用于分子的细胞内递送的肽和纳米颗粒的制作方法

用于分子的细胞内递送的肽和纳米颗粒
1.相关申请
2.本技术要求2019年4月17日提交的法国申请号fr1904115的优先权的权益，其内容通过引用以其整体并入本文，用于所有目的。
技术领域
3.本发明涉及含肽复合物/纳米颗粒，其用于将货物分子(cargo molecules)递送到细胞中。


背景技术：

4.本文提及的所有出版物、专利、专利申请和已公布的专利申请的公开内容特此通过引用以其整体并入本文。
5.虽然小分子在许多情况下仍然是在临床中使用的主要药物，但是它们的治疗影响已经达到极限，比如到达靶标的能力不足、缺乏特异性、需要高剂量——其导致毒性和严重的副作用。在过去十年内，为了规避小分子和基于基因的疗法的限制，我们已经在较大的治疗性分子比如蛋白质、肽和核酸——其对它们的靶标呈现高特异性但是不遵循里宾斯基规则(lipinski’s rules)——的发现中见证了急剧的加速。这些分子的药物效力仍然受限于它们差的体内稳定性和它们低的细胞中摄取。因此，“递送”已经成为治疗难题的核心部分(central piece)并且新的里程碑已经被建立以验证递送策略：(a)缺乏毒性、(b)低剂量下的体内效率、(c)易于处理用于治疗应用、(d)快速的内体释放、和(e)达到靶标的能力。虽然病毒性递送策略已经给基因和细胞疗法很大希望，但是它们的临床应用已经遭受副作用和毒性作用(ibraheem等(2014)int j pharm 459,70-83)。研究主要集中于非病毒性策略的研发，并且已经提出了不同的方法，包括脂质、聚阳离子纳米颗粒和基于肽的制剂，但是这些技术中仅少数在体内有效并且已经达到临床水平(yin等(2014)nat rev genet 15,541-555)。因此，需要用于在靶细胞内部有效递送mrna或rnai的改进方法。


技术实现要素：

6.本技术提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物和纳米颗粒。在一些实施方式中，用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物包括：a)包括第一细胞穿透肽的第一肽；b)包括第二细胞穿透肽的第二肽；和c)货物分子，其中第二肽包括与第二细胞穿透肽共价连接的聚乙二醇(peg)部分，并且其中第一肽不具有peg部分。在一些实施方式中，用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物包括细胞穿透肽和货物分子，其中细胞穿透肽是反向-翻转肽(retro-inverso peptide)。在一些实施方式中，用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中所述肽进一步包括选自gyvsk、gyvs、yigs和yigsr的靶向序列。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、病毒、多肽、蛋白质/核酸复合物(protein/nucleic complex)、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。在一些实施方式中，货物分子不包括病毒。在一些实施方式中，诸如(第一或第二细胞穿透
肽的细胞穿透肽选自cady、pep-1肽、pep-2肽、pep-3肽、vepep-3肽、vepep-6肽、vepep-9肽和adgn-100肽。
7.在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括第一细胞穿透肽的第一肽；b)包括第二细胞穿透肽的第二肽；和c)货物分子，其中第二肽包括与第二细胞穿透肽共价连接的聚乙二醇(peg)部分，并且其中第一肽不具有peg部分。在一些实施方式中，第一和第二细胞穿透肽选自cady、pep-1肽、pep-2肽、pep-3肽、vepep-3肽、vepep-6肽、vepep-9肽和adgn-100肽。在一些实施方式中，第一和第二细胞穿透肽选自vepep-3肽、vepep-6肽、vepep-9肽和adgn-100肽。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是vepep-3肽。在一些实施方式中，vepep-3肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:1-14、75、76和113-115。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是vepep-6肽。在一些实施方式中，vepep-6肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:15-40、77、85、92-100、105、107-109和129-139。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是vepep-9肽。在一些实施方式中，vepep-9肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:41-52、78和116-120。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是adgn-100肽。在一些实施方式中，adgn-100肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:53-70、79、80、86-91、101-104、106、110-112和121-128。在一些实施方式中，第一和第二细胞穿透肽是相同的。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、病毒、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。在一些实施方式中，货物分子是核酸。在一些实施方式中，核酸选自sirna、mirna、shrna、grna、mrna、dna、dna质粒、寡核苷酸及其类似物。在一些实施方式中，核酸包括mrna。在一些实施方式中，核酸包括或进一步包括rnai。在一些实施方式中，核酸包括mrna和rnai，并且其中mrna编码用于治疗疾病或状况的治疗性蛋白质，并且其中rnai靶向rna，其中rna的表达与疾病或状况相关。在一些实施方式中，细胞穿透肽与核酸的摩尔比在约1:1与约100:1之间。在一些实施方式中，货物递送复合物的平均直径在约20nm与约1000nm之间。在一些实施方式中，第一细胞穿透肽与第二细胞穿透肽的比约为50:1。在一些实施方式中，peg部分是线性peg。在一些实施方式中，peg部分是支化peg。在一些实施方式中，peg部分的分子量为约5kda至约10kda。在一些实施方式中，peg部分由约一至十个乙二醇单元组成。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽的n-末端缀合。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽的c-末端缀合。在一些实施方式中，第一和/或第二肽进一步包括选自乙酰基、硬脂酰基、脂肪酸、胆固醇、核定位信号、核输出信号、抗体或其抗体片段、肽、多糖、和靶向序列的一个或多个部分，其中所述一个或多个部分共价连接到第一或第二细胞穿透肽的n-末端，或peg部分。在一些实施方式中，所述一个或多个部分包括靶向序列。在一些实施方式中，靶向序列选自gy、yv、vs、sk、gyv、yvs、vsk、gyvs、yvsk、yi、ig、gs、sr、yig、igs、gsr、yigs和igsr。在一些实施方式中，靶向序列选自gyvsk、gyvs、yigs和yigsr。在一些实施方式中，靶向序列通过连接体共价连接到第一或第二细胞穿透肽。在一些实施方式中，所述一个或多个部分包括乙酰基和/或硬脂酰基。在一些实施方式中，第一和/或第二肽进一步包括选自以下的一个或多个部分：半胱酰胺(巯基乙胺化，cysteamide)、半胱氨酸、硫醇、酰胺、任选地取代的次氮基三乙酸、羧基、任选地取代的线性或分支c
1-c6烷基、伯胺或仲胺、糖苷(osidic)衍生物、脂质、磷脂、脂肪酸、胆固醇、核定位信号、核输出信号、抗体、多糖和靶向序列，其中所述一个或多个部分共价连接到第一细胞穿
透肽、第二细胞穿透肽的c-末端或peg部分。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是反向-翻转肽。
8.在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括细胞穿透肽和货物分子，其中细胞穿透肽选自cady、pep-1肽、pep-2肽、pep-3肽、vepep-3肽、vepep-6肽、vepep-9肽和adgn-100肽，并且其中细胞穿透肽是反向-翻转肽。在一些实施方式中，反向-翻转肽包括seq id no:85或86的序列。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、多肽和蛋白质复合物。在一些实施方式中，货物分子包括选自以下的核酸：sirna、mirna、shrna、grna、mrna、dna、dna质粒、寡核苷酸及其类似物。在一些实施方式中，货物分子包括mrna。在一些实施方式中，货物分子包括rnai。在一些实施方式中，货物分子不包括病毒。
9.在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中细胞穿透肽选自vepep-3肽、vepep-6肽、vepep-9肽和adgn-100肽，其中所述肽进一步包括选自gyvsk、gyvs、yigs和yigsr的靶向序列。在一些实施方式中，靶向序列通过连接体共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，所述肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的一个或多个部分，其中所述一个或多个部分选自乙酰基和硬脂酰基。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、多肽和蛋白质复合物。在一些实施方式中，货物分子包括选自以下的核酸：sirna、mirna、shrna、grna、mrna、dna、dna质粒、寡核苷酸及其类似物。在一些实施方式中，货物分子包括mrna。在一些实施方式中，货物分子包括rnai。在一些实施方式中，货物分子不包括病毒。
10.本技术还提供了纳米颗粒，其包括核，所述核包括上述货物递送复合物。在一些实施方式中，核由包括周围细胞穿透肽的壳包覆。在一些实施方式中，周围细胞穿透肽选自cady、pep-1肽、pep-2肽、pep-3肽、vepep-3肽、vepep-6肽、vepep-9肽和adgn-100肽。
11.本技术还提供了药物组合物，其包括上述任一种货物递送复合物或纳米颗粒和药学上可接受的载体。
12.本技术还提供了制备上述货物递送复合物的方法，所述方法包括：a)将第一肽与第二肽组合，从而形成肽混合物；b)将肽混合物与货物组合，从而形成货物递送复合物。
13.本技术还提供了制备上述货物递送复合物的方法，所述方法包括将肽与货物分子组合，从而形成货物递送复合物。
14.在根据制备上述货物递送复合物的任意方法的一些实施方式中，肽或肽混合物与货物分子分别以约1:1至约100:1的摩尔比组合。在一些实施方式中，所述方法包括将包括货物分子的第一溶液与包括肽或肽混合物的第二溶液混合以形成第三溶液，其中第三溶液包括或被调整以包括：i)约0-5％蔗糖，ii)约0-5％葡萄糖，iii)约0-50％dmem，iv)约0-80mm nacl，或v)约0-20％pbs，其中第三溶液被温育以允许形成货物递送复合物。在一些实施方式中，第一溶液包括无菌水中的货物和/或其中第二溶液包括无菌水中的肽或肽混合物。在一些实施方式中，在温育以形成货物递送复合物之后，第三溶液被调整以包括：i)约0-5％蔗糖，ii)约0-5％葡萄糖，iii)约0-50％dmem，iv)约0-80mm nacl，或v)约0-20％pbs。在一些实施方式中，所述方法进一步包括过滤过程，其中货物递送复合物通过设定尺寸的孔膜(pore-sized membrane)过滤。在一些实施方式中，孔的直径至少约为0.1μm。
15.本技术还提供了将一种或多种货物送到细胞中的方法，所述方法包括将细胞与上
述货物递送复合物或纳米颗粒接触，其中货物递送复合物包括一种或多种货物。
16.本技术还提供了将一种或多种货物递送到个体的组织或器官中的方法，所述方法包括将有效量的上述货物递送复合物、纳米颗粒、或药物组合物给予到个体中，其中组织或器官选自肝、肺、肾、脑、肠、脾、心脏、肌肉和淋巴结。在一些实施方式中，静脉内给予货物递送复合物。在一些实施方式中，个体是人。
17.本技术还提供了治疗个体中的疾病或状况的方法，所述方法包括将有效量的上述货物递送复合物、纳米颗粒、或药物组合物给予到个体中。在一些实施方式中，疾病或状况与选自肝、肺、肾、脑、肠、脾、心脏、肌肉和淋巴结的器官或组织中的病理细胞相关联。在一些实施方式中，疾病或状况选自癌症、糖尿病、自身免疫性疾病、血液学疾病、心脏病、血管病、炎性疾病、纤维变性疾病、病毒感染性疾病、遗传性疾病、眼部疾病、肝脏疾病、肺部疾病、肌肉疾病、蛋白质缺乏病、溶酶体贮积病、神经学疾病、肾脏疾病、老化和变性疾病、和以胆固醇水平异常为特征的疾病。在一些实施方式中，静脉内给予货物递送复合物。在一些实施方式中，个体是人。
18.本技术还提供了试剂盒，其包括上述货物递送复合物、纳米颗粒、或药物组合物。
附图说明
19.图1a-图1c显示了经adgn肽/mrna复合物处理的293t细胞中萤光素酶的表达。用adgn-肽纳米颗粒转染48孔板中培养的293t细胞。在无菌水中形成含有0.25μg mrna的adgn-100、adgn-106、adgn-100ri、adgn-106ri、adgn-100stearyl、adgn-hydro1、adgn-hydro2、adgn-hydro3、adgn-hydro4、adgn-hydro5、adgn-hydro6和adgn肽/adgn-100peg 10％纳米颗粒，在含有5％蔗糖的无菌水中稀释，并用0.45μm pes过滤器过滤。在转染前，在25％血清或硫酸乙酰肝素的存在下将adgn/mrna复合物温育3小时。转染后72小时监测萤光素酶表达并将结果报告为rlu(发光):mg蛋白质。
20.图2a-图2c显示了经adgn肽/pgl4质粒dna复合物处理的293t细胞中萤光素酶的表达。用adgn-肽纳米颗粒转染48孔板中培养的293t细胞。在无菌水中形成含有0.17μg pgl4质粒dna的adgn-100、adgn-106、adgn-100ri、adgn-106ri、adgn-100stearyl、adgn-hydro1、adgn-hydro2、adgn-hydro3、adgn-hydro4、adgn-hydro5和adgn-hydro6，在含有5％蔗糖的无菌水中稀释。在使用0.45μm pes过滤器过滤之前(图2a)和之后(图2b)对adgn-肽纳米颗粒进行评估。图2c聚乙二醇化adgn-100对转染效率的影响。将pgl4 luc质粒(0.15μg)与含有5-50％的adgn-100-peg的adgn-100溶液或与adgn-100peg结合。在转染前，在25％血清或硫酸乙酰肝素的存在下将adgn/pgl4质粒dna复合物温育3小时。转染后72小时监测萤光素酶表达并将结果报告为rlu(发光):mg蛋白质。
21.图3a-图3c显示了经adgn-肽/sirna复合物处理的a375/luc细胞中萤光素酶的表达。用adgn-肽纳米颗粒转染48孔板中培养的a375/luc细胞。在无菌水中形成含有10nm或25nm sirna的adgn-100、adgn-106、adgn-100ri、adgn-106ri、adgn-100stearyl、adgn-hydro1、adgn-hydro2、adgn-hydro3、adgn-hydro4、adgn-hydro5、adgn-hydro6和adgn-肽/adgn-100peg 10％纳米颗粒，在含有5％蔗糖的无菌水中稀释，并用0.45μm pes过滤器过滤。图3c聚乙二醇化adgn-100对转染效率的影响。将sirna-luc(10nm和25nm)与含有5-50％的adgn-100-peg的adgn-100溶液或与adgn-100peg相结合。在转染前，在25％血清存在的情
况下将adgn/sirna复合物培养3小时。转染后48小时监测萤光素酶表达并将结果报告为rlu(发光):mg蛋白质。
22.图4a-图4d显示了adgn-肽变体在小鼠中通过静脉内给予在体内递送萤光素酶mrna的效力。在无菌水中形成含有5μg mrna的adgn-肽/luc mrna颗粒，然后在5％蔗糖中稀释。小鼠接受iv注射100μl adgn-肽/mrna复合物。在12小时、24h、48h和72h后，通过生物发光成像监测mrna-luc的表达。图4b显示了对照组和处理组中24hr时的生物发光成像。使用制造商的软件(living image；perkinelmer)获得肝脏(c)和肺(d)中萤光素酶信号的半定量数据。然后将结果表示为相对于第0天的值。
23.图5a-图5b显示了adgn-肽变体在小鼠中通过肌肉内给予在体内递送萤光素酶mrna的效力。在无菌水中形成含有2.5μg mrna的adgn-肽/luc mrna颗粒，然后在5％蔗糖中稀释。小鼠接受iv注射25μl adgn-肽/mrna复合物。在12h、24h和48h后，通过生物发光成像监测mrnaluc的表达(a)。图5b显示了对照组和处理组中24hr时的生物发光成像。
24.图6a-图6c显示了adgn-肽变体在小鼠体中通过静脉内给予在体内递送表达萤光素酶的质粒pgl4的效力。在无菌水中形成含有5μg质粒dna的adgn-肽/pgl4颗粒，然后在5％蔗糖中稀释。小鼠接受iv注射100μl adgn-肽/质粒复合物。在12h、24h、48h和72h后，通过生物发光成像监测pgl4萤光素酶的表达。图6b显示了对照组和处理组中24hr时的生物发光成像。图6c显示了使用制造商软件(living image；perkinelmer)获得的肝脏中萤光素酶信号的半定量数据。然后将结果表示为相对于第0天的值。
25.图7a-图7b显示了adgn-肽变体在小鼠中通过肌肉内给予在体内递送表达萤光素酶的质粒pgl4的效力。在无菌水中形成含有2.5μg质粒dna的adgn-肽/pgl4 luc颗粒，然后在5％蔗糖中稀释。小鼠接受iv注射25μl adgn-肽/pgl4复合物。在12h、24h和48h后，通过生物发光成像监测萤光素酶的表达(a)。图7b显示了对照组和处理组中24hr时的生物发光成像。
26.图8显示了在未经过滤或经过滤的情况下在dls nanozs(malvern ltd)上测量的adgn-100肽变体/mrna复合物的粒径和聚集水平。
27.图9显示了在未经过滤或经过滤的情况下在dls nanozs(malvern ltd)上测量的adgn-106肽变体/mrna复合物的粒径和聚集水平。
28.图10显示了在未经过滤或经过滤的情况下在dls nanozs(malvern ltd)上测量的adgn-肽变体/dna质粒复合物的粒径和聚集水平。
29.图11a-图11c显示了adgn-肽变体在小鼠中通过静脉内给予在体内递送萤光素酶mrna的效力。
具体实施方式
30.本技术提供了包括细胞穿透肽(cpp)和一种或多种mrna的复合物和纳米颗粒，其中cpp适合将所述一种或多种mrna(如编码治疗产物，例如肿瘤阻抑蛋白的mrna)递送到细胞中。复合物和纳米颗粒可包括多种mrna。mrna可包括例如编码治疗性蛋白质(例如，肿瘤阻抑蛋白、免疫调节剂等)的mrna。在一些实施方式中，mrna编码嵌合抗原受体(car)。在一些实施方式中，复合物和纳米颗粒优先定位到靶组织，如疾病组织，例如肿瘤。在一些实施方式中，复合物和纳米颗粒进一步包括rnai，如靶向内源基因的rnai。在一些实施方式中，
rnai靶向与疾病相关联的内源基因，例如癌基因。在一些实施方式中，rnai靶向外源基因。
31.因此，本技术一方面提供了新型的货物递送复合物和纳米颗粒，下文将对其进行更详细的描述。
32.另一方面，提供了使用细胞穿透肽将mrna递送到细胞中的方法。另一方面，提供了将包括mrna和细胞穿透肽的复合物或纳米颗粒递送到局部组织、器官或细胞中的方法。另一方面，提供了通过向对象给予本文所述的包括mrna和细胞穿透肽的复合物或纳米颗粒来治疗疾病或障碍的方法。
33.还提供了包括细胞穿透肽和一种或多种mrna的药物组合物(例如以复合物和纳米颗粒的形式)及其用于治疗疾病的用途。
34.定义
35.如本文所用，术语“反向-翻转肽”是由d-氨基酸以反向序列组成的肽，当被延伸时，呈现的侧链拓扑与其母体分子的侧链拓扑相似，但具有翻转的酰胺肽键。
36.如本文所用，术语“野生型”是技术人员理解的技术术语，并且意为生物体、菌种、基因或特性其存在于自然界时的一般形式，区别于突变体或变体形式。
37.如本文所用，术语“变体”应当用来意指展现具有偏离自然界存在模式的性质。
38.术语“非天然存在”或“工程化”被可互换地使用并且表示涉及人工。该术语在指代核酸分子或多肽时意为核酸分子或多肽至少基本上不含有在自然界中或在自然界中发现的与其天然缔合的至少一种其它组分。
[0039]“互补性”指核酸与另一核酸序列通过传统watson-crick碱基配对或其它非传统类型形成氢键(一个或多个)的能力。互补性百分比表示核酸分子中可与第二核酸序列形成氢键(例如，watson-crick碱基配对)的残基的百分比(例如，10分之5、6、7、8、9、10是50％、60％、70％、80％、90％和100％互补)。“完美互补”意为核酸序列的所有连续残基与第二核酸序列中相同数量的连续残基成氢键。本文所用的“基本上互补”是指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多个核苷酸的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的互补程度，或者是指在严格条件下杂交的两个核酸。
[0040]
如本文所用，“表达”是指从dna模板转录多核苷酸(如转录成mrna或其它rna转录物)的过程和/或转录的mrna随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和被编码的多肽可被统称为“基因产物”。如果多核苷酸源自基因组dna，则表达可包括真核细胞中的mrna的剪接。
[0041]
术语“对象”、“个体”和“患者”在本文中被可互换地用于指代脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。哺乳动物包括，但不限于，鼠类、猿类、人类、农场动物、运动动物和宠物。体内获得或体外培养的生物实体的组织、细胞和其后代也被包括在内。
[0042]
术语“治疗剂(therapeutic agent)”、“治疗能力剂(therapeutic capable agent)”或“治疗剂(treatment agent)”被可互换地使用，并且指代在向对象给予后赋予某些有益效果的分子或化合物。有益效果包括实现诊断性判断；缓解疾病、症状、障碍、或病理状况；减少或预防疾病、症状、障碍或状况的发作；和总体上对抗疾病、症状、障碍或病理状况。
[0043]
如本文所用，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指获得有益的或期望的
结果的方法，其包括但不限于治疗益处。治疗益处意为在治疗下，一种或多种疾病、状况、或症状的任何治疗相关改善或对一种或多种疾病、状况、或症状的任何治疗相关效果。
[0044]
术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以产生有益或期望的结果的剂的量。治疗有效量可根据下列一项或多项而变化：被治疗的对象和疾病状况、对象的体重和年龄、疾病状况的严重性、给予方式等——其可容易地被本领域普通技术人员确定。该术语还适用于通过本文描述的任一种成像方法提供检测图像的剂量。具体剂量可根据下列一项或多项而变化：所选择的特定剂、遵照的给药方案、其是否与其它化合物组合给予、给予时机、被成像的组织、和运载其的物理递送系统。
[0045]
如本文所用，单数形式“一”、“一个/种”和“所述/该”包括复数指代，除非另有指示。
[0046]
本文中对“约”某个值或参数的提及包括(并且描述了)涉及该值或参数本身的实施方式。例如，提及“约x”的描述包括对“x”的描述。
[0047]
本发明的组合物和方法可包括下列、由下列组成或主要由下列组成：本文描述的本发明的必需要素和限定，以及本文描述的或其它有用的任何另外的或任选的成分、组分、或限定。
[0048]
除非另有说明，否则技术术语按照常规用法使用。
[0049]
复合物和纳米颗粒
[0050]
复合物
[0051]
在一些方面中，提供了包括用于将一种或多种货物分子递送到细胞中的细胞穿透肽的货物递送复合物。
[0052]
包括肽混合物的货物递送复合物
[0053]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括第一细胞穿透肽的第一肽；b)包括第二细胞穿透肽的第二肽；和c)货物分子，其中第二肽包括与第二细胞穿透肽共价连接的聚乙二醇(peg)部分，并且其中第一肽不具有peg部分。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是基于ptd的肽、两亲肽、基于聚精氨酸的肽、mpg肽、cady肽、pep-1肽、pep-2肽、或pep-3肽。在一些实施方式中，第一和第二细胞穿透肽选自cady、pep-1肽、pep-2肽、pep-3肽、vepep-3肽、vepep-4肽、vepep-5肽、vepep-6肽、vepep-9肽和adgn-100肽。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、病毒、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。在一些实施方式中，货物分子是核酸。在一些实施方式中，核酸选自irna(如sirna、mirna或shrna)、grna、mrna、dna、dna、dna质粒、寡核苷酸及其类似物。在一些实施方式中，核酸包括mrna。在一些实施方式中，核酸进一步包括rnai。在一些实施方式中，核酸包括mrna和rnai，并且其中mrna编码用于治疗疾病或状况的治疗性蛋白质，并且其中rnai靶向rna，其中rna的表达与疾病或状况相关联。在一些实施方式中，细胞穿透肽与货物分子(如核酸)的摩尔比在约1:1与约100:1之间(如约在约1:1与约50:1之间，或约20:1)。在一些实施方式中，货物递送复合物的平均直径在约20nm与约1000nm之间(如约20至约500nm、约50至约400nm、约60至约300nm、约80至约200nm、或约100至约160nm)。在一些实施方式中，peg部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，peg部分的分子量为约0.05kda至约50kda。在一些实施方式中，peg部分的分子量为约0.05kda至约0.5kda(如约0.05-0.1、
0.05-0.4、0.1-0.3、0.05-0.25、0.25-0.5kda)。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽的n-末端或c-末端缀合。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽内的位点缀合。
[0054]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括第一细胞穿透肽的第一肽；b)包括第二细胞穿透肽的第二肽；和c)货物分子，其中第二肽包括与第二细胞穿透肽共价连接的聚乙二醇(peg)部分，并且其中第一肽不具有peg部分，其中第一细胞穿透肽与第二细胞穿透肽的比为约20:1至约1:1(如约15:1至约2:1、约10:1至约4:1)。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是基于ptd的肽、两亲肽、基于聚精氨酸的肽、mpg肽、cady肽、pep肽(如pep-1、pep-2或pep-3肽)、或vepep肽(如adgn-100、vepep-3、vepep-4、vepep-5、vepep-6或vepep-9肽)。在一些实施方式中，货物递送复合物的平均直径在约20nm与约1000nm之间(如约20至约500nm、约50至约400nm、约60至约300nm、约80至约200nm、或约100至约160nm)。在一些实施方式中，peg部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，peg部分的分子量为约0.05kda至约50kda。在一些实施方式中，peg部分的分子量为约0.05kda至约0.5kda(如约0.05-0.1、0.05-0.4、0.1-0.3、0.05-0.25、0.25-0.5kda)。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽的n-末端或c-末端缀合。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽内的位点缀合。
[0055]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括第一细胞穿透肽的第一肽；b)包括第二细胞穿透肽的第二肽；和c)货物分子，其中第二肽包括与第二细胞穿透肽共价连接的聚乙二醇(peg)部分，并且其中第一肽不具有peg部分，其中第一和/或第二细胞穿透肽选自vepep-3肽、vepep-6肽、vepep-9肽和adgn-100肽。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽选自vepep-6肽和adgn-100肽。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、病毒、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。在一些实施方式中，货物分子是核酸。在一些实施方式中，核酸选自irna(如sirna、mirna或shrna)、grna、mrna、dna、dna、dna质粒、寡核苷酸及其类似物。在一些实施方式中，核酸包括mrna。在一些实施方式中，核酸进一步包括rnai。在一些实施方式中，核酸包括mrna和rnai，并且其中mrna编码用于治疗疾病或状况的治疗性蛋白质，并且其中rnai靶向rna，其中rna的表达与疾病或状况相关联。在一些实施方式中，细胞穿透肽与货物分子(如核酸)的摩尔比在约1:1与约100:1之间(如约在约1:1与约50:1之间，或约20:1)。在一些实施方式中，货物递送复合物的平均直径在约20nm与约1000nm之间(如约20至约500nm、约50至约400nm、约60至约300nm、约80至约200nm、或约100至约160nm)。在一些实施方式中，peg部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，peg部分的分子量为约0.05kda至约50kda。在一些实施方式中，peg部分的分子量为约0.05kda至约0.5kda(如约0.05-0.1、0.05-0.4、0.1-0.3、0.05-0.25、0.25-0.5kda)。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽的n-末端或c-末端缀合。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽内的位点缀合。
[0056]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括第一细胞穿透肽的第一肽；b)包括第二细胞穿透肽的第二肽；和c)货物分子，其中第二肽包括与第二细胞穿透肽共价连接的聚乙二醇(peg)部分，并且其
中第一肽不具有peg部分，其中货物分子选自核酸、病毒、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。在一些实施方式中，货物分子是/包括核酸。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是基于ptd的肽、两亲肽、基于聚精氨酸的肽、mpg肽、cady肽、pep-1肽、pep-2肽、或pep-3肽。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽包括选自seq id no:71-74和81的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一和第二细胞穿透肽选自cady、pep-1肽、pep-2肽、pep-3肽、vepep-3肽、vepep-6肽、vepep-9肽和adgn-100肽。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是vepep-3肽。在一些实施方式中，vepep-3肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:1-14、75、76和113-115。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是vepep-6肽。在一些实施方式中，vepep-6肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:15-40、77、85、92-100、105、107-109和129-139。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是vepep-9肽。在一些实施方式中，vepep-9肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:41-52、78和116-120。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是adgn-100肽。在一些实施方式中，adgn-100肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:53-70、79、80、86-91、101-104、106、110-112和121-128。在一些实施方式中，第一和第二细胞穿透肽是相同的。在一些实施方式中，第一和第二细胞穿透肽是不同的。在一些实施方式中，货物递送复合物的平均直径在约20nm与约1000nm之间(如约20至约500nm、约50至约400nm、约60至约300nm、约80至约200nm、或约100至约160nm)。在一些实施方式中，peg部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，peg部分的分子量为约0.05kda至约50kda。在一些实施方式中，peg部分的分子量为约0.05kda至约0.5kda(如约0.05-0.1、0.05-0.4、0.1-0.3、0.05-0.25、0.25-0.5kda)。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽的n-末端或c-末端缀合。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽内的位点缀合。
[0057]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括第一细胞穿透肽的第一肽；b)包括第二细胞穿透肽的第二肽；和c)货物分子，其中第二肽包括与第二细胞穿透肽共价连接的聚乙二醇(peg)部分，并且其中第一肽不具有peg部分，其中第一细胞穿透肽与第二细胞穿透肽的比约为20:1至约1:1(如约15:1至约2:1、约10:1至约4:1)，并且其中第一和/或第二细胞穿透肽是vepep-3肽。在一些实施方式中，vepep-3肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:1-14、75、76和113-115。在一些实施方式中，货物递送复合物的平均直径在约20nm与约1000nm之间(如约20至约500nm、约50至约400nm、约60至约300nm、约80至约200nm、或约100至约160nm)。在一些实施方式中，peg部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，peg部分的分子量为约0.05kda至约50kda。在一些实施方式中，peg部分的分子量为约0.05kda至约0.5kda(如约0.05-0.1、0.05-0.4、0.1-0.3、0.05-0.25、0.25-0.5kda)。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽的n-末端或c-末端缀合。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽内的位点缀合。
[0058]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括第一细胞穿透肽的第一肽；b)包括第二细胞穿透肽的第二肽；和c)货物分子，其中第二肽包括与第二细胞穿透肽共价连接的聚乙二醇(peg)部分，并且其中第一肽不具有peg部分，其中第一细胞穿透肽与第二细胞穿透肽的比为约20:1至约1:1
(如约15:1至约2:1、约10:1至约4:1)，并且其中第一和/或第二细胞穿透肽是vepep-6肽。在一些实施方式中，vepep-6肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:15-40、77、85、92-100、105、107-109和129-139。在一些实施方式中，货物递送复合物的平均直径在约20nm与约1000nm之间(如约20至约500nm、约50至约400nm、约60至约300nm、约80至约200nm、或约100至约160nm)。在一些实施方式中，peg部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，peg部分的分子量为约0.05kda至约50kda。在一些实施方式中，peg部分的分子量为约0.05kda至约0.5kda(如约0.05-0.1、0.05-0.4、0.1-0.3、0.05-0.25、0.25-0.5kda)。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽的n-末端或c-末端缀合。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽内的位点缀合。
[0059]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括第一细胞穿透肽的第一肽；b)包括第二细胞穿透肽的第二肽；和c)货物分子，其中第二肽包括与第二细胞穿透肽共价连接的聚乙二醇(peg)部分，并且其中第一肽不具有peg部分，其中第一细胞穿透肽与第二细胞穿透肽的比为约20:1至约1:1(如约15:1至约2:1、约10:1至约4:1)，并且其中第一和/或第二细胞穿透肽是vepep-9肽。在一些实施方式中，vepep-9肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:41-52、78和116-120。在一些实施方式中，货物递送复合物的平均直径在约20nm与约1000nm之间(如约20至约500nm、约50至约400nm、约60至约300nm、约80至约200nm、或约100至约160nm)。在一些实施方式中，peg部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，peg部分的分子量为约0.05kda至约50kda。在一些实施方式中，peg部分的分子量为约0.05kda至约0.5kda(如约0.05-0.1、0.05-0.4、0.1-0.3、0.05-0.25、0.25-0.5kda)。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽的n-末端或c-末端缀合。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽内的位点缀合。
[0060]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括第一细胞穿透肽的第一肽；b)包括第二细胞穿透肽的第二肽；和c)货物分子，其中第二肽包括与第二细胞穿透肽共价连接的聚乙二醇(peg)部分，并且其中第一肽不具有peg部分，其中第一细胞穿透肽与第二细胞穿透肽的比为约20:1至约1:1(如约15:1至约2:1、约10:1至约4:1)，并且其中第一和/或第二细胞穿透肽是adgn-100肽。在一些实施方式中，adgn-100肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:53-70、79、80、86-91、101-104、106、110-112和121-128。在一些实施方式中，货物递送复合物的平均直径在约20nm与约1000nm之间(如约20至约500nm、约50至约400nm、约60至约300nm、约80至约200nm、或约100至约160nm)。在一些实施方式中，peg部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，peg部分的分子量为约0.05kda至约50kda。在一些实施方式中，peg部分的分子量为约0.05kda至约0.5kda(如约0.05-0.1、0.05-0.4、0.1-0.3、0.05-0.25、0.25-0.5kda)。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽的n-末端或c-末端缀合。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽内的位点缀合。
[0061]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括第一细胞穿透肽的第一肽；b)包括第二细胞穿透肽的第二肽；和c)货物分子，其中第二肽包括与第二细胞穿透肽共价连接的聚乙二醇(peg)部分，并且其中第一肽不具有peg部分，其中第一细胞穿透肽与第二细胞穿透肽的比为约20:1至约1:1
(如约15:1至约2:1、约10:1至约4:1)，并且其中第一和/或第二细胞穿透肽是基于ptd的肽、两亲肽、基于聚精氨酸的肽、mpg肽、cady肽、pep-1肽、pep-2肽、或pep-3肽。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽包括选自seq id no:71-74和81的氨基酸序列。在一些实施方式中，货物递送复合物的平均直径在约20nm与约1000nm之间(如约20至约500nm、约50至约400nm、约60至约300nm、约80至约200nm、或约100至约160nm)。在一些实施方式中，peg部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，peg部分的分子量为约0.05kda至约50kda。在一些实施方式中，peg部分的分子量为约0.05kda至约0.5kda(如约0.05-0.1、0.05-0.4、0.1-0.3、0.05-0.25、0.25-0.5kda)。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽的n-末端或c-末端缀合。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽内的位点缀合。
[0062]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括第一细胞穿透肽的第一肽；b)包括第二细胞穿透肽的第二肽；和c)货物分子，其中第二肽包括与第二细胞穿透肽共价连接的聚乙二醇(peg)部分，并且其中第一肽不具有peg部分，其中第一细胞穿透肽与第二细胞穿透肽的比为约20:1至约1:1(如约15:1至约2:1、约10:1至约4:1)，其中货物分子是或包括核酸。在一些实施方式中，核酸选自irna(如sirna、mirna或shrna)、grna、mrna、dna、dna、dna质粒、寡核苷酸及其类似物。在一些实施方式中，核酸包括mrna。在一些实施方式中，核酸进一步包括rnai。在一些实施方式中，核酸包括mrna和rnai，其中mrna编码用于治疗疾病或状况的治疗性蛋白质，并且其中rnai靶向rna，其中rna的表达与疾病或状况相关联。在一些实施方式中，细胞穿透肽与核酸的摩尔比在约1:1至约100:1之间(如约在约1:1与约50:1之间，或约20:1)。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是基于ptd的肽、两亲肽、基于聚精氨酸的肽、mpg肽、cady肽、pep-1肽、pep-2肽、或pep-3肽。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽包括选自seq id no:71-74和81的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一和第二细胞穿透肽选自cady、pep-1肽、pep-2肽、pep-3肽、vepep-3肽、vepep-6肽、vepep-9肽和adgn-100肽。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是vepep-3肽。在一些实施方式中，vepep-3肽包括选自seq id no:1-14、75、76和113-115的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是vepep-6肽。在一些实施方式中，vepep-6肽包括选自seq id no:15-40、77、85、92-100、105、107-109和129-139的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是vepep-9肽。在一些实施方式中，vepep-9肽包括选自seq id no:41-52、78和116-120的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是adgn-100肽。在一些实施方式中，adgn-100肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:53-70、79、80、86-91、101-104、106、110-112和121-128。在一些实施方式中，第一和第二细胞穿透肽是相同的。在一些实施方式中，第一和第二细胞穿透肽是不同的。在一些实施方式中，货物递送复合物的平均直径在约20nm与约1000nm之间(如约20至约500nm、约50至约400nm、约60至约300nm、约80至约200nm、或约100至约160nm)。在一些实施方式中，peg部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，peg部分的分子量为约0.05kda至约50kda。在一些实施方式中，peg部分的分子量为约0.05kda至约0.5kda(如约0.05-0.1、0.05-0.4、0.1-0.3、0.05-0.25、0.25-0.5kda)。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽的n-末端或c-末端缀合。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽内的位点缀
合。
[0063]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括第一细胞穿透肽的第一肽；b)包括第二细胞穿透肽的第二肽；和c)货物分子，其中第二肽包括与第二细胞穿透肽共价连接的聚乙二醇(peg)部分，并且其中第一肽不具有peg部分，其中第一细胞穿透肽与第二细胞穿透肽的比为约20:1至约1:1(如约15:1至约2:1、约10:1至约4:1)，并且其中货物分子是或包括病毒。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是基于ptd的肽、两亲肽、基于聚精氨酸的肽、mpg肽、cady肽、pep-1肽、pep-2肽、或pep-3肽。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽包括选自seq id no:71-74和81的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一和第二细胞穿透肽选自cady、pep-1肽、pep-2肽、pep-3肽、vepep-3肽、vepep-6肽、vepep-9肽和adgn-100肽。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是vepep-3肽。在一些实施方式中，vepep-3肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:1-14、75、76和113-115。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是vepep-6肽。在一些实施方式中，vepep-6肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:15-40、77、85、92-100、105、107-109和129-139。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是vepep-9肽。在一些实施方式中，vepep-9肽包括选自seq id no:41-52、78和116-120的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是adgn-100肽。在一些实施方式中，adgn-100肽包括选自seq id no:53-70、79、80、86-91、101-104、106、110-112和121-128的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一和第二细胞穿透肽是相同的。在一些实施方式中，第一和第二细胞穿透肽是不同的。在一些实施方式中，货物递送复合物的平均直径在约20nm与约1000nm之间(如约20至约500nm、约50至约400nm、约60至约300nm、约80至约200nm、或约100至约160nm)。在一些实施方式中，peg部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，peg部分的分子量为约0.05kda至约50kda。在一些实施方式中，peg部分的分子量为约0.05kda至约0.5kda(如约0.05-0.1、0.05-0.4、0.1-0.3、0.05-0.25、0.25-0.5kda)。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽的n-末端或c-末端缀合。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽内的位点缀合。
[0064]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括第一细胞穿透肽的第一肽；b)包括第二细胞穿透肽的第二肽；和c)货物分子，其中第二肽包括与第二细胞穿透肽共价连接的聚乙二醇(peg)部分，并且其中第一肽不具有peg部分，其中第一细胞穿透肽与第二细胞穿透肽的比为约20:1至约1:1(如约15:1至约2:1、约10:1至约4:1)，并且其中货物分子是或包括多肽。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是基于ptd的肽、两亲肽、基于聚精氨酸的肽、mpg肽、cady肽、pep-1肽、pep-2肽、或pep-3肽。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽包括选自seq id no:71-74和81的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一和第二细胞穿透肽选自cady、pep-1肽、pep-2肽、pep-3肽、vepep-3肽、vepep-6肽、vepep-9肽和adgn-100肽。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是vepep-3肽。在一些实施方式中，vepep-3肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:1-14、75、76和113-115。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是vepep-6肽。在一些实施方式中，vepep-6肽包括选自seq id no:15-40、77、85、92-100、105、107-109和129-139的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞
穿透肽是vepep-9肽。在一些实施方式中，vepep-9肽包括选自seq id no:41-52、78和116-120的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是adgn-100肽。在一些实施方式中，adgn-100肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:53-70、79、80、86-91、101-104、106、110-112和121-128。在一些实施方式中，第一和第二细胞穿透肽是相同的。在一些实施方式中，第一和第二细胞穿透肽是不同的。在一些实施方式中，货物递送复合物的平均直径在约20nm与约1000nm之间(如约20至约500nm、约50至约400nm、约60至约300nm、约80至约200nm、或约100至约160nm)。在一些实施方式中，peg部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，peg部分的分子量为约0.05kda至约50kda。在一些实施方式中，peg部分的分子量为约0.05kda至约0.5kda(如约0.05-0.1、0.05-0.4、0.1-0.3、0.05-0.25、0.25-0.5kda)。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽的n-末端或c-末端缀合。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽内的位点缀合。
[0065]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括第一细胞穿透肽的第一肽；b)包括第二细胞穿透肽的第二肽；和c)货物分子，其中第二肽包括与第二细胞穿透肽共价连接的聚乙二醇(peg)部分，并且其中第一肽不具有peg部分，其中第一细胞穿透肽与第二细胞穿透肽的比为约20:1至约1:1(如约15:1至约2:1、约10:1至约4:1)，其中货物分子是或包括蛋白质/核酸复合物。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是基于ptd的肽、两亲肽、基于聚精氨酸的肽、mpg肽、cady肽、pep-1肽、pep-2肽、或pep-3肽。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽包括选自seq id no:71-74和81的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一和第二细胞穿透肽选自cady、pep-1肽、pep-2肽、pep-3肽、vepep-3肽、vepep-6肽、vepep-9肽和adgn-100肽。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是vepep-3肽。在一些实施方式中，vepep-3肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:1-14、75、76和113-115。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是vepep-6肽。在一些实施方式中，vepep-6肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:15-40、77、85、92-100、105、107-109和129-139。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是vepep-9肽。在一些实施方式中，vepep-9肽包括选自seq id no:41-52、78和116-120的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是adgn-100肽。在一些实施方式中，adgn-100肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:53-70、79、80、86-91、101-104、106、110-112和121-128。在一些实施方式中，第一和第二细胞穿透肽是相同的。在一些实施方式中，第一和第二细胞穿透肽是不同的。在一些实施方式中，货物递送复合物的平均直径在约20nm与约1000nm之间(如约20至约500nm、约50至约400nm、约60至约300nm、约80至约200nm、或约100至约160nm)。在一些实施方式中，peg部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，peg部分的分子量为约0.05kda至约50kda。在一些实施方式中，peg部分的分子量为约0.05kda至约0.5kda(如约0.05-0.1、0.05-0.4、0.1-0.3、0.05-0.25、0.25-0.5kda)。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽的n-末端或c-末端缀合。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽内的位点缀合。
[0066]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括第一细胞穿透肽的第一肽；b)包括第二细胞穿透肽的第二肽；
和c)货物分子，其中第二肽包括与第二细胞穿透肽共价连接的聚乙二醇(peg)部分，并且其中第一肽不具有peg部分，其中第一细胞穿透肽与第二细胞穿透肽的比为约20:1至约1:1(如约15:1至约2:1、约10:1至约4:1)，其中货物分子是或包括病毒样颗粒。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是基于ptd的肽、两亲肽、基于聚精氨酸的肽、mpg肽、cady肽、pep-1肽、pep-2肽、或pep-3肽。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽包括选自seq id no:71-74和81的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一和第二细胞穿透肽选自cady、pep-1肽、pep-2肽、pep-3肽、vepep-3肽、vepep-6肽、vepep-9肽和adgn-100肽。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是vepep-3肽。在一些实施方式中，vepep-3肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:1-14、75、76和113-115。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是vepep-6肽。在一些实施方式中，vepep-6肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:15-40、77、85、92-100、105、107-109和129-139。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是vepep-9肽。在一些实施方式中，vepep-9肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:41-52、78和116-120。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是adgn-100肽。在一些实施方式中，adgn-100肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:53-70、79、80、86-91、101-104、106、110-112和121-128。在一些实施方式中，第一和第二细胞穿透肽是相同的。在一些实施方式中，第一和第二细胞穿透肽是不同的。在一些实施方式中，货物递送复合物的平均直径在约20nm与约1000nm之间(如约20至约500nm、约50至约400nm、约60至约300nm、约80至约200nm、或约100至约160nm)。在一些实施方式中，peg部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，peg部分的分子量为约0.05kda至约50kda。在一些实施方式中，peg部分的分子量为约0.05kda至约0.5kda(如约0.05-0.1、0.05-0.4、0.1-0.3、0.05-0.25、0.25-0.5kda)。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽的n-末端或c-末端缀合。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽内的位点缀合。
[0067]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括第一细胞穿透肽的第一肽；b)包括第二细胞穿透肽的第二肽；和c)货物分子，其中第二肽包括与第二细胞穿透肽共价连接的聚乙二醇(peg)部分，并且其中第一肽不具有peg部分，其中第一细胞穿透肽与第二细胞穿透肽的比为约20:1至约1:1(如约15:1至约2:1、约10:1至约4:1)，其中货物分子是或包括蛋白质复合物。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是基于ptd的肽、两亲肽、基于聚精氨酸的肽、mpg肽、cady肽、pep-1肽、pep-2肽、或pep-3肽。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽包括选自seq id no:71-74和81的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一和第二细胞穿透肽选自cady、pep-1肽、pep-2肽、pep-3肽、vepep-3肽、vepep-6肽、vepep-9肽和adgn-100肽。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是vepep-3肽。在一些实施方式中，vepep-3肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:1-14、75、76和113-115。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是vepep-6肽。在一些实施方式中，vepep-6肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:15-40、77、85、92-100、105、107-109和129-139。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是vepep-9肽。在一些实施方式中，vepep-9肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:41-52、78和116-120。在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是adgn-100肽。在一些实施方式中，adgn-100肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:53-70、79、
80、86-91、101-104、106、110-112和121-128。在一些实施方式中，第一和第二细胞穿透肽是相同的。在一些实施方式中，第一和第二细胞穿透肽是不同的。在一些实施方式中，货物递送复合物的平均直径在约20nm与约1000nm之间(如约20至约500nm、约50至约400nm、约60至约300nm、约80至约200nm、或约100至约160nm)。在一些实施方式中，peg部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，peg部分的分子量为约0.05kda至约50kda。在一些实施方式中，peg部分的分子量为约0.05kda至约0.5kda(如约0.05-0.1、0.05-0.4、0.1-0.3、0.05-0.25、0.25-0.5kda)。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽的n-末端或c-末端缀合。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽内的位点缀合。
[0068]
在一些实施方式中，peg部分是线性peg。在一些实施方式中，peg部分是支化peg。
[0069]
在一些实施方式中，第一和/或第二肽进一步包括选自以下的一个或多个部分：乙酰基、硬脂酰基、脂肪酸、胆固醇、核定位信号、核输出信号、抗体或其抗体片段、肽、多糖、和靶向序列，其中一个或多个部分与第一或第二细胞穿透肽的n-末端，或peg部分共价连接。在一些实施方式中，一个或多个部分通过连接体与第一细胞穿透肽、第二细胞穿透肽的n-末端或peg部分共价连接。在一些实施方式中，一个或多个部分包括乙酰基和/或硬脂酰基。在一些实施方式中，一个或多个部分包括靶向序列。在一些实施方式中，靶向序列通过连接体共价连接到第一或第二细胞穿透肽。在一些实施方式中，靶向序列在不具有连接体的情况下与第一或第二细胞穿透肽共价连接。
[0070]
在一些实施方式中，第一和/或第二肽进一步包括选自以下的一个或多个部分：半胱酰胺、半胱氨酸、硫醇、酰胺、任选地取代的次氮基三乙酸、羧基、任选地取代的线性或分支c
1-c6烷基、伯胺或仲胺、糖苷衍生物(osidic derivative)、脂质、磷脂、脂肪酸、胆固醇、核定位信号、核输出信号、抗体、多糖和靶向序列，其中一个或多个部分共价连接到第一细胞穿透肽、第二细胞穿透肽的c-末端或peg部分。在一些实施方式中，一个或多个部分通过连接体共价连接到第一细胞穿透肽、第二细胞穿透肽的c-末端或peg部分。在一些实施方式中，一个或多个部分包括乙酰基和/或硬脂酰基。在一些实施方式中，一个或多个部分包括靶向序列。在一些实施方式中，靶向序列通过连接体共价连接到第一或第二细胞穿透肽。在一些实施方式中，靶向序列在不具有连接体的情况下与第一或第二细胞穿透肽共价连接。
[0071]
在一些实施方式中，靶向序列选自gy、yv、vs、sk、gyv、yvs、vsk、gyvs、yvsk、yi、ig、gs、sr、yig、igs、gsr、yigs和igsr。在一些实施方式中，靶向序列选自gyvsk、gyvs、yigs和yigsr。
[0072]
在一些实施方式中，本文所述的连接体包括聚甘氨酸连接体。在一些实施方式中，连接体选自β-丙氨酸、半胱氨酸、半胱酰胺桥、聚甘氨酸(如g2或g4)、peg连接体部分、aun(11-氨基-十一酸)、ava(5-氨基戊酸)和ahx(氨基己酸)。在一些实施方式中，连接体包括peg连接体部分。在一些实施方式中，peg连接体部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，peg连接体部分的分子量为约0.05kda至约0.5kda(如约0.05-0.1、0.05-0.4、0.1-0.3、0.05-0.25、0.25-0.5kda)。在一些实施方式中，peg连接体部分是线性peg。在一些实施方式中，peg连接体部分是支化peg。在一些实施方式中，连接体包括β-丙氨酸。在一些实施方式中，连接体包括至少约两个、三个或四个甘氨酸，任选地连续甘氨酸。在一些实施方式中，连接体进一步包括丝氨酸。在一些实施方式中，连
接体包括ggggs或sgggg序列。在一些实施方式中，连接体包括甘氨酸-β-丙氨酸基序。
[0073]
在一些实施方式中，第一和/或第二细胞穿透肽是反向-翻转肽。在一些实施方式中，反向-翻转肽包括seq id no:85或86的序列。
[0074]
在一些实施方式中，第一和/或第二肽包括sed id no:1-112的序列。
[0075]
包括反向-翻转细胞穿透肽的货物递送复合物
[0076]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括细胞穿透肽和货物分子，其中细胞穿透肽是反向-翻转肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽是基于ptd的肽、两亲肽、基于聚精氨酸的肽、mpg肽、pep肽(如pep-1、pep-2或pep-3肽)、或vepep肽(如adgn-100、vepep-3、vepep-4、vepep-5、vepep-6或vepep-9肽)。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、蛋白质复合物和蛋白质复合物。
[0077]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括细胞穿透肽和货物分子，其中细胞穿透肽选自pep-1肽、pep-2肽、pep-3肽、vepep-3肽、vepep-4肽，vepep-5肽、vepep-6肽、vepep-9肽和adgn-100肽，并且其中细胞穿透肽是反向-翻转肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自vepep-3肽、vepep-4肽、vepep-5肽、vepep-6肽、vepep-9肽和adgn-100肽。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、蛋白质复合物和蛋白质复合物。在一些实施方式中，货物分子不包括病毒。在一些实施方式中，货物分子包括选自以下的核酸：rnai(如sirna、mirna、shrna)、grna、mrna、dna、dna质粒、寡核苷酸及其类似物。在一些实施方式中，货物分子包括mrna。在一些实施方式中，货物分子包括或进一步包括rnai(如sirna、mirna、shrna)。在一些实施方式中，核酸包括mrna和rnai，并且其中mrna编码用于治疗疾病或状况的治疗性蛋白质，并且其中rnai靶向rna，其中rna的表达与疾病或状况相关联。在一些实施方式中，细胞穿透肽与货物分子(如核酸)的摩尔比在约1:1与约100:1之间(如约在约1:1与约50:1之间，或约20:1)。
[0078]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括细胞穿透肽和货物分子，其中细胞穿透肽是反向-翻转肽，并且其中货物分子不包括病毒。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、以及蛋白质复合物和蛋白质复合物。在一些实施方式中，货物分子包括核酸。在一些实施方式中，核酸选自rnai(如sirna、mirna、shrna)、grna、mrna、dna、dna质粒、寡核苷酸及其类似物。在一些实施方式中，货物分子包括mrna。在一些实施方式中，货物分子包括或进一步包括rnai(如sirna、mirna、shrna)。在一些实施方式中，核酸包括mrna和rnai，并且其中mrna编码用于治疗疾病或状况的治疗性蛋白质，并且其中rnai靶向rna，其中rna的表达与疾病或状况相关联。在一些实施方式中，细胞穿透肽与货物分子(如核酸)的摩尔比在约1:1与约100:1之间(如约在约1:1与约50:1之间，或约20:1)。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自vepep-3肽、vepep-4肽、vepep-5肽、vepep-6肽、vepep-9肽和adgn-100肽。
[0079]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括细胞穿透肽和货物分子，其中细胞穿透肽是反向-翻转肽，其中细胞穿透肽是adgn-100肽，其中货物分子不包括病毒。在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括细胞穿透肽和货物分子，其中细
胞穿透肽是反向-翻转肽，其中细胞穿透肽是adgn-100肽，其中货物分子包括核酸。在一些实施方式中，adgn-100肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:53-70、79、80、86-91、101-104、106、110-112和121-128。在一些实施方式中，核酸选自rnai(如sirna、mirna、shrna)、grna、mrna、dna、dna质粒、寡核苷酸及其类似物。在一些实施方式中，货物分子包括mrna。在一些实施方式中，货物分子包括或进一步包括rnai(如sirna、mirna、shrna)。在一些实施方式中，核酸包括mrna和rnai，其中mrna编码用于治疗疾病或状况的治疗性蛋白质，并且其中rnai靶向rna，其中rna的表达与疾病或状况相关联。在一些实施方式中，细胞穿透肽与核酸的摩尔比在约1:1与约100:1之间(如约在约1:1与约50:1之间，或约20:1)。
[0080]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括细胞穿透肽和货物分子，其中细胞穿透肽是反向-翻转肽，其中细胞穿透肽是vepep-3肽，其中货物分子不包括病毒。在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括细胞穿透肽和货物分子，其中细胞穿透肽是反向-翻转肽，其中细胞穿透肽是vepep-3肽，其中货物分子包括核酸。在一些实施方式中，vepep-3肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:1-14、75、76和113-115。在一些实施方式中，核酸选自rnai(如sirna、mirna、shrna)、grna、mrna、dna、dna质粒、寡核苷酸及其类似物。在一些实施方式中，货物分子包括mrna。在一些实施方式中，货物分子包括或进一步包括rnai(如sirna、mirna、shrna)。在一些实施方式中，核酸包括mrna和rnai，并且其中mrna编码用于治疗疾病或状况的治疗性蛋白质，并且其中rnai靶向rna，其中rna的表达与疾病或状况相关联。在一些实施方式中，货物包括dna质粒。在一些实施方式中，细胞穿透肽与核酸的摩尔比在约1:1与约100:1之间(如约在约1:1与约50:1之间，或约20:1)。
[0081]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括细胞穿透肽和货物分子，其中细胞穿透肽是反向-翻转肽，其中细胞穿透肽是vepep-6肽，其中货物分子不包括病毒。在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括细胞穿透肽和货物分子，其中细胞穿透肽是反向-翻转肽，其中细胞穿透肽是vepep-6肽，其中货物分子包括核酸。在一些实施方式中，vepep-6肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:15-40、77、85、92-100、105、107-109和129-139。在一些实施方式中，核酸选自rnai(如sirna、mirna、shrna)、grna、mrna、dna、dna质粒、寡核苷酸及其类似物。在一些实施方式中，货物分子包括mrna。在一些实施方式中，货物分子包括或进一步包括rnai(如sirna、mirna、shrna)。在一些实施方式中，核酸包括mrna和rnai，并且其中mrna编码用于治疗疾病或状况的治疗性蛋白质，并且其中rnai靶向rna，其中rna的表达与疾病或状况相关联。在一些实施方式中，细胞穿透肽与核酸的摩尔比在约1:1与约100:1之间(如约在约1:1与约50:1之间，或约20:1)。
[0082]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括细胞穿透肽和货物分子，其中细胞穿透肽是反向-翻转肽，其中细胞穿透肽是vepep-9肽，其中货物分子不包括病毒。在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括细胞穿透肽和货物分子，其中细胞穿透肽是反向-翻转肽，其中细胞穿透肽是vepep-9肽，其中货物分子包括核酸。在一些实施方式中，vepep-9肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:41-52、78和116-120。在一些实施方式中，核酸选自rnai(如sirna、mirna、shrna)、grna、mrna、dna、dna质粒、寡核苷酸及
其类似物。在一些实施方式中，货物分子包括mrna。在一些实施方式中，货物分子包括或进一步包括rnai(如sirna、mirna、shrna)。在一些实施方式中，核酸包括mrna和rnai，并且其中mrna编码用于治疗疾病或状况的治疗性蛋白质，并且其中rnai靶向rna，其中rna的表达与疾病或状况相关联。在一些实施方式中，细胞穿透肽与核酸的摩尔比在约1:1与约100:1之间(如约在约1:1与约50:1之间，或约20:1)。
[0083]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，其中所述复合物包括细胞穿透肽和货物分子，其中细胞穿透肽是包括seq id no:85或86序列的反向-翻转肽，并且其中货物分子不包括病毒。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、以及蛋白质复合物和蛋白质复合物。在一些实施方式中，货物分子包括核酸。在一些实施方式中，核酸选自rnai(如sirna、mirna、shrna)、grna、mrna、dna、dna质粒、寡核苷酸及其类似物。在一些实施方式中，货物分子包括mrna。在一些实施方式中，货物分子包括或进一步包括rnai(如sirna、mirna、shrna)。在一些实施方式中，核酸包括mrna和rnai，并且其中mrna编码用于治疗疾病或状况的治疗性蛋白质，并且其中rnai靶向rna，其中rna的表达与疾病或状况相关联。在一些实施方式中，细胞穿透肽与货物分子(如核酸)的摩尔比在约1:1与约100:1之间(如约在约1:1与约50:1之间，或约20:1)。
[0084]
在一些实施方式中，货物递送复合物的平均直径在约20nm与约1000nm之间(如约20至约500nm、约50至约400nm、约60至约300nm、约80至约200nm、或约100至约160nm)。
[0085]
在一些实施方式中，细胞穿透肽进一步包括选自以下的一个或多个部分：乙酰基、硬脂酰基、脂肪酸、胆固醇、核定位信号、核输出信号、抗体或其抗体片段、肽、多糖、和靶向序列，其中一个或多个部分与细胞穿透肽的n-末端共价连接。在一些实施方式中，一个或多个部分通过连接体共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，一个或多个部分包括乙酰基和/或硬脂酰基。在一些实施方式中，一个或多个部分包括靶向序列。在一些实施方式中，靶向序列通过连接体共价连接到细胞穿透肽。在一些实施方式中，靶向序列在不具有连接体的情况下与细胞穿透肽共价连接。
[0086]
在一些实施方式中，肽进一步包括选自以下的一个或多个部分：半胱酰胺、半胱氨酸、硫醇、酰胺、任选地取代的次氮基三乙酸、羧基、任选地取代的线性或分支c
1-c6烷基、伯胺或仲胺、糖苷衍生物、脂质、磷脂、脂肪酸、胆固醇、核定位信号、核输出信号、抗体、多糖和靶向序列，其中一个或多个部分共价连接到细胞穿透肽的c-末端。在一些实施方式中，一个或多个部分通过连接体共价连接到细胞穿透肽的c-末端。在一些实施方式中，一个或多个部分包括乙酰基和/或硬脂酰基。在一些实施方式中，一个或多个部分包括靶向序列。在一些实施方式中，靶向序列通过连接体共价连接到细胞穿透肽。在一些实施方式中，靶向序列在不具有连接体的情况下与第二细胞穿透肽共价连接。
[0087]
在一些实施方式中，靶向序列选自gy、yv、vs、sk、gyv、yvs、vsk、gyvs、yvsk、yi、ig、gs、sr、yig、igs、gsr、yigs和igsr。在一些实施方式中，靶向序列选自gyvsk、gyvs、yigs和yigsr。
[0088]
在一些实施方式中，本文的连接体包括聚甘氨酸连接体。在一些实施方式中，连接体选自β-丙氨酸、半胱氨酸、半胱酰胺桥、聚甘氨酸(如g2或g4)、peg连接体部分、aun(11-氨基-十一酸)、ava(5-氨基戊酸)和ahx(氨基己酸)。在一些实施方式中，连接体包括peg连接体部分。在一些实施方式中，peg连接体部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙
二醇单元组成。在一些实施方式中，peg连接体部分的分子量为约0.05kda至约0.5kda(如约0.05-0.1、0.05-0.4、0.1-0.3、0.05-0.25、0.25-0.5kda)。在一些实施方式中，peg连接体部分是线性peg。在一些实施方式中，peg连接体部分是支化peg。在一些实施方式中，连接体包括β-丙氨酸。在一些实施方式中，连接体包括至少约两个、三个或四个甘氨酸，任选地连续甘氨酸。在一些实施方式中，连接体进一步包括丝氨酸。在一些实施方式中，连接体包括ggggs或sgggg序列。在一些实施方式中，连接体包括甘氨酸-β-丙氨酸基序。
[0089]
包括具有信号序列(即，靶向部分)的细胞穿透肽的货物递送复合物
[0090]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中肽进一步包括选自gyvsk、gyvs、yigs和yigsr的靶向序列。在一些实施方式中，细胞穿透肽是基于ptd的肽、两亲肽、基于聚精氨酸的肽、mpg肽、cady肽、pep-1肽、pep-2肽、或pep-3肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自cady、pep-1肽、pep-2肽、pep-3肽、vepep-3肽、vepep-4肽、vepep-5肽、vepep-6肽、vepep-9肽和adgn-100肽。在一些实施方式中，货物递送复合物的平均直径在约20nm与约1000nm之间(如约20至约500nm、约50至约400nm、约60至约300nm、约80至约200nm、或约100至约160nm)。在一些实施方式中，靶向序列共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，靶向序列通过连接体共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，连接体包括聚甘氨酸连接体。在一些实施方式中，连接体选自β-丙氨酸、半胱氨酸、半胱酰胺桥、聚甘氨酸(如g2或g4)、peg连接体部分、aun(11-氨基-十一酸)、ava(5-氨基戊酸)和ahx(氨基己酸)。在一些实施方式中，连接体包括peg连接体部分。在一些实施方式中，peg连接体部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，peg连接体部分的分子量为约0.05kda至约0.5kda(如约0.05-0.1、0.05-0.4、0.1-0.3、0.05-0.25、0.25-0.5kda)。在一些实施方式中，peg连接体部分是线性peg。在一些实施方式中，peg连接体部分是支化peg。在一些实施方式中，连接体包括β-丙氨酸。在一些实施方式中，连接体包括至少约两个、三个或四个甘氨酸，任选地连续甘氨酸。在一些实施方式中，连接体进一步包括丝氨酸。在一些实施方式中，连接体包括ggggs或sgggg序列。在一些实施方式中，连接体包括甘氨酸-β-丙氨酸基序。在一些实施方式中，靶向序列在不具有连接体的情况下与细胞穿透肽的n-末端共价连接。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的一个或多个部分，其中一个或多个部分选自乙酰基和硬脂酰基。
[0091]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中肽进一步包括选自gyvsk、gyvs、yigs和yigsr的靶向序列，并且其中货物分子不包括病毒。在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中肽进一步包括选自gyvsk、gyvs、yigs和yigsr的靶向序列，其中货物分子选自核酸、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。在一些实施方式中，细胞穿透肽与货物分子的摩尔比在约1:1与约100:1之间(如约在约1:1与约50:1之间，或约20:1)。在一些实施方式中，细胞穿透肽是基于ptd的肽、两亲肽、基于聚精氨酸的肽、mpg肽、cady肽、pep-1肽、pep-2肽、或pep-3肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自cady、pep-1肽、pep-2肽、pep-3肽、vepep-3肽、vepep-4肽、vepep-5肽、vepep-6肽、vepep-9肽和adgn-100肽。在一些实施方式中，靶向序列共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些
实施方式中，靶向序列通过连接体共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，连接体包括聚甘氨酸连接体。在一些实施方式中，连接体选自β-丙氨酸、半胱氨酸、半胱酰胺桥、聚甘氨酸(如g2或g4)、peg连接体部分、aun(11-氨基-十一酸)、ava(5-氨基戊酸)和ahx(氨基己酸)。在一些实施方式中，连接体包括peg连接体部分。在一些实施方式中，peg连接体部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，peg连接体部分的分子量为约0.05kda至约0.5kda(如约0.05-0.1、0.05-0.4、0.1-0.3、0.05-0.25、0.25-0.5kda)。在一些实施方式中，peg连接体部分是线性peg。在一些实施方式中，peg连接体部分是支化peg。在一些实施方式中，连接体包括β-丙氨酸。在一些实施方式中，连接体包括至少约两个、三个或四个甘氨酸，任选地连续甘氨酸。在一些实施方式中，连接体进一步包括丝氨酸。在一些实施方式中，连接体包括ggggs或sgggg序列。在一些实施方式中，连接体包括甘氨酸-β-丙氨酸基序。在一些实施方式中，靶向序列在不具有连接体的情况下与细胞穿透肽的n-末端共价连接。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的一个或多个部分，其中一个或多个部分选自乙酰基和硬脂酰基。
[0092]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中肽进一步包括选自gyvsk、gyvs、yigs和yigsr的靶向序列，其中货物分子是核酸。在一些实施方式中，核酸选自irna(如sirna、mirna或shrna)、grna、mrna、dna、dna、dna质粒、寡核苷酸及其类似物。在一些实施方式中，核酸包括mrna。在一些实施方式中，核酸包括或进一步包括rnai。在一些实施方式中，核酸包括mrna和rnai，其中mrna编码用于治疗疾病或状况的治疗性蛋白质，并且其中rnai靶向rna，其中rna的表达与疾病或状况相关联。在一些实施方式中，核酸是dna质粒。在一些实施方式中，细胞穿透肽与核酸的摩尔比在约1:1与约100:1之间(如约在约1:1与约50:1之间，或约20:1)。在一些实施方式中，细胞穿透肽是基于ptd的肽、两亲肽、基于聚精氨酸的肽、mpg肽、cady肽、pep-1肽、pep-2肽、或pep-3肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自cady、pep-1肽、pep-2肽、pep-3肽、vepep-3肽、vepep-4肽、vepep-5肽、vepep-6肽、vepep-9肽和adgn-100肽。在一些实施方式中，靶向序列共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，靶向序列通过连接体共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，连接体包括聚甘氨酸连接体。在一些实施方式中，连接体选自β-丙氨酸、半胱氨酸、半胱酰胺桥、聚甘氨酸(如g2或g4)、peg连接体部分、aun(11-氨基-十一酸)、ava(5-氨基戊酸)和ahx(氨基己酸)。在一些实施方式中，连接体包括peg连接体部分。在一些实施方式中，peg连接体部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，peg连接体部分的分子量为约0.05kda至约0.5kda(如约0.05-0.1、0.05-0.4、0.1-0.3、0.05-0.25、0.25-0.5kda)。在一些实施方式中，peg连接体部分是线性peg。在一些实施方式中，peg连接体部分是支化peg。在一些实施方式中，连接体包括β-丙氨酸。在一些实施方式中，连接体包括至少约两个、三个或四个甘氨酸，任选地连续甘氨酸。在一些实施方式中，连接体进一步包括丝氨酸。在一些实施方式中，连接体包括ggggs或sgggg序列。在一些实施方式中，连接体包括甘氨酸-β-丙氨酸基序。在一些实施方式中，靶向序列在不具有连接体的情况下与细胞穿透肽的n-末端共价连接。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的一个或多个部分，其中一个或多个部分选自乙酰基和硬脂酰基。
[0093]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述
货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中肽进一步包括选自gyvsk、gyvs、yigs和yigsr的靶向序列，其中细胞穿透肽是adgn-100肽，其中货物分子不包括病毒。在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中肽进一步包括选自gyvsk、gyvs、yigs和yigsr的靶向序列，其中细胞穿透肽是adgn-100肽，其中货物分子选自核酸、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中肽进一步包括选自gyvsk、gyvs、yigs和yigsr的靶向序列，其中细胞穿透肽是adgn-100肽，其中货物分子是核酸。在一些实施方式中，核酸选自irna(如sirna、mirna或shrna)、grna、mrna、dna、dna、dna质粒、寡核苷酸及其类似物。在一些实施方式中，核酸包括mrna。在一些实施方式中，核酸包括或进一步包括rnai。在一些实施方式中，核酸包括mrna和rnai，并且其中mrna编码用于治疗疾病或状况的治疗性蛋白质，并且其中rnai靶向rna，其中rna的表达与疾病或状况相关联。在一些实施方式中，核酸是dna质粒。在一些实施方式中，细胞穿透肽与核酸的摩尔比在约1:1与约100:1之间(如约在约1:1与约50:1之间，或约20:1)。在一些实施方式中，adgn-100肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:53-70、79、80、86-91、101-104、106、110-112和121-128。在一些实施方式中，靶向序列共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，靶向序列通过连接体共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，连接体包括聚甘氨酸连接体。在一些实施方式中，连接体选自β-丙氨酸、半胱氨酸、半胱酰胺桥、聚甘氨酸(如g2或g4)、peg连接体部分、aun(11-氨基-十一酸)、ava(5-氨基戊酸)和ahx(氨基己酸)。在一些实施方式中，连接体包括peg连接体部分。在一些实施方式中，peg连接体部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，peg连接体部分的分子量为约0.05kda至约0.5kda(如约0.05-0.1、0.05-0.4、0.1-0.3、0.05-0.25、0.25-0.5kda)。在一些实施方式中，peg连接体部分是线性peg。在一些实施方式中，peg连接体部分是支化peg。在一些实施方式中，连接体包括β-丙氨酸。在一些实施方式中，连接体包括至少约两个、三个或四个甘氨酸，任选地连续甘氨酸。在一些实施方式中，连接体进一步包括丝氨酸。在一些实施方式中，连接体包括ggggs或sgggg序列。在一些实施方式中，连接体包括甘氨酸-β-丙氨酸基序。在一些实施方式中，靶向序列在不具有连接体的情况下与细胞穿透肽的n-末端共价连接。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的一个或多个部分，其中一个或多个部分选自乙酰基和硬脂酰基。
[0094]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中肽进一步包括选自gyvsk、gyvs、yigs和yigsr的靶向序列，其中细胞穿透肽是vepep-3肽，其中货物分子不包括病毒。在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中肽进一步包括选自gyvsk、gyvs、yigs和yigsr的靶向序列，其中细胞穿透肽是vepep-3肽，其中货物分子选自核酸、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中肽进一步包括选自gyvsk、gyvs、yigs和yigsr的靶向序列，其中细胞
末端。在一些实施方式中，连接体包括聚甘氨酸连接体。在一些实施方式中，连接体选自β-丙氨酸、半胱氨酸、半胱酰胺桥、聚甘氨酸(如g2或g4)、peg连接体部分、aun(11-氨基-十一酸)、ava(5-氨基戊酸)和ahx(氨基己酸)。在一些实施方式中，连接体包括peg连接体部分。在一些实施方式中，peg连接体部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，peg连接体部分的分子量为约0.05kda至约0.5kda(如约0.05-0.1、0.05-0.4、0.1-0.3、0.05-0.25、0.25-0.5kda)。在一些实施方式中，peg连接体部分是线性peg。在一些实施方式中，peg连接体部分是支化peg。在一些实施方式中，连接体包括β-丙氨酸。在一些实施方式中，连接体包括至少约两个、三个或四个甘氨酸，任选地连续甘氨酸。在一些实施方式中，连接体进一步包括丝氨酸。在一些实施方式中，连接体包括ggggs或sgggg序列。在一些实施方式中，连接体包括甘氨酸-β-丙氨酸基序。在一些实施方式中，靶向序列在不具有连接体的情况下与细胞穿透肽的n-末端共价连接。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的一个或多个部分，其中一个或多个部分选自乙酰基和硬脂酰基。
[0096]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中肽进一步包括选自gyvsk、gyvs、yigs和yigsr的靶向序列，其中细胞穿透肽是vepep-9肽，其中货物分子不包括病毒。在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中肽进一步包括选自gyvsk、gyvs、yigs和yigsr的靶向序列，其中细胞穿透肽是vepep-9肽，其中货物分子选自核酸、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中肽进一步包括选自gyvsk、gyvs、yigs和yigsr的靶向序列，其中细胞穿透肽是vepep-9肽，其中货物分子是核酸。在一些实施方式中，vepep-9肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:41-52、78和116-120。在一些实施方式中，核酸选自irna(如sirna、mirna或shrna)、grna、mrna、dna、dna、dna质粒、寡核苷酸及其类似物。在一些实施方式中，核酸包括mrna。在一些实施方式中，核酸包括或进一步包括rnai。在一些实施方式中，核酸包括mrna和rnai，并且其中mrna编码用于治疗疾病或状况的治疗性蛋白质，并且其中rnai靶向rna，其中rna的表达与疾病或状况相关联。在一些实施方式中，核酸是dna质粒。在一些实施方式中，细胞穿透肽与核酸的摩尔比在约1:1与约100:1之间(如约在约1:1与约50:1之间，或约20:1)。在一些实施方式中，靶向序列共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，靶向序列通过连接体共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，连接体包括聚甘氨酸连接体。在一些实施方式中，连接体选自β-丙氨酸、半胱氨酸、半胱酰胺桥、聚甘氨酸(如g2或g4)、peg连接体部分、aun(11-氨基-十一酸)、ava(5-氨基戊酸)和ahx(氨基己酸)。在一些实施方式中，连接体包括peg连接体部分。在一些实施方式中，peg连接体部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，peg连接体部分的分子量为约0.05kda至约0.5kda(如约0.05-0.1、0.05-0.4、0.1-0.3、0.05-0.25、0.25-0.5kda)。在一些实施方式中，peg连接体部分是线性peg。在一些实施方式中，peg连接体部分是支化peg。在一些实施方式中，连接体包括β-丙氨酸。在一些实施方式中，连接体包括至少约两个、三个或四个甘氨酸，任选地连续甘氨酸。在一些实施方式中，连接体进一步
包括丝氨酸。在一些实施方式中，连接体包括ggggs或sgggg序列。在一些实施方式中，连接体包括甘氨酸-β-丙氨酸基序。在一些实施方式中，靶向序列在不具有连接体的情况下与细胞穿透肽的n-末端共价连接。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的一个或多个部分，其中一个或多个部分选自乙酰基和硬脂酰基。
[0097]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中肽进一步包括含有yigsr的序列的靶向序列，其中靶向序列在不具有连接体的情况下与细胞穿透肽的n-末端共价连接。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的乙酰基。在一些实施方式中，细胞穿透肽是adgn-100肽或vepep-6肽。在一些实施方式中，货物分子不包括病毒。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。在一些实施方式中，货物分子是选自以下的核酸：sirna、mirna、shrna、grna、mrna、dna、dna质粒、寡核苷酸及其类似物。
[0098]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中肽进一步包括含有yigsr的序列的靶向序列，其中靶向序列通过连接体共价连接到细胞穿透肽的n-末端，并且其中连接体包括至少约两个、三个或四个甘氨酸。在一些实施方式中，连接体由两个、三个或四个甘氨酸组成。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的乙酰基。在一些实施方式中，细胞穿透肽是adgn-100肽或vepep-6肽。在一些实施方式中，货物分子不包括病毒。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。在一些实施方式中，货物分子是选自以下的核酸：sirna、mirna、shrna、grna、mrna、dna、dna质粒、寡核苷酸及其类似物。
[0099]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中肽进一步包括含有gyvs的序列的靶向序列，其中靶向序列通过连接体共价连接到细胞穿透肽的n-末端，并且其中连接体包括至少约两个、三个或四个甘氨酸。在一些实施方式中，连接体由两个、三个或四个甘氨酸组成。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的乙酰基。在一些实施方式中，细胞穿透肽是adgn-100肽或vepep-6肽。在一些实施方式中，货物分子不包括病毒。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。在一些实施方式中，货物分子是选自以下的核酸：sirna、mirna、shrna、grna、mrna、dna、dna质粒、寡核苷酸及其类似物。
[0100]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中肽进一步包括含有yigsr的序列的靶向序列，其中靶向序列通过连接体共价连接到细胞穿透肽的n-末端，并且其中连接体包括ava(5-氨基戊酸)部分。在一些实施方式中，ava部分进一步包括亚甲基(即ch2)。在一些实施方式中，ava部分包括至少约两个ch2。在一些实施方式中，ava部分具有两个ch2。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的乙酰基。在一些实施方式中，细胞穿透肽是adgn-100肽或vepep-6肽。在一些实施方式中，货物分子不包括病毒。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。在一些实施方式中，货物分子是选自以下的核酸：sirna、mirna、shrna、grna、mrna、
dna、dna质粒、寡核苷酸及其类似物。
[0101]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中肽进一步包括含有gyvs的序列的靶向序列，其中靶向序列通过连接体共价连接到细胞穿透肽的n-末端，并且其中连接体包括ava(5-氨基戊酸)部分。在一些实施方式中，ava部分进一步包括亚甲基(即ch2)。在一些实施方式中，ava部分包括至少约两个ch2。在一些实施方式中，ava部分具有两个ch2。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的乙酰基。在一些实施方式中，细胞穿透肽是adgn-100肽或vepep-6肽。在一些实施方式中，货物分子不包括病毒。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。在一些实施方式中，货物分子是选自以下的核酸：sirna、mirna、shrna、grna、mrna、dna、dna质粒、寡核苷酸及其类似物。
[0102]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中肽进一步包括含有yigsr的序列的靶向序列，其中靶向序列通过连接体共价连接到细胞穿透肽的n-末端，并且其中连接体包括aun(11-氨基-十一酸)部分。在一些实施方式中，ava部分进一步包括亚甲基(即ch2)。在一些实施方式中，ava部分包括至少一个ch2(如至少两个、三个、四个、五个或六个)。在一些实施方式中，ava部分具有约一至十个(如约四至八、约五至七、或六个)ch2。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的乙酰基。在一些实施方式中，细胞穿透肽是adgn-100肽或vepep-6肽。在一些实施方式中，货物分子不包括病毒。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。在一些实施方式中，货物分子是选自以下的核酸：sirna、mirna、shrna、grna、mrna、dna、dna质粒、寡核苷酸及其类似物。
[0103]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中肽进一步包括含有gyvs的序列的靶向序列，其中靶向序列通过连接体共价连接到细胞穿透肽的n-末端，并且其中连接体包括aun(11-氨基-十一酸)部分。在一些实施方式中，ava部分进一步包括亚甲基(即ch2)。在一些实施方式中，ava部分包括至少一个ch2(如至少两个、三个、四个、五个或六个)。在一些实施方式中，ava部分具有约一至十个(如约四至八、约五至七、或六个)ch2。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的乙酰基。在一些实施方式中，细胞穿透肽是adgn-100肽或vepep-6肽。在一些实施方式中，货物分子不包括病毒。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。在一些实施方式中，货物分子是选自以下的核酸：sirna、mirna、shrna、grna、mrna、dna、dna质粒、寡核苷酸及其类似物。
[0104]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中肽进一步包括含有gyvs或yigsr的序列的靶向序列，其中靶向序列通过包括peg连接体部分的连接体共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，靶向序列包括yigsr或由yigsr组成。在一些实施方式中，靶向序列包括gyvs或由gyvs组成。在一些实施方式中，peg连接体部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，peg连接体部分由1、2、
3、4、5、6、7、8、9或10个乙二醇单元组成。在一些实施方式中，peg连接体部分的分子量为约0.05kda至约0.5kda(如约0.05-0.1、0.05-0.4、0.1-0.3、0.05-0.25、0.25-0.5kda)。在一些实施方式中，peg连接体部分是线性peg。在一些实施方式中，peg连接体部分是支化peg。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的乙酰基。在一些实施方式中，细胞穿透肽是adgn-100肽或vepep-6肽。在一些实施方式中，货物分子不包括病毒。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。在一些实施方式中，货物分子是选自以下的核酸：sirna、mirna、shrna、grna、mrna、dna、dna质粒、寡核苷酸及其类似物。
[0105]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中肽进一步包括含有gyvs或yigsr的序列的靶向序列，其中肽包括选自以下的序列：seq id no:88、89、94-99、101-112。
[0106]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中肽进一步包括含有sytsstm的序列的靶向序列，其中靶向序列共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的乙酰基。在一些实施方式中，靶向序列通过连接体部分连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，连接体部分选自β-丙氨酸、半胱氨酸、半胱酰胺桥、聚甘氨酸(如g2或g4)、peg连接体部分、aun(11-氨基-十一酸)、ava(5-氨基戊酸)和ahx(氨基己酸)。在一些实施方式中，细胞穿透肽是adgn-100肽或vepep-6肽。在一些实施方式中，adgn-100肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:53-70、79、80、86-91、101-104、106、110-112和121-128。在一些实施方式中，vepep-6肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:15-40、77、85、92-100、105、107-109和129-139。在一些实施方式中，细胞穿透肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:115、128、131和132。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。在一些实施方式中，货物分子是选自以下的核酸：sirna、mirna、shrna、grna、mrna、dna、dna质粒、寡核苷酸及其类似物。
[0107]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中肽进一步包括含有cktrrvp的序列的靶向序列，其中靶向序列共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的乙酰基。在一些实施方式中，靶向序列通过连接体部分连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，连接体部分选自β-丙氨酸、半胱氨酸、半胱酰胺桥、聚甘氨酸(如g2或g4)、peg连接体部分、aun(11-氨基-十一酸)、ava(5-氨基戊酸)和ahx(氨基己酸)。在一些实施方式中，细胞穿透肽是adgn-100肽或vepep-6肽。在一些实施方式中，adgn-100肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:53-70、79、80、86-91、101-104、106、110-112和121-128。在一些实施方式中，vepep-6肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:15-40、77、85、92-100、105、107-109和129-139。在一些实施方式中，细胞穿透肽包括seq id no:134或137中列出的氨基酸序列。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。在一些实施方式中，货物分子是选自以下的核酸：sirna、mirna、shrna、grna、mrna、dna、dna质粒、寡核苷酸及其类似
物。
[0108]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中肽进一步包括含有thrppnwspv的序列的靶向序列，其中靶向序列共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的乙酰基。在一些实施方式中，靶向序列通过连接体部分连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，连接体部分选自β-丙氨酸、半胱氨酸、半胱酰胺桥、聚甘氨酸(如g2或g4)、peg连接体部分、aun(11-氨基-十一酸)、ava(5-氨基戊酸)和ahx(氨基己酸)。在一些实施方式中，细胞穿透肽是adgn-100肽或vepep-6肽。在一些实施方式中，adgn-100肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:53-70、79、80、86-91、101-104、106、110-112和121-128。在一些实施方式中，vepep-6肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:15-40、77、85、92-100、105、107-109和129-139。在一些实施方式中，细胞穿透肽包括seq id no:133或138中列出的氨基酸序列。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。在一些实施方式中，货物分子是选自以下的核酸：sirna、mirna、shrna、grna、mrna、dna、dna质粒、寡核苷酸及其类似物。
[0109]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中肽进一步包括含有tgnykalhpdhng的序列的靶向序列，其中靶向序列共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的乙酰基。在一些实施方式中，靶向序列通过连接体部分连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，连接体部分选自β-丙氨酸、半胱氨酸、半胱酰胺桥、聚甘氨酸(如g2或g4)、peg连接体部分、aun(11-氨基-十一酸)、ava(5-氨基戊酸)和ahx(氨基己酸)。在一些实施方式中，细胞穿透肽是adgn-100肽或vepep-6肽。在一些实施方式中，adgn-100肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:53-70、79、80、86-91、101-104、106、110-112和121-128。在一些实施方式中，vepep-6肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:15-40、77、85、92-100、105、107-109和129-139。在一些实施方式中，细胞穿透肽包括seq id no:122或123中列出的氨基酸序列。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。在一些实施方式中，货物分子是选自以下的核酸：sirna、mirna、shrna、grna、mrna、dna、dna质粒、寡核苷酸及其类似物。
[0110]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中肽进一步包括含有carpar的序列的靶向序列，其中靶向序列共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的乙酰基。在一些实施方式中，靶向序列通过连接体部分连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，连接体部分选自β-丙氨酸、半胱氨酸、半胱酰胺桥、聚甘氨酸(如g2或g4)、peg连接体部分、aun(11-氨基-十一酸)、ava(5-氨基戊酸)和ahx(氨基己酸)。在一些实施方式中，细胞穿透肽是adgn-100肽或vepep-6肽。在一些实施方式中，adgn-100肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:53-70、79、80、86-91、101-104、106、110-112和121-128。在一些实施方式中，vepep-6肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:15-40、77、85、92-100、105、107-109和129-139。在一些实施方式中，细
胞穿透肽包括seq id no:121或139中列出的氨基酸序列。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。在一些实施方式中，货物分子是选自以下的核酸：sirna、mirna、shrna、grna、mrna、dna、dna质粒、寡核苷酸及其类似物。
[0111]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中肽进一步包括含有asslnia的序列的靶向序列，其中靶向序列共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的乙酰基。在一些实施方式中，靶向序列通过连接体部分连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，连接体部分选自β-丙氨酸、半胱氨酸、半胱酰胺桥、聚甘氨酸(如g2或g4)、peg连接体部分、aun(11-氨基-十一酸)、ava(5-氨基戊酸)和ahx(氨基己酸)。在一些实施方式中，细胞穿透肽是adgn-100肽或vepep-6肽。在一些实施方式中，adgn-100肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:53-70、79、80、86-91、101-104、106、110-112和121-128。在一些实施方式中，vepep-6肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:15-40、77、85、92-100、105、107-109和129-139。在一些实施方式中，细胞穿透肽包括seq id no:113中列出的氨基酸序列。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。在一些实施方式中，货物分子是选自以下的核酸：sirna、mirna、shrna、grna、mrna、dna、dna质粒、寡核苷酸及其类似物。
[0112]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中肽进一步包括含有lssrlda的序列的靶向序列，其中靶向序列共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的乙酰基。在一些实施方式中，靶向序列通过连接体部分连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，连接体部分选自β-丙氨酸、半胱氨酸、半胱酰胺桥、聚甘氨酸(如g2或g4)、peg连接体部分、aun(11-氨基-十一酸)、ava(5-氨基戊酸)和ahx(氨基己酸)。在一些实施方式中，细胞穿透肽是adgn-100肽或vepep-6肽。在一些实施方式中，adgn-100肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:53-70、79、80、86-91、101-104、106、110-112和121-128。在一些实施方式中，vepep-6肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:15-40、77、85、92-100、105、107-109和129-139。在一些实施方式中，细胞穿透肽包括seq id no:114中列出的氨基酸序列。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。在一些实施方式中，货物分子是选自以下的核酸：sirna、mirna、shrna、grna、mrna、dna、dna质粒、寡核苷酸及其类似物。
[0113]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中肽进一步包括含有ksydty的序列的靶向序列，其中靶向序列共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的乙酰基。在一些实施方式中，靶向序列通过连接体部分连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，连接体部分选自β-丙氨酸、半胱氨酸、半胱酰胺桥、聚甘氨酸(如g2或g4)、peg连接体部分、aun(11-氨基-十一酸)、ava(5-氨基戊酸)和ahx(氨基己酸)。在一些实施方式中，细胞穿透肽是adgn-100肽或vepep-6肽。在一些实施方式中，adgn-100肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:53-70、79、80、86-91、101-104、106、110-112和121-128。在一些实施方式中，vepep-6肽包括选自以下的氨基
酸序列：seq id no:15-40、77、85、92-100、105、107-109和129-139。在一些实施方式中，细胞穿透肽包括seq id no:116或119中列出的氨基酸序列。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。在一些实施方式中，货物分子是选自以下的核酸：sirna、mirna、shrna、grna、mrna、dna、dna质粒、寡核苷酸及其类似物。
[0114]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的货物递送复合物，所述货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中肽进一步包括含有ckrav的序列的靶向序列，其中靶向序列共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的乙酰基。在一些实施方式中，靶向序列通过连接体部分连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，连接体部分选自β-丙氨酸、半胱氨酸、半胱酰胺桥、聚甘氨酸(如g2或g4)、peg连接体部分、aun(11-氨基-十一酸)、ava(5-氨基戊酸)和ahx(氨基己酸)。在一些实施方式中，细胞穿透肽是adgn-100肽或vepep-6肽。在一些实施方式中，adgn-100肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:53-70、79、80、86-91、101-104、106、110-112和121-128。在一些实施方式中，vepep-6肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:15-40、77、85、92-100、105、107-109和129-139。在一些实施方式中，细胞穿透肽包括seq id no:117中列出的氨基酸序列。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。在一些实施方式中，货物分子是选自以下的核酸：sirna、mirna、shrna、grna、mrna、dna、dna质粒、寡核苷酸及其类似物。
[0115]
在一些实施方式中，货物递送复合物的平均直径在约20nm与约1000nm之间(如约20至约500nm、约50至约400nm、约60至约300nm、约80至约200nm、或约100至约160nm)。
[0116]
在一些实施方式中，细胞穿透肽进一步包括选自以下的一个或多个部分：乙酰基、硬脂酰基、脂肪酸、胆固醇、核定位信号、核输出信号、抗体或其抗体片段、肽和多糖，其中一个或多个部分共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，一个或多个部分通过第二连接体共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，一个或多个部分包括硬脂酰基或由硬脂酰基组成。
[0117]
在一些实施方式中，肽进一步包括选自以下的一个或多个部分：半胱酰胺、半胱氨酸、硫醇、酰胺、任选地取代的次氮基三乙酸、羧基、任选地取代的线性或分支c
1-c6烷基、伯胺或仲胺、糖苷衍生物、脂质、磷脂、脂肪酸、胆固醇、核定位信号、核输出信号、抗体、多糖和靶向序列，其中一个或多个部分共价连接到细胞穿透肽的c-末端。在一些实施方式中，一个或多个部分通过第二连接体共价连接到细胞穿透肽的c-末端。在一些实施方式中，一个或多个部分包括硬脂酰基或由硬脂酰基组成。
[0118]
在一些实施方式中，肽是反向-翻转肽。在一些实施方式中，反向-翻转肽包括seq id no:85或86的序列。
[0119]
在一些实施方式中，肽包括sed id no:1-112的序列。
[0120]
在一些实施方式中，本文所述的细胞穿透肽与一种或多种货物分子复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽与一种或多种货物分子中的至少一种非共价复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽与一种或多种货物分子中的每一种非共价复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽与一种或多种货物分子中的至少一种共价复合。在一些实施方式中，细胞穿透肽与一种或多种货物分子中的每一种共价复合。
[0121]
细胞穿透肽
[0122]
细胞穿透肽(cpp)是最有希望的非病毒性策略之一。虽然cpp的定义在不断地发展，但是它们通常被描述为衍生自蛋白质或嵌合序列的少于30个氨基酸的短肽。它们通常是两亲的并且具备净正电荷(langel u(2007)handbook of cell-penetrating peptides(crc taylor&francis,boca raton)；heitz等(2009)br j pharmacol 157,195-206)。cpp能够穿透生物膜，引发多种生物分子跨越细胞膜进入细胞质的运动和改进它们的细胞内途径，从而促进与靶标的相互作用。cpp可以被细分为两个主要类别，第一种需要与货物化学连接，而第二种涉及形成稳定的、非共价复合物。来自两种策略的cpp已经被报道有助于将许多货物(质粒dna、寡核苷酸、sirna、pna、蛋白质、肽、脂质体、纳米颗粒
…
)递送入各种细胞类型和体内模型(langel u(2007)handbook of cell-penetrating peptides(crc taylor&francis,boca raton)；heitz等(2009)br j pharmacol 157,195-206；mickan等(2014)curr pharm biotechnol 15,200-209；shukla et al.(2014)mol pharm 11,3395-3408)。
[0123]
蛋白转导结构域(ptd)的概念最初基于如下观察被提出：某些蛋白质，主要是转录因子，可以在细胞内穿梭并且从一个细胞穿梭至另一个(综述参见langel u(2007)handbook of cell-penetrating peptides(crc taylor&francis,boca raton)；heitz等(2009)br j pharmacol 157,195-206)。第一次观察由frankel和pabo在1988年完成。他们显示hiv-1的转录-反式激活(tat)蛋白可以进入细胞并且易位入细胞核。在1991年，prochiantz的团队使用果蝇触角足同源域得出了相同的结论并证明此结构域由神经细胞内化。这些工作是1994年发现第一个蛋白转导结构域的源头：源自命名为穿膜肽(penetratin)的触角足的同源域的第三螺旋的16聚-肽。在1997年，lebleu的团队鉴定了细胞摄取需要的tat的最小序列，并且ptd的体内应用的第一个概念验证由dowdy的团队报道用于递送小的肽和大的蛋白质(gump jm,和dowdy sf(2007)trends mol med 13,443-448.)。在历史上，langel的团队在1998年使用第一种嵌合肽载体transportan——其衍生自神经肽甘丙肽的n
–
末端片段，连接到黄蜂毒素(mastoparan)(一种蜂毒肽(wasp venom peptide))——的设计介绍了细胞穿透肽(cpp)的概念。transportan最初被报道为在培养的细胞和体内二者中提高pna(肽核酸)的递送(langel u(2007)handbook of cell-penetrating peptides(crc taylor&francis,boca raton))。在1997年，heitz和divita的团队提出了新的策略，其使cpp参与具有它们的货物的稳定但是非共价复合物的形成(morris等(1997)nucleic acids res 25,2730-2736)。该策略首先基于由两个结构域构成的短肽载体(mpg)：亲水性(极性)结构域和疏水性(非极性)结构域。mpg被设计用于递送核酸。一级两亲肽pep-1然后被认为用于非共价递送蛋白质和肽(morris等(2001)nat biotechnol 19,1173-1176)。然后，wender的团队和futaki的团队证明了聚精氨酸序列(arg8)足以驱使小分子和大分子进入细胞和体内(nakase等(2004)mol ther 10,1011-1022；rothbard et al.(2004)j am chem soc 126,9506-9507)。从那以后，衍生自天然或非天然序列的许多cpp已经被鉴定并且列表在不断地增加。肽已经源自单纯疱疹病毒的vp22蛋白，源自降钙素，源自抗菌肽或毒素肽，源自参与细胞周期调控的蛋白质，以及源自富含聚脯氨酸的肽(heitz et al.(2009)br j pharmacol 157,195-206)。最近，已经描述了基于二级两亲cpp的新的非共价策略。这些肽诸如cady和vepep-家族能够使用分子的不
同侧上的亲水和疏水残基以螺旋形状自组装。wo2014/053879公开了vepep-3肽；wo2014/053881公开了vepep-4肽；wo2014/053882公开了vepep-5肽；wo2012/137150公开了vepep-6肽；wo2014/053880公开了vepep-9肽；wo 2016/102687公开了adgn-100肽；us2010/0099626公开了cady肽；以及美国专利号7,514,530公开了mpg肽；其公开内容特此通过引用以其整体并入本文。
[0124]
本发明的货物递送复合物或纳米颗粒中的细胞穿透肽能够与各种货物形成稳定的复合物和纳米颗粒。本文所述的任何货物递送复合物或纳米颗粒中的任何细胞穿透肽都可以包括本节描述的任何细胞穿透肽序列或由本节描述的任何细胞穿透肽序列组成。
[0125]
在一些实施方式中，本文所述的货物递送复合物或纳米颗粒包括选自以下的细胞穿透肽：cady、pep-1、pep-2、mpg、vepep-3肽(在本文中可与adgn-103肽互换使用)、vepep-4肽(在本文中可与adgn-104肽互换使用)、vepep-5肽(在本文中可与adgn-105肽互换使用)、vepep-6肽(在本文中可与adgn-106肽互换使用)、vepep-9肽(在本文中可与adgn-109肽互换使用)、和adgn-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽存在于货物递送复合物中。在一些实施方式中，细胞穿透肽存在于货物递送复合物中，存在于纳米颗粒的核中。在一些实施方式中，细胞穿透肽存在于纳米颗粒的核中。在一些实施方式中，细胞穿透肽存在于纳米颗粒的核中并且与货物分子结合。在一些实施方式中，细胞穿透肽存在于纳米颗粒的中间层中。在一些实施方式中，细胞穿透肽存在于纳米颗粒的表层中。在一些实施方式中，细胞穿透肽连接到靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。在一些实施方式中，共价键合是通过化学偶联实现的。在一些实施方式中，共价键合是通过遗传方法实现的。wo2014/053879公开了vepep-3肽；wo2014/053881公开了vepep-4肽；wo2014/053882公开了vepep-5肽；wo2012/137150公开了vepep-6肽；wo2014/053880公开了vepep-9肽；wo 2016/102687公开了adgn-100肽；us2010/0099626公开了cady肽；以及美国专利号7,514,530公开了mpg肽；其公开内容特此通过引用以其整体并入本文。
[0126]
vepep-3肽
[0127]
在一些实施方式中，本文所述的货物递送复合物或纳米颗粒包括vepep-3细胞穿透肽，vepep-3细胞穿透肽包括氨基酸序列x1x2x3x4x5x2x3x4x6x7x3x8x9x
10
x
11
x
12
x
13
(seq id no:1)，其中x1为β-a或s，x2为k、r或l(彼此独立)，x3为f或w(彼此独立)，x4为f、w或y(彼此独立)，x5为e、r或s，x6为r、t或s，x7为e、r或s，x8为无、f或w，x9为p或r，x
10
为r或l，x
11
为k、w或r，x
12
为r或f，并且x
13
为r或k。在一些实施方式中，vepep-3肽包括氨基酸序列x1x2wx4ex2wx4x6x7x3prx
11
rx
13
(seq id no:2)，其中x1为β-a或s，x2为k、r或l，x3为f或w，x4为f、w或y，x5为e、r或s，x6为r、t或s，x7为e、r或s，x8为无、f或w，x9为p或r，x
10
为r或l，x
11
为k、w或r，x
12
为r或f，并且x
13
为r或k。在一些实施方式中，vepep-3肽包括氨基酸序列x1kwferwfrewprkrr(seq id no:3)、x1kwwerwwrewprkrr(seq id no:4)，x1kwwerwwrewprkrk(seq id no:5)、x1rwwekwwtrwprkrk(seq id no:6)、或x1rwyekwytefprrrr(seq id no:7)，其中x1为β-a或s。在一些实施方式中，vepep-3肽包括seq id no:1-7中任一个的氨基酸序列，其中通过将第10位的氨基酸替换为非天然氨基酸，在第2位和第3位的氨基酸之间添加非天然氨基酸，并在这两个非天然氨基酸之间添加烃键合来修饰细胞穿透肽。在一些实施方式中，vepep-3肽包括氨基酸序列x1kx
14
wwerwwrx
14
wprkrk(seq id no:8)，其中x1为β-a或s，x
14
为非天然氨基酸，并且其中两
x1lwralwrllrnlwrllwka-半胱酰胺(seq id no:31)，其中x1为β-a或s。在一些实施方式中，vepep-6肽包括seq id no:15-31中任一个的氨基酸序列，进一步包括第8位和第12位的两个残基之间的烃键合。在一些实施方式中，vepep-6肽包括选自以下的氨基酸序列：ac-x1lfralwrsllrsslwrllwk-半胱酰胺(seq id no:32)、ac-x1lflarwrsllrsslwrllwk-半胱酰胺(seq id no:33)、ac-x1lfralwssllrsslwrllwk-半胱酰胺(seq id no:34)、ac-x1lflarwssllrsslwrllwk-半胱酰胺(seq id no:35)、ac-x1lfralwrllrsslwssllwk-半胱酰胺(seq id no:36)、ac-x1lflarwrllrsslwssllwk-半胱酰胺(seq id no:37)、ac-x1lfralwrllssslwssllwk-半胱酰胺(seq id no:38)、ac-x1lflarwrllssslwssllwk-半胱酰胺(seq id no:39)、ac-x1lfarslwrllrsslwrllwk-半胱酰胺(seq id no:40)，其中x1为β-a或s，并且其中后面带下标“s”的残基是被所述烃键合连接的残基。在一些实施方式中，vepep-6肽包括seq id no:77的氨基酸序列。在一些实施方式中，vepep-6肽包括seq id no:85的氨基酸序列。在一些实施方式中，vepep-6肽包括seq id no:92或93的氨基酸序列。在一些实施方式中，vepep-6肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:94-100、105、107-109和129-139。在一些实施方式中，vepep-6肽存在于货物递送复合物中。在一些实施方式中，vepep-6肽存在于货物递送复合物中，在纳米颗粒的核中。在在一些实施方式中，vepep-6肽存在于纳米颗粒的核中。在一些实施方式中，vepep-6肽存在于纳米颗粒的核中并且与货物结合。在一些实施方式中，vepep-6肽存在于纳米颗粒的中间层中。在一些实施方式中，vepep-6肽存在于纳米颗粒的表层中。在一些实施方式中，vepep-6肽连接到靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。在一些实施方式中，共价键合是通过化学偶联实现的。在一些实施方式中，共价键合是通过遗传方法实现的。
[0130]
vepep-9肽
[0131]
在一些实施方式中，本文所述的货物递送复合物或纳米颗粒包括vepep-9细胞穿透肽，vepep-9细胞穿透肽包括氨基酸序列x1x2x3wwx4x5wax6x3x7x8x9x
10
x
11
x
12
wx
13
r(seq id no:41)，其中x1为β-a或s，x2为l或无，x3为r或无，x4为l、r或g，x5为r、w或s，x6为s、p或t，x7为w或p，x8为f、a或r，x9为s、l、p或r，x
10
为r或s，x
11
为w或无，x
12
为a、r或无，并且x
13
为w或f，并且其中如果x3为无，则x2、x
11
和x
12
也为无。在一些实施方式中，vepep-9肽包括氨基酸序列x1x2rwwlrwax6rwx8x9x
10
wx
12
wx
13
r(seq id no:42)，其中x1为β-a或s，x2为l或无，x6为s或p，x8为f或a，x9为s、l或p，x
10
为r或s，x
12
为a或r，并且x
13
为w或f。在一些实施方式中，vepep-9肽包括选自以下的氨基酸序列：x1lrwwlrwasrwfsrwawwr(seq id no:43)、x1lrwwlrwasrwasrwawfr(seq id no:44)、x1rwwlrwasrwalswrwwr(seq id no:45)、x1rwwlrwasrwflswrwwr(seq id no:46)、x1rwwlrwaprwfpswrwwr(seq id no:47)和x1rwwlrwasrwapswrwwr(seq id no:48)，其中x1为β-a或s。在一些实施方式中，vepep-9肽包括氨基酸序列x1wwx4x5wax6x7x8rx
10
wwr(seq id no:49)，其中x1为β-a或s，x4为r或g，x5为w或s，x6为s、t或p，x7为w或p，x8为a或r，并且x
10
为s或r。在一些实施方式中，vepep-9肽包括选自以下的氨基酸序列：x1wwrwwaswarswwr(seq id no:50)、x1wwgswatprrrwwr(seq id no:51)和x1wwrwwapwarswwr(seq id no:52)，其中x1为β-a或s。在一些实施方式中，vepep-9肽包括seq id no:78中列出的氨基酸序列。在一些实施方式中，vepep-9肽包括选自seq id no:116-120的氨基酸序列。在一些实施方式中，vepep-9肽存在于货物递送复合物中。在一些实施方式中，vepep-9肽存在于货物递送复合物中，在纳米颗粒的核中。在一些实施方式中，
vepep-9肽存在于纳米颗粒的核中。在一些实施方式中，vepep-9肽存在于纳米颗粒的核中并且与货物结合。在一些实施方式中，vepep-9肽存在于纳米颗粒的中间层中。在一些实施方式中，vepep-9肽存在于纳米颗粒的表层中。在一些实施方式中，vepep-9肽连接到靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。在一些实施方式中，共价键合是通过化学偶联实现的。在一些实施方式中，共价键合是通过遗传方法实现的。
[0132]
adgn-100肽
[0133]
在一些实施方式中，本文所述的货物递送复合物或纳米颗粒包括adgn-100细胞穿透肽，adgn-100细胞穿透肽包括氨基酸序列x1kwrsx2x3x4rwrlwrx5x6x7x8sr(seq id no:53)，其中x1为任何氨基酸或无，且x
2-x8为任何氨基酸。在一些实施方式中，adgn-100肽包括氨基酸序列x1kwrsx2x3x4rwrlwrx5x6x7x8sr(seq id no:54)，其中x1为βa、s或无，x2为a或v，x3为或l，x4为w或y，x5为v或s，x6为r、v或a，x7为s或l，并且x8为w或y。在一些实施方式中，adgn-100肽包括氨基酸序列kwrsagwrwrlwrvrswsr(seq id no:55)、kwrsalyrwrlwrvrswsr(seq id no:56)、kwrsalyrwrlwrsrswsr(seq id no:57)或kwrsalyrwrlwrsalysr(seq id no:58)。在一些实施方式中，adgn-100肽包括由三个或六个通过烃键合连接的残基隔开的两个残基。在一些实施方式中，adgn-100肽包括氨基酸序列kwrssagwrswrlwrvrswsr(seq id no:59)、kwrssagwrwrslwrvrswsr(seq id no:60)、kwrsagwrswrlwrvrsswsr(seq id no:61)、kwrssalyrswrlwrsrswsr(seq id no:62)、kwrssalyrwrslwrsrswsr(seq id no:63)、kwrsalyrswrlwrsrsswsr(seq id no:64)、kwrsalyrwrslwrssrswsr(seq id no:65)，kwrsalyrwrlwrssrswssr(seq id no:66)、kwrssalyrwrslwrsalysr(seq id no:67)、kwrssalyrswrlwrsalysr(seq id no:68)、kwrsalyrwrslwrssalysr(seq id no:69)、或kwrsalyrwrlwrssalyssr(seq id no:70)，其中标有下标“s”的残基通过烃键合连接。在一些实施方式中，adgn-100肽包括seq id no:79或80中列出的氨基酸序列。在一些实施方式中，adgn-100肽包括seq id no:86中列出的氨基酸序列。在一些实施方式中，adgn-100肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:87-91、101-104、106、110-112和121-128。在一些实施方式中，adgn-100肽存在于货物递送复合物中。在一些实施方式中，adgn-100肽存在于货物递送复合物中，在纳米颗粒的核中。在一些实施方式中，adgn-100肽存在于纳米颗粒的核中。在一些实施方式中，adgn-100肽存在于纳米颗粒的核中并且与货物结合。在一些实施方式中，adgn-100肽存在于纳米颗粒的中间层中。在一些实施方式中，adgn-100肽存在于纳米颗粒的表层中。在一些实施方式中，adgn-100肽连接到靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。在一些实施方式中，共价键合是通过化学偶联实现的。在一些实施方式中，共价键合是通过遗传方法实现的。
[0134]
vepep-4肽
[0135]
在一些实施方式中，本文所述的基因组编辑复合物或纳米颗粒包括vepep-4细胞穿透肽，vepep-4细胞穿透肽包括氨基酸序列xwxrlxxxxxx(seq id no:140)，其中第1位的x为β-a或s；第3位、第9位和第10位的x彼此独立地为w或f；如果第8位的x为s，则第6位的x为r；并且如果第8位的x为r，则第6位的x为s；第7位的x为l或无；第11位的x为r或无，并且如果第11位的x为无，则第7位的x为l。在一些实施方式中，vepep-4肽包括seq id no:141-144中任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，vepep-4肽存在于货物递送复合物中。在一些实施方式中，vepep-4肽存在于货物递送复合物中，在纳米颗粒的核中。在一些实施方式中，
vepep-4肽存在于纳米颗粒的核中。在一些实施方式中，vepep-4肽存在于纳米颗粒的核中并且与货物结合。在一些实施方式中，vepep-4肽存在于纳米颗粒的中间层中。在一些实施方式中，vepep-4肽存在于纳米颗粒的表层中。在一些实施方式中，vepep-4肽连接到靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。在一些实施方式中，共价键合是通过化学偶联实现的。在一些实施方式中，共价键合是通过遗传方法实现的。
[0136]
vepep-5肽
[0137]
在一些实施方式中，本文所述的基因组编辑复合物或纳米颗粒包括vepep-5细胞穿透肽，vepep-5细胞穿透肽包括氨基酸序列rxwxrlwxrlr(seq id no:145)，其中第2位的x为r或s；并且第4位和第8位的x彼此独立地为w或f。在一些实施方式中，vepep-5肽包括seq id no:146-151中任一个的氨基酸序列。在一些实施方式中，vepep-5肽存在于货物递送复合物中。在一些实施方式中，vepep-5肽存在于货物递送复合物中，在纳米颗粒的核中。在一些实施方式中，vepep-5肽存在于纳米颗粒的核中。在一些实施方式中，vepep-5肽存在于纳米颗粒的核中并且与货物结合。在一些实施方式中，vepep-5肽存在于纳米颗粒的中间层中。在一些实施方式中，vepep-5肽存在于纳米颗粒的表层中。在一些实施方式中，vepep-5肽连接到靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。在一些实施方式中，共价键合是通过化学偶联实现的。在一些实施方式中，共价键合是通过遗传方法实现的。
[0138]
在一些实施方式中，本文所述的cpp(例如，pep-1、pep-2、vepep-3肽、vepep-6肽、vepep-9肽、或adgn-100肽)进一步包括连接到cpp的n-末端的一个或多个部分。在一些实施方式中，一个或多个部分共价连接到cpp的n-末端。在一些实施方式中，一个或多个部分选自乙酰基、硬脂酰基、脂肪酸、胆固醇、聚乙二醇、核定位信号、核输出信号、抗体或其抗体片段、肽、多糖、和靶向分子。在一些实施方式中，一个或多个部分是乙酰基和/或硬脂酰基。在一些实施方式中，cpp包括连接到其n-末端的乙酰基和/或硬脂酰基。在一些实施方式中，cpp包括连接到其n-末端的乙酰基。在一些实施方式中，cpp包括连接到其n-末端的硬脂酰基。在一些实施方式中，cpp包括共价连接到其n-末端的乙酰基和/或硬脂酰基。在一些实施方式中，cpp包括共价连接到其n-末端的乙酰基。在一些实施方式中，cpp包括共价连接到其n-末端的硬脂酰基。
[0139]
在一些实施方式中，本文所述的cpp(例如，pep-1、pep-2、vepep-3肽、vepep-6肽、vepep-9肽、或adgn-100肽)进一步包括连接到cpp的c-末端的一个或多个部分。在一些实施方式中，一个或多个部分共价连接到cpp的c-末端。在一些实施方式中，一个或多个部分选自半胱酰胺基、半胱氨酸、硫醇、酰胺、氮基三乙酸、羧基、线性或分支c
1-c6烷基、伯胺或仲胺、糖苷衍生物、脂质、磷脂、脂肪酸、胆固醇、聚乙二醇、核定位信号、核输出信号、抗体或其抗体片段、肽、多糖、和靶向分子。在一些实施方式中，一个或多个部分是半胱酰胺基。在一些实施方式中，cpp包括连接到其c-末端的半胱酰胺基。在一些实施方式中，cpp包括共价连接到其c-末端的半胱酰胺基。
[0140]
在一些实施方式中，本文所述的cpp(例如，pep-1、pep-2、vepep-3肽、vepep-6肽、vepep-9肽、或adgn-100肽)是u型钉式的(stapled)。本文所用的“u型钉式”是指化学键合在肽中两个残基之间。在一些实施方式中，cpp是u型钉式的，其包括在肽的两个氨基酸之间的化学键合。在一些实施方式中，通过化学键合连接的两个氨基酸被3或6个氨基酸隔开。在一些实施方式中，通过化学键合连接的两个氨基酸被3个氨基酸隔开。在一些实施方式中，通
过化学键合连接的两个氨基酸被6个氨基酸隔开。在一些实施方式中，通过化学键合连接的两个氨基酸中的每一个都是r或s。在一些实施方式中，通过化学键合连接的两个氨基酸中的每一个都是r。在一些实施方式中，通过化学键合连接的两个氨基酸中的每一个都是s。在一些实施方式中，通过化学键合连接的两个氨基酸中的一个是r，而另一个是s。在一些实施方式中，化学键合是烃键合。
[0141]
在一些实施方式中，cpp是包括l-氨基酸的l-肽。在一些实施方式中，cpp是反向-翻转肽(例如，由d-氨基酸以反向序列组成的肽，当被延伸时，呈现的侧链拓扑与其母体分子的侧链拓扑相似，但具有翻转的酰胺肽键)。
[0142]
在一些实施方式中，本文所述的cpp(例如，pep-1、pep-2、vepep-3肽、vepep-6肽、vepep-9肽、或adgn-100肽)进一步包括一个或多个部分。在一些实施方式中，一个或多个部分与cpp的n-末端或c-末端缀合。在一些实施方式中，第一部分与cpp的n-末端缀合，而第二部分与cpp的c-末端缀合。
[0143]
在一些实施方式中，一个或多个部分包括靶向分子。在一些实施方式中，靶向分子与cpp的n-末端或c-末端缀合。在一些实施方式中，第一靶向分子与cpp的n-末端缀合，而第二靶向分子与cpp的c-末端缀合。在一些实施方式中，靶向分子包括至少约3、4或5个氨基酸。在一些实施方式中，靶向分子包括不多于约8、7、6、5或4个氨基酸。在一些实施方式中，靶向分子包括约3、4或5个氨基酸。在一些实施方式中，靶向分子包括选自以下的序列：gy、yv、vs、sk、gyv、yvs、vsk、gyvs、yvsk、yi、ig、gs、sr、yig、igs、gsr、yigs、igsr。在一些实施方式中，序列(例如，靶向序列)选自gyvsk、gyvs、yigs和yigsr。
[0144]
在一些实施方式中，序列(例如，靶向序列)选自seq id no:152-162。
[0145]
在一些实施方式中，靶向分子通过连接体与cpp缀合。在一些实施方式中，连接体包括聚甘氨酸连接体。在一些实施方式中，连接体包括β-丙氨酸。在一些实施方式中，连接体包括至少约两个、三个或四个甘氨酸，任选地连续甘氨酸。在一些实施方式中，连接体进一步包括丝氨酸。在一些实施方式中，连接体包括ggggs或sgggg序列。在一些实施方式中，连接体包括甘氨酸-β-丙氨酸基序。
[0146]
在一些实施方式中，一个或多个部分包括聚合物(例如，peg、聚赖氨酸、pet)。在一些实施方式中，聚合物与cpp的n-末端或c-末端缀合。在一些实施方式中，第一聚合物与cpp的n-末端缀合，而第二聚合物与cpp的c-末端缀合。在一些实施方式中，聚合物是peg。在一些实施方式中，peg是线性peg。在一些实施方式中，peg是支化peg。在一些实施方式中，peg的分子量不多于约5kda、10kda、15kda、20kda、30kda或40kda。在一些实施方式中，peg的分子量为至少约5kda、10kda、15kda、20kda、30kda或40kda。在一些实施方式中，peg的分子量为约5kda至约10kda、约10kda至约15kda、约15kda至约20kda、约20kda至约30kda、或约30kda至约40kda。在一些实施方式中，peg的分子量约为5kda、10kda、20kda或40kda。在一些实施方式中，peg的分子量选自5kda、10kda、20kda或40kda。在一些实施方式中，peg的分子量为约5kda。在一些实施方式中，peg的分子量为约10kda。在一些实施方式中，peg包括至少约1、2或3个乙二醇单元。在一些实施方式中，peg包括不多于约3、2或1个乙二醇单元。在一些实施方式中，peg包括约1、2或3个乙二醇单元。
[0147]
靶向部分
[0148]
在一些实施方式中，细胞穿透肽包括靶向部分。在一些实施方式中，靶向部分与
cpp的n-末端缀合。在一些实施方式中，靶向部分与cpp的c-末端缀合。在一些实施方式中，第一靶向部分与cpp的n-末端缀合，而第二靶向部分与cpp的c-末端缀合。
[0149]
在一些实施方式中，靶向部分包括靶向一个或多个器官的靶向肽。在一些实施方式中，一个或多个器官选自肌肉、心脏、脑、脾、淋巴结、肝、肺和肾。在一些实施方式中，靶向肽靶向脑。在一些实施方式中，靶向肽靶向肌肉。在一些实施方式中，靶向肽靶向心脏。
[0150]
在一些实施方式中，靶向部分包括至少约3、4或5个氨基酸。在一些实施方式中，靶向部分包括不多于约8、7、6、5或4个氨基酸。在一些实施方式中，靶向部分包括约3、4或5个氨基酸。在一些实施方式中，靶向部分包括选自以下的序列：gy、yv、vs、sk、gyv、yvs、vsk、gyvs、yvsk、yi、ig、gs、sr、yig、igs、gsr、yigs、igsr。在一些实施方式中，序列(例如，靶向序列)选自gyvsk、gyvs、yigs和yigsr。
[0151]
在一些实施方式中，靶向部分包括选自seq id no:152-162的靶向序列。在一些实施方式中，靶向部分包括靶向序列sytsstm(seq id no:152)。在一些实施方式中，靶向部分包括靶向序列cktrrvp(seq id no:153)。在一些实施方式中，靶向部分包括靶向序列thrppnwspv(seq id no:154)。在一些实施方式中，靶向部分包括靶向序列tgnykalhpdhng(seq id no:155)。在一些实施方式中，靶向部分包括靶向序列carpar(seq id no:156)。在一些实施方式中，靶向部分包括靶向序列asslnia(seq id no:159)。在一些实施方式中，靶向部分包括靶向序列lssrlda(seq id no:160)。在一些实施方式中，靶向部分包括靶向序列ksydty(seq id no:161)。在一些实施方式中，靶向部分包括靶向序列ckrav(seq id no:162)。
[0152]
在一些实施方式中，靶向部分通过连接体部分，如本文所述的任一个连接体部分与cpp缀合。
[0153]
连接体部分
[0154]
在一些实施方式中，细胞穿透肽包括连接体部分。
[0155]
在一些实施方式中，连接体部分包括聚甘氨酸连接体。在一些实施方式中，连接体包括β-丙氨酸。在一些实施方式中，连接体包括至少约两个、三个或四个甘氨酸，任选地连续甘氨酸。在一些实施方式中，连接体进一步包括丝氨酸。在一些实施方式中，连接体包括ggggs或sgggg序列。在一些实施方式中，连接体包括甘氨酸-β-丙氨酸基序。
[0156]
在一些实施方式中，一个或多个部分包括聚合物(例如，peg、聚赖氨酸、pet)。在一些实施方式中，聚合物与cpp的n-末端缀合。在一些实施方式中，聚合物与cpp的c-末端缀合。在一些实施方式中，第一聚合物与cpp的n-末端缀合，而第二聚合物与cpp的c-末端缀合。在一些实施方式中，聚合物是peg。在一些实施方式中，peg是线性peg。在一些实施方式中，peg是支化peg。在一些实施方式中，peg的分子量不多于约5kda、10kda、15kda、20kda、30kda或40kda。在一些实施方式中，peg的分子量为至少约5kda、10kda、15kda、20kda、30kda或40kda。在一些实施方式中，peg的分子量为约5kda至约10kda、约10kda至约15kda、约15kda至约20kda、约20kda至约30kda、或约30kda至约40kda。在一些实施方式中，peg的分子量为约5kda、10kda、20kda或40kda。在一些实施方式中，peg的分子量选自5kda、10kda、20kda或40kda。在一些实施方式中，peg的分子量为约5kda。在一些实施方式中，peg的分子量为约10kda。在一些实施方式中，peg包括至少约1、2或3个乙二醇单元。在一些实施方式中，peg由不多于约10、9、8或7个乙二醇单元组成。在一些实施方式中，peg由约1、2或3个乙
二醇单元组成。在一些实施方式中，peg部分由约一至八个，或约二至七个乙二醇单元组成。
[0157]
在一些实施方式中，连接体部分选自β-丙氨酸、半胱氨酸、半胱酰胺桥、聚甘氨酸(如g2或g4)、peg连接体部分、aun(11-氨基-十一酸)、ava(5-氨基戊酸)和ahx(氨基己酸)。在一些实施方式中，连接体部分包括aun(11-氨基-十一酸)。在一些实施方式中，连接体部分包括ava(5-氨基戊酸)。在一些实施方式中，连接体部分包括ahx(氨基己酸)。
[0158]
碳水化合物部分
[0159]
在一些实施方式中，细胞穿透肽进一步包括碳水化合物部分。在一些实施方式中，碳水化合物部分是galnac。在一些实施方式中，细胞穿透肽是adgn-106肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽是adgn-100肽。在一些实施方式中，碳水化合物部分修饰细胞穿透肽内的丙氨酸。在一些实施方式中，seq id no:124或129中列出了细胞穿透肽。
[0160]
第一细胞穿透肽和第二细胞穿透肽
[0161]
在一些实施方式中，第二肽包括与第二细胞穿透肽共价连接的聚乙二醇(peg)部分，并且第一肽不具有peg部分。在一些实施方式中，第一细胞穿透肽与第二细胞穿透肽的比为约50:1(如约25比约2、约20比约3、约15比约4、约12比约4、约12比约5、或约10比约5)。
[0162]
在一些实施方式中，peg部分是线性peg。在一些实施方式中，peg部分是支化peg。在一些实施方式中，peg部分的分子量为约5kda至约10kda。在一些实施方式中，peg部分由约一至十个乙二醇单元组成。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽的n-末端缀合。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽的c-末端缀合。
[0163]
货物分子
[0164]
在一些实施方式中，如上所述的复合物或纳米颗粒的货物分子选自核酸、病毒、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。
[0165]
在一些实施方式中，如上所述的复合物或纳米颗粒的货物分子是核酸。在一些实施方式中，货物分子选自寡核苷酸、多核苷酸、单链或双链寡核苷酸和多核苷酸、反义寡核苷酸、各种形式的rnai(包括例如sirna、shrna等)、微小rna(mirna)、antagomirs、核酶、适配体(aptamers)、质粒dna等，以及其一种或多种的适当组合。在一些实施方式中，核酸选自sirna、mirna、shrna、grna、mrna、dna、dna质粒、寡核苷酸及其类似物。在一些实施方式中，核酸包括mrna。在一些实施方式中，核酸包括rnai。在一些实施方式中，核酸包括mrna和rnai，并且其中mrna编码用于治疗疾病或状况的治疗性蛋白质，并且其中rnai靶向rna，其中rna的表达与疾病或状况相关联。在一些实施方式中，细胞穿透肽与核酸的摩尔比在约1:1与约100:1之间。
[0166]
在一些实施方式中，货物分子是蛋白质，如，例如酶或抗体，或者是小分子。在一些实施方式中，货物分子包括多个货物分子，其包括核酸与蛋白质或小分子的组合。在一些实施方式中，组合包括核酸与彼此共价连接的蛋白质或小分子。在一些实施方式中，组合包括核酸与彼此不共价连接的蛋白质或小分子。
[0167]
如本文可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任意长度的核苷酸的聚合物，并且包括dna和rna。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或它们的类似物、或通过dna或rna聚合酶可以并入聚合物的任何底物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和它们的类似物。如本文使用的术语“核酸”是指以单链或双链形式包括至少两个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物并且包括dna和rna。dna可以
是，例如，反义分子、质粒dna、预浓缩的dna、pcr产物、载体(pac、bac、yac、人工染色体)、表达盒、嵌合序列、染色体dna、或这些组的衍生物和组合的形式。rna可以是sirna、非对称干扰rna(airna)、微小rna(mirna)、mrna、trna、rrna、rna、病毒rna(vrna)、和其组合的形式。核酸包括包括已知的核苷酸类似物或修饰的主链残基或键的核酸，其包括例如锁定核酸(lna)、解锁核酸(unlocked nucleic acid)(una)和拉链核酸(zip nucleic acid)(zna)，其可以是合成的、天然存在的和非天然存在的，并且其具有与参考核酸类似的结合性质。这样的类似物的实例非限制性地包括硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、手性-甲基磷酸酯、2
’‑
o-甲基核糖核苷酸、和肽-核酸(pna)。除非具体地限定，否则该术语涵盖包括天然核苷酸的已知类似物——其具有与参考核酸类似的结合性质——的核酸。除非另外指示，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子置换)、等位基因、直向同源物、snp、和互补序列以及明确指示的序列。具体地，简并密码子置换可以通过生成序列实现，其中一种或多种选择的(或所有的)密码子的第三位被置换为混合碱基和/或脱氧肌苷残基(batzer等,nucleic acid res.,19:5081(1991)；ohtsuka等,j.biol.chern.,260:2605-2608(1985)；rossolini等,mol.cell.probes,8:91-98(1994))。“核苷酸”包括糖——脱氧核糖(dna)或核糖(rna)、碱基和磷酸基团。核苷酸通过磷酸基团连接在一起。“碱基”包括嘌呤和嘧啶，其进一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷、和天然类似物、和嘌呤与嘧啶的合成衍生物，其包括但不限于修饰，所述修饰放置新的活性基团，诸如，但不限于胺、醇、硫醇、羧化酶和卤代烷。如本文使用的，“寡核苷酸”通常指的是短的、一般合成的多核苷酸，其长度通常但不必然小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”不是相互排斥的。上面对多核苷酸的描述同等地和完全地适用于寡核苷酸。
[0168]
在一些实施方式中，核酸是单链寡核苷酸。在一些实施方式中，核酸是双链寡核苷酸。本文描述的核酸在反义寡核苷酸、rnai、sirna、shrna、irna、antagomirs的情况下可以是多至但不必然200个核苷酸的长度范围中的任一种，或在质粒dna的情况下可以是多至1,000,000个碱基。
[0169]
在一些实施方式中，核酸是干扰rna，如sirna或shrna。术语“干扰rna”或“rnai”或“干扰rna序列”是指当干扰rna在与靶基因或序列相同的细胞中时能够降低或抑制靶基因或序列的表达(例如，通过调节降解或抑制与干扰rna序列互补的mrna的翻译)的单链rna(例如，成熟的mirna)或双链rna(即，双链体rna，如sirna、airna或mirna前体)，因而，干扰rna是指与靶mrna序列互补的单链rna或通过两条互补链或通过一条自互补链形成的双链rna。干扰rna可以具有与靶基因或序列基本或完全的同一性，或可以包括错配区域(即，错配基序)。干扰rna的序列可以对应于全长靶基因，或其子序列。干扰rna包括“小-干扰rna”或“sirna”，例如，长度为约15-60、15-50或5-40个(双链体)核苷酸，更通常地长度为约15-30、15-25或19-25个(双链体)核苷酸，并且优选地是长度为约20-24、21-22或21-23个(双链体)核苷酸的干扰rna(例如，双链sirna的每个互补序列的长度是15-60、15-50、15-40、15-30、15-25或19-25个核苷酸，优选地约20-24、21-22或21-23个核苷酸，并且双链sirna的长度是约15-60、15-50、15-40、5-30、5-25或19-25个碱基对，优选地约8-22、9-20或19-21个碱基对)。sirna双链体可以包括约1至约4个核苷酸或约2至约3个核苷酸的3'突出端和5'磷酸末端。sirna的实例非限制性地包括由两个分离的链分子组装的双链多核苷酸分子，其中一
条链是有义链而另一条是互补反义链；由单链分子组装的双链多核苷酸分子，其中有义和反义区通过基于核酸或非基于核酸的连接体连接；具有发夹二级结构——其具有自互补的有义和反义区——的双链多核苷酸分子；和具有两个或更多个环结构和茎——其具有自互补的有义和反义区——的环状单链多核苷酸分子，其中环状多核苷酸可以被体内或体外加工以生成活性双链sirna分子。优选地，sirna是化学合成的。sirna还可以通过使用大肠杆菌rnase iii或切酶切割较长的dsrna(例如，长度大于约25个核苷酸的dsrna)生成。这些酶将dsrna加工成生物活性sirna(参见，例如，yang等,proc natl.acad.set.usa,99:9942-9947(2002)；calegari等,proc.natl.acad.sci.usa,99:14236(2002)；byrom等,ambion teehnotes,10(l):4-6(2003)；kawasaki等,nucleic acids res.,3 1:981-987(2003)；knight等,science,293:2269-2271(2001)；和robertson等,j.biol.chem.,243:82(1968))。优选地，dsrna的长度是至少50个核苷酸至约100、200、300、400或500个核苷酸。dsrna的长度可以长达1000、1500、2000、5000个核苷酸或更长。dsrna可以编码整个基因转录物或部分基因转录物。在某些情况下，sirna可以被质粒(例如，转录为自动折叠成具有发夹环的双链体的序列)编码。小发夹rna或短发夹rna(shrna)是制造紧密发夹弯(tight hairpinturn)——其可以用于经由rna干扰沉默基因表达——的rna的序列。shrna发夹结构被细胞机器切割为sirna，其然后被结合至rna-诱导的沉默复合物(risc)。此复合物结合至并且切割mrna，其匹配结合至其的sirna。干扰rna的合适的长度是约5至约200个核苷酸，或10-50个核苷酸或碱基对或15-30个核苷酸或碱基对。在一些实施方式中，干扰rna基本上互补(如至少约60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、或更多同一)于对应的靶基因。在一些实施方式中，干扰rna被修饰，例如通过并入非天然存在的核苷酸。
[0170]
在一些实施方式中，核酸是双链反义rna。干扰rna的合适的长度是约5至约200个核苷酸，或10-50个核苷酸或碱基对或15-30个核苷酸或碱基对。在一些实施方式中，干扰rna基本上互补(如至少约60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、或更多同一)于对应的靶基因。在一些实施方式中，反义rna被修饰，例如通过并入非天然存在的核苷酸。
[0171]
在一些实施方式中，核酸是干扰rna，如sirna，其特异性地靶向编码在疾病如癌症中涉及的蛋白质的rna分子，如mrna。在一些实施方式中，疾病是癌症，如实体瘤或血液学恶性肿瘤，并且干扰rna靶向编码在癌症中涉及的蛋白质——如在调控癌症的进展中涉及的蛋白质——的mrna。
[0172]
在一些实施方式中，核酸是干扰rna，如sirna，其特异性地靶向编码在负调控免疫应答中涉及的蛋白质的rna分子，如mrna。在一些实施方式中，干扰rna靶向编码阴性共刺激分子的mrna。在一些实施方式中，阴性共刺激分子包括，例如，pd-1、pd-l1、pd-l2、tim-3、btla、vista、lag-3和ctla-4。
[0173]
在一些实施方式中，核酸是mirna。微小rna(简称mirna)是在真核细胞中发现的短的核糖核酸(rna)分子。微小rna分子与其它rna相比具有非常少的核苷酸(平均22个)。mirna是结合至靶标信使rna转录物(mrna)上的互补序列的转录后调节子，其通常导致翻译阻遏或靶标降解和基因沉默。人基因组可以编码多于1000个mirna，其可以靶向约60％的哺乳动物基因并且在许多人细胞类型中丰富。mirna的合适的长度是约5至约200个核苷酸，或0-50个核苷酸或碱基对或15-30个核苷酸或碱基对。在一些实施方式中，mirna基本上互补(如至少约60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、或更多同一)于对应的靶基因。在一些
实施方式中，反义rna被修饰，例如通过并入非天然存在的核苷酸。
[0174]
在一些实施方式中，核酸是质粒dna或dna片段(例如，dna片段，例如多至约1000bp的长度的dna片段)。此外，质粒dna或dna片段可以被超甲基化或去甲基化。在一些实施方式中，质粒dna或dna片段编码一种或多种基因，并且可以包括表达所述一种或多种基因必需的调控元件。在一些实施方式中，质粒dna或dna片段可以包括编码可选择的标志物的一种或多种基因，使得在适当的宿主细胞中维持质粒dna或dna片段。
[0175]
在一些实施方式中，质粒dna包括编码嵌合抗原受体(car)——其包括与靶抗原特异性结合的细胞外抗原-结合结构域、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域——的dna序列。例如，在美国专利号8,822,647、美国专利申请公开号2015/0051266、wo 2014/127261和wo2014099671中描述了car，其公开内容通过引用以其整体具体地并入本文。在一些实施方式中，靶抗原是与癌细胞特异性相关联(如由癌细胞表达)的抗原。例如，在一些实施方式中，质粒dna包括编码car——其包括与癌症相关联抗原特异性结合的细胞外抗原-结合结构域、跨膜结构域、和细胞内信号传导结构域——的dna序列。在一些实施方式中，癌症相关联抗原与实体瘤相关联。在一些实施方式中，癌症相关联抗原与血液学恶性肿瘤如b细胞恶性肿瘤或白血病相关联。
[0176]
在一些实施方式中，货物分子包括病毒。在一些实施方式中，病毒是重组病毒，包括，包括重组腺相关联病毒(aav)、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒(hsv)、痘病毒、埃巴病毒(ebv)、痘苗病毒、和人巨细胞病毒(hcmv)。在一些实施方式中，重组病毒包括插入细胞基因组的转基因。在一些实施方式中，转基因是治疗性转基因。在一些实施方式中，转基因编码蛋白质，如治疗性蛋白质。在一些实施方式中，转基因编码抑制性rna(rnai)，如靶向内源基因的rnai，例如，疾病相关联内源基因。在一些实施方式中，转基因编码car。在一些实施方式中，病毒包括编码rnai的第一转基因。在一些实施方式中，rnai是靶向疾病或病况中涉及的内源基因的治疗性rnai。在一些实施方式中，治疗性rnai靶向内源基因的疾病相关联形式(例如，编码突变蛋白的基因或导致蛋白质异常表达的基因)。在一些实施方式中，病毒包括编码蛋白质的第二转基因。在一些实施方式中，蛋白质是用于治疗疾病或状况的治疗性蛋白质。在一些实施方式中，第二转基因是治疗形式的内源基因(例如，第二转基因编码内源基因所编码的突变蛋白质的野生型或功能形式，或者第二转基因导致内源基因所编码的蛋白质的正常表达)。在一些实施方式中，提供了包括第一转基因和第二转基因的病毒。
[0177]
在一些实施方式中，货物分子包括mrna(例如，pten)和sirna(如靶向癌基因(例如，kras)的sirna)。
[0178]
在一些实施方式中，货物分子包括mrna(如编码dna核酸酶(例如，cas9)的mrna)和指导rna(如靶向突变的癌基因(例如，kras)的指导rna)。
[0179]
基因组编辑系统
[0180]
在一些实施方式中，货物包括基因组编辑系统分子。
[0181]
在一些实施方式中，本文所述的基因组编辑复合物或纳米颗粒的基因组编辑系统分子(例如，rgen)是蛋白质或多肽。例如，在一些实施方式中，本文所述的基因组编辑复合物或纳米颗粒包括rgen(例如，cas9)。在一些实施方式中，蛋白质或多肽在约10kda与约200kda之间(如约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、
180、190和200kda中的任一个，包括这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，基因组编辑复合物或纳米颗粒包括多种蛋白质或多肽，其中所述多种蛋白质或多肽中的每一种在约10kda与约200kda之间(如约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190和200kda中的任一个，包括这些值之间的任意范围)。
[0182]
在一些实施方式中，本文所述的基因组编辑复合物或纳米颗粒的基因组编辑系统分子(例如，grna)是核酸。在一些实施方式中，核酸在约20nt与约20kb之间(如约0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、19和20kb中的任一个，包括这些值之间的任意范围)。例如，在一些实施方式中，本文所述的基因组编辑复合物或纳米颗粒包括grna(例如，cas9 grna)。在一些实施方式中，grna在约20nt与约200nt之间(如约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190和200nt中的任意一个，包括这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，核酸是dna，如编码基因组编辑系统分子的dna质粒。在一些实施方式中，dna质粒包括用于表达基因组编辑系统分子的表达盒。在一些实施方式中，dna质粒在约1kb与约20kb之间(如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20kb中的任一个，包括这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，核酸是rna，如编码基因组编辑系统分子的mrna。在一些实施方式中，mrna在约100nt与约10kb之间(如约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5和10kb中的任一个，包括这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，基因组编辑复合物或纳米颗粒包括多种核酸，如本文所述的任意核酸。例如，在一些实施方式中，基因组编辑复合物或纳米颗粒包括grna和编码基因组编辑系统分子的核酸(例如，编码基因组编辑系统分子的dna质粒或mrna)。在一些实施方式中，基因组编辑复合物或纳米颗粒包括编码多种基因组编辑系统分子的核酸(例如，编码所述多种基因组编辑系统分子的一种或多种dna质粒，或编码所述多种基因组编辑系统分子的多种mrna)。
[0183]
在一些实施方式中，本文所述的基因组编辑复合物或纳米颗粒的基因组编辑系统分子(例如，rgen或grna)被替换为编码该基因组编辑系统分子的核酸。例如，在一些实施方式中，本文所述的基因组编辑复合物或纳米颗粒包括编码rgen的核酸和/或编码grna的核酸。在一些实施方式中，核酸是dna，如编码基因组编辑系统分子的dna质粒。在一些实施方式中，dna质粒包括用于表达基因组编辑系统分子的表达盒。在一些实施方式中，dna质粒在约1kb与约20kb之间(如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、和20kb中的任一个，包括这些数值之间的任意范围)。在一些实施方式中，核酸是rna，如编码基因组编辑系统分子的mrna。在一些实施方式中，mrna在约100nt与约10kb之间(如约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、和10kb中的任一个，包括这些数值之间的任意范围)。
[0184]
在一些实施方式中，货物包括crispr相关联核酸酶。在一些实施方式中，crispr相关联核酸酶是cas核酸酶。cas蛋白的非限制性实例包括cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9(还被称为csn1和csx12)、cas10、cpf1、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx15、csf1、csf2、csf3、
csf4、其同源物、或其修饰形式，如诱导型、失活型、或脱落cas蛋白(参见例如dominguez等(2015).nature reviews molecular cell biology；polstein,l.r.,&gersbach,c.a.(2015).nature chemical biology,11(3):198-200；dow等(2015).nature biotechnology,33(4):390-394；zetsche等(2015).nature biotechnology,33(2):139-142；kleinstiver等(2015).nature.523:481
–
485；bikard等(2013).nucleic acids research,41(15):7429-7437；qi等(2013).cell,152(5):1173-1183)。这些酶是本领域技术人员已知的；例如，酿脓链球菌(s.pyogenes)cas9蛋白的氨基酸序列可在swissprot数据库中以登录号q99zw2找到，而氨基酸球菌属(acidaminococcus sp.)cpf1蛋白的氨基酸序列可在swissprot数据库中以登录号u2umq6找到。在一些实施方式中，未修饰的crispr酶具有dna切割活性，如cas9。在一些实施方式中，crispr酶是cas9，并且可以是来自酿脓链球菌或肺炎链球菌(s.pneumoniae)的cas9。在一些实施方式中，crispr酶是cpf1，并且可以是来自氨基酸球菌或毛螺菌科(lachnospiraceae)的cpf1。在一些实施方式中，crispr酶引导在靶序列位置处一条链或两条链的切割，如在靶序列内和/或在靶序列的补体内。在一些实施方式中，crispr酶引导在距靶序列第一个或最后一个核苷酸约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500、或更多个碱基对内的一条链或两条链的切割。在一些实施方式中，crispr酶被相对于对应的野生型酶突变，使得突变crispr酶不具有切割包括靶序列的靶多核苷酸的一条链或两条链的能力。例如，酿脓链球菌的cas9的ruvc i催化结构域中的天冬氨酸至丙氨酸的取代(d10a)使cas9从切割双链的核酸酶转化成切口酶(切割单链)。致使cas9成为切口酶的突变的其它实例非限制地包括h840a、n854a和n863a。在一些实施方式中，cas9切口酶可与指导序列组合使用，例如，分别靶向dna靶的有义和反义链的两个指导序列。这种组合允许双链均被切口和用于引起nhej。
[0185]
作为进一步实例，两种或更多种cas9催化结构域(ruvc i、ruvc ii和ruvc iii)可被突变以产生基本上不具有全部dna切割活性的突变cas9。在一些实施方式中，d10a突变与h840a、n854a、或n863a突变中的一种或多种组合，以产生基本上不具有全部dna切割活性的cas9酶。在一些实施方式中，在突变酶的dna切割活性相对于其非突变形式小于约25％、10％、5％、1％、0.1％、0.01％、或更低时，认为crispr酶基本上不具有全部dna切割活性。其它突变可以是有用的；在cas9或其它crispr酶来自酿脓链球菌以外的物种时，可进行对应氨基酸的突变以实现类似的效果。
[0186]
在一些实施方式中，cas蛋白(如cas9)是脱落cas蛋白，其包括n-末端cas蛋白片段cas(n)和c-末端cas蛋白片段cas(c)，其中cas(n)融合于第一二聚结构域(dimerization domain)，并且cas(c)融合于第二二聚结构域，并且其中第一和第二二聚结构域促进cas(n)和cas(c)二聚，以形成具有功能性cas核酸酶活性的复合物。在一些实施方式中，第一和第二二聚结构域的二聚对二聚剂敏感。例如，在一些实施方式中，第一和第二二聚结构域包括fk506结合蛋白12(fkbp)和哺乳动物雷帕霉素靶标(mtor)的fkbp雷帕霉素结合(frb)结构域，并且二聚剂是雷帕霉素。
[0187]
在一些实施方式中，编码crispr酶的酶编码序列是针对特定细胞如真核细胞中的表达优化的密码子。真核细胞可以属于或衍生自特定生物体，如哺乳动物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、狗、或非人灵长类。总体上，密码子优化指代为增强目标宿主细胞中的表达而修饰核酸序列的过程，该修饰通过下列进行：在维持天然氨基酸序列的同时，将天然序
列的至少一个密码子(例如，约或多于约1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、或更多个密码子)替换成更常或最常用于宿主细胞基因的密码子。各种物种展现出对特定氨基酸的某些密码子的特定偏好。密码子偏好(生物体之间的密码子使用差异)通常与信使rna(mrna)的翻译效率有关，其进而被认为取决于被翻译密码子的性质和特定转运rna(trna)分子的可利用性。被选择的trna在细胞中的占优总体上是最常用于肽合成的密码子的体现。因此，可基于密码子优化来修整基因，以在给定生物体中最佳基因表达。密码子使用表是可容易获得的，例如，在“密码子使用数据库(codon usage database)”，并且这些表可以多种方式被采用。参见nakamura,y.,等“codon usage tabulated from the international dna sequence databases:status for the year 2000”nucl.acids res.28:292(2000)。优化在特定宿主细胞中表达的特定序列的密码子计算机算法也是可获得的，如gene forge(aptagen；jacobus,pa.)也是可获得的。在一些实施方式中，编码crispr酶的序列中的一个或多个密码子(例如，1、2、3、4、5、10、15、20、25、50或更多个或全部密码子)对应于特定氨基酸的最常用密码子。
[0188]
在一些实施方式中，crispr酶包括一个或多个核定位序列(nls)，如约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多个nls。在一些实施方式中，crispr酶包括在氨基端处或附近的约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多个nls，在羧基端处或附近的约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多个nls、或其组合(例如，在氨基端处的一个或多个nls和在羧基端处的一个或多个nls)。当多于1个nls存在时，各nls可彼此独立地被选择，使得单个nls可在多于一个拷贝中存在，和/或与一个或多个其它nls组合在一个或多个拷贝中存在。在一些实施方式中，crispr酶包括至多6个nls。在一些实施方式中，当nls的最近氨基酸在沿多肽链距n-末端或c-末端约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50、或更多个氨基酸之内时，认为nls在n-末端或c-末端附近。一般地，nls由一个或多个暴露于蛋白质表面上的带正电荷的赖氨酸或精氨酸的短序列组成，但其它类型的nls是已知的。nls的非限制性实例包括衍生自以下的nls序列：sv40病毒大t-抗原的nls，具有氨基酸序列pkkkrkv；来自核质蛋白的nls(例如，核质蛋白二分nls，具有序列krpaatkkagqakkkk)；c-myc nls，具有氨基酸序列paakrvkld或rqrrnelkrsp；hrnpa1 m9 nls，具有序列nqssnfgpmkggnfggrssgpyggggqyfakprnqggy；来自输入蛋白-α的ibb结构域的序列rmrizfknkgkdtaelrrrrvevsvelrkakkdeqilkrrnv；肌瘤t蛋白的序列vsrkrprp和ppkkared；人p53的序列pqpkkkpl；小鼠c-ab1 iv的序列salikkkkkmap；流感病毒ns1的序列drlrr和pkqkkrk；肝炎病毒δ抗原的序列rklkkkikkl；小鼠mx1蛋白的序列rekkkflkrr；人聚(adp-核糖)聚合酶的序列krkgdevdgvdevakkkskk；和类固醇激素受体(人)糖皮质激素的序列rkclqagmnlearktkk。
[0189]
一般来说，指导序列是与靶多核苷酸序列具有充分互补性以与靶序列杂交和引导crispr复合物与靶序列的序列特异性结合的任何多核苷酸序列。在一些实施方式中，在利用适当的比对算法最佳比对时，指导序列和其对应靶序列之间的互补程度是约或多于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％、或更高。最佳比对可通过利用任何适于比对序列的算法来确定，其非限制性实例包括smith-waterman算法、needleman-wunsch算法、基于burrows-wheeler变换的算法(例如，burrows wheeler比对器)、clustalw、clustal x、blat、novoalign(novocraft technologies,eland(illumina,san diego,calif.)、soap(可在soap.genomics.org.cn获得)和maq(可在maq.sourceforge.net
获得)。在一些实施方式中，指导序列的长度是约或多于约5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75、或更多个核苷酸。在一些实施方式中，指导序列的长度小于约75、50、45、40、35、30、25、20、15、12、或更少个核苷酸。指导序列引导crispr复合物与靶序列的序列特异性结合的能力可通过任何适当的测定来评估。例如，足以形成crispr复合物的crispr系统的组分——包括待测试的指导序列——可被提供给具有对应靶序列的宿主细胞，然后评估靶序列内的优先切割，如通过本文描述的surveyor测定。类似地，靶多核苷酸序列的切割可在测试管中通过以下来评价：提供靶序列、crispr复合物组分——包括测试指导序列和不同于测试指导序列的对照指导序列；和比较测试和对照指导序列反应之间在靶序列处的结合或切割率。其它测定也是可能的，并且将被本领域技术人员想到。
[0190]
指导序列可被选择以靶向任何靶序列。在一些实施方式中，靶序列是细胞基因组中的序列。示例性靶序列包括靶基因组中独特的那些序列。在一些实施方式中，指导序列被选择以降低指导序列中二级结构的程度。二级结构可通过任何适当的多核苷酸折叠算法来确定。一些程序基于计算最小吉布斯自由能。一种这种算法的实例是mfold，如zuker和stiegler(nucleic acids res.9(1981),133-148)所述。另一实例折叠算法是在线网络服务器rna折叠，其在维也纳大学的理论化学研究所(institute for theoretical chemistry)被开发，利用了质心结构预测算法(参见例如，a.r.gruber等,2008,cell 106(1):23-24；和p a carr与g m church,2009,nature biotechnology 27(12):1151-62)。进一步算法可在美国申请序列号61/836,080中找到；该申请通过引用并入本文。
[0191]
总体上，tracr配偶序列包括与tracr序列具有充分互补性以促进以下一项或多项的任意序列：(1)包括对应tracr序列的细胞中侧接tracr配偶序列的指导序列的切除；和(2)crispr复合物在靶序列处的形成，其中crispr复合物包括杂交至tracr序列的tracr配偶序列。总体上，互补程度参考tracr配偶序列和tracr序列沿这两个序列中较短者的长度的最佳比对。最佳比对可通过任何适当的比对算法确定，并且可进一步解释二级结构，如tracr序列或tracr配偶序列内的自互补性。在一些实施方式中，在最佳比对时，tracr序列和tracr配偶序列之间沿这两者中的较短者的长度的互补程度是约或多于约25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％、或更高。在一些实施方式中，tracr序列的长度是约或多于约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、或更多个核苷酸。在一些实施方式中，指导序列、tracr序列和tracr配偶序列被包括在单rna(在本文中被称为“单指导rna”或“sgrna”)中，使得tracr序列和tracr配偶序列之间的杂交产生二级结构，如发夹。用于发夹结构的优选成环序列的长度是四个核苷酸，并且最优选具有序列gaaa。然而，可使用更长或更短的环序列作为可选的序列。该序列优选包括核苷酸三联体(例如，aaa)，和另外的核苷酸(例如c或g)。成环序列的实例包括caaa和aaag。在本发明的实施方式中，sgrna具有至少两个或更多个发夹。在优选的实施方式中，sgrna具有两个、三个、四个或五个发夹。在本发明的进一步实施方式中，sgrna具有至多五个发夹。在一些实施方式中，sgrna进一步包括转录终止序列；优选地，这是聚t序列，例如六个t核苷酸。
[0192]
在一些实施方式中，还提供了供体核酸。在一些实施方式中，供体核酸被设计以在同源重组中充当模板，如在被crispr酶(作为crispr复合物的一部分)切开或切割的靶序列之内或附近。供体核酸可以具有任何适当的长度，如约或多于约10、15、20、25、50、75、100、
150、200、500、1000、或更多个核苷酸的长度。在一些实施方式中，供体核酸包括与包括靶序列的多核苷酸的部分互补的序列。在一些实施方式中，当供体核酸和包括靶序列的多核苷酸最佳比对时，供体核酸与靶序列的一个或多个核苷酸重叠(例如，约或多于约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多个核苷酸)。在一些实施方式中，当供体核酸和包括靶序列的多核苷酸最佳比对时，互补区域中供体核酸的最近核苷酸在距靶序列约1、5、10、15、20、25、50、75、100、200、300、400、500、1000、5000、10000、或更多个核苷酸之内。
[0193]
在一些实施方式中，crispr酶是包括一个或多个异源蛋白质结构域(例如，除crispr酶以外约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多个结构域)的融合蛋白的一部分。crispr酶融合蛋白可包括任何另外的蛋白质序列和任选地，任意两个结构域之间连接体序列。可融合于crispr酶的蛋白质结构域的实例非限制地包括表位标签、报告基因序列、和具有下列一种或多种活性的蛋白质结构域：甲基化酶活性、去甲基化酶活性、转录激活活性、转录抑制活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、rna切割活性、和核酸结合活性。表位标签的非限制性实例包括组氨酸(his)标签、v5标签、flag标签、流感血凝素(ha)标签、myc标签、vsv-g标签、和硫氧还蛋白(trx)标签。报告基因的实例包括，但不限于，谷胱甘肽s转移酶(gst)、辣根过氧化物酶(hrp)、氯霉素乙酰转移酶(cat)β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、萤光素酶、绿色荧光蛋白(gfp)、hcred、dsred、青色荧光蛋白(cfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、和自体荧光蛋白——包括蓝色荧光蛋白(bfp)。crispr酶可融合于编码以下蛋白质或蛋白质片段的基因序列：结合dna分子或结合其它细胞分子，包括但不限于麦芽糖结合蛋白(mbp)、s-标签、lex a dna结合结构域(dbd)融合体、gal4 dna结合结构域融合体、和单纯疱疹病毒(hsv)bp16蛋白融合体。可构成包括crispr酶的融合蛋白的部分的其它结构域描述于us20110059502，其通过引用并入本文。在一些实施方式中，带标签的crispr酶用于识别靶序列的位置。
[0194]
在一些实施方式中，货物包括融合蛋白，所述融合蛋白包括催化上失活的(catalytically disabled)核酸酶(如催化上失活的cas9核酸内切酶)和逆转录酶(如m-mlv逆转录酶的五突变体(pentamutant))。参见例如，anzalone&liu et al.,nature.2019dec；576(7785):149-157。在一些实施方式中，货物包括编码融合蛋白的多核苷酸。
[0195]
在一些实施方式中，货物包括融合蛋白，所述融合蛋白包括催化上失活的核酸酶(如催化上失活的cas9核酸内切酶)和核碱基脱氨酶。在一些实施方式中，核碱基脱氨酶是apobec1胞苷脱氨酶。在一些实施方式中，核碱基脱氨酶是胞苷脱氨酶cda1。在一些实施方式中，融合蛋白进一步包括dna糖基化酶抑制剂。在一些实施方式中，dna糖基化酶抑制剂是尿嘧啶dna糖基化酶抑制剂(ugi)。在一些实施方式中，货物包括编码融合蛋白的多核苷酸。
[0196]
mrna
[0197]
在一些实施方式中，货物包括mrna。示例性mrna编码选自几种靶类别中的任意种的感兴趣的多肽，靶类别包括但不限于生物制品、抗体、疫苗、治疗性蛋白质或肽、细胞穿透肽、分泌蛋白、质膜蛋白、胞质或细胞主链蛋白、细胞内膜结合蛋白、核蛋白、与人疾病相关联的蛋白质、靶向部分或人基因组编码的没有鉴定治疗适应症但仍在研究和发现领域有用的那些蛋白质。
[0198]
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的货物递送复合物中含有的
mrna包括根据美国专利号9,061,059和9,221,891(其每一个均以其整体并如本文)中描述的任意mrna的编码感兴趣的多肽的区域和连接的核苷的区域。
[0199]
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的货物递送复合物中含有的mrna编码参考多肽的多肽变体。在一些实施方式中，多肽变体可以具有与参考多肽相同或相似的活性。可选地，变体可以相对于参考多肽具有改变的活性(如，提高的或降低的)。总体上，本发明的特定多核苷酸或多肽的变体将具有与该特定参考多核苷酸或多肽至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％但小于100％的序列同一性，如通过本文描述和本领域技术人员已知的序列比对程序和参数确定的。
[0200]
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的货物递送复合物中含有的mrna编码生物制品。如本文所使用，“生物制品”是通过本文提供的方法生产的基于多肽的分子并且其可用于治疗、治愈、减轻、预防、或诊断严重或危及生命的疾病或医学状况。根据本发明，生物制品包括但不限于变应原提取物(例如，对于脱敏针(allergy shot)和试验)、血液组分、基因疗法产品、用于移植的人组织或细胞产品、疫苗、单克隆抗体、细胞因子、生长因子、酶、溶栓剂、和免疫调节剂等。在一些实施方式中，生物制品是当前市场销售的或正在研发的。
[0201]
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的货物递送复合物中含有的mrna编码抗体或其片段(如抗原结合片段)。在一些实施方式中，抗体或其片段是当前市场销售的或正在研发的。
[0202]
术语“抗体”包括单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白fc区的全长抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如，双特异性抗体、双抗体和单链分子)、以及抗体片段。术语“免疫球蛋白”(ig)在本文中与“抗体”可互换使用。如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可以微量存在的可能天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)外，构成群体的单独的抗体是相同的。单克隆抗体针对单个抗原位点具有高度特异性。
[0203]
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的货物递送复合物中含有的mrna编码疫苗。如本文所用，“疫苗”是提高对特定疾病或传染剂的免疫力的生物制剂。在一些实施方式中，疫苗是当前市场销售的或正在研发的。
[0204]
在一些实施方式中，mrna编码的疫苗用于治疗以下许多治疗领域中的状况或疾病：诸如但不限于心血管、cns、皮肤病学、内分泌学、肿瘤学、免疫学、呼吸、和抗感染。
[0205]
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的货物递送复合物中含有的mrna编码治疗性蛋白。在一些实施方式中，治疗性蛋白质是当前市场销售的或正在研发的。在一些实施方式中，治疗性蛋白质可用于：(a)替换缺乏或异常的蛋白质；(b)扩增现有途径；(c)提供新的功能或活性；或(d)干扰分子或有机体。在一些实施方式中，治疗性蛋白质包括但不限于基于抗体的药物、fc融合蛋白、抗凝剂、血液因子、骨形态发生蛋白、工程化蛋白质支架、酶、生长因子、激素、干扰素、白介素和溶栓剂。在一些实施方式中，治疗性蛋白质通过以下途径起作用：(a)非共价结合至靶标，例如，mab；(b)影响共价键，例如，酶；或(c)发挥活性而不需要特异性相互作用，例如，血清白蛋白。在一些实施方式中，治疗性蛋白质是重组蛋白。
[0206]
在一些实施方式中，mrna编码的治疗性蛋白质用于治疗以下许多治疗领域中的状况或疾病，诸如但不限于血液、心血管、cns、中毒(包括抗蛇毒素)、皮肤病学、内分泌学、遗传、泌尿生殖、胃肠、肌骨骼、肿瘤学、和免疫学、呼吸、感觉和抗感染。在一些实施方式中，治疗性蛋白质包括但不限于血管内皮生长因子(vegf-a、vegf-b、vegf-c、vegf-d)、胎盘生长因子(pgf)、ox40配体(ox40l；cd134l)、白介素12(il12)、白介素23(il23)、白介素36γ(il36γ)和coa变位酶。
[0207]
在一些实施方式中，治疗性蛋白质替换缺乏或异常的蛋白质。在一些实施方式中，治疗性蛋白质包括但不限于α1抗胰蛋白酶、共济蛋白、胰岛素、生长激素(促生长素)、生长因子、激素、肌养蛋白、胰岛素样生长因子1(igf1)、因子viii、因子ix、抗凝血酶iii、蛋白质c、β-葡糖脑苷脂酶、葡萄糖苷酶-α、α-l-艾杜糖苷酸梅、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、加硫酶(galsulphase)、人α-半乳糖苷酶a、α-1-蛋白酶抑制剂、乳糖酶、胰酶(包括脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶)、腺苷脱氨酶和白蛋白，包括其重组体形式。
[0208]
在一些实施方式中，治疗性蛋白质提供新的功能或活性。在一些实施方式中，治疗性蛋白质包括但不限于a型肉毒杆菌毒素、b型肉毒杆菌毒素、胶原酶、人脱氧核糖核酸酶i、链道酶-α、透明质酸酶、木瓜蛋白酶、l-天冬酰胺酶、拉布立酶、来匹卢定、比伐卢定、链激酶、和茴酰化纤溶酶原链激酶活化物复合物(apsac)。
[0209]
在一些实施方式中，治疗性蛋白干扰分子或有机体。在一些实施方式中，治疗性蛋白包括但不限于抗-vegfa抗体、抗-egfr抗体、抗-cd52抗体、抗-cd20抗体、抗-her2/neu抗体、人ctla4的细胞外结构域和人免疫球蛋白g1的修饰的fc部分之间的融合蛋白、白介素1(il1)受体拮抗剂、抗-tnfα抗体、cd2-结合蛋白质、抗-cd11a抗体、α4β1和α4β7整联蛋白抗体的抗-α4-亚基、抗-补体蛋白质c5抗体、抗胸腺细胞球蛋白质、嵌合(人/小鼠)igg1、结合cd25的α链的人源化igg1 mab、抗-cd3抗体、抗-ige抗体、结合呼吸道合胞病毒的f蛋白质的a抗原位点的人源化igg1 mab、hiv包膜蛋白质gp120/gp41结合肽、结合糖蛋白iib/iiia整联蛋白受体的嵌合(人/小鼠)mab 7e3的fab片段、和结合并中和毒液毒素的igg的fab片段。
[0210]
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的货物递送复合物中含有的mrna编码肿瘤阻抑蛋白，其中该蛋白对应于肿瘤阻抑基因。在一些实施方式中，肿瘤-阻抑蛋白是视网膜母细胞瘤蛋白(prb)。在一些实施方式中，肿瘤-阻抑蛋白是p53肿瘤-阻抑蛋白。在一些实施方式中，对应的肿瘤-阻抑基因是磷酸酶和张力蛋白同系物(pten)。在一些实施方式中，对应的肿瘤-阻抑基因是brca1。在一些实施方式中，对应的肿瘤-阻抑基因是brca2。在一些实施方式中，对应的肿瘤-阻抑基因是视网膜母细胞瘤rb(或rb1)。在一些实施方式中，对应的肿瘤-阻抑基因是tsc1。在一些实施方式中，对应的肿瘤-阻抑基因是tsc2。在一些实施方式中，对应的肿瘤-阻抑基因包括但不限于视网膜母细胞瘤rb(或rb1)、tp53、tp63、tp73、cdkn2a (ink4a)、cdkn1b、cdkn1c、dld/np1、hepacam、sdhb、sdhd、sfrp1、tcf21、tig1、mlh1、msh2、msh6、wt1、wt2、nf1、nf2n、vhl、klf4、pvhl、apc、cd95、st5、ypel3、st7、apc、madr2、brca1、brca2、patched、tsc1、tsc2、palb2、st14或vhl。
[0211]
在一些实施方式中，mrna编码肿瘤阻抑蛋白pten。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白pten由人pten序列编码。在一些实施方式中，mrna包含这样的序列，其选自具有ncbi genbank中以下登录号的序列：bc005821、jf268690、u92436、cr450306、ak024986、ak313581、u96180、和u93051和nm_000314。
[0212]
在一些实施方式中，mrna编码肿瘤阻抑蛋白p53。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白p53由人tp53序列编码。在一些实施方式中，mrna包含这样的序列，其选自具有ncbi genbank中如下登录号的序列：af052180、nm_000546、ay429684、bt019622、ak223026、dq186652、dq186651、dq186650、dq186649、dq186648、dq263704、dq286964、dq191317、dq401704、af307851、am076972、am076971、am076970、dq485152、bc003596、dq648887、dq648886、dq648885、dq648884、ak225838、m14694、m14695、ef101869、ef101868、ef101867、x01405、ak312568、nm_001126117、nm_001126116、nm_001126115、nm_001126114、nm_001126113、nm_001126112、fj207420、x60020、x60019、x60018、x60017、x60016、x60015、x60014、x60013、x60011、x60012、x60010、x02469、s66666、ab082923、nm_001126118、jn900492、nm_001276699、nm_001276698、nm_001276697、nm_001276761、nm_001276760、nm_001276696、和nm_001276695。
[0213]
在一些实施方式中，mrna编码肿瘤阻抑蛋白brca1。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白brca1由人brca1序列编码。在一些实施方式中，mrna包括这样的序列，其选自具有ncbi genbank中如下登录号的序列：nm_007294、nm_007297、nm_007298、nm_007304、nm_007299、nm_007300、bc046142、bc062429、bc072418、ay354539、ay751490、bc085615、bc106746、bc106745、bc114511、bc115037、u14680、ak293762、u68041、bc030969、bc012577、ak316200、dq363751、dq333387、dq333386、y08864、jn686490、ab621825、bc038947、u64805、和af005068。
[0214]
在一些实施方式中，mrna编码肿瘤阻抑蛋白brca2。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白brca2由人brca2序列编码。在一些实施方式中，mrna包含这样的序列，其选自具有ncbi genbank中如下登录号的序列：bc047568、nm_000059、dq897648、bc026160。
[0215]
在一些实施方式中，mrna编码肿瘤阻抑蛋白tsc1。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白tsc1由人tsc1序列编码。在一些实施方式中，mrna包含这样的序列，其选自具有ncbi genbank中如下登录号的序列：bc047772、nm_000368、bc070032、ab190910、bc108668、bc121000、nm_001162427、nm_001162426、d87683和af013168。
[0216]
在一些实施方式中，mrna编码肿瘤阻抑蛋白tsc2。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白tsc2由人tsc2序列编码。在一些实施方式中，mrna包含这样的序列，其选自具有ncbi genbank中如下登录号的序列：bc046929、bx647816、ak125096、nm_000548、ab210000、nm_001077183、bc150300、bc025364、nm_001114382、ak094152、ak299343、ak295728、ak295672、ak294548和x75621。
[0217]
在一些实施方式中，mrna编码肿瘤阻抑蛋白视网膜母细胞瘤1(rb1)。在一些实施方式中，肿瘤阻抑蛋白rb1由人rb1序列编码。在一些实施方式中，mrna包含这样的序列，其序列选自具有ncbi genbank中如下登录号的序列：nm_000321、ay429568、ab208788、m19701、ak291258、l41870、ak307730、ak307125、ak300284、ak299179、m33647、m15400、m28419、bc039060、bc040540和af043224。
[0218]
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的货物递送复合物中含有的mrna编码蛋白质，其中该蛋白质的缺乏导致疾病或障碍。在一些实施方式中，蛋白质是共济蛋白。在一些实施方式中，蛋白质是α1抗胰蛋白酶。在一些实施方式中，蛋白质是因子viii。在一些实施方式中，蛋白质是因子ix。
[0219]
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的货物递送复合物中含有的mrna编码蛋白质，其中个体中该蛋白质的表达调节对个体中该蛋白质的免疫应答。在一些实施方式中，蛋白质是抗原。在一些实施方式中，抗原是疾病相关联抗原(如，肿瘤相关联抗原)，和个体中抗原的表达导致对个体中抗原的增加的免疫应答。在一些实施方式中，抗原是自身抗原，并且个体中抗原的表达导致对个体中抗原的降低的免疫应答。
[0220]
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的货物递送复合物中含有的mrna编码抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，抗体是治疗性抗体。在一些实施方式中，抗体是双特异性抗体，如双特异性t细胞衔接蛋白(bite)。在一些实施方式中，抗体特异性结合疾病相关联抗原，如肿瘤相关联抗原。
[0221]
在一些实施方式中，根据本文描述的任意实施方式的货物递送复合物中含有的mrna包括报告mrna。在一些实施方式中，mrna包括egfp mrna，例如，cleancap egfp mrna、cleancap egfp mrna(5mou)或cleancap cyanine 5egfp mrna(5mou)。在一些实施方式中，mrna包括luc mrna，例如，cleancap fluc mrna、cleancap fluc mrna(5mou)、cleancap cyanine 5fluc mrna(5mou)、cleancap gaussia luc mrna(5mou)或cleancap renilla luc mrna(5mou)。在一些实施方式中，mrna包括选自以下的mrna：cleancapβ-gal mrna、cleancapβ-gal mrna(5mou)和cleancap mcherry mrna(5mou)。
[0222]
rnai
[0223]
在一些实施方式中，货物分子包括干扰rna(rnai)。在一些实施方式中，rnai包括但不限于sirna、shrna或mirna。在一些实施方式中，rnai是sirna。在一些实施方式中，rnai是微小rna。在一些实施方式中，rnai靶向内源基因。在一些实施方式中，rnai靶向外源基因。在一些实施方式中，rnai靶向疾病相关联基因，如，癌症相关联基因，如癌基因。在一些实施方式中，rnai靶向癌基因。在一些实施方式中，癌基因是smoothened。在一些实施方式中，癌基因是rask。在一些实施方式中，癌基因是kras。
[0224]
在一些实施方式中，货物分子包括mrna(如本文所述的任一种mrna)和rnai(如sirna)。
[0225]
在一些实施方式中，rnai(例如，sirna)靶向癌基因，其中癌基因是kras。在一些实施方式中，个体包含kras畸变。在一些实施方式中，kras畸变包含在kras的密码子12、13、17、34或61上的突变。在一些实施方式中，kras畸变选自g12c、g12s、g12r、g12f、g12l、g12n、g12a、g12d、g12s、g12v、g13c、g13s、g13r、g13a、g13d、g13v、g13p、s17g、p34s、q61e、q61k、q61l、q61r、q61p、q61h、k117n、a146p、a146t和a146v。在一些实施方式中，kras畸变选自g12c、g12s、g12r、g12f、g12l、g12n、g12a、g12d、g12v、g13c、g13s、g13d、g13v、g13p、s17g、p34s、q61k、q61l、q61r、和q61h。在一些实施方式中，kras畸变选自g12c、g12r、g12s、g12a、g12d、g12v、g13c、g13r、g13s、g13a、g13d、g13v、q61k、q61l、q61r、q61h、k117n、a146p、a146t和a146v。在一些实施方式中，kras畸变选自kras g12a、g12c、g12d、g12r、g12s、g12v、g13a、g13c、g13d、g13r、g13s、g13v、q61e、q61h、q61k、q61l、q61p、和q61r。在一些实施方式中，kras畸变包括g12c。在一些实施方式中，kras畸变包括g12d。在一些实施方式中，kras畸变包括q61k。在一些实施方式中，kras畸变包括g12c和g12d。在一些实施方式中，kras畸变包括g12c和q61k。在一些实施方式中，kras畸变包括g12d和q61k。在一些实施方式中，kras畸变包括g12c、g12d和q61k。
[0226]
在一些实施方式中，rnai(例如，sirna)靶向kras的突变体形式。在一些实施方式中，rnai(例如，sirna)特异性靶向kras的突变体形式，但是不靶向kras的野生型形式。在一些实施方式中，突变体形式包括kras畸变，其中kras畸变包括在kras的密码子12、13、17、34或61上的突变。在一些实施方式中，突变体形式包括kras畸变，其中kras畸变选自g12c、g12s、g12r、g12f、g12l、g12n、g12a、g12d、g12s、g12v、g13c、g13s、g13r、g13a、g13d、g13v、g13p、s17g、p34s、q61e、q61k、q61l、q61r、q61p、q61h、k117n、a146p、a146t和a146v。在一些实施方式中，突变体形式包括kras畸变，其中kras畸变选自g12c、g12s、g12r、g12f、g12l、g12n、g12a、g12d、g12v、g13c、g13s、g13d、g13v、g13p、s17g、p34s、q61k、q61l、q61r和q61h。在一些实施方式中，突变体形式包括kras畸变，其中kras畸变选自g12c、g12r、g12s、g12a、g12d、g12v、g13c、g13r、g13s、g13a、g13d、g13v、q61k、q61l、q61r、q61h、k117n、a146p、a146t和a146v。在一些实施方式中，突变体形式包括kras畸变，其中kras畸变选自kras g12a、g12c、g12d、g12r、g12s、g12v、g13a、g13c、g13d、g13r、g13s、g13v、q61e、q61h、q61k、q61l、q61p和q61r。在一些实施方式中，kras畸变选自kras g12c、g12d、g12r、g12s、g12v和g13d。在一些实施方式中，kras畸变包括g12c。在一些实施方式中，kras畸变包括g12d。在一些实施方式中，kras畸变包括q61k。在一些实施方式中，kras畸变包括g12c和g12d。在一些实施方式中，kras畸变包括g12c和q61k。在一些实施方式中，kras畸变包括g12d和q61k。在一些实施方式中，kras畸变包括g12c、g12d和q61k。
[0227]
在一些实施方式中，rnai(例如，sirna)靶向kras的多个突变体形式。在一些实施方式中，多个突变体形式包括kras的多个畸变，其中kras的多个畸变包括kras的密码子12、13、17、34和/或61上的至少两个或更多个突变。在一些实施方式中，kras的多个畸变包括kras的密码子12和61上的至少两个或更多个突变。在一些实施方式中，kras畸变选自g12c、g12s、g12r、g12f、g12l、g12n、g12a、g12d、g12s、g12v、g13c、g13s、g13r、g13a、g13d、g13v、g13p、s17g、p34s、q61e、q61k、q61l、q61r、q61p、q61h、k117n、a146p、a146t和a146v。在一些实施方式中，kras畸变选自g12c、g12s、g12r、g12f、g12l、g12n、g12a、g12d、g12v、g13c、g13s、g13d、g13v、g13p、s17g、p34s、q61k、q61l、q61r和q61h。在一些实施方式中，kras畸变选自g12c、g12r、g12s、g12a、g12d、g12v、g13c、g13r、g13s、g13a、g13d、g13v、q61k、q61l、q61r、q61h、k117n、a146p、a146t和a146v。在一些实施方式中，kras畸变选自kras g12a、g12c、g12d、g12r、g12s、g12v、g13a、g13c、g13d、g13r、g13s、g13v、q61e、q61h、q61k、q61l、q61p和q61r。在一些实施方式中，kras畸变选自kras g12c、g12d、g12r、g12s、g12v和g13d。在一些实施方式中，kras畸变选自kras g12c、g12d和q61k。在一些实施方式中，kras畸变包括g12c和g12d。在一些实施方式中，kras畸变包括g12c和q61k。在一些实施方式中，kras畸变包括g12d和q61k。在一些实施方式中，kras畸变包括g12c、g12d和q61k。
[0228]
在一些实施方式中，rnai(例如，sirna)包括多个rnai(例如，sirna)，其包括第一rnai(例如，第一sirna)和第二rnai(例如，第二sirna)，其中第一rnai靶向kras的第一突变体形式，并且其中第二rnai靶向kras的第二突变体形式。在一些实施方式中，第一rnai和/或第二rnai不靶向kras的野生型形式。在一些实施方式中，第一突变体形式和/或第二突变体形式包括kras畸变，其中kras畸变包括kras的密码子12、13、17、34和/或61上的突变。在一些实施方式中，第一突变体形式和/或第二突变体形式包括kras畸变，其中kras畸变包括kras的密码子12或61上的突变。在一些实施方式中，第一突变体形式包括含有密码子12上
的突变的kras畸变，并且第二突变体形式包括含有密码子61上的突变的kras畸变。在一些实施方式中，第一突变体形式和/或第二突变体形式包括kras畸变，其中kras畸变选自g12c、g12s、g12r、g12f、g12l、g12n、g12a、g12d、g12s、g12v、g13c、g13s、g13r、g13a、g13d、g13v、g13p、s17g、p34s、q61e、q61k、q61l、q61r、q61p、q61h、k117n、a146p、a146t和a146v。在一些实施方式中，第一突变体形式和/或第二突变体形式包括kras畸变，其中kras畸变选自g12c、g12s、g12r、g12f、g12l、g12n、g12a、g12d、g12v、g13c、g13s、g13d、g13v、g13p、s17g、p34s、q61k、q61l、q61r和q61h。在一些实施方式中，第一突变体形式和/或第二突变体形式包括kras畸变，其中kras畸变选自g12c、g12r、g12s、g12a、g12d、g12v、g13c、g13r、g13s、g13a、g13d、g13v、q61k、q61l、q61r、q61h、k117n、a146p、a146t和a146v。在一些实施方式中，第一突变体形式和/或第二突变体形式包括kras畸变，其中kras畸变选自kras g12a、g12c、g12d、g12r、g12s、g12v、g13a、g13c、g13d、g13r、g13s、g13v、q61e、q61h、q61k、q61l、q61p和q61r。在一些实施方式中，第一突变体形式和/或第二突变体形式包括kras畸变，其中kras畸变选自kras g12c、g12d、g12r、g12s、g12v和g13d。在一些实施方式中，第一突变体形式和/或第二突变体形式包括kras畸变，其中kras畸变选自g12c、g12d和q61k。在一些实施方式中，第一突变体形式包括含有kras g12c的kras畸变，并且第二突变体形式包括含有kras g12d的kras畸变。在一些实施方式中，第一突变体形式包括含有kras g12c的kras畸变，并且第二突变体形式包括含有kras q61k的kras畸变。在一些实施方式中，第一突变体形式包括含有kras g12d的kras畸变，并且第二突变体形式包括含有kras q61k的kras畸变。
[0229]
在一些实施方式中，rnai(例如，sirna)包括含有第一rnai(例如，第一sirna)、第二rnai(例如，第二sirna)和第三rnai(例如，sirna)的多个rnai(例如，sirna)。在一些实施方式中，第一rnai靶向kras的第一突变体形式，第二rnai靶向kras的第二突变体形式，和第三rnai靶向kras的第三突变体形式。在一些实施方式中，第一、第二和第三kras突变体形式各自包括含有kras的密码子12、13、17、34和/或61上的突变的kras畸变。在一些实施方式中，第一、第二和第三kras突变体形式各自包括选自以下的kras畸变：g12c、g12s、g12r、g12f、g12l、g12n、g12a、g12d、g12s、g12v、g13c、g13s、g13r、g13a、g13d、g13v、g13p、s17g、p34s、q61e、q61k、q61l、q61r、q61p、q61h、k117n、a146p、a146t和a146v。在一些实施方式中，第一、第二和第三kras突变体形式各自包括选自以下的kras畸变：g12c、g12s、g12r、g12f、g12l、g12n、g12a、g12d、g12v、g13c、g13s、g13d、g13v、g13p、s17g、p34s、q61k、q61l、q61r和q61h。在一些实施方式中，第一、第二和第三kras突变体形式各自包括选自以下的kras畸变：g12c、g12r、g12s、g12a、g12d、g12v、g13c、g13r、g13s、g13a、g13d、g13v、q61k、q61l、q61r、q61h、k117n、a146p、a146t和a146v。在一些实施方式中，第一、第二和第三kras突变体形式各自包括选自以下的kras畸变：kras g12a、g12c、g12d、g12r、g12s、g12v、g13a、g13c、g13d、g13r、g13s、g13v、q61e、q61h、q61k、q61l、q61p和q61r。在一些实施方式中，第一、第二和第三kras突变体形式各自包括选自以下的kras畸变：kras g12c、g12d、g12r、g12s、g12v、g13d和q61k。在一些实施方式中，第一、第二和第三kras突变体形式各自包括选自以下的kras畸变：g12c、g12d和q61k。在一些实施方式中，第一突变体形式包括含有kras g12c的kras畸变，第二突变体形式包括含有kras g12d的kras畸变，和第三突变体形式包括含有kras q61k的kras畸变。
[0230]
在一些实施方式中，rnai(例如，sirna)包括靶向含有5
’‑
guuggagcuuguggcguagtt-3’(有义)、5
’‑
cuacgccaccagcuccaactt-3(反义)、5
’‑
gaagugcauacaccgagactt-3’(有义)、5
’‑
gucucgguguagcacuuctt-3’(反义)、5
’‑
guuggagcuguuggcguagtt-3’(有义)和/或5'-cuacgccaacagcuccaactt-3’(反义)的序列的kras的rnai(例如，sirna)。在一些实施方式中，rnai(例如，sirna)包括靶向含有选自具有seq id no:179、180、182-185的序列的核酸序列的kras的rnai(例如，sirna)。在一些实施方式中，rnai(例如，sirna)包括靶向含有靶向kras g12s的序列的kras的rnai(例如，sirna)，如在acunzo,m.等,proc natl acad sci usa.2017may 23；114(21):e4203-e4212中公开的sirna序列。在一些实施方式中，rnai(例如，sirna)包括靶向kras的rnai(例如，sirna)，如在wo2014013995、jp2013212052、wo2014118817、wo2012129352、wo2017179660、jp2013544505、us8008474、us7745611、us7576197、us7507811中所公开的，其中每篇完全并入本技术。
[0231]
在一些实施方式中，rnai包括但不限于sirna、shrna和mirna。术语“干扰rna”或“rnai”或“干扰rna序列”是指当干扰rna与靶基因或序列在同一细胞中时能够降低或抑制靶基因或序列的表达(例如，通过介导降解或抑制与干扰rna序列互补的mrna的翻译)的单链rna(例如，成熟mirna)或双链rna(即，双链体rna，如sirna、airna或前-mirna)，干扰rna因此是指与靶mrna序列互补的单链rna或由两个互补链或单个自互补链形成的双链rna。干扰rna可以具有与靶基因或序列基本上或完全的同一性，或可以包括错配区(即，错配基序)。干扰rna的序列可以对应全长靶基因或其子序列。干扰rna包括“小-干扰rna”或“sirna”，例如，长度在约15-60、15-50或5-40(双链体)个核苷酸的干扰rna，更典型地，长度在约15-30、15-25或19-25(双链体)个核苷酸，和优选地约20-24、21-22或21-23(双链体)个核苷酸长度(例如，双链sirna的每个互补序列长度在15-60、15-50、15-40、15-30、15-25或19-25个核苷酸，优选地长度在约20-24、21-22或21-23个核苷酸，并且双链sirna长度为约15-60、15-50、15-40、5-30、5-25或19-25个碱基对，优选地长度约8-22、9-20或19-21个碱基对)。sirna双链体可以包括约1至约4个核苷酸或约2至约3个核苷酸的3'突出端和5'磷酸末端。sirna的实例包括但不限于由两个单独的链分子组装的双链多核苷酸分子，其中一条链是有义链，而另一条是互补的反义链；由单个链分子组装的双链多核苷酸分子，其中有义和反义区通过基于核酸或基于非核酸的连接体连接；具有发卡二级结构的双链多核苷酸分子，其中发卡二级结构具有自互补的有义和反义区；和环状单链多核苷酸分子，其具有两个或更多个环结构和具有自互补的有义和反义区的茎，其中环状多核苷酸可以体内或体外加工以产生活性双链sirna分子。优选地，sirna通过化学合成。sirna还可以通过利用大肠杆菌rnase iii或切酶切割较长的dsrna产生(例如，长度上大于约25个核苷酸的dsrna)。这些酶将dsrna加工为生物活性sirna(参见，例如，yang等,proc natl.acad.set.usa,99:9942-9947(2002)；calegari等,proc.natl.acad.sci.usa,99:14236(2002)；byrom等,ambion teehnotes,10(l):4-6(2003)；kawasaki等,nucleic acids res.,3 1:981-987(2003)；knight等,science,293:2269-2271(2001)；和robertson等,j.biol.chem.,243:82(1968))。优选地，dsrna为至少50个核苷酸至约100、200、300、400或500个核苷酸长度。dsrna可以在长度上长达1000、1500、2000、5000个核苷酸，或更长。dsrna可以编码整个基因转录物或部分基因转录物。在某些情况下，sirna可以由质粒编码(例如，转录为自动折叠成带有发夹环的双链体的序列)。小发卡rna或短发卡rna(shrna)是制造紧密发卡弯的rna序
列，其可被用于经由rna干扰沉默基因表达。shrna发卡结构通过细胞机器切割为sirna，其然后与rna诱导的沉默复合物(risc)结合。该复合物与mrna结合并将其切割，所述mrna匹配与其结合的sirna。rnai的合适长度包括但不限于约5至约200个核苷酸，或10-50个核苷酸或碱基对或15-30个核苷酸或碱基对。在一些实施方式中，rnai是与对应的靶基因基本上互补的(如至少约60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或更高同一性的)。在一些实施方式中，rnai例如通过并入非天然存在的核苷酸进行修饰。
[0232]
在一些实施方式中，rnai是双链rnai。rnai的合适长度包括但不限于约5至约200个核苷酸，或10-50个核苷酸或碱基对或15-30个核苷酸或碱基对。在一些实施方式中，rnai是与对应的靶基因基本上互补的(如至少约60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、或更高同一性的)。在一些实施方式中，rnai例如通过并入非天然存在的核苷酸进行修饰。
[0233]
在一些实施方式中，rnai特异性靶向rna分子，如mrna，其编码涉及疾病(如癌症)的蛋白质。在一些实施方式中，疾病是癌症，如实体瘤或血液系统恶性肿瘤，和干扰rna靶向编码涉及癌症的蛋白质(如涉及调节癌症进展的蛋白质)的mrna。在一些实施方式中，rnai靶向涉及癌症的癌基因。
[0234]
在一些实施方式中，rnai特异性靶向rna分子，如mrna，其编码涉及负调节免疫应答的蛋白质。在一些实施方式中，干扰rna靶向编码阴性共刺激分子的mrna。在一些实施方式中，阴性共刺激分子包括，例如，pd-1、pd-l1、pd-l2、tim-3、btla、vista、lag-3和ctla-4。
[0235]
在一些实施方式中，rnai是mirna。微小rna(缩写为mirna)是在真核细胞中发现的短核糖核酸(rna)分子。与其它rna相比，微小rna分子具有非常少的核苷酸(平均22个)。mirna是与靶信使rna转录物(mrna)上互补序列结合的后转录调节子，通常导致翻译阻抑或靶标降解和基因沉默。人基因组可以编码超过1000个mirna，其可靶向约60％的哺乳动物基因并且在许多人细胞类型中是丰富的。mirna的合适长度包括但不限于约5至约200个核苷酸，或约0-50个核苷酸或碱基对或15-30个核苷酸或碱基对。在一些实施方式中，mirna是与对应的靶基因基本上互补的(如至少约60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或更高同一性的)。在一些实施方式中，mirnai例如通过并入非天然存在的核苷酸进行修饰。
[0236]
病毒
[0237]
在一些实施方式中，根据本文所述的任何复合物和/或纳米颗粒，病毒是重组病毒，包括重组腺相关联病毒(aav)、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒(hsv)、痘病毒、埃巴病毒(ebv)、痘苗病毒和人巨细胞病毒(hcmv)。在一些实施方式中，重组病毒包括插入细胞基因组的转基因。在一些实施方式中，转基因是治疗性转基因。在一些实施方式中，转基因编码蛋白质，如治疗性蛋白质。在一些实施方式中，转基因编码抑制性rna(rnai)，如靶向内源基因的rnai，例如，疾病相关联内源基因。在一些实施方式中，转基因编码car。在一些实施方式中，病毒包括编码rnai的第一转基因。在一些实施方式中，rnai是靶向疾病或病况中涉及的内源基因的治疗性rnai。在一些实施方式中，治疗性rnai靶向内源基因的疾病相关联形式(例如，编码突变蛋白的基因或导致蛋白质异常表达的基因)。在一些实施方式中，病毒包括编码蛋白质的第二转基因。在一些实施方式中，蛋白质是用于治疗疾病或状况的治疗性蛋白质。在一些实施方式中，第二转基因是治疗形式的内源基因(例如，第二转基因编码内源基因所编码的突变蛋白质的野生型或功能形式，或者第二转基因导致内源基因所编码的蛋白质的正常表达)。在一些实施方式中，提供了包括第一转基因和第二转基因
的病毒。
[0238]
在一些实施方式中，根据本文所述的任何复合物和/或纳米颗粒，病毒是经修饰的病毒，包括经修饰的腺相关联病毒(aav)、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒(hsv)、痘病毒、埃巴病毒(ebv)、痘苗病毒和人巨细胞病毒(hcmv)。在一些实施方式中，根据本文所述的任何复合物和/或纳米颗粒，病毒是失活病毒，包括失活腺相关联病毒(aav)、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒(hsv)、痘病毒、埃巴病毒(ebv)、痘苗病毒和人巨细胞病毒(hcmv)。在一些实施方式中，根据本文所述的任何复合物和/或纳米颗粒，病毒是复制缺陷型病毒，包括复制缺陷型腺相关联病毒(aav)、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒(hsv)、痘病毒、埃巴病毒(ebv)、痘苗病毒和人巨细胞病毒(hcmv)。在一些实施方式中，根据本文所述的任何复合物和/或纳米颗粒，病毒仅能够在靶细胞中复制。
[0239]
纳米颗粒
[0240]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的纳米颗粒，所述纳米颗粒包括含有如本文所述的任一种或多种货物递送复合物的核。
[0241]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的纳米颗粒，所述货物分子包括含有本文所述的一种或多种货物递送复合物的核。在一些实施方式中，纳米颗粒核包括多种货物递送复合物。在一些实施方式中，纳米颗粒核包括以预定比存在的多种货物递送复合物。在一些实施方式中，选择预定比以允许在下文更详细描述的任何方法中最有效地使用纳米颗粒。在一些实施方式中，纳米颗粒核进一步包括一种或多种另外的细胞穿透肽和/或一种或多种另外的货物。
[0242]
在一些实施方式中，提供了用于货物分子的细胞内递送的纳米颗粒，所述纳米颗粒包括含有本文所述的货物递送复合物的核，其中货物递送复合物中的至少一种细胞穿透肽与货物结合。在一些实施方式中，结合是非共价的。在一些实施方式中，结合是共价的。
[0243]
在一些实施方式中，纳米颗粒进一步包括含有周围细胞穿透肽(即，cpp)的表层(例如，壳)，其中核由壳包覆。在一些实施方式中，周围cpp与核中的cpp相同。在一些实施方式中，周围cpp不同于核中的任何cpp。在一些实施方式中，周围cpp包括但不限于基于ptd的肽、两亲肽、基于聚精氨酸的肽、mpg肽、cady肽、vepep肽(如vepep-3、vepep-4、vepep-5、vepep-6或vepep-9肽)、adgn-100肽、pep-1肽和pep-2肽。在一些实施方式中，周围cpp是vepep-3肽、vepep-6肽、vepep-9肽或adgn-100肽。在一些实施方式中，周围细胞穿透肽选自pep-1肽、pep-2肽、pep-3肽、vepep-3肽、vepep-6肽、vepep-9肽和adgn-100肽。在一些实施方式中，表层中的至少一些周围细胞穿透肽连接到靶向部分。在一些实施方式中，键合是共价的。在一些实施方式中，共价键合是通过化学偶联实现的。在一些实施方式中，共价键合是通过遗传方法实现的。在一些实施方式中，纳米颗粒进一步包括纳米颗粒的核和表层之间的中间层。在一些实施方式中，中间层包括中间cpp。在一些实施方式中，中间cpp与核中的cpp相同。在一些实施方式中，中间cpp不同于核中的任何cpp。在一些实施方式中，中间体cpp包括但不限于基于ptd的肽、两亲肽、基于聚精氨酸的肽、mpg肽、cady肽、vepep肽(如vepep-3、vepep-6或vepep-9肽)、adgn-100肽、pep-1肽和pep-2肽。在一些实施方式中，中间体cpp是vepep-3肽、vepep-6肽、vepep-9肽或adgn-100肽。
[0244]
在一些实施方式中，根据本文所述的任何纳米颗粒，纳米颗粒的平均尺寸(直径)为约20nm至约1000nm，包括例如约50nm至约800nm、约75nm至约600nm、约100nm至约600nm、
和约200nm至约400nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均尺寸(直径)不大于约1000纳米(nm)，如不大于约900、800、700、600、500、400、300、200或100nm中的任一个。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均(average)直径或平均(mean)直径不大于约200nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均直径或平均直径不大于约150nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均直径或平均直径不大于约100nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均直径或平均直径为约20nm至约400nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均直径或平均直径为约30nm至约400nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均直径或平均直径为约40nm至约300nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均直径或平均直径为约50nm至约200nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均直径或平均直径为约60nm至约150nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均直径或平均直径为约70nm至约100nm。在一些实施方式中，纳米颗粒是可无菌过滤的。
[0245]
在一些实施方式中，纳米颗粒的ζ电位为约-30mv至约60mv(如约-30、-25、-20、-15、-10、-5、0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55和60mv中的任一个，包括这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，纳米颗粒的ζ电位为约-30mv至约30mv，包括例如约-25mv至约25mv、约-20mv至约20mv、约-15mv至约15mv、约-10mv至约10mv、和约-5mv至约10mv。在一些实施方式中，纳米颗粒的多分散指数(pi)为约0.05至约0.6(如约0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55和0.6中的任一个，包括这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，纳米颗粒基本上是无毒的。
[0246]
组合物
[0247]
在一些实施方式中，提供了组合物(例如，药物组合物)，其包括如本文描述的货物递送复合物或纳米颗粒。在一些实施方式中，组合物是药物组合物，其包括如本文描述的货物递送复合物或纳米颗粒和药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体。在一些实施方式中，组合物中复合物或纳米颗粒的浓度是约1nm至约100mm，包括例如约10nm至约50mm、约25nm至约25mm、约50nm至约10mm、约100nm至约1mm、约500nm至约750μm、约750nm至约500μm、约1μm至约250μm、约10μm至约200μm、和约50μm至约150μm。在一些实施方式中，药物组合物是冻干的。
[0248]
如本文使用的术语“药学上可接受的稀释剂、赋形剂、和/或载体”意图包括与给予至人或其它脊椎动物宿主相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂与抗真菌剂、等渗剂与吸收延迟剂等。通常，药学上可接受的稀释剂、赋形剂、和/或载体是被联邦管理机构、州政府、或其它管理机构批准的，或在美国药典或其它公认的药典中列出的用于动物——包括人以及非人哺乳动物——的稀释剂、赋形剂、和/或载体。术语稀释剂、赋形剂、和/或“载体”是指使用其给予药物组合物的稀释剂、佐剂、赋形剂、或媒介物。这样的药物稀释剂、赋形剂、和/或载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些。水、盐水溶液和水性葡萄糖与甘油溶液可以被用作液体稀释剂、赋形剂、和/或载体，特别地用于可注射的溶液。合适的药物稀释剂和/或赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等，包括冻干协助。组合物，如果需要，还可以包含微量的湿润剂、膨胀剂、乳化剂、或ph缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳液、缓释制剂等的形式。合适的药物稀释剂、赋形剂、和/或载体的实例被描述在e.w.martin的“remington's pharmaceutical sciences”中。制剂应当适合给予模式。适当的稀释剂、赋形剂、和/或载体
对本领域技术人员将是显而易见的并且将在很大程度上取决于给予途径。
[0249]
在一些实施方式中，包括如本文所述的货物递送复合物或纳米颗粒的组合物进一步包括药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体。在一些实施方式中，药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体影响组合物中货物递送复合物或纳米颗粒的聚集水平和/或由组合物中货物递送复合物或纳米颗粒介导的细胞内递送效率。在一些实施方式中，由药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体介导的对聚集和/或递送效率的影响的程度和/或方向取决于组合物中药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体的相对量。
[0250]
例如，在一些实施方式中，组合物中以一个或多个浓度存在的药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体(如盐、糖、化学缓冲剂、缓冲溶液、细胞培养基、或载体蛋白)不促进和/或不助于货物递送复合物或纳米颗粒的聚集，或促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约200％(如不大于约190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1％中的任一个，包括任意这些值之间的任意范围)的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包括药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体，该浓度不促进和/或不助于货物递送复合物或纳米颗粒的聚集，或促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约200％(如不超过约190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1％中的任一个，包括任意这些值之间的任意范围)的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约150％的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体的浓度包括药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体。在一些实施方式中，组合物以促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约100％的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体的浓度包括药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体。在一些实施方式中，组合物以促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约50％的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体的浓度包括药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体。在一些实施方式中，组合物以促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约20％的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体的浓度包括药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体。在一些实施方式中，组合物以促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约15％的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体的浓度包括药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体。在一些实施方式中，组合物以促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约10％的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体的浓度包括药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体。在一些实施方式中，药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体是盐，其包括但不限于nacl。在一些实施方式中，药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体是糖，其包括但不限于蔗糖、葡萄糖和甘露醇。在一些实施方式中，药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体是化学缓冲剂，其包括但不限于hepes。在一些实施方式中，药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体是缓冲溶液，其包括但不限于pbs。在一些实施方式中，药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体是细胞培养基，其包括但不限于dmem。可以使用本领域中已知的用于测量粒径的任何手段来确定粒径，如通过动态光散射(dls)。例如，在一些实施方式中，通过dls测量的聚集体的z-平均值大于通过dls测量的货物递送复合物或纳米颗粒
的z-平均值10％，该聚集体大于货物递送复合物或纳米颗粒10％。
[0251]
在一些实施方式中，组合物以如下浓度包括盐(例如，nacl)，该浓度不促进和/或不助于货物递送复合物或纳米颗粒的聚集，或促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约100％(如不超过约90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1％中的任一个，包括任意这些值之间的任意范围)的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包括盐(例如，nacl)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约75％的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包括盐(例如，nacl)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约50％的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包括盐(例如，nacl)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约20％的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包括盐(例如，nacl)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约15％的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包括盐(例如，nacl)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约10％的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物中盐的浓度不大于约100mm(如不大于约90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1mm中的任一个，包括任意这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，盐是nacl。
[0252]
在一些实施方式中，组合物以如下浓度包括糖(例如，蔗糖、葡萄糖或甘露醇)，该浓度不促进和/或不助于货物递送复合物或纳米颗粒的聚集，或促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约25％(如不超过约24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1％中的任一个，包括任意这些值之间的任意范围)的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包括糖(例如，蔗糖、葡萄糖或甘露醇)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约75％的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包括糖(例如，蔗糖、葡萄糖或甘露醇)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约50％的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包括糖(例如，蔗糖、葡萄糖或甘露醇)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约20％的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包括糖(例如，蔗糖、葡萄糖或甘露醇)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约15％的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包括糖(例如，蔗糖、葡萄糖或甘露醇)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约10％的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物中糖的浓度不大于约20％(如不大于约18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1％中的任一个，包括任意这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，糖是蔗糖。在一些实施方式中，糖是葡萄糖。在一些实施方式中，糖是甘露醇。
[0253]
在一些实施方式中，组合物以如下浓度包括化学缓冲剂(例如，hepes或磷酸盐)，该浓度不促进和/或不助于货物递送复合物或纳米颗粒的聚集，或促进和/或助于形成大小
不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约10％(如不超过约9、8、7、6、5、4、3、2、或1％中的任一个，包括任意这些值之间的任意范围)的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包括化学缓冲剂(例如，hepes或磷酸盐)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约7.5％的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包括化学缓冲剂(例如，hepes或磷酸盐)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约5％的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包括化学缓冲剂(例如，hepes或磷酸盐)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约3％的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包括化学缓冲剂(例如，hepes或磷酸盐)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约1％的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包括化学缓冲剂(例如，hepes或磷酸盐)，该浓度不促进和/或不助于形成货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，化学缓冲剂是hepes。在一些实施方式中，hepes以包括hepes的缓冲液的形式添加到组合物。在一些实施方式中，包括hepes的溶液的ph为约5和约9之间(如约5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5和9中的任一个，包括这些值之间的任意范围)。在一些实施方式中，组合物以不大于约75mm(如不大于约70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10mm中的任一个或更少，包括任意这些值之间的任意范围)的浓度包括hepes。在一些实施方式中，化学缓冲剂是磷酸盐。在一些实施方式中，磷酸盐以包括磷酸盐的缓冲溶液的形式添加至组合物。在一些实施方式中，组合物不包括pbs。
[0254]
在一些实施方式中，组合物以如下浓度包括细胞培养基(例如，dmem或opti-mem)，该浓度不促进和/或不助于货物递送复合物或纳米颗粒的聚集，或促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约200％(如不超过约190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1％中的任一个，包括任意这些值之间的任意范围)的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包括细胞培养基(例如，dmem或opti-mem)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约150％的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包括细胞培养基(例如，dmem或opti-mem)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约100％的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包括细胞培养基(例如，dmem或opti-mem)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约50％的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包括细胞培养基(例如，dmem或opti-mem)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约25％的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包括细胞培养基(例如，dmem或opti-mem)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约10％的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，细胞培养基是dmem。在一些实施方式中，组合物以不大于约70％(如不大于65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10％中的任一个或更少，包括任意这些值之间的任意范围)的浓度包括dmem。
[0255]
在一些实施方式中，组合物以如下浓度包括载体蛋白(例如，白蛋白)，该浓度不促进和/或不助于货物递送复合物或纳米颗粒的聚集，或促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约200％(如不超过约190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1％中的任一个，包括任意这些值之间的任意范围)的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包括载体蛋白(例如，白蛋白)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约150％的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包括载体蛋白(例如，白蛋白)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约100％的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包括载体蛋白(例如，白蛋白)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约50％的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包括载体蛋白(例如，白蛋白)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约25％的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，组合物以如下浓度包括载体蛋白(例如，白蛋白)，该浓度促进和/或助于形成大小不超过大于货物递送复合物或纳米颗粒的大小约10％的货物递送复合物或纳米颗粒的聚集体。在一些实施方式中，载体蛋白是白蛋白。在一些实施方式中，白蛋白是人血清白蛋白。
[0256]
在一些实施方式中，如本文描述的药物组合物被配制用于静脉内、肿瘤内、动脉内、局部、眼内、眼科、门静脉内、颅内、脑内、脑室内、鞘内、囊泡内、皮内、皮下、肌肉内、鼻内、气管内、肺部、腔内或口服给予。
[0257]
示例性给药频率包括但不限于每三天不多于一次。
[0258]
制备方法
[0259]
在一些实施方式中，提供了制备如本文所述的货物递送复合物或纳米颗粒的方法。
[0260]
在一些实施方式中，提供了制备如上所述的包括第一肽和第二肽的货物递送复合物的方法，所述方法包括：a)将第一肽与第二肽组合，从而形成肽混合物；b)将肽混合物与货物组合，从而形成货物递送复合物。
[0261]
在一些实施方式中，提供了制备如上所述的包括肽和货物分子的货物递送复合物的方法，所述方法包括将肽与货物分子组合，从而形成货物递送复合物。
[0262]
在一些实施方式中，肽或肽混合物和货物分子分别以约1:1至约100:1(如约在约1:1至约50:1之间，或约20:1)的摩尔比组合。
[0263]
在一些实施方式中，方法包括将包括货物分子的第一溶液与包括肽或肽混合物的第二溶液混合以形成第三溶液，其中第三溶液包括或被调整以包括：i)约0-5％蔗糖，ii)约0-5％葡萄糖，iii)约0-50％dmem，iv)约0-80mm nacl，或v)约0-20％pbs，并且其中第三溶液被温育以允许形成货物递送复合物。在一些实施方式中，第一溶液包括无菌水中的货物和/或其中第二溶液包括无菌水中的肽或肽混合物。在一些实施方式中，在温育以形成货物递送复合物之后，第三溶液被调整以包括：i)约0-5％蔗糖，ii)约0-5％葡萄糖，iii)约0-50％dmem，iv)约0-80mm nacl，或v)约0-20％pbs。
[0264]
在一些实施方式中，方法进一步包括过滤过程，其中货物递送复合物通过设定尺
寸的孔膜过滤。在一些实施方式中，孔的直径为至少约0.1μm(如至少约0.1μm、0.15μm、0.2μm、0.25μm、0.3μm、0.35μm、0.4μm、0.45μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1.0μm、1.1μm或1.2μm)。在一些实施方式中，孔的直径不大于约1.2μm、1.0μm、0.8μm、0.6μm、0.5μm、0.45μm、0.4μm、0.35μm、0.3μm、或0.25μm在一些实施方式中，孔的直径为约0.1μm至约1.2μm(如约0.1至约0.8μm、约0.2至0.5μm)。
[0265]
在一些实施方式中，对于本技术的包括货物递送复合物或纳米颗粒的稳定组合物，复合物或纳米颗粒的平均直径改变不超过约10％，并且多分散指数改变不超过约10％。
[0266]
还提供了制备包括本文所述的细胞穿透肽的任何肽的方法。
[0267]
使用方法
[0268]
本技术还提供了将一种或多种货物递送到细胞中的方法。在一些实施方式中，方法包括使细胞与货物递送复合物或纳米颗粒接触，其中货物递送复合物包括一种或多种货物。
[0269]
在一些实施方式中，提供了将一种或多种货物递送到细胞中的方法，包括使细胞与本文所述的货物递送复合物接触，其中货物递送复合物包括一种或多种货物。在一些实施方式中，细胞是癌细胞。在一些实施方式中，细胞是人细胞。在一些实施方式中，细胞表达抗原(如肿瘤抗原)，其中货物递送复合物中的货物分子特异性结合或靶向抗原。
[0270]
本技术还提供了将一种或多种货物递送到个体的组织或器官中的方法，包括将有效量的如本文所述的货物递送复合物、纳米颗粒、或药物组合物给予到个体中，其中组织或器官选自肝、肺、肾、脑、肠、脾、心脏、肌肉和淋巴结。
[0271]
在一些实施方式中，提供了将一种或多种货物分子递送到个体的组织或器官中的方法，包括将有效量的本文所述的货物递送复合物给予到个体中，其中组织或器官选自肝、肺、肾、脑、肠、脾、心脏、肌肉和淋巴结。在一些实施方式中，组织或器官选自肝、肺、肾、脑、脾和淋巴结。
[0272]
在一些实施方式中，提供了促进一种或多种货物分子在个体的组织或器官中保留的方法，包括将有效量的本文所述的货物递送复合物给予到个体中，其中组织或器官选自肝、肺、肾、脑、肠、脾、心脏、肌肉和淋巴结。在一些实施方式中，组织或器官选自肝、肺、肾、脑、脾和淋巴结。
[0273]
在一些实施方式中，提供了促进个体中一种或多种货物分子的稳定性的方法，包括将有效量的本文所述的货物递送复合物给予到个体中。
[0274]
在一些实施方式中，提供了促进一种或多种货物分子在个体的组织或器官中保留的方法，包括：a)将包括第一细胞穿透肽的第一肽和包括第二细胞穿透肽的第二肽组合，从而形成肽混合物，其中第二肽包括与第二细胞穿透肽共价连接的聚乙二醇(peg)部分，并且其中第一肽不具有peg部分；b)将肽混合物与货物分子组合，从而形成货物递送复合物；和c)将货物递送复合物给予到个体中。在一些实施方式中，组织或器官选自肝、肺、肾、脑、肠、脾、心脏、肌肉和淋巴结。在一些实施方式中，组织或器官选自肝、肺、肾、脑、脾和淋巴结。在一些实施方式中，提供了促进个体中一种或多种货物分子的稳定性的方法，包括：a)将包括第一细胞穿透肽的第一肽和包括第二细胞穿透肽的第二肽组合，从而形成肽混合物，其中第二肽包括与第二细胞穿透肽共价连接的聚乙二醇(peg)部分，并且其中第一肽不具有peg部分；b)将肽混合物与货物分子组合，从而形成货物递送复合物；和c)将货物递送复合物给
予到个体中。在一些实施方式中，第一细胞穿透肽与第二细胞穿透肽的比为约20:1至约1:1(如约15:1至约2:1、约10:1至约4:1)。肽(例如，细胞穿透肽或包括细胞穿透肽的肽)、货物、和peg部分的实例包括本文所述的那些。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽的n-末端或c-末端缀合。在一些实施方式中，peg部分与第二细胞穿透肽内的位点缀合。
[0275]
本技术还提供了将货物分子递送到个体中的器官/组织中的方法，包括将如上所述的货物递送复合物给予到个体中。
[0276]
在一些实施方式中，提供了将货物分子递送到个体中的器官/组织中的方法，包括将货物递送复合物给予到个体中，其中货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子，其中肽进一步包括选自seq id no:152-162的靶向序列。在一些实施方式中，器官或组织是肿瘤组织、肾、胰腺、肌肉、心脏、脑、肝脏、肾、淋巴结、肺或脾。在一些实施方式中，细胞穿透肽是基于ptd的肽、两亲肽、基于聚精氨酸的肽、mpg肽、cady肽、pep-1肽、pep-2肽、或pep-3肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽选自cady、pep-1肽、pep-2肽、pep-3肽、vepep-3肽、vepep-4肽、vepep-5肽、vepep-6肽、vepep-9肽和adgn-100肽。在一些实施方式中，靶向序列共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，靶向序列通过连接体共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，连接体选自β-丙氨酸、半胱氨酸、半胱酰胺桥、聚甘氨酸(如g2或g4)、peg连接体部分、aun(11-氨基-十一酸)、ava(5-氨基戊酸)和ahx(氨基己酸)。在一些实施方式中，连接体包括peg连接体部分。在一些实施方式中，peg连接体部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，靶向序列在不具有连接体的情况下与细胞穿透肽的n-末端共价连接。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的一个或多个部分，其中一个或多个部分选自乙酰基和硬脂酰基。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、病毒、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。
[0277]
在一些实施方式中，提供了将货物分子递送到个体中的器官或组织(例如，心脏或肌肉)中的方法，包括将货物递送复合物给予(例如，静脉内)到个体中，其中货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子(例如，pna、寡核苷酸、mrna)，其中肽进一步包括靶向序列lssrlda。在一些实施方式中，肽包括vepep-3肽、vepep-6肽、vepep-9肽或adgn-100肽。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:1-14、75、76和113-115。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:15-40、77、85、92-100、105、107-109和129-139。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:41-52、78和116-120。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:53-70、79、80、86-91、101-104、106、110-112和121-128。在一些实施方式中，肽包括seq id no:114中列出的氨基酸序列。在一些实施方式中，靶向序列共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，靶向序列通过连接体共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，连接体选自β-丙氨酸、半胱氨酸、半胱酰胺桥、聚甘氨酸(如g2或g4)、peg连接体部分、aun(11-氨基-十一酸)、ava(5-氨基戊酸)和ahx(氨基己酸)。在一些实施方式中，连接体包括peg连接体部分。在一些实施方式中，peg连接体部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，靶向序列在不具有连接体的情况下与细胞穿透肽的n-末端共价连接。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的一个或多个部分，其中一个或多个部分选自乙酰基和硬脂酰基。在一些实施方式中，货物分
子选自核酸、病毒、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。
[0278]
在一些实施方式中，提供了将货物分子递送到个体中的器官或组织(例如，脑或肝)中的方法，包括将货物递送复合物给予(例如，静脉内)到个体中，其中货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子(例如，sirna/mrna)，其中肽进一步包括靶向序列sytsstm。在一些实施方式中，肽包括vepep-3肽、vepep-6肽、vepep-9肽或adgn-100肽。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:1-14、75、76和113-115。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:15-40、77、85、92-100、105、107-109和129-139。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:41-52、78和116-120。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:53-70、79、80、86-91、101-104、106、110-112和121-128。在一些实施方式中，肽包括seq id no:115、128、131或132中列出的氨基酸序列。在一些实施方式中，靶向序列共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，靶向序列通过连接体共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，连接体选自β-丙氨酸、半胱氨酸、半胱酰胺桥、聚甘氨酸(如g2或g4)、peg连接体部分、aun(11-氨基-十一酸)、ava(5-氨基戊酸)和ahx(氨基己酸)。在一些实施方式中，连接体包括peg连接体部分。在一些实施方式中，peg连接体部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，靶向序列在不具有连接体的情况下与细胞穿透肽的n-末端共价连接。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的一个或多个部分，其中一个或多个部分选自乙酰基和硬脂酰基。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、病毒、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。
[0279]
在一些实施方式中，提供了将货物分子递送到个体中的器官或组织(例如，脑或淋巴结)中的方法，包括将货物递送复合物给予(例如，静脉内)到个体中，其中货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子(例如，sirna/mrna/肽)，其中肽进一步包括靶向序列ksydty。在一些实施方式中，肽包括vepep-3肽、vepep-6肽、vepep-9肽或adgn-100肽。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:1-14、75、76和113-115。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:15-40、77、85、92-100、105、107-109和129-139。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:41-52、78和116-120。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:53-70、79、80、86-91、101-104、106、110-112和121-128。在一些实施方式中，肽包括seq id no:116或119中列出的氨基酸序列。在一些实施方式中，靶向序列共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，靶向序列通过连接体共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，连接体选自β-丙氨酸、半胱氨酸、半胱酰胺桥、聚甘氨酸(如g2或g4)、peg连接体部分、aun(11-氨基-十一酸)、ava(5-氨基戊酸)和ahx(氨基己酸)。在一些实施方式中，连接体包括peg连接体部分。在一些实施方式中，peg连接体部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，靶向序列在不具有连接体的情况下与细胞穿透肽的n-末端共价连接。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的一个或多个部分，其中一个或多个部分选自乙酰基和硬脂酰基。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、病毒、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。
[0280]
在一些实施方式中，提供了将货物分子递送到个体中的器官或组织(例如，心脏或肺)中的方法，包括将货物递送复合物给予(例如，静脉内)到个体中，其中货物递送复合物
包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子(例如，sirna/mrna)，其中肽进一步包括靶向序列carpar。在一些实施方式中，肽包括vepep-3肽、vepep-6肽、vepep-9肽或adgn-100肽。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:1-14、75、76和113-115。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:15-40、77、85、92-100、105、107-109和129-139。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:41-52、78和116-120。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:53-70、79、80、86-91、101-104、106、110-112和121-128。在一些实施方式中，肽包括seq id no:121或139中列出的氨基酸序列。在一些实施方式中，靶向序列共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，靶向序列通过连接体共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，连接体选自β-丙氨酸、半胱氨酸、半胱酰胺桥、聚甘氨酸(如g2或g4)、peg连接体部分、aun(11-氨基-十一酸)、ava(5-氨基戊酸)和ahx(氨基己酸)。在一些实施方式中，连接体包括peg连接体部分。在一些实施方式中，peg连接体部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，靶向序列在不具有连接体的情况下与细胞穿透肽的n-末端共价连接。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的一个或多个部分，其中一个或多个部分选自乙酰基和硬脂酰基。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、病毒、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。
[0281]
在一些实施方式中，提供了将货物分子递送到个体中的器官或组织(例如，脑或肺)中的方法，包括将货物递送复合物给予(例如，静脉内)到个体中，其中货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子(例如，sirna/mrna)，其中肽进一步包括靶向序列tgnykalhpdhng。在一些实施方式中，肽包括vepep-3肽、vepep-6肽、vepep-9肽或adgn-100肽。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:1-14、75、76和113-115。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:15-40、77、85、92-100、105、107-109和129-139。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:41-52、78和116-120。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:53-70、79、80、86-91、101-104、106、110-112和121-128。在一些实施方式中，肽包括seq id no:122或123中列出的氨基酸序列。在一些实施方式中，靶向序列共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，靶向序列通过连接体共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，连接体选自β-丙氨酸、半胱氨酸、半胱酰胺桥、聚甘氨酸(如g2或g4)、peg连接体部分、aun(11-氨基-十一酸)、ava(5-氨基戊酸)和ahx(氨基己酸)。在一些实施方式中，连接体包括peg连接体部分。在一些实施方式中，peg连接体部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，靶向序列在不具有连接体的情况下与细胞穿透肽的n-末端共价连接。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的一个或多个部分，其中一个或多个部分选自乙酰基和硬脂酰基。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、病毒、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。
[0282]
在一些实施方式中，提供了将货物分子递送到个体中的器官或组织(例如，肺、肾、肝、肿瘤、胰腺)中的方法，包括将货物递送复合物给予(例如，静脉内或肌肉内)到个体中，其中货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子(例如，sirna/mrna/crispr分子)，其中肽进一步包括靶向序列yigsr。在一些实施方式中，肽包括vepep-3肽、vepep-6肽、vepep-9肽或adgn-100肽。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：
seq id no:1-14、75、76和113-115。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:15-40、77、85、92-100、105、107-109和129-139。在一些实施方式中，肽包括选自seq id no:41-52、78和116-120的氨基酸序列。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:53-70、79、80、86-91、101-104、106、110-112和121-128。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:88、94、96、98、101、103、105-112、125、126、130和135。在一些实施方式中，靶向序列共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，靶向序列通过连接体共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，连接体选自β-丙氨酸、半胱氨酸、半胱酰胺桥、聚甘氨酸(如g2或g4)、peg连接体部分、aun(11-氨基-十一酸)、ava(5-氨基戊酸)和ahx(氨基己酸)。在一些实施方式中，连接体包括peg连接体部分。在一些实施方式中，peg连接体部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，靶向序列在不具有连接体的情况下与细胞穿透肽的n-末端共价连接。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的一个或多个部分，其中一个或多个部分选自乙酰基和硬脂酰基。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、病毒、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。
[0283]
在一些实施方式中，提供了将货物分子递送到个体中的器官或组织(例如，肺、肾、肝、脾、脑、肿瘤、胰腺)中的方法，包括将货物递送复合物给予(例如，静脉内或肌肉内)到个体中，其中货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子(例如，sirna/mrna/crispr分子)，其中肽进一步包括靶向序列gyvs。在一些实施方式中，肽包括vepep-3肽、vepep-6肽、vepep-9肽或adgn-100肽。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:1-14、75、76和113-115。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:15-40、77、85、92-100、105、107-109和129-139。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:41-52、78和116-120。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:53-70、79、80、86-91、101-104、106、110-112和121-128。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:89、95、97、99、102、104、127和136。在一些实施方式中，靶向序列共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，靶向序列通过连接体共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，连接体选自β-丙氨酸、半胱氨酸、半胱酰胺桥、聚甘氨酸(如g2或g4)、peg连接体部分、aun(11-氨基-十一酸)、ava(5-氨基戊酸)和ahx(氨基己酸)。在一些实施方式中，连接体包括peg连接体部分。在一些实施方式中，peg连接体部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，靶向序列在不具有连接体的情况下与细胞穿透肽的n-末端共价连接。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的一个或多个部分，其中一个或多个部分选自乙酰基和硬脂酰基。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、病毒、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。
[0284]
在一些实施方式中，提供了将货物分子递送到个体中的器官或组织(例如，心脏)中的方法，包括将货物递送复合物给予(例如，静脉内)到个体中，其中货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子(例如，寡核苷酸)，其中肽进一步包括靶向序列ckrav。在一些实施方式中，肽包括vepep-3肽、vepep-6肽、vepep-9肽或adgn-100肽。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:1-14、75、76和113-115。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:15-40、77、85、92-100、105、107-109
和129-139。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:41-52、78和116-120。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:53-70、79、80、86-91、101-104、106、110-112和121-128。在一些实施方式中，肽包括seq id no:117中列出的氨基酸序列。在一些实施方式中，靶向序列共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，靶向序列通过连接体共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，连接体选自β-丙氨酸、半胱氨酸、半胱酰胺桥、聚甘氨酸(如g2或g4)、peg连接体部分、aun(11-氨基-十一酸)、ava(5-氨基戊酸)和ahx(氨基己酸)。在一些实施方式中，连接体包括peg连接体部分。在一些实施方式中，peg连接体部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，靶向序列在不具有连接体的情况下与细胞穿透肽的n-末端共价连接。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的一个或多个部分，其中一个或多个部分选自乙酰基和硬脂酰基。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、病毒、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。
[0285]
在一些实施方式中，提供了将货物分子递送到个体中的器官或组织(例如，脑)中的方法，包括将货物递送复合物给予(例如，静脉内或肌肉内)到个体中，其中货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子(例如，mrna、sirna、crispr分子)，其中肽进一步包括靶向序列thrppnwspv。在一些实施方式中，肽包括vepep-3肽、vepep-6肽、vepep-9肽或adgn-100肽。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:1-14、75、76和113-115。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:15-40、77、85、92-100、105、107-109和129-139。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:41-52、78和116-120。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:53-70、79、80、86-91、101-104、106、110-112和121-128。在一些实施方式中，肽包括seq id no:133或138中列出的氨基酸序列。在一些实施方式中，靶向序列共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，靶向序列通过连接体共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，连接体选自β-丙氨酸、半胱氨酸、半胱酰胺桥、聚甘氨酸(如g2或g4)、peg连接体部分、aun(11-氨基-十一酸)、ava(5-氨基戊酸)和ahx(氨基己酸)。在一些实施方式中，连接体包括peg连接体部分。在一些实施方式中，peg连接体部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，靶向序列在不具有连接体的情况下与细胞穿透肽的n-末端共价连接。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的一个或多个部分，其中一个或多个部分选自乙酰基和硬脂酰基。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、病毒、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。
[0286]
在一些实施方式中，提供了将货物分子递送到个体中的器官或组织(例如，肌肉、心脏)中的方法，包括将货物递送复合物给予(例如，静脉内或肌肉内)到个体中，其中货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子(例如，mrna、sirna、crispr分子)，其中肽进一步包括靶向序列cktrrvp。在一些实施方式中，肽包括vepep-3肽、vepep-6肽、vepep-9肽或adgn-100肽。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:1-14、75、76和113-115。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:15-40、77、85、92-100、105、107-109和129-139。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:41-52、78和116-120。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：
seq id no:53-70、79、80、86-91、101-104、106、110-112和121-128。在一些实施方式中，肽包括seq id no:134或137中列出的氨基酸序列。在一些实施方式中，靶向序列共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，靶向序列通过连接体共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，连接体选自β-丙氨酸、半胱氨酸、半胱酰胺桥、聚甘氨酸(如g2或g4)、peg连接体部分、aun(11-氨基-十一酸)、ava(5-氨基戊酸)和ahx(氨基己酸)。在一些实施方式中，连接体包括peg连接体部分。在一些实施方式中，peg连接体部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，靶向序列在不具有连接体的情况下与细胞穿透肽的n-末端共价连接。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的一个或多个部分，其中一个或多个部分选自乙酰基和硬脂酰基。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、病毒、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。
[0287]
在一些实施方式中，提供了将货物分子递送到个体中的器官或组织(例如，肌肉)中的方法，包括将货物递送复合物给予(例如，静脉内或肌肉内)到个体中，其中货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子(例如，肽、蛋白质、pna)，其中肽进一步包括靶向序列asslnia。在一些实施方式中，肽包括vepep-3肽、vepep-6肽、vepep-9肽或adgn-100肽。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:1-14、75、76和113-115。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:15-40、77、85、92-100、105、107-109和129-139。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:41-52、78和116-120。在一些实施方式中，肽包括选自以下的氨基酸序列：seq id no:53-70、79、80、86-91、101-104、106、110-112和121-128。在一些实施方式中，肽包括seq id no:113中列出的氨基酸序列。在一些实施方式中，靶向序列共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，靶向序列通过连接体共价连接到细胞穿透肽的n-末端。在一些实施方式中，连接体选自β-丙氨酸、半胱氨酸、半胱酰胺桥、聚甘氨酸(如g2或g4)、peg连接体部分、aun(11-氨基-十一酸)、ava(5-氨基戊酸)和ahx(氨基己酸)。在一些实施方式中，连接体包括peg连接体部分。在一些实施方式中，peg连接体部分由约一至十个(如约1-8、2-7、1-5或6-10个)乙二醇单元组成。在一些实施方式中，靶向序列在不具有连接体的情况下与细胞穿透肽的n-末端共价连接。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的一个或多个部分，其中一个或多个部分选自乙酰基和硬脂酰基。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、病毒、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。
[0288]
在一些实施方式中，提供了将货物分子递送到个体中的器官或组织(例如，胰腺、肾)中的方法，包括将货物递送复合物给予(例如，静脉内)到个体中，其中货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽，细胞穿透肽包括seq id no:75中列出的氨基酸序列；和b)货物分子(例如，mrna、蛋白质、肽、病毒或病毒样颗粒)。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的一个或多个部分，其中一个或多个部分选自乙酰基和硬脂酰基。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、病毒、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。
[0289]
在一些实施方式中，提供了将货物分子递送到个体中的器官或组织(例如，脑、肝、肺、肾)中的方法，包括将货物递送复合物给予(例如，静脉内、肌肉内)到个体中，其中货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽，细胞穿透肽包括seq id no:78中列出的氨基酸
序列；和b)货物分子(例如，肽、寡核苷酸、质粒dna、病毒或病毒样颗粒)。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的一个或多个部分，其中一个或多个部分选自乙酰基和硬脂酰基。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、病毒、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。
[0290]
在一些实施方式中，提供了将货物分子递送到个体中的器官或组织(例如，肝、肺、肾、脑)中的方法，包括将货物递送复合物给予(例如，静脉内)到个体中，其中货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽，细胞穿透肽包括seq id no:118中列出的氨基酸序列；和b)货物分子(例如，肽、寡核苷酸、质粒dna、病毒或病毒样颗粒)。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的一个或多个部分，其中一个或多个部分选自乙酰基和硬脂酰基。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、病毒、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。
[0291]
在一些实施方式中，提供了将货物分子递送到个体中的器官或组织(例如，肝、肺、肾、胰腺)中的方法，包括将货物递送复合物给予(例如，静脉内、肌肉内、皮下)到个体中，其中货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽，细胞穿透肽包括seq id no:79或80中列出的氨基酸序列；和b)货物分子(例如，质粒dna、肽、sirna、crispr分子、mrna)。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的一个或多个部分，其中一个或多个部分选自乙酰基和硬脂酰基。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、病毒、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。
[0292]
在一些实施方式中，提供了将货物分子递送到个体中的器官或组织(例如，肝、肺、肾、脾)中的方法，包括将货物递送复合物给予(例如，静脉内、肌肉内)到个体中，其中货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子(例如，质粒dna、sirna、mrna)，其中细胞穿透肽是反向-翻转肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽是adgn-100肽或vepep-6肽。在一些实施方式中，肽包括seq id no:85或86中列出的氨基酸序列。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的一个或多个部分，其中一个或多个部分选自乙酰基和硬脂酰基。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、病毒、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。
[0293]
在一些实施方式中，提供了将货物分子递送到个体中的器官或组织(例如，肝)中的方法，包括将货物递送复合物给予(例如，静脉内、皮下)到个体中，其中货物递送复合物包括：a)包括细胞穿透肽的肽；和b)货物分子(例如，质粒dna、crispr分子、mrna)，其中细胞穿透肽包括碳水化合物部分(如galnac)。在一些实施方式中，细胞穿透肽是adgn-100肽或vepep-6肽。在一些实施方式中，肽包括seq id no:124或129中列出的氨基酸序列。在一些实施方式中，肽进一步包括连接到靶向序列的n-末端的一个或多个部分，其中一个或多个部分选自乙酰基和硬脂酰基。在一些实施方式中，货物分子选自核酸、病毒、多肽、蛋白质/核酸复合物、病毒样颗粒、和蛋白质复合物。
[0294]
疾病和状况
[0295]
本技术还提供了治疗个体中的疾病或状况的方法，包括将有效量的如本文所述的货物递送复合物、纳米颗粒、或药物组合物给予到个体中。在一些实施方式中，疾病或状况与选自肝、肺、肾、脑、肠、脾、心脏、肌肉和淋巴结的器官或组织中的病理细胞相关联。在一些实施方式中，疾病或状况选自癌症、糖尿病、自身免疫性疾病、血液学疾病、心脏病、血管
病、炎性疾病、纤维变性疾病、病毒感染性疾病、遗传性疾病、眼部疾病、肝脏疾病、肺部疾病、肌肉疾病、蛋白质缺乏病、溶酶体贮积病、神经学疾病、肾脏疾病、老化和变性疾病、和以胆固醇水平异常为特征的疾病。
[0296]
在本文方法的一些实施方式中，待治疗的疾病是癌症。在一些实施方式中，癌症是实体瘤，并且药物组合物包括含有编码蛋白质的一种或多种mrna的货物递送复合物或纳米颗粒，所述蛋白质包括但不限于生长因子和细胞因子、细胞表面受体、信号传导分子和激酶、转录因子和其它转录调节子、蛋白质表达和修饰的调节子、肿瘤阻抑蛋白、和凋亡和转移的调节子。
[0297]
在一些实施方式中，实体瘤包括但不限于肉瘤和癌，如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴血管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、卡波西肉瘤、软组织肉瘤、子宫滑膜肉瘤(uterine sacronomasynovioma)、间皮瘤、尤文氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、wilm肿瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质瘤、脑膜瘤(menangioma)、黑素瘤、成神经细胞瘤、和视网膜母细胞瘤。
[0298]
在一些实施方式中，根据本发明的货物递送复合物或纳米颗粒可用于治疗各种疾病、障碍和/或状况中的任一种，包括但不限于以下一种或多种：自身免疫障碍(例如，糖尿病、狼疮、多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎)；炎性障碍(例如，关节炎、盆腔炎症性疾病)；传染性疾病(例如，病毒感染(例如，hiv、hcv、rsv、基孔肯雅病毒、寨卡病毒、流感病毒)、细菌感染、真菌感染、脓毒症)；神经障碍(例如，阿尔茨海默病、杭廷顿氏舞蹈病；孤独症；杜兴氏肌营养不良)；心血管障碍(例如，动脉粥样硬化、高胆固醇血症、血栓形成、凝血障碍、血管生成障碍(如黄斑变性))；增殖性障碍(例如，癌症、良性肿瘤)；呼吸障碍(例如，慢性阻塞性肺病)；消化障碍(例如，炎性肠病、溃疡)；肌骨骼障碍(例如，纤维肌痛、关节炎)；内分泌、代谢和营养障碍(例如，糖尿病、骨质疏松)；泌尿科障碍(例如，肾病)；心理障碍(例如，抑郁、精神分裂症)；皮肤障碍(例如，伤口、湿疹)；血液和淋巴障碍(例如，贫血、血友病)；等等。
[0299]
在一些实施方式中，本文所述的货物递送复合物或纳米颗粒可用于治疗以机能障碍或畸变蛋白质活性为特征的疾病，包括囊性纤维化、镰状细胞贫血、表皮水泡症、肌萎缩性侧索硬化、和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏。例如，本发明提供了通过给予包括含有mrna的基于核酸或细胞的治疗剂的货物递送复合物来治疗对象中这类状况或疾病的方法，其中mrna编码拮抗或以其它方式克服对象细胞中存在的畸变蛋白质活性的蛋白质。机能障碍的蛋白质的具体实例是囊性纤维化跨膜电导调节蛋白(cftr)基因的错义突变变体，其产生cftr蛋白的机能障碍的蛋白质变体，其导致囊性纤维化。
[0300]
以缺失(或基本上减少，以致不出现适当的(正常)或生理蛋白质功能)蛋白质活性为特征的疾病包括囊性纤维化、尼-皮二氏c型、β地中海贫血、杜兴氏肌营养不良、胡尔勒综合征、亨特综合征、和血友病a。这类蛋白质可以不存在，或基本上是无功能的。本发明提供了通过给予包括含有mrna的基于核酸或细胞的治疗剂的货物递送复合物来治疗对象中这
类状况或疾病的方法，其中mrna编码替代从对象的靶细胞缺失的蛋白质活性的蛋白质。机能障碍的蛋白质的具体实例是囊性纤维化跨膜电导调节蛋白(cftr)基因的无义突变变体，其产生cftr蛋白质的非功能蛋白变体，其导致囊性纤维化。
[0301]
在本文所述方法的一些实施方式中，待治疗的疾病是癌症，其中癌症是实体瘤，并且药物组合物包括含有编码涉及肿瘤发展和/或进展的蛋白质的一种或多种mrna的货物递送复合物或纳米颗粒。在一些实施方式中，mrna编码涉及肿瘤发展和/或进展的蛋白质，所述蛋白质包括但不限于il-2、il-12、干扰素-γ、gm-csf、b7-1、胱天蛋白酶-9、p53、muc-1、mdr-1、hla-b7/β2-微球蛋白、her2、hsp27、胸苷激酶和mda-7，包括其突变体。在一些实施方式中，mrna编码蛋白质，如治疗性蛋白质。在一些实施方式中，mrna编码car。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包括编码多种蛋白质的多种mrna。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包括编码单一蛋白质的多种mrna。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包括编码第一蛋白质和第二蛋白质的单一mrna。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒进一步包括rnai，如sirna，如靶向内源基因(例如，疾病相关内源基因)的rnai。在一些实施方式中，rnai靶向外源基因。在一些实施方式中，rnai是靶向涉及疾病或状况的内源基因的治疗性rnai，并且蛋白质是可用于治疗疾病或状况的治疗性蛋白质。在一些实施方式中，复合物或纳米颗粒包括治疗性mrna和治疗性rnai，其中治疗性rnai靶向内源基因(例如，编码突变体蛋白质的基因，或导致蛋白质异常表达的基因)的疾病相关形式，并且治疗性mrna与内源基因的治疗形式对应(例如，第二转基因编码突变体蛋白质的野生型或功能形式，或第二转基因导致蛋白质的正常表达)。
[0302]
在本文所述方法的一些实施方式中，药物组合物通过静脉内、肿瘤内、动脉内、局部、眼内、眼科、门静脉内、颅内、脑内、脑室内、鞘内、囊泡内、皮内、皮下、肌肉内、鼻内、气管内、肺部、腔内、气管内滴注、雾化、或口服给予向个体给予。
[0303]
在本文所述方法的一些实施方式中，个体是哺乳动物。在一些实施方式中，个体是人。
[0304]
试剂盒
[0305]
本文还提供了对本文所述方法有用的试剂盒、试剂和制品。这样的试剂盒可包含如本文所述的货物递送复合物、纳米颗粒、或药物组合物。
[0306]
本文所述的试剂盒可进一步包括使用试剂盒的组分实践主题方法的说明(例如制造本文所述的药物组合物和/或使用药物组合物的说明)。实践主题方法的说明通常被记录在合适的记录介质上。例如，说明可以被印刷在基底上，如纸或塑料等。因此，说明可以作为包装插页(insert)存在于试剂盒中，存在于试剂盒的容器的标签中或其部件中(即，与包装或分包装相关联)等。在一些实施方式中，说明作为在合适的计算机可读存储介质——例如，cd-rom、磁盘等——上存在的电子存储数据文件存在。在又其它实施方式中，实际说明不存在于试剂盒中，但是提供了用于从远程来源获得说明的手段，例如，经由互联网。此实施方式的实例是试剂盒，其包括可以查看说明和/或可以下载说明的网址。与说明一样，用于获得说明的此手段被记录在合适的基底上。
[0307]
试剂盒的多种组分可以在单独的容器中，其中容器可以被包含在单个外壳，例如，盒子内。
[0308]
实施例
[0309]
本领域技术人员将认识到若干实施方式在本发明的范围和精神内是可能的。现将参考下文非限制性实例对本发明进行更详细地描述。以下实例进一步示例了本发明，而当然不应被解释为以任何方式限制其范围。
[0310]
实施例1：adgn-肽/mrna/质粒-dna/sirna纳米颗粒优化以供体内应用
[0311]
材料
[0312]
mrna：cleancap
tm
luc mrna(5mou)获自trilink biotechnology(美国)。
[0313]
质粒：从promega获得在cmv启动子下表达萤光素酶的pgl4报告载体。
[0314]
sirna luc：从eurogentec获得靶向萤光素酶luc2 5’cuu-acg-cug-agu-acu-ucg-att-3’(有义链)和5
’‑
ucg-aag-uac-uca-gcg-uaa-gtt-3’(反义链)的sirna。
[0315]
adgn肽：使用以下肽：
[0316]
adgn-106:βalwralwrlwrslwrllwka
[0317]
adgn-106-ri:akwllrwlsrwlrwlarwlr
[0318]
adgn-106-peg7:ac-(peg)7-βalwralwrlwrslwrllwka-nh2
[0319]
adgn-106-peg2:ac-(peg)2-βalwralwrlwrslwrllwka-nh2
[0320]
adgn-106-hydro-1:ac-yigsr-(g)4-alwralwrlwrslwrllwka-nh2
[0321]
adgn-106hydro-2:ac-gyvs-(g)4-alwralwrlwrslwrllwka-nh2
[0322]
adgn-106-hydro-3:ac-yigsr-ava(ch2)
2-alwralwrlwrslwrllwka-nh2
[0323]
adgn-106hydro-4:ac-gyvs-ava(ch2)
2-alwralwrlwrslwrllwka-nh2
[0324]
adgn-106-hydro-5:ac-yigsr-aun(ch2)
6-alwralwrlwrslwrllwka-nh2
[0325]
adgn-106hydro-6:ac-gyvs-aun(ch2)
6-alwralwrlwrslwrllwka-nh2
[0326]
adgn-106-hydro-8:ac-yigsr-ahx-alwralwrlwrslwrllwka-nh2
[0327]
adgn-106stearyl:硬脂酰基-βa-alwralwrlwrslwrllwka-nh2
[0328]
adgn-100:βakwrsagwrwrlw rvrswsr
[0329]
adgn-100-ri:rswsrvrwlrwrwgasrwk
[0330]
adgn-100-peg7:ac-(peg)7-βa-kwrsalwrwrlwrvrswsr-nh2
[0331]
adgn-100-peg2:ac-(peg)2-βa-kwrsalwrwrlwrvrswsr-nh2
[0332]
adgn-100-hydro-1:ac-yigsr-(g)4-kwrsalwrwrlwrvrswsr-nh2
[0333]
adgn-100hydro-2:ac-gyvs-(g)4-kwrsalwrwrlwrvrswsr-nh2
[0334]
adgn-100-hydro-3:ac-yigsr-ava-kwrsalwrwrlwrvrswsr-nh2
[0335]
adgn-100hydro-4:ac-gyvs-ava-kwrsalwrwrlwrvrswsr-nh2
[0336]
adgn-100-hydro-5:ac-yigsr-aun-kwrsalwrwrlwrvrswsr-nh2
[0337]
adgn-100hydro-6:ac-gyvs-aun-kwrsalwrwrlwrvrswsr-nh2
[0338]
adgn-100-hydro-8:ac-yigsr-ahx-kwrsalwrwrlwrvrswsr-nh2
[0339]
adgn-100stearyl:硬脂酰基-βa-kwrsalwrwrlwrvrswsr-nh2
[0340]
adgn-103c:ac-asslnia-ava-kwwerwwrewprkrr-nh2
[0341]
adgn-104ac-lssrlda-ava-kwwerwwrewprkrr
[0342]
adgn-105ac-sytsstm-ava-kwwerwwrewprkrr
[0343]
adgn-106tb:ac-sytsstm-ava-βalwralwrlwrslwrllwka-nh2
[0344]
adgn-109:ac-ksydty-ava-alrwlrwasrwfsrwawr-nh2
[0345]
adgn-109d:ac-ksydtyaaetr-rwasrwfsrwawwr-nh2
[0346]
adgn-109b:ac-ckrav-rwwlrwasrwfsrwawwr-nh2
[0347]
adgn-101:ac-carpar-wrsagwrwrlwrvrswsr-nh2
[0348]
adgn-102:ac-tgnykalhpdhng-wrsalrwrlwrwsr-nh2
[0349]
adgn-100galnac:ac-kwrsa(galnac)lwrwrlwrvrswsr-nh2
[0350]
adgn-106galnac:ac-alwra(galnac)lwrlwrslwrllwka-nh2
[0351]
adgn-106tc:ac-thrppnwspvwp-ralwrlwrslwrlrwka-nh2
[0352]
adgn-106td:ac-cktrrvp-wralwrlwrslwrllwka-nh2
[0353]
值得注意的是，肽制备的产率比用ahx连接体得到的肽高约20倍。
[0354]
细胞系：293t细胞(crl-3216
tm
)和hepg2(hb-8065
tm
)细胞获自atcc。skov-3/luc细胞和a375/luc细胞获自clinisciences。
[0355]
方法
[0356]
与mrna的复合物形成。以下方案用于转染2-5 106个细胞或在24孔板中培养的约70-80％汇合的细胞。使用(0.25μg)mrna，以20:1摩尔比的adgn-肽/mrna制备adgn-肽/mrna颗粒。在室温下，在20μl无菌水(gibco)中稀释luc mrna(0.25μg)。添加5μl最终肽溶液以获得20μl的总体积。用无菌水将体积调整至50μl并用涡流低速温和混合1min，并在室温下温育30min。然后通过添加含有5％蔗糖的无菌水将体积构成100μl，并且溶液用涡流低速温和混合1min，并在37℃下温育5min，然后进行细胞转染。
[0357]
经优化的与mrna的复合物形成。以2:1摩尔比(2x)的adgn-肽/核酸制备adgn-肽/mrna/grna颗粒。以1:2摩尔比(2x)，用0.2μg mrna:0.15μg sgrna和5％葡萄糖或dmem(例如，96孔板)制备adgn/cas9mrna/sgrna复合物。在室温下，在玻璃小瓶(1-4ml)中，在无菌水中制备预混合的cas9 mrna/grna(5μg/15μg)。在400rpm的磁力搅动下逐滴(1滴/秒)添加adgn-肽溶液以获得1:2的比。然后在室温或37℃下将溶液温育30分钟。刚好在转染之前，添加150μl葡萄糖或dmem。然后在400rpm的磁力搅动下将溶液混合1分钟，然后在37℃下温育5min。然后，溶液准备用于细胞转染或iv给予。在iv给予之前，在5％蔗糖溶液中稀释复合物。
[0358]
与质粒dna的复合物形成。以下方案用于转染2-5 106个细胞或在24孔板中培养的约70-80％汇合的细胞。使用(0.2μg)，以20:1摩尔比的adgn-肽/pgl4制备adgn-肽/质粒dnapgl4颗粒。在室温下，在20μl无菌水(gibco)中稀释pgl4质粒(0.15μg)。添加10μl最终肽溶液以获得20μl的总体积。用无菌水将体积调整至50μl并用涡流低速温和混合1min，并在室温下温育30min。然后通过添加含有5％蔗糖的无菌水将体积构成100μl，并且溶液用涡流低速温和混合1min，并在37℃下温育5min，然后进行细胞转染。
[0359]
与sirna的复合物形成。以下方案用于转染2-5 106个细胞或在24孔板中培养的约70-80％汇合的细胞。使用20nm sirna，以20:1摩尔比的adgn-肽/pgl4制备adgn-肽/sirna luc颗粒。在室温下，在20μl无菌水(gibco)中稀释sirna双链体(10和25nm)。添加1.5或3μl最终肽溶液(55μm)以获得20μl的总体积。用无菌水将体积调整至50μl并用涡流低速温和混合1min，并在室温下温育30min。然后通过添加含有5％蔗糖的无菌水将体积构成100μl，并且溶液用涡流低速温和混合1min，并在37℃下温育5min，然后进行细胞转染。
[0360]
转染方案。报告方案用于24孔板格式。在含有5％co2的潮湿气氛中，在37℃下，补
充有2mm谷氨酰胺、1％抗生素(链霉素10,000μg/ml、青霉素10,000iu/ml)和10％(w/v)胎牛血清(fcs)的dulbecco’s modified eagle’s medium(dmem)中培养细胞。转染之前那天，接种有150,000个细胞的24孔板生长至50-60％汇合并在转染时设定为上至约70％汇合。转染前，用dmem洗涤细胞两次。然后用0.1ml的含有0.25μg mrna、0.15μg质粒dna或10-25nm sirna的adgn-肽/货物复合物溶液覆盖细胞，温和混合，并在37℃下温育10min。添加0.2ml的新鲜dmem并在37℃下温育细胞20min。然后添加1ml的含有15％fcs的完全dmem，以达到10％的最终fcs浓度，而不需要去除adgn-肽/货物复合物的覆盖。将细胞返回至培养箱(37℃,5％co2)并且在转染后72hrs。
[0361]
结果
[0362]
研究的目的是评估哪些adgn制剂可产生具有mrna或质粒dna或sirna以供体内全身iv和局部或im递送的优质adgn纳米颗粒。对adgn肽的几种不同的修饰进行了评估，包括硬脂酰基、用不同peg长度的聚乙二醇化、信号传导序列和反向-翻转转化。反向-翻转肽-肽由d-氨基酸以天然存在的l-同种型的反向序列组成，以研究它们在维持结构特征的同时是否产生蛋白水解稳定的肽类似物。已在体外对adgn-肽/货物制剂进行了表征，并在培养细胞和体内对其递送mrna、质粒dna和sirna的效力进行了评估。
[0363]
实施例2：adgn-肽变体/mrna复合物的表征和稳定性。
[0364]
分析了不同adgn-肽与mrna形成稳定纳米颗粒的能力。在dls nanozs(malvern ltd)上测量了粒径和聚集水平。在25℃下测定adgn/mrna复合物的平均大小和多分散性，每次测量3分钟。为了去除大颗粒，使用pes或pvdf 0.45μm过滤器过滤adgn/mrna复合物。图8和图9显示了3次独立实验的平均值。
[0365]
如图8报告的，所有adgn-100肽均与mrna形成了稳定的纳米颗粒，平均大小在100至160nm之间。adgn/mrna复合物溶液中含有一小部分——5％到13％之间——平均大小大于400nm的纳米颗粒。adgn-100的反向翻转修饰并未修改肽与mrna形成稳定复合物的能力。用adgn-100retro inverso、adgn-100hydro5和adgn-100hydro6肽获得聚集体小于4％的高度均一的纳米颗粒。
[0366]
如图9报告的，所有adgn-106肽均与mrna形成了稳定的纳米颗粒，平均大小在110至160nm之间。adgn/mrna复合物溶液中含有一小部分——5％到13％之间——平均大小大于400nm的纳米颗粒。adgn-106的反向翻转修饰并未修改肽与mrna形成稳定复合物的能力。用adgn-106retro inverso和adgn-100hydro6肽获得聚集体小于3％的高度均一的纳米颗粒。
[0367]
对于adgn-100和adgn-106肽变体两者，通过在0.45μm过滤器上过滤，有效地去除了大颗粒和聚集体，并导致pes过滤器中约15-20％的材料损失和pvdf过滤器中约30％的材料损失。因此，将添加带有0.45μm pes过滤器的过滤步骤以供进一步研究。
[0368]
实施例3：adgn-肽变体/dna质粒复合物的表征和稳定性。
[0369]
分析了不同adgn-肽与dna pgl4——一种5.6kpb质粒表达萤光素酶——形成稳定纳米颗粒的能力。在dls nanozs(malvern ltd)上测量了粒径和聚集水平。在25℃下测定adgn/mrna复合物的平均大小和多分散性，每次测量3分钟。为了去除大颗粒，使用pes或pvdf 0.45μm过滤器过滤adgn/质粒dna复合物。图10显示了数据3次独立实验的平均值。
[0370]
如图10报告的，除adgn-106、adgn-106ri、adgn-100hydro2a和adgn-100hydro3外，
所有adgn-肽均与pgl4在100-150nm范围内形成了稳定的纳米颗粒。稳定的adgn/质粒dna复合物溶液中含有一小部分——5％到20％之间——平均大小大于400nm的纳米颗粒。通过在0.45μm过滤器上过滤，有效地去除了大颗粒和聚集体，并导致pes过滤器中约15-30％的材料损失和pvdf过滤器中约40％的材料损失。因此，将添加带有0.45μm pes过滤器的过滤步骤以供进一步研究。adgn-100的反向翻转修饰并未修改肽与质粒dna形成稳定复合物的能力。adgn-106的反向翻转修饰并未提高adgn-106与质粒形成稳定颗粒的效力。用adgn-100retro inverso、adgn-100hydro5和adgn-100hydro6肽获得聚集体小于4％的高度均一的纳米颗粒。
[0371]
实施例4：adgn-肽变体改善293t细胞中的货物递送
[0372]
评估adgn-肽在293t细胞中对萤光素酶mrna的细胞递送。评估单剂量0.25μg的mrna。将无菌水(gibco)中的luc mrna(0.25μg)与adgn-100、adgn-100ri、adgn-106、adgn-106ri、adgn-100stearyl、adgn-hydro1、adgn-hydro2、adgn-hydro5和adgn-hydro6混合。用0.45μm pes过滤器过滤adgn-肽/mrna复合物。为了评估adgn/mrna复合物在高血清和细胞培养条件下的稳定性，在转染前将复合物在25％血清或硫酸乙酰肝素的存在下温育3hrs，然后转染293t细胞，并在72hrs监测萤光素酶的表达。
[0373]
如图1a和图1b报告的，过滤不影响adgn颗粒效率。在缺少血清或硫酸乙酰肝素处理的情况下，adgn-100和adgn-106肽均获得高水平的萤光素酶表达，adgn-106的效力是adgn-100的2倍。与adgn肽连接的stearyl、hydro5和hydro6基序的存在对萤光素酶的表达没有显著影响。相比之下，hydro1和hydro2基序的存在使adgn肽的效率降低了20到50％。反向-翻转修饰并未修改adgn-100和adgn-106的效率。
[0374]
血清或硫酸乙酰肝素的存在降低了adgn/mrna复合物的稳定性，这与萤光素酶表达的显著降低相关。adgn-106的效率在血清的存在下降低了71％，在硫酸乙酰肝素的存在下降低了50％；而adgn-100的效率在血清中降低了90％，在乙酰肝素中降低了50％。stearyl或hydro-1、hydro-5和hydro-6基序的存在稳定了adgn/mrna颗粒，并且萤光素酶在血清中的表达仅降低30-40％，在硫酸乙酰肝素中降低10-20％。引入反向-翻转修饰可使adgn-mrna复合物强力地稳定，尤其是在血清和硫酸乙酰肝素存在的情况下。adgn-100ri介导的萤光素酶表达在血清的存在下降低40％，在硫酸乙酰肝素的存在下降低16％。adgn-106ri介导的萤光素酶表达在血清的存在下降低26％，在硫酸乙酰肝素的存在下降低13％。
[0375]
luc mrna(0.25μg)与含有10％或20％的adgn-100-peg的adgn-100或adgn-106溶液结合，并且与含有10％或20％的adgn-106-peg的adgn-106结合。将adgn-100或adgn-106与10％或20％的聚乙二醇化adgn-100或聚乙二醇化adgn-106组合，显著地稳定了复合物。分别使用adgn-100peg 10％和20％，血清处理后的转染效率仅降低20％或17％。
[0376]
为了评估连接体序列的影响，使用各种连接体基序将yigsr靶向序列连接到adgn-106。
[0377]
adgn-106:ac-βalwralwrlwrslwrllwka-nh2
[0378]
adgn-106-hydro:ac-yigsr-βalwralwrlwrslwrllwka-nh2
[0379]
adgn-106-hypeg2:ac-yigsr-(peg)2-βalwralwrlwrslwrllwka-nh2
[0380]
adgn-106-hypeg4:ac-yigsr-(peg)4-βalwralwrlwrslwrllwka-nh2
[0381]
adgn-106-hypeg7:ac-yigsr-(peg)7-βalwralwrlwrslwrllwka-nh2
[0382]
adgn-106-hydro-1:ac-yigsr-(g)4-alwralwrlwrslwrllwka-nh2
[0383]
adgn-106-hydro-7:ac-yigsr-(g)2-alwralwrlwrslwrllwka-nh2
[0384]
adgn-106-hydro-3:ac-yigsr-ava(ch2)2-alwralwrlwrslwrllwka-nh2
[0385]
adgn-106-hydro-5:ac-yigsr-aun(ch2)6-alwralwrlwrslwrllwka-nh2
[0386]
adgn-106-hydro-8:ac-yigsr-ahx-alwralwrlwrslwrllwka-nh2
[0387]
评估含有yigsr靶向序列的adgn-106肽在293t细胞中对萤光素酶mrna的细胞递送。评估单剂量0.25μg的mrna。将无菌水(gibco)中的luc mrna(0.25μg)与adgn-106和adgn-106hydro变体混合。用0.45μm pes过滤器过滤adgn-肽/mrna复合物。在转染前将adgn-106/mrna复合物在25％血清的存在下温育3hrs，然后转染293t细胞，并在72hrs监测萤光素酶的表达。
[0388]
如图1c报告的，在缺少血清处理的情况下，adgn-106、adgn-106hydro、adgn-106hypeg2、adgn-106-hydro1、hydro3、hydro5和hydro8获得了高水平的萤光素酶表达，这表明使用诸如βala、peg2、ava、aun、ahx和(gly)4的连接体并不影响转染效率。相比之下，使用peg4、peg7和gly-gly作为连接体，萤光素酶表达分别降低了35％、72％和28％。
[0389]
在血清存在的情况下，adgn-106/mrna复合物的稳定性显著降低，这与萤光素酶表达的显著降低相关。adgn-106和adgn-106hydro效率降低了80％。使用peg2、ava、ahx、(gly)4和aun作为连接体，减少了血清对颗粒稳定性的影响。使用aun》ahx》peg2》ava》gly4连接体获得最佳结果，其中萤光素酶表达分别降低15％、17％、21％、32％和40％。结果证明，连接体的长度和性质都很重要，并且(ch2)4基序的结果最好。
[0390]
结果证明，adgn-100和adgn-106促进293t细胞中mrna的有效递送。过滤可用于净化(clarify)纳米颗粒制备而不影响效率。结果表明，利用adgn-肽的反向-翻转或hydro-6修饰，或在adgn/mrna颗粒内组合10％至20％的聚乙二醇化adgn-肽，强力地使复合物在高血清条件下稳定。
[0391]
实施例5：adgn-肽变体改善293t细胞中pgl4 dna质粒的递送
[0392]
评估adgn-肽在293t细胞中对表达萤光素酶的pgl4质粒dna的细胞递送。将无菌水(gibco)中的luc pgl4质粒(0.15μg)与adgn-100、adgn-100ri、adgn-106、adgn-106ri、adgn-100stearyl、adgn-100hydro1、adgn-hydro2、adgn-hydro4、adgn-hydro3、adgn-hydro5和adgn-hydro6混合。用0.45μm pes过滤器过滤adgn-肽/mrna复合物。为了评估adgn/pgl4质粒复合物在高血清和细胞培养条件下的稳定性，在转染前将复合物在25％血清或硫酸乙酰肝素的存在下温育3hrs，然后转染293t细胞，并在72hrs监测萤光素酶的表达。
[0393]
如图2a和图2b报告的，过滤并不影响adgn颗粒效率。在缺少血清或硫酸乙酰肝素处理的情况下，adgn-100和adgn-100变体肽获得了高水平的萤光素酶表达。hydro1、2、3、4、5基序的存在使adgn-100的效率降低了20％到40％。相比之下，stearyl、retro inverso和hydro 6修饰并不影响adgn-100的效率。如图2a和图2b所示，在不存在或存在血清的情况下，使用adgn-106和adgn-106ri监测较差的萤光素酶表达，这与adgn-106/质粒dna颗粒的大尺寸和差稳定性密切相关。血清或硫酸乙酰肝素的存在降低了adgn/pgl4质粒复合物的稳定性，这与萤光素酶表达的显著降低相关。adgn-100的效率在血清的存在下降低了90％，在硫酸乙酰肝素的存在下降低了50％。stearyl或hydro-1、hydro-5和hydro-6基序的存在
使adgn/pgl4颗粒和萤光素酶表达在血清中仅降低30-40％，在硫酸乙酰肝素中仅降低10-20％。相比之下，hydro-2、hydro-3和hydro-4修饰在血清存在下和在乙酰肝素处理后并未显著改善转染。引入反向-翻转修饰使adgn-质粒dna复合物强力地稳定，尤其是在血清和硫酸乙酰肝素存在的情况下。adgn-100ri介导的萤光素酶表达在血清的存在下降低25％，在硫酸乙酰肝素存在的情况下降低小于10％。
[0394]
我们评估了adgn-100与聚乙二醇化adgn-100组合对转染效率的影响。使pgl4 luc质粒(0.15μg)与含有5至50％adgn-100-peg的adgn-100溶液或与adgn-100peg结合。如图2c报告的，将adgn-100与10％或20％的聚乙二醇化adgn-100组合，显著地使复合物稳定。在25％血清的存在下，转染效率提高了2.3倍和2.4倍。相比之下，使用50％和100％的adgn-100peg使萤光素酶的表达水平降低了50％和80％。
[0395]
结果证明，adgn-100促进293t细胞中质粒dna的有效递送。过滤可用于净化纳米颗粒制备而不影响效率。结果表明，利用adgn肽的硬脂酰化、反向-翻转或hydro-6修饰，或在adgn/质粒颗粒内组合10％至20％的聚乙二醇化adgn肽，强力地使复合物在高血清条件下稳定。
[0396]
实施例6：adgn-肽变体改善a375/luc细胞中的sirna递送
[0397]
评估adgn-肽在a375/luc细胞中对靶向萤光素酶的sirna双链体的细胞递送。将无菌水(gibco)中的靶向萤光素酶的sirna(10和25nm)与adgn-100、adgn-100ri、adgn-106、adgn-106ri、adgn-100stearyl、adgn-100hydro1、adgn-hydro2、adgn-hydro4、adgn-hydro3、adgn-hydro5和adgn-hydro6混合。用0.45μm pes过滤器过滤adgn-肽/sirna复合物。为了评估adgn/sirna复合物在高血清条件下的稳定性，将复合物在25％血清的存在下温育3hrs，然后转染a375/luc细胞，并在48hrs监测萤光素酶的表达。
[0398]
如图3a和图3b报告的，在缺少血清处理的情况下，adgn-100和adgn-106肽均获得了高水平的sirna介导的萤光素酶沉默。使用10nm sirna，萤光素酶ix水平降低78％，而使用25nm sirna，萤光素酶ix水平降低93％。hydro1、2、3、4、5基序的存在使adgn-100或adgn-106的效率降低了50至90％。相比之下，stearyl、retro inverso和hydro 6修饰并不影响adgn-100和adgn-106的效率。血清的存在降低了adgn/sirna复合物的稳定性，这与sirna介导的萤光素酶沉默显著降低相关。在血清存在的情况下，adgn-100和adgn-106的效率降低了90％。stearyl和hydro-6基序的存在稳定了adgn/sirna颗粒，并且sirna介导的萤光素酶沉默在血清中仅降低20％。引入反向-翻转修饰强力地使adgn/sirna复合物稳定。如图3a和图3b报告的，当使用adgn-100ri或adgn-106ri时，sirna介导的萤光素酶沉默不受血清存在的影响，并且10nm sirna和25nm sirna使萤光素酶表达水平降低了77％和95％。
[0399]
我们评估了adgn-100与聚乙二醇化adgn-100组合对sirna转染效率的影响。使靶向萤光素酶的sirna(10nm和25nm)与含有5至50％的adgn-100-peg的adgn-100溶液或与adgn-100peg结合。如图3c报告的，将adgn-100与10％或20％的聚乙二醇化adgn-100组合，显著地使复合物稳定。使用10％和20％的聚乙二醇化adgn-100，萤光素酶表达分别降低75％和81％。相比之下，使用50％和100％的adgn-100peg，转染效率降低50％和80％。
[0400]
结果证明，adgn-100和adgn-106促进了a375/luc细胞中sirna的高效递送。结果表明，利用adgn肽的硬脂酰化、反向-翻转或hydro-6修饰，或在adgn/sirna颗粒内组合10％至20％的聚乙二醇化adgn肽，强力地使复合物在高血清条件下稳定。
[0401]
实施例7：adgn-肽变体改善体内货物递送
[0402]
通过静脉内和肌肉内给予，评估稳定的adgn-肽/mrna对萤光素酶mrna的体内递送。用单剂量5μg的5mou修饰的luc mrna处理动物。将无菌水(gibco)中5mou修饰的luc mrna(5μg)与adgn肽(无菌水)混合，每个样品的体积调整至100μl，其中无菌水含有5％蔗糖。样品用涡流低速温和混合1min并在室温下温育30min。给予前在0.45μm pes过滤器上过滤样品。对于iv给予，小鼠接受100μl静脉内(iv)注射adgn-106/mrna、adgn-100/mrna、adgn-106ri/mrna、adgn-100-stearyl/mrna、adgn-100hydro1/mrna、adgn-100hydro2或含有10％的adgn-100peg的adgn/mrna复合物(每组3只动物)。作为对照，第3组的小鼠(每组2只动物)接受iv注射100μl裸的5mou修饰的luc mrna(5μg)。对于im给予，小鼠接受25μl(5μg mrna)iv注射adgn-100/mrna、adgn-106/mrna、adgn-106ri/mrna或含有10％或20％的adgn-100peg的adgn/mrna复合物(每组2只动物)。作为对照，第3组的小鼠(每组2只动物)接受iv注射25μl裸的5mou修饰的luc mrna(5μg)。
[0403]
通过生物发光监测mrnaluc的表达。在12、24、48和72hrs后进行生物发光成像。小鼠接受i.p.注射150μg/g萤光素进行非侵入性生物发光成像(ivis kinetic；perkinelmer,waltham,ma,usa)。然后将结果表示为相对于第0天的值并在图4a-图4d和图5中显示。
[0404]
如图4a所示；adgn-106、adgn-106ri、adgn-100和adgn-100stearyl介导的体内货物递送和mrna表达主要在肝中观察到，而在肺和肾中水平较低。adgn-106的效率分别是adgn-100stearyl和adgn-100的2倍和4倍。adgn-106ri修饰使所有组织的adgn-106效率提高了2倍。相比之下，使用adgn-100hydro1或adgn-100hydro2获得了微不足道的萤光素酶表达。
[0405]
如图4a和图4b所示，将adgn-106与10％adgn-100peg组合，使萤光素酶在不同组织中的表达提高3-6倍。此外，adgn106/mrna复合物中10％adgn-100peg的存在促进了脑、淋巴结和脾中的mrna靶向性。
[0406]
如图4c和图4d所示，肝和肺中萤光素酶表达的动力学在12h后开始，其中在48h表达最佳，并保持至少72hr稳定。
[0407]
如图4c和图4d所示，肝和肺中萤光素酶表达的动力学在12h后开始，其中在48h表达最佳，并保持至少72hr稳定。
[0408]
如图5a和图5b所示，肌肉内(im)给予后adgn-106、adgn106-hydro-6、adgn-106ri和adgn-106/adgn-100p介导的萤光素酶表达。adgn-106ri和hydro-6修饰使adgn-106的效率提高了6倍和4倍。将adgn-106与10％或20％的adgn-100peg组合，使肌肉中萤光素酶的表达提高8至12倍。相比之下，使用adgn-100未观察到显著的表达，而与adgn-106相比，将adgn-100与10％的adgn-100peg组合使萤光素酶表达提高3倍。如图5a报告的，萤光素酶的表达在12h后开始，其中在24h表达最佳，并保持至少48hr稳定。
[0409]
结果证明，与adgn-100相比，adgn-106在iv给予后促进体内mrna显著更高的递送。对adgn-106引入反向-翻转修饰提高了复合物的稳定性和体内货物递送。结果证明，在adgn-106/mrna颗粒内组合聚乙二醇化adgn肽，强力地使im给予和iv给予的复合物都稳定。聚乙二醇化adgn显著提高了体内萤光素酶表达和组织分布。
[0410]
实施例8：adgn-肽变体改善体内质粒dna递送
[0411]
通过静脉内和肌肉内给予，评估稳定的adgn-肽/pgl4.11 dna对萤光素酶mrna的
体内递送。用单剂量5μg的pgl4.11质粒dna通过iv给予和用单剂量2.5μg的pgl4.11质粒dna通过肌肉内给予来处理动物。
[0412]
将无菌水(gibco)中的pgl4.11 dna质粒(5μg)与adgn肽(无菌水)混合，每个样品的体积调整至100μl，其中无菌水含有5％蔗糖。样品用涡流低速温和混合1分钟并在室温下温育30min。给予前在0.45μm pes过滤器上过滤样品。对于iv给予，小鼠接受100μl iv注射adgn-106/pgl4、adgn-100/pgl4、adgn-100ri/pgl4、adgn-100-stearyl/pgl4、adgn-100hydro1/pgl4、adgn-100hydro2/pgl4、adgn100hydro6/pgl4或含有10％或20％的adgn-100peg的adgn/pgl4复合物(每组3只动物)。作为对照，第3组的小鼠(每组2只动物)接受iv注射100μl裸的pgl4质粒(5μg)。
[0413]
对于im给予，小鼠接受25μl(2.5μg pgl4质粒)iv注射adgn-100/pgl4、adgn-106/pgl4、adgn-100ri/pgl4、adgn-100hydro1/pgl4、adgn-100hydro6/pgl4、adgn-100stearyl/pgl4或含有10％或20％的adgn-100peg的adgn-100/pgl4复合物(每组2只动物)。作为对照，第3组的小鼠(每组2只动物)接受iv注射25μl裸的pgl4质粒(2.5μg)。
[0414]
通过生物发光监测萤光素酶表达。在12、24、48和72hrs后进行生物发光成像。小鼠接受i.p.注射150μg/g萤光素进行非侵入性生物发光成像(ivis kinetic；perkinelmer,waltham,ma,usa)。然后将结果表示为相对于第0天的值并在图6和图7中显示。
[0415]
如图6a所示；在iv注射后，adgn-100、adgn-100ri、adgn-100-hydro6和adgn-100stearyl介导的体内质粒递送和萤光素酶表达主要在肝中观察到，而在肺和肾中水平较低。相比之下，adgn-106未观察到表达或表达程度最低。在所有组织中，反向翻转、硬脂酰化和hydro-6修饰使adgn-100效率分别提高了4、2.7和3.4倍。相比之下，使用adgn-100hydro1或adgn-100hydro2了获得微不足道的萤光素酶表达。
[0416]
如图6a和图6b所示，adgn-100与10％adgn-100peg组合使萤光素酶在不同组织中的表达提高5-6倍。如图6b所示，肝中萤光素酶表达的动力学在12h后开始，其中在48h表达最佳，并保持至少72hr稳定。
[0417]
如图7a和图7b所示，im给予后adgn-100、adgn-100ri、adgn-100hydro6和adgn-100/adgn-100p介导的萤光素酶表达。adgn-100ri修饰使adgn-100的效率提高了6倍。硬脂酰和hydro-6修饰使adgn-100的效率提高了3-4倍。将adgn-100与10％或20％的adgn-100peg组合，使将肌肉中的萤光素酶表达提高10至12倍。相比之下，使用adgn-106和hydro-1或hydro-2修饰未观察到显著的表达。如图7a所示，萤光素酶表达在12h后开始，其中在24h表达最佳，并保持至少48hr稳定。
[0418]
结果证明，与adgn-106相比，adgn-100在iv给予后促进体内质粒dna显著更高的递送。对adgn-100引入反向翻转、硬脂酰或hydro-6修饰，如先前关于培养细胞和体内质粒dna递送所观察到的那样，提高了复合物的稳定性。结果证明，在adgn-100/pgl4质粒颗粒内组合聚乙二醇化adgn-肽，强力地使im给予和iv给予的复合物都稳定。聚乙二醇化adgn显著提高了体内萤光素酶表达和组织分布。
[0419]
实施例9：adgn-肽变体改善体内货物递送
[0420]
通过静脉内给予评估稳定的adgn-肽/mrna对萤光素酶mrna在体内的递送。用单剂量5μg的5mou修饰的luc mrna处理动物。将无菌水(gibco)中的5mou修饰的luc mrna(5μg)与adgn肽(无菌水)混合，每个样品的体积调整至100μl，其中无菌水含有5％蔗糖。在室温
下，在玻璃小瓶(1-4ml)中，在无菌水中制备5mou修饰的luc mrna(5μg)。在400rpm的磁力搅动下逐滴(1滴/秒)添加adgn-肽溶液并在室温下温育30min。iv给予前，将adgn-肽/mrna复合物在5％蔗糖溶液中稀释，并在400rpm的磁力搅动下混合1分钟。给予前在0.45μm pes过滤器上过滤样品。
[0421]
对于iv给予，小鼠接受静脉内(iv)注射100μl adgn-103c/mrna、adgn-104/mrna、adgn-105/mrnaadgn-106tb/mrna、adgn-109/mrna、adgn-109d/mrna、adgn-109b/mrna、adgn-101/mrna、adgn-102/mrna:adgn-100galnac/mrna、adgn-106galnac/mrna、adgn-106tc/mrna、adgn-106td/mrna、adgn-106/mrna、adgn-100/mrna、adgn-106hydro8/mrnaand adgn-100-hydro8。(每组3只动物)。作为对照，第3组的小鼠(每组2只动物)接受iv注射100μl裸的5mou修饰的luc mrna(5μg)。
[0422]
通过生物发光监测mrna luc表达。在12、24、48和72小时后进行生物发光成像。小鼠接受i.p.注射150μg/g萤光素进行非侵入性生物发光成像(ivis kinetic；perkinelmer,waltham,ma,usa)。然后将结果表示为相对于第0天的值并在图11a-图11c中显示。
[0423]
如图11a和图11b所示；与adgn-106或adgn-100相比，adgn-100galnac和adgn-106galnac介导了肝中的mrna积累，其中mrna表达提高了10到20倍。
[0424]
如图11a和图11b所示，adgn-100hydro 8修饰在肺和肾中的效率分别提高22倍和4倍。adgn-106hydro8修饰使肺和肌肉中的adgn-106肽效率提高了5倍，并且使肝中的adgn-106肽效率提高了2倍。
[0425]
如图11a所示，adgn-101修饰使肺中的萤光素酶表达提高了6倍，并促进了心脏和肌肉中的靶标递送和mrna表达。adgn-102修饰使肺中萤光素酶的表达提高了3倍，并促进了脑中的靶标递送和mrna表达。
[0426]
如图11b所示，adgn-106修饰使肺中的萤光素酶表达提高了2-3倍。adgn-106tb和adgn-106tc修饰促进了脑中的靶标递送和mrna表达。adgn-106td修饰促进了心脏和肌肉中的靶标递送和mrna表达。
[0427]
如图11c所示，静脉内给予后adgn-104、adgn105、adgn-109、adgn-109d、adgn-109b介导的萤光素酶表达。adgn-104促进了心脏和肌肉中的靶标递送和mrna表达，而在肝中水平较低。adgn-105促进了脑中的靶标递送和mrna表达，而在肝、肺和淋巴结中水平较低。adgn-109和adgn-109d促进了脑和淋巴结中的靶标递送和mrna表达，而在肝和肾中水平较低。adgn-109b促进了肺、心脏和肌肉中的靶标递送和mrna表达。相比之下，使用adgn-103c获得了微不足道的萤光素酶表达。
[0428]
实施例10：
[0429]
表1列出了在小鼠或大鼠模型中已被证明成功地将各种货物分子递送至一个或多个靶向器官(例如，通过静脉内(iv)、肌肉内(im)或皮下(sq)给予，或气管内滴注或雾化(nb))的细胞穿透肽的总结。
[0430]
表1.
[0431]
[0432]
[0433]
[0434][0435]
序列表
[0436]
[0437]
[0438]
[0439]
[0440]
[0441]
[0442]
[0443]
[0444]