-人绒毛膜促性腺激素检测试剂盒包括有试剂r1、试剂r3和试剂r4；其中，所述试剂r1具有链霉亲和素包被的磁性微粒和三羟甲基氨基甲烷tris缓冲液，所述试剂r3具有吖啶酯标记的鼠抗人hcg抗体和磷酸盐缓冲液，所述试剂r4具有生物素标记的鼠抗人hcg抗体和吗啉乙磺酸mes；
9.还包括有校准品和质控品。
10.检验原理为采用双抗体夹心法进行检测，将样本、生物素标记的hcg β单克隆抗体以及链霉亲合素包被的磁性微粒在温育条件下反应，抗体捕获样本中的抗原，形成抗原抗体复合物，结合到磁性微粒上，孵育结束后，加磁场沉淀，去掉上清液，用清洗液清洗沉淀复合物，并吸干废液，除去未与磁性微粒结合的物质，加入吖啶酯标记的另外一株hcg β单克
隆抗体在温育条件下反应，形成抗原抗体夹心复合物，检测读数：温育结束后，加磁场沉淀，去掉上清液，用清洗液清洗沉淀复合物，并吸干废液，除去未与磁性微粒结合的物质，再将反应杯送入测量室中。仪器自动泵入激发液，使复合物产生化学发光信号，通过光电倍增器测量发光强度，仪器自动通过工作曲线计算得出检测结果。
11.在本发明中，在试剂r1、试剂r3和试剂r4中均有缓冲液(试剂r4中，吗啉乙磺酸mes是缓冲液)，此外，β-人绒毛膜促性腺激素检测试剂盒包括有校准品和质控品，检测结果准确度高，抗干扰性好，稳定性好。
12.优选的，所述试剂r1、所述试剂r3和所述试剂r4中均含有防腐剂proclin 300。
13.优选的，所述校准品和质控品为冻干粉状态的通过体外重组获得的人绒毛膜促性腺激素重组抗原；所述防腐剂proclin 300为1g/l。
14.优选的，在所述试剂r1中，所述链霉亲和素包被的磁性微粒为2.5g/l，所述三羟甲基氨基甲烷tris缓冲液为50mmol/l；在所述试剂r3中，所述吖啶酯标记的鼠抗人hcg抗体为0.15mg/l，所述磷酸盐缓冲液为100mmol/l；在所述试剂r4中，所述生物素标记的鼠抗人hcg抗体为0.78mg/l，所述吗啉乙磺酸mes为100mmol/l。
15.优选的，在所述试剂r1、所述试剂r3和所述试剂r4中均含有牛血清白蛋白bsa，所述牛血清白蛋白bsa为10g/l。
16.本发明要解决的另一个问题是提供一种β-人绒毛膜促性腺激素检测试剂盒的制备方法，所述β-人绒毛膜促性腺激素检测试剂盒包括有试剂r1、试剂r3和试剂r4，包括以下步骤：
17.s1所述试剂r1的制备：取直径1um链霉亲和素包被的磁性微粒，用磁珠稀释液稀释浓度，搅拌混匀；
18.s2所述试剂r3的制备：将一株针对hcg抗原表位的鼠抗人hcg抗体，与吖啶酯混合后进行吖啶酯标记；标记完成后进行离心脱盐纯化，得到一株针对hcg抗原表位的吖啶酯标记的鼠抗人hcg抗体；
19.将得到的一株针对hcg抗原表位的吖啶酯标记的鼠抗人hcg抗体用稀释液稀释浓度；
20.s3所述试剂r4的制备：将鼠抗人hcg抗体用缓冲液稀释浓度，与生物素混合后进行生物素标记；标记完成后进行离心脱盐纯化，得到生物素标记的鼠抗人hcg抗体；
21.将得到的生物素标记的鼠抗人hcg抗体用稀释液稀释浓度；
22.s4分装试剂：将制备好的所述试剂r1、所述试剂r3和所述试剂r4进行分装，于2-8℃避光存储；
23.所述β-人绒毛膜促性腺激素检测试剂盒还包括有校准品和质控品。
24.优选的，在所述步骤s1中，磁珠稀释液包含tris作为缓冲剂，bsa作为封闭剂和proclin300作为防腐剂；在所述步骤s2中，稀释液包括二水合磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠作为缓冲剂，bsa、酪蛋白作为封闭剂，proclin 300作为防腐剂，tween-20作为表面活性剂；在所述步骤s3中，稀释液的主要成分为mes。
25.优选的，在所述步骤s2和所述步骤s3中，均采用zeba脱盐离心柱进行离心脱盐纯化；在所述步骤s2中，进行标记时，是在37℃反应90分钟进行标记；在所述步骤s3中，进行标记时，是在37℃反应60分钟进行标记。
26.其中，zeba脱盐离心柱为7k mwco，0.5ml货号：89883规格。
27.优选的，还包括有步骤s5贴标：将射频卡粘贴在试剂盒上，再将标签覆盖与所述射频卡之上；所述射频卡含有试剂批号、盒号、使用期限、项目代码、项目名称和试剂规格信息。
28.优选的，在所述步骤s1中，链霉亲和素包被的磁性微粒用磁珠稀释液稀释至2.5g/l的浓度；在所述步骤s2中，每株鼠抗人hcg抗体与吖啶酯的摩尔比为1:10，将得到的一株针对hcg抗原表位的吖啶酯标记的鼠抗人hcg抗体用稀释液配成0.15mg/l的浓度；在所述步骤s3中，将鼠抗人hcg抗体用缓冲液稀释至0.78mg/l的浓度，鼠抗人hcg抗体与生物素的摩尔比为1:10，将得到的生物素标记的鼠抗人hcg抗体用稀释液配成0.78mg/l的浓度。
具体实施方式
29.下面结合本发明的实施方式进一步详细说明：
30.本实施例的β-人绒毛膜促性腺激素检测试剂盒，包括有试剂r1、试剂r3和试剂r4；其中，所述试剂r1具有链霉亲和素包被的磁性微粒和三羟甲基氨基甲烷tris缓冲液，所述试剂r3具有吖啶酯标记的鼠抗人hcg抗体和磷酸盐缓冲液，所述试剂r4具有生物素标记的鼠抗人hcg抗体和吗啉乙磺酸mes；
31.还包括有校准品和质控品。
32.所述试剂r1、所述试剂r3和所述试剂r4中均含有防腐剂proclin 300。
33.所述校准品和质控品为冻干粉状态的通过体外重组获得的人绒毛膜促性腺激素重组抗原；所述防腐剂proclin 300为1g/l。
34.在所述试剂r1中，所述链霉亲和素包被的磁性微粒为2.5g/l，所述三羟甲基氨基甲烷tris缓冲液为50mmol/l；在所述试剂r3中，所述吖啶酯标记的鼠抗人hcg抗体为0.15mg/l，所述磷酸盐缓冲液为100mmol/l；在所述试剂r4中，所述生物素标记的鼠抗人hcg抗体为0.78mg/l，所述吗啉乙磺酸mes为100mmol/l。
35.在所述试剂r1、所述试剂r3和所述试剂r4中均含有牛血清白蛋白bsa，所述牛血清白蛋白bsa为10g/l。
36.本实施例的上述β-人绒毛膜促性腺激素检测试剂盒的制备方法，所述β-人绒毛膜促性腺激素检测试剂盒包括有试剂r1、试剂r3和试剂r4，包括以下步骤：
37.s1所述试剂r1的制备：取直径1um链霉亲和素包被的磁性微粒，用磁珠稀释液稀释浓度，搅拌混匀；
38.s2所述试剂r3的制备：将一株针对hcg抗原表位的鼠抗人hcg抗体，与吖啶酯混合后进行吖啶酯标记；标记完成后进行离心脱盐纯化，得到一株针对hcg抗原表位的吖啶酯标记的鼠抗人hcg抗体；
39.将得到的一株针对hcg抗原表位的吖啶酯标记的鼠抗人hcg抗体用稀释液稀释浓度；
40.s3所述试剂r4的制备：将鼠抗人hcg抗体用缓冲液稀释浓度，与生物素混合后进行生物素标记；标记完成后进行离心脱盐纯化，得到生物素标记的鼠抗人hcg抗体；
41.将得到的生物素标记的鼠抗人hcg抗体用稀释液稀释浓度；
42.s4分装试剂：将制备好的所述试剂r1、所述试剂r3和所述试剂r4进行分装，于2-8
℃避光存储；
43.所述β-人绒毛膜促性腺激素检测试剂盒还包括有校准品和质控品。
44.在所述步骤s1中，磁珠稀释液包含tris作为缓冲剂，bsa作为封闭剂和proclin 300作为防腐剂；在所述步骤s2中，稀释液包括二水合磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠作为缓冲剂，bsa、酪蛋白作为封闭剂，proclin 300作为防腐剂，tween-20作为表面活性剂；在所述步骤s3中，稀释液的主要成分为mes。
45.在所述步骤s2和所述步骤s3中，均采用zeba脱盐离心柱进行离心脱盐纯化；在所述步骤s2中，进行标记时，是在37℃反应90分钟进行标记；在所述步骤s3中，进行标记时，是在37℃反应60分钟进行标记。
46.还包括有步骤s5贴标：将射频卡粘贴在试剂盒上，再将标签覆盖与所述射频卡之上；所述射频卡含有试剂批号、盒号、使用期限、项目代码、项目名称和试剂规格信息。
47.在所述步骤s1中，链霉亲和素包被的磁性微粒用磁珠稀释液稀释至2.5g/l的浓度；在所述步骤s2中，每株鼠抗人hcg抗体与吖啶酯的摩尔比为1:10，将得到的一株针对hcg抗原表位的吖啶酯标记的鼠抗人hcg抗体用稀释液配成0.15mg/l的浓度；在所述步骤s3中，将鼠抗人hcg抗体用缓冲液稀释至0.78mg/l的浓度，鼠抗人hcg抗体与生物素的摩尔比为1:10，将得到的生物素标记的鼠抗人hcg抗体用稀释液配成0.78mg/l的浓度。
48.在本实施例中，试剂盒1的试剂r1、试剂r3和试剂r4的具体组分和含量如下表1所示：
49.表1
[0050][0051]
表1中的生物素标记的鼠抗单克隆抗体即为生物素标记的鼠抗人hcg抗体；吖啶酯标记的鼠抗单克隆抗体即为hcg抗原表位的吖啶酯标记的鼠抗人hcg抗体；
[0052]
在本实施例中，试剂盒2的试剂r1、试剂r3和试剂r4具体组分和含量如下表2所示：
[0053]
表2
[0054][0055]
表2中的生物素标记的鼠抗单克隆抗体即为生物素标记的鼠抗人hcg抗体；吖啶酯标记的鼠抗单克隆抗体即为hcg抗原表位的吖啶酯标记的鼠抗人hcg抗体；
[0056]
将上述试剂盒1和试剂盒2进行抗干扰性测试，结果如下表3所示：
[0057]
表3
[0058][0059]
从上述测试结果来看，试剂盒1的抗干扰性较好，试剂盒1的偏差相对试剂盒2的偏差较小。
[0060]
将上述试剂盒1和试剂盒2进行稳定性测试，结果如下表4所示：
[0061]
表4
[0062][0063]
从上述测试结果来看，试剂盒1的稳定性较好，试剂盒1的信号保留率相对试剂盒2的信号保留率较高；表中的a、b、c、d、e表示不同浓度的校准品编号，浓度即为编号后面的数值，单位为ng/ml。
[0064]
发明人经过研究发现，试剂盒1中试剂r4的生物素浓度对于试剂盒的抗干扰性有影响，具体数据表格如下表5所示：
[0065]
表5
[0066][0067]
结果显示，生物素的浓度为30miu/ml抗干扰性最好。
[0068]
采用本实施例的β-人绒毛膜促性腺激素检测试剂盒进行人绒毛膜促性腺激素检测时，检测结果出来后，阳性判断值或者参考区间如下表6所示：
[0069]
表6
[0070][0071]
由于地理、人种、性别和年龄等差异，建议各实验室建立自己的参考范围。
[0072]
1.人绒毛膜促性腺激素项目的默认结果单位使用miu/ml(或iu/l)；
[0073]
2.由于方法学不同或抗体特异性等原因，不同生产商的试剂检测结果之间可能存在偏差，因此不应直接相互比较，以免造成错误的医学解释；
[0074]
3.当样本中hcg β的浓度超过8000miu/ml时，可用样本稀释液对样本进行稀释(推荐稀释倍数为100倍)后再进行检测；
[0075]
4.人绒毛膜促性腺激素浓度低于检测下限报告为＜0.600miu/ml，而高于检测上限的则报告为＞8000miu/ml。
[0076]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。